CN101812126B

CN101812126B - 一种新的hPEBP4蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽及其应用

Info

Publication number: CN101812126B
Application number: CN2009100466142A
Authority: CN
Inventors: 李楠; 曹雪涛; 孙伟红
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2029-02-25
Also published as: CN101812126A

Abstract

本发明提供一种新的hPEBP4蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽，以及该表位及其相关的重组蛋白、编码核苷酸序列、抗原递呈细胞、组合物以及针对该表位的特异性免疫效应细胞在表达hPEBP4肿瘤治疗及预防中的用途。

Description

一种新的hPEBP4蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种人磷脂酰乙醇胺结合蛋白(hPEBP4蛋白)来源的HLA-A2限制性表位多肽，以及该表位及其相关的重组蛋白、编码核苷酸序列、抗原递呈细胞、组合物以及针对该表位的特异性免疫效应细胞在表达hPEBP4肿瘤治疗及预防中的用途。

背景技术

hPEBP4(SEQ ID NO：12)，原称为“hPEBP5”，其核苷酸序列和氨基酸见中国专利申请CN02136556.3。它是从正常成人骨髓细胞体外原代培养获得骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell，BMSC)并构建BMSC cDNA文库，利用cDNA文库大规模测序的手段，从BMSC cDNA文库中分离到的一种新型全长新基因，属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族，在GenBank/EMBL数据库中登录(序列号为AY037148)。hPEBP4蛋白包含227个氨基酸(SEQ ID NO：13)。其氨基酸序列在75-195位为典型的磷脂酰乙醇胺结合保守区域(PBP)。

合成肽疫苗是近年来随着分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，而且其副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个新的方向，广泛应用于抗肿瘤及抗病毒免疫治疗。目前已经有多种基于表位多肽的疫苗进入临床研究或上市。

细胞免疫在抗肿瘤和抗病毒免疫中起关键作用。T细胞识别的抗原是与细胞表面的MHC-I类或II类分子结合的肽，其长度约为8-12个氨基酸。而作为杀伤肿瘤细胞的主要效应细胞CTL(细胞毒T淋巴细胞，Cytotoxic TLymphocytes)则识别与MHC-I类分子结合的内源性肽。已有证据表明，合成肽能直接与MHC-I类分子结合，而不需要APC的加工、处理，它和天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有同等的效力。

多肽疫苗己成为目前抗恶性肿瘤的一项新策略，也是目前研究最多的肿瘤治疗性疫苗。研究较多的有：(1)gp100：来源于gp100的肽G9154(序列为：KTWGQYWQV)、G9209(序列为：ITDQVPPFSV)均能诱导抗原特异性的CTL。用之致敏来自HLA-A2⁺的黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞(PBL)，能明显增强其诱导特异性CTL的能力：诱导的CTL即能识别未修饰的gp100；(2)CEA：采用与上述相似的方法，Zaremba等人的研究表明：CEA的肽CAP1-6D不仅能在体外致敏CEA特异的CTL，其效力为CAP1的100-1000倍，在体内也能诱导CEA特异的CTL(而CAP1却不能)；而且所致敏的CTL同样能识别CAP1。更为重要的是，这些CTL能溶解同源的表达CEA的人类肿瘤；(3)MAGE-2：MAGE-2广泛存在于黑色素瘤、喉癌、肺癌、肉瘤等多种肿瘤(除睾丸外)，不存在于正常组织。在MAGE-2中已发现有三段多肽能与MHC-I类分子在37℃下形成稳定复合物，其中至少有两个能被HLA-A*0201加工、呈递，成为多肽疫苗研究的新候选者；(4)P21^WAF1：将P21^WAFI的肽与内源化肽融合能抑制肿瘤的生长；(5)HER2/neu：来源于HER2/neu的肽在体外能致敏特异性的CTL，在小鼠体内也能诱导特异的CTL，且能抑制肿瘤的生长。另外采用HPV多肽疫苗也已经进入临床研究。

HLA-A2是一种在我国人群中具有较高分布的一种MHC-I类分子，阳性率在40-60％之间，占MHC-I类分子各个亚群的首位，由于HLA-A*0201是人群出现频率最高的位点，基序组成明确，因此是疫苗设计中首选的相关分子。

随着对MHC-I类分子和肽表位分子相互作用认识的深人，科学家们已建立了较为成熟的表位鉴定技术路线，主要步骤如下：(1)根据表位和MHC-I类分子相互作用的特点，预测MHC-I类分子限制性CTL表位，并利用计算机分子模拟技术对预测表位进行进一步筛选；(2)测定表位与MHC-I类分子结合力；(3)利用体外细胞毒分析或免疫荷瘤转基因小鼠鉴定肽表位能否诱导CTL，寻求最佳优势表位。基于这一技术路线，已有多种HLA-A*0201限制性CTL表位被鉴定，有的已在临床显示了较好疗效。

T2细胞是用于测定表位与HLA-A*0201分子结合力的工具细胞之一，它是一株抗原递呈转运体缺陷的HLA-A*0201型细胞株，该细胞表面只表达不含内源性抗原分子的HLA-A*0201分子，从而可利用其与目的肽的结合程度来测定HLA-A*0201分子与目的表位间的亲和力。

目前尚缺乏有效预防和治疗抗肿瘤的治疗性疫苗，尤其是安全性高的合成肽疫苗，因此本领域迫切需要开发新的可用于预防和治疗肿瘤的安全性高、具有高免疫原性的合成肽疫苗。

发明内容

本发明的目的就是提供一种安全性高、具有高免疫原性的合成肽及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种hPEBP4蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽，所述多肽具有诱导细胞毒T细胞杀伤活性，且选自下组：

(a)包含如下通式(I)中的氨基酸序列的多肽：

X_aa1-RLVTAALLL-X_aa2 (I)

式中，X_aa1和X_aa2各为0、1、2或3个任选的氨基酸。

(b)将通式氨基酸序列经过1-4个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱导细胞毒T细胞杀伤活性功能的由(a)衍生的HLA-A2限制性表位多肽。

更佳地，(b)中所述的氨基酸可选自下组：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val。

更佳地，所述的X_aa1是不存在、D、DE、DED或LDED，优选为不存在、D、DE或DED；而X_aa2是不存在、F、FY、FYP或FYPE，优选为F、FY、FYP或FYPE。

在本发明的一个实施方式中，所述的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。

在本发明的一个实施方式中，所述的多肽为RLVTAALLL(SEQ ID NO：1)

在本发明的第二方面涉及一种重组蛋白，所述的重组蛋白含有如前所述的hPEBP4来源的HLA-A2限制性表位多肽。

在本发明的第三方面，涉及一种分离的核酸，所述的核酸编码如前所述的hPEBP4来源的HLA-A2限制性表位多肽。

在一个优选例中，所述分离的核酸是人工合成的核酸序列。

在另一优选例中，所述分离的核酸的序列是aggctggtcacagcagcactgttactg(对应于SEQ ID NO：12中的81-107位)。

在本发明的第四方面，涉及一种抗原递呈细胞，所述的抗原递呈细胞是被如前所述的hPEBP4来源的HLA-A2限制性表位多肽致敏的。

较佳地，所述抗原递呈细胞经过分离和纯化。

较佳地，所述的抗原递呈细胞选自下组：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞、或内皮细胞。

在本发明的第五方面，涉及一种组合物，所述的组合物含有：

(a)0.001-99.99wt％如前所述的hPEBP4来源的HLA-A2限制性表位多肽或如前所述的抗原递呈细胞；和

(b)免疫学或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

较佳地，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一个优选例中，所述组分(a)的含量为0.001-99.99wt％，优选0.1-99.0wt％，更优选1-90wt％。

在本发明的第六方面，涉及一种如前所述的hPEBP4来源的HLA-A2限制性表位多肽或如前所述的抗原递呈细胞在制备预防和治疗肿瘤的药物中的用途。

在本发明的第七方面，提供了本发明所述的hPEBP4来源的HLA-A2限制性表位多肽的用途，它被用于制备包含该限制性表位多肽的重组蛋白(如融合蛋白)，或用于制备致敏的抗原提呈细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

以下结合附图对本发明进行进一步阐述。

图1：P6-14肽致敏的树突状细胞(DC)体内诱导HLA-A2.1/K^b转基因小鼠细胞毒T淋巴细胞的杀伤活性。其中：

图1A的效应细胞来自单纯用同源DC体内诱导的细胞毒T淋巴细胞；

图1B的效应细胞来自P6-14肽致敏的DC体内诱导的细胞毒T淋巴细胞。

图2：P6-14肽致敏的树突状细胞(DC)体内诱导HLA-A2.1/K^b转基因小鼠细胞毒T淋巴细胞IFN-γ分泌情况。其中：

图2A的效应细胞来自单纯用同源DC体内诱导的细胞毒T淋巴细胞；

图2B的效应细胞来自P6-14肽致敏的DC体内诱导的细胞毒T淋巴细胞。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现hPEBP4高表达于某些肿瘤细胞内，能通过抑制Ras/Raf/MEK/ERK途径、JNK活化和PE外翻来抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。因此，利用hPEBP4特异的抗原肽，能够诱导机体产生特异性CTL，杀伤高表达hPEBP4的肿瘤细胞。据此，本发明人在对hPEBP4进行计算机模拟分析的基础上，选择性地合成了多条有可能与HLA-A*0201结合并诱导机体产生CTL的hPEBP4特异的抗原肽，通过T2细胞结合实验，筛选出与HLA-A*0201具有强亲合力的表位肽，并对其免疫原性进行评价，发现其不仅可以在HLA-A*0201/K^b转基因小鼠及健康人外周血中诱导出特异性的、HLA-A*0201限制性的细胞毒T淋巴细胞，而且是一个被细胞自然加工、递呈的免疫原性多肽。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人的研究表明，hPEBP4的氨基酸序列在75-195位为典型的磷脂酰乙醇胺结合保守区域(PBP)。hPEBP4能通过抑制Ras/Raf/MEK/ERK途径、JNK活化和PE外翻来抑制TNF-α诱导的细胞凋亡，这些功能均由其PE结合保守区域(PBP)介导。

RT-PCR显示，hPEBP4作为抗凋亡分子在前列腺癌PC-3、卵巢癌CaoV-3、乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞中高表达，而肺癌来源的A549细胞和结肠癌来源的LoVo细胞等大部分实体肿瘤细胞未见表达。在临床肿瘤标本中，hPEBP4蛋白高表达于50％以上的乳腺癌肿瘤组织中，而仅表达于4％的正常乳腺组织中。此外，实验结果还显示hPEBP4表达下调增强了乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞对TNF-α诱导凋亡的敏感性，表明hPEBP4是治疗乳腺癌等肿瘤潜在的作用靶点。

因此，如果以hPEBP4为靶标，对机体进行免疫，将会使机体产生针对hPEBP4蛋白的特异性免疫应答，从而使机体能有效地抑制、清除肿瘤细胞，为相关肿瘤的预防及治疗提供措施。

据此，本发明人在对hPEBP4进行计算机模拟分析的基础上，选择性地合成了多条有可能与HLA-A*0201结合并诱导机体产生CTL的hPEBP4特异的抗原肽，通过T2肽结合实验，筛选出与HLA-A*0201具有强亲合力的表位肽，并对其免疫原性进行评价，发现其不仅可以在HLA-A*0201/K^b转基因小鼠及健康人外周血中诱导出特异性的、HLA-A*0201限制性的细胞毒T淋巴细胞，而且是一个被细胞自然加工、递呈的免疫原性多肽。

肿瘤相关抗原hPEBP4来源的HLA-A2限制性的细胞毒T淋巴细胞表位肽的鉴定，对其肿瘤疫苗以及治疗制剂的研制有重要的意义。

如本文所用，“本发明多肽”、“特异性多肽”、“HLA-A2限制性表位多肽”可互换使用，指氨基酸序列P6-14(SEQ ID NO：1)所示的多肽。此外，还包括具有与P6-14(SEQ ID NO：1)相同功能的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-9个，较佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括P6-14的活性衍生物。

一种优选的衍生多肽是在SEQ ID NO：1的上游添加对应于hPEBP4中第2-5位的1个或2个或3个或4个氨基酸，和/或在SEQ ID NO：1的下游添加对应于hPEBP4中第15-18位的1个或2个或3个或4个氨基酸。

本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

本发明多肽也可用于与BSA等蛋白偶联，从而形成多肽偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂、和BSA构成，其中所述的交联剂优选戊二醛、EDAC。所述蛋白质可选自：匙孔槭血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白或γ球蛋白。

本发明还提供了一种分离的核酸，所述核酸序列编码本发明的HLA-A2限制性表位多肽。所述核酸序列优选hPEBP4中所述表位多肽的天然编码序列，aggctggtcacagcagcactgttactg(对应于SEQ ID NO：12中的81-107位)。

此外，本发明的多肽和偶联物还可用于制备治疗性的药物组合物或预防性及治疗性的疫苗组合物。

因此，另一方面，本发明还提供了一种组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽、偶联物或其组合物；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

本发明的含本发明多肽的治疗或预防性药物组合物(包括疫苗)，可以经口服、皮下、皮内、静脉注射等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

本发明的主要优点在于：本发明的表位肽是hPEBP4蛋白来源的、HLA-A2限制性的细胞毒T淋巴细胞表位肽，可安全有效地引起针对肿瘤细胞的免疫应答，则不仅对肿瘤发病机制的研究，而且对肿瘤治疗性疫苗以及治疗制剂的研制均有重要的意义。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.HLA-A*0201高亲和力肽的筛选

本实施例通过肽结合实验筛选出与HLA-A*0201具有高亲和力的表位肽。

试验步骤

首先收集T2细胞(一种缺失抗原加工能力的细胞，购买自ATCC：CRL-1991)，用无血清1640培养基(购自Invitrogen公司)洗三次后，调细胞浓度至2×10⁵个/ml，铺于24孔板中，0.5ml/孔。再加入50μM的候选多肽，2.5μg/ml的β2微球蛋白(购自R&D公司)于37℃，5％CO₂孵箱中共孵育18h。孵育后的细胞用冰PBS(pH7.2，PBS为缓冲液，自配)洗三遍，加入FITC标记的HLA-A2特异性的mAb BB7.2(Sterotec Ltd，Oxford，UK)，冰浴45分钟，PBS洗后用流式细胞仪(Beckton Dickinson公司FACSCalibur)检测平均荧光强度。以阳性已知肽CEAHLA-A2限制性表位多肽CAP-1(SEQ ID NO：10，序列为YLSGANLNL)作为阳性对照，未加肽刺激的单纯T2细胞作为背景对照。

检测方法

免疫荧光法检测肽与HLA-A*0201分子的结合情况，是基于外源性多肽与T2细胞表面MHC-I类分子的结合可使其表面的MHC-I类分子的表达量增加，两者结合越稳固，则可检测到的MHC-I类分子的表达量越多，以平均荧光强度为检测指标。结果以荧光系数(FI)作为衡量指标。

其中，多肽的FI＞l被认为是高亲和力的表位。

试验结果

免疫荧光法测得的hPEBP4蛋白来源多肽的T2-HLA-A*0201结合的亲和力结果如表1所示。本发明人从数条hPEBP4蛋白来源多肽中筛选出HLA-A2高亲和力的表位P614，其序列为RLVTAALLL(SEQ ID NO：1)。

表1hPEBP4蛋白来源多肽的T2-HLA-A*0201结合的亲和力

高亲和力：FI＞1

表1的结果显示，hPEBP4蛋白来源的多肽P6-14对HLA-A2具有极高的亲和力。

实施例2.HLA-A2.1/K^b转基因小鼠体内针对hPEBP4来源的HLA-A2限制性多肽特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导

效应细胞的制备

按常规方法(参照Inaba实验室方法)制备HLA-A2.1/K^b转基因小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)。收集培养至第7天的DC，调细胞浓度至1×10⁶个细胞/ml，加入P6-14(终浓度10μM/ml)及β2微球蛋白(终浓度3μg/ml)，37℃，5％CO₂孵箱中孵育3h。收集肽致敏的DC，用PBS(pH7.2，PBS为缓冲液，自配)洗三遍，调细胞浓度至1×10⁶个/0.2ml(免疫用量即为0.2ml)免疫转基因小鼠(HLA-A2.1/K^b转基因小鼠，购自美国JaxMice)。每只小鼠腹腔注射0.2ml，共免疫三次，间隔一周。末次免疫后7天，无菌操作摘取小鼠脾脏，溶解红细胞，制成单细胞悬液。将脾细胞悬液(5×10⁶个/ml)与肽致敏的经⁶⁰Coγ射线照射(总剂量为30Gy)的自体(即同一小鼠)树突状细胞以10∶1比例(数量比)置于RPMI1640完全培养基中培养。培养6天后，收集效应细胞。

检测方法

(1)特异性杀伤活性的检测

本实施例采用了标准的4小时⁵¹Cr释放试验检测特异性杀伤活性。

分别用负载P6-14、SSp-1(无关对照，SEQ ID NO：11)的T2细胞及未加负载的T2细胞作为靶细胞(即实施例1制备的效应细胞的靶细胞)，加入⁵¹Cr(100μCi/10⁶个细胞)，置37℃水浴中标记90分钟，每间隔15分钟轻混匀一次，PBS洗3遍，彻底洗去残余Na₂ ⁵¹CrO₄，标记好的靶细胞用完全1640培养基调整细胞浓度为1×10⁵个细胞/ml，加入96孔圆底板，每孔100μl。按50∶1、25∶1和12.5∶1(数量比)三个不同效靶比加入效应细胞，37℃孵育4小时，收集各孔上清各100μl，用γ计数仪(Wallac公司1470)检测cpm值(counts per minute每分钟计数)。

按下式计算特异性裂解率或杀伤率：

其中，最大释放组各孔为单独的靶细胞加100μl 1％SDS；自发释放孔为单独的靶细胞加100μl完全培养基。

(2)肽特异性CTL胞内IFN-γ的检测

在所诱导的效应细胞中加入20μM相应的P6-14或无关对照SSp-1肽培养48小时。在培养的最后8小时加入20μg/ml Brefeldin A(购自Beckton Dickinson公司)，以使胞内蛋白蓄积。之后收集细胞，PBS洗两次。室温，血清(购自Invitrogen公司)封闭细胞Fc受体15分钟。细胞用PBS洗，加入FITC-标记的抗-CD8单克隆抗体(购自Beckton Dickinson公司)，4℃，放置30分钟。PBS洗后，细胞用4％甲醛固定，saponine(购自Sigma公司)细胞打孔，加入PE-标记的小鼠IFN-γ单克隆抗体(购自Beckton Dickinson公司)，4℃，放置30分钟后流式细胞仪(Beckton Dickinson公司FACSCalibur)检测。该数值显示可检测到的IFN-γ的量。

试验结果

结果显示，P6-14多肽致敏的树突状细胞免疫小鼠产生的CTL均能有效杀伤负载P6-14的T2细胞，但对未加负载的T2细胞及负载无关肽SSp-1的T2细胞无杀伤活性(见图1)。相应地，P6-14所刺激的效应细胞(CTL)能检测到有明显的IFN-γ释放；而针对无关对照肽HLA-A^*0201限制性SSp-1刺激的CTL则没有明显的IFN-γ释放。这说明P6-14肽能在体内诱导出P6-14肽特异的CTL，具有较强的免疫原性。

该试验是用效应细胞来杀伤靶细胞，靶细胞是负载肽的T2细胞，效应细胞是实施例1中制备的、经多肽致敏的转基因小鼠来源树突状细胞体内刺激得到的杀伤性T细胞(存在于脾细胞中)。如果P6-14多肽致敏的树突状细胞刺激得到T细胞能够特异性杀伤负载有P6-14的T2细胞，那么表示P6-14多肽能够在体内被T细胞识别为表位，就证明了该多肽是一种杀伤性T细胞特异性表位多肽)。

实施例3.P6-14多肽致敏的人外周血单核细胞来源DC的培养

HLA-A2.1+/hPEBP4+乳腺癌病人抗凝外周全血通过淋巴细胞分离液(Ficoll-Histopaque 1.077，购自Sigma公司)密度梯度离心(室温，400×g，30分钟)，取界面细胞，置入50ml离心管中，用无钙镁PBS(pH7.2)-EDTA(2mM)悬浮细胞，之后离心(300×g，10分钟)洗细胞一次，弃上清，无钙镁PBS重悬细胞，再次离心(200×g，5分钟)洗细胞2次，获得人外周血单个核细胞(PBMC)。

用完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI1640)悬浮PBMC，按1×10⁷细胞/孔铺于6孔板，37℃、5％CO₂孵育2小时后，轻轻吸出悬浮细胞，用预温的培养基小心洗6孔板三遍(此部分细胞连同吸出的悬浮细胞冻存备用)，剩下的细胞即为贴壁的单核细胞。贴壁细胞在含人重组rhGM-CSF(500U/ml)和人重组rhIL-4(10ng/ml)(购自R&D公司)的完全培养基中37℃、5％CO₂进行培养。第3天补充完全培养基，继续培养。

收集上述培养至第6天的hPEBP4+/HLA-A^*0201+乳腺癌患者外周血单核细胞来源的DC，用人DC完全培养基(RPMI 1640完全培养基，500U/mlrhGM-CSF、10ng/ml rhIL-4)调整细胞浓度为2×10⁵细胞/ml浓度，1ml/孔分入24孔板，加入20μM P6-14多肽，4小时后收集细胞，弃培养基上清，用RPMI1640培养基离心洗涤细胞两次以除去原培养基中存在的刺激物，最后将2×105细胞悬浮在0.5ml人DC完全培养基中，即为P6-14多肽致敏的人外周血单核细胞来源DC。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>一种新的hPEBP4蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽及其应用

<130>082771

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Arg Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Leu

1 5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Ala Leu Leu Leu Gly Leu Met Met Val

1 5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

Leu Leu Leu Gly Leu Met Met Val Val

1 5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Ser Leu Leu Pro Lys Glu Asn Lys Thr

1 5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

Thr Met Arg Leu Val Thr Ala Ala Leu

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

Glu Leu Gly Asn Ile Gly Cys Lys Val

1 5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

Trp Leu Val Thr Asp Ile Lys Gly Ala

1 5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

Lys Ile Gln Gly Gln Glu Leu Ser Ala

1 5

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

Phe Val Tyr Leu Gln Glu Gly Lys Val

1 5

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>10

Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu

1 5

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>11

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu

1 5

<210>12

<211>874

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(66)..(746)

<400>12

actggattcg ctgcggagcc ctggaagctg cctttccttc tccctgtgct taaccagagg 60

tgccc atg ggt tgg aca atg agg ctg gtc aca gca gca ctg tta ctg ggt 110

Met Gly Trp Thr Met Arg Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

ctc atg atg gtg gtc act gga gac gag gat gag aac agc ccg tgt gcc 158

Leu Met Met Val Val Thr Gly Asp Glu Asp Glu Asn Ser Pro Cys Ala

20 25 30

cat gag gcc ctc ttg gac gag gac acc ctc ttt tgc cag ggc ctt gaa 206

His Glu Ala Leu Leu Asp Glu Asp Thr Leu Phe Cys Gln Gly Leu Glu

35 40 45

gtt ttc tac cea gag ttg ggg aac att ggc tgc aag gtt gtt cct gat 254

Val Phe Tyr Pro Glu Leu Gly Asn Ile Gly Cys Lys Val Val Pro Asp

50 55 60

tgt aac aac tac aga cag aag atc acc tcc tgg atg gag ccg ata gtc 302

Cys Asn Asn Tyr Arg Gln Lys Ile Thr Ser Trp Met Glu Pro Ile Val

65 70 75

aag ttc ccg ggg gcc gtg gac ggc gca acc tat atc ctg gtg atg gtg 350

Lys Phe Pro Gly Ala Val Asp Gly Ala Thr Tyr Ile Leu Val Met Val

80 85 90 95

gat cca gat gcc cct agc aga gca gaa ccc aga cag aga ttc tgg aga 398

Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Ala Glu Pro Arg Gln Arg Phe Trp Arg

100 105 110

cat tgg ctg gta aca gat atc aag ggc gcc gac ctg aag aaa ggg aag 446

His Trp Leu Val Thr Asp Ile Lys Gly Ala Asp Leu Lys Lys Gly Lys

115 120 125

att cag ggc cag gag tta tca gcc tac cag gct ccc tcc cca ccg gca 494

Ile Gln Gly Gln Glu Leu Ser Ala Tyr Gln Ala Pro Ser Pro Pro Ala

130 135 140

cac agt ggc ttc cat cgc tac cag ttc ttt gtc tat ctt cag gaa gga 542

His Ser Gly Phe His Arg Tyr Gln Phe Phe Val Tyr Leu Gln Glu Gly

145 150 155

aaa gtc atc tct ctc ctt ccc aag gaa aac aaa act cga ggc tct tgg 590

Lys Val Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Asn Lys Thr Arg Gly Ser Trp

160 165 170 175

aaa atg gac aga ttt ctg aac cgt ttc cac ctg ggc gaa cct gaa gca 638

Lys Met Asp Arg Phe Leu Asn Arg Phe His Leu Gly Glu Pro Glu Ala

180 185 190

agc acc cag ttc atg acc cag aac tac cag gac tca cca acc ctc cag 686

Ser Thr Gln Phe Met Thr Gln Asn Tyr Gln Asp Ser Pro Thr Leu Gln

195 200 205

gct ccc aga gaa agg gcc agc gag ccc aag cac aaa aac cag gcg gag 734

Ala Pro Arg Glu Arg Ala Ser Glu Pro Lys His Lys Asn Gln Ala Glu

210 215 220

ata gct gcc tgc tagatagccg gctttgccat ccgggcatgt ggccacactg 786

Ile Ala Ala Cys

225

cccaccaccg acgatgtggg tatggaaccc cctctggata cagaacccct tcttttccaa 846

ataaaaaaaa aatcatccag gaaaaaaa 874

<210>13

<211>227

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>13

Met Gly Trp Thr Met Arg Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

Met Met Val Val Thr Gly Asp Glu Asp Glu Asn Ser Pro Cys Ala His

20 25 30

Glu Ala Leu Leu Asp Glu Asp Thr Leu Phe Cys Gln Gly Leu Glu Val

35 40 45

Phe Tyr Pro Glu Leu Gly Asn Ile Gly Cys Lys Val Val Pro Asp Cys

50 55 60

Asn Asn Tyr Arg Gln Lys Ile Thr Ser Trp Met Glu Pro Ile Val Lys

65 70 75 80

Phe Pro Gly Ala Val Asp Gly Ala Thr Tyr Ile Leu Val Met Val Asp

85 90 95

Pro Asp Ala Pro Ser Arg Ala Glu Pro Arg Gln Arg Phe Trp Arg His

100 105 110

Trp Leu Val Thr Asp Ile Lys Gly Ala Asp Leu Lys Lys Gly Lys Ile

115 120 125

Gln Gly Gln Glu Leu Ser Ala Tyr Gln Ala Pro Ser Pro Pro Ala His

130 135 140

Ser Gly Phe His Arg Tyr Gln Phe Phe Val Tyr Leu Gln Glu Gly Lys

145 150 155 160

Val Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Asn Lys Thr Arg Gly Ser Trp Lys

165 170 175

Met Asp Arg Phe Leu Asn Arg Phe His Leu Gly Glu Pro Glu Ala Ser

180 185 190

Thr Gln Phe Met Thr Gln Asn Tyr Gln Asp Ser Pro Thr Leu Gln Ala

195 200 205

Pro Arg Glu Arg Ala Ser Glu Pro Lys His Lys Asn Gln Ala Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Cys

225

Claims

1.hPEBP4来源的HLA-A2限制性表位多肽在制备诱导细胞毒T细胞杀伤活性药物中的用途，所述多肽的序列为RLVTAALLL。

2.如权利要求1所述的hPEBP4来源的HLA-A2限制性表位多肽在制备诱导细胞毒T细胞杀伤活性药物中的用途，其特征在于，所述药物用于预防和治疗肿瘤。