CN101818213B - 检测人乳头瘤病毒的基因芯片及试剂盒 - Google Patents
检测人乳头瘤病毒的基因芯片及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人乳头瘤病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的人乳头瘤病毒检测探针，所述检测探针包括SEQ ID No.9-37的核苷酸序列；本发明的27种HPV亚型特异性探针，对应包括了22种高危及中危型HPV，5种低危型HPV和2种高危型HPV整合(HPV16/HPV18)。本发明还公开了一种快速、高通量的检测样本中HPV各亚型的检测试剂盒，包括基因芯片，固定于其上的检测探针为SEQ ID No.9-37的核苷酸序列；检测用引物序列，用于扩增临床样本中的人乳头瘤病毒DNA序列；用于扩增临床样本中的人GAPDH基因；人乳头瘤病毒专用裂解液；PCR反应液和显色试剂。本发明的HPV检测对于HPV的临床诊断和宫颈癌的早期预防、诊断、治疗和术后跟踪有重大意义。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种含有人乳头瘤病毒(HPV)各亚型探针的基因芯片，本发明还涉及一种用于HPV检测及分型的试剂盒。
背景技术
全球每年约有51万名妇女被诊断为宫颈癌，其是仅次于乳腺癌的人类第二大妇科恶性肿瘤，并且其发病现在呈年轻化趋势。在国内，每年新增宫颈癌病例约13.5万，占全球发病数量的1/3，约有8万人因此病死亡。研究发现90％以上的宫颈癌患者伴有人乳头瘤病毒(human papillomaviruses，HPV)感染。宫颈癌及其癌前病变的发生是多种因素协同作用的结果，高危型HPV感染时宫颈癌演变的始动因素，而HPV与宿主染色体的整合则是推动宫颈癌变进展的重要事件。因此检测宫颈病变中HPV感染及整合情况，有利于早期发现、早期诊断宫颈癌及癌前病变；及时治疗控制HPV感染，可预防宫颈内瘤变发生，能有效降低宫颈癌的发病率和死亡率，对宫颈癌的防治有极大的临床价值。
HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒。人类是HPV的唯一宿主，它定向感染人体皮肤及粘膜的复层鳞状上皮内，具有高度的宿主特异亲和力。
国际癌症研究中心(IARC)专题讨论会(1995年)明确提出，HPV感染是宫颈癌的主要病因。目前鉴定出HPV亚型100余种，其中30余种与宫颈感染和病变有关，根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种：将HPV6、11、40、42等归为低危型，主要引起生殖道、肛周皮肤和阴道下部的外生殖性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤变(CIN I)；高危型主要为HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等，主要导致高度子宫颈上皮内瘤变(CIN II、CIN III)和宫颈癌的发生，尤其是HPV16和18型。因此，检测出样本中的具体HPV亚型对于宫颈癌的防治具有重要的指导意义。
HPV病毒无法在体外培养，在体内也不能被诱导出易于检测的免疫反应，因此无法采用血清学检测的方法对其进行诊断和分型。早期HPV的诊断主要是根据典型的临床表现和肉眼可见的尖锐湿疣；或是根据细胞学或病理学特征性改变来判断，包括巴氏涂片(Pap Smear)和液基薄层细胞检测(TCT)，但常会出现一种未确定意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)，常可掩盖一部分有意义的组织病理学异常而出现假阴性结果，需结合分子生物学技术进行确诊。
近年来各种分子生物学技术广泛应用为检测病毒基因组的诊断技术，其中普通及荧光PCR方法具有特异、敏感、简便、快速等优点，但是由于其高灵敏度，容易因非特异性扩增而出现假阳性，并且由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。HC2则是目前唯一获得美国FDA批准的，可以应用于临床的诊断方法。但该方法只能检测出样本中是否有HPV的感染，不能鉴定出具体的HPV病毒亚型，不利于临床跟踪检查和治疗。
高危型HPV DNA整合到宿主基因组将导致宿主细胞产生包括抑癌基因功能缺陷、激活癌基因、基因组不稳定性和细胞永生化等一系列不可逆的链式反应，是宫颈癌变的重要机制之一，其警示价值高于目前的一般HPV-DNA感染检测，但目前市售的试剂盒所采用的探针均缺少针对HPV整合情况的检测，此外目前已有的HPV检测膜条并未明确分区检测HPV，对于普通临床医生容易误诊，本发明针对以上2种对临床有重要意义的指标进行了检测和改进，使得临床HPV感染的检测更丰富，更精确，更实用，更有价值。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种可用于检测27种HPV亚型与人染色体整合状态的基因芯片：
一种检测人乳头瘤病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的人乳头瘤病毒检测探针，其特征在于，所述检测探针包括SEQ ID No.9-37的核苷酸序列：
HPV6：5’-AACTACATCTTCCACATACAC-3’(SEQ ID No.9)
HPV11：5’-GTCTAAATCTGCTACATACAC-3’(SEQ ID No.10)
HPV16：5’-ATTATGTGCTGCCATATCTACTT-3’(SEQ ID No.11)
HPV18：5’-ACAGTCTCCTGTACCTGGG-3’(SEQ ID No.12)
HPV31：5’-CCAATATGTCTGTTTGTGCTGC-3’(SEQ ID No.13)
HPV33：5’-GTACTAATATGACTTTATGC-3’(SEQ ID No.14)
HPV35：5’-GTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT-3’(SEQ ID No.15)
HPV39：5’-TATAGAGTCTTCCATACCT-3’(SEQ ID No.16)
HPV40：5’-CCCCACACCAACCCCATATAA-3’(SEQ ID No.17)
HPV42：5’-CATGACTTTGTGTGCCACTG-3’(SEQ ID No.18)
HPV43：5’-CGTTATGTGCCTCTACTGACC-3’(SEQ ID No.19)
HPV44：5’-CTACACAGTCCCCTCC-3’(SEQ ID No.20)
HPV45：5’-CTCTACACAAAATCCTGTG-3’(SEQ ID No.21)
HPV51：5’-CTGCTGCGGTTTCC-3’(SEQ ID No.22)
HPV52：5’-TTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG-3(SEQ ID No.23)
HPV53：5’-CGCAACCACACAGTCTATG-3’(SEQ ID No.24)
HPV54：5’-ACAGCATCCACGCAGG-3’(SEQ ID No.25)
HPV56：5’-CAGAACAGTTAAGTAAATATGAT-3’(SEQ ID No.26)
HPV58：5’-CACTGAAGTAACTAAGG-3’(SEQ ID No.27)
HPV59：5’-TTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA-3’(SEQ ID No.28)
HPV66：5’-TAATGCAGCTAAAAGC-3’(SEQ ID No.29)
HPV68：5’-TTTGTCTACTACTACTGAATCA-3’(SEQ ID No.30)
HPV70：5’-AACGGCCATACCTGCTGTATAT-3’(SEQ ID No.31)
HPV73：5’-TAGGTACACAGGCTAGTAG-3’(SEQ ID No.32)
HPV83：5’-GCTACACAGGCTAATGAATACACA-3’(SEQ ID No.33)
HPVmm4：5’-CACTGCTGTTACTCAATCTG-3’(SEQ ID No.34)
HPVCP8304：5’-GCTACATCTGCTGCT-3’(SEQ ID No.35)
GP：5’-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3’(SEQ ID No.36)
ALU：5’-AGCTACTCGGGAGGCTGAGGC-3’(SEQ ID No.37)
进一步地，所述固相载体优选为尼龙膜；所述检测探针的3’端具有氨基标记。
本发明的HPV常见亚型的特异性探针的设计是根据HPV L1区域，针对不同的亚型设计的与HPV DNA互补的核苷酸序列的检测探针(SEQ ID No.9-35)。上述的27种HPV亚型特异性探针，对应包括了22种高危及中危型HPV，5种低危型HPV和2种高危型HPV整合(HPV16/HPV18)。
SEQ ID No.36是针对人GAPDH基因的探针，由于该类引物对HPV的检测、特别是对多亚型感染的检测比较敏感，提高了HPV检测的准确性。
本发明中探针为3′氨基修饰探针(C7)，较5’氨基修饰探针能得到更好的杂交效果。
本发明中27种探针的Tm在42℃-55℃之间，相对比较均一，即27种亚型探针和对应的PCR产物杂交时最佳温度条件基本一致，有利于在同一杂交温度下以相近的效率同步结合，使检查的准确性大大增加。
在本发明的实施方案中，可以用一条窄线代替了一般采用的原点的点探针的方式，使得单位面积上的所载有的信息量大大增加。
本发明的基因芯片用以下方法制备而成：
(1)DNA探针的制备：合成与HPV DNA互补的3’末端经过氨基化的DNA片段；从HPV DNA的L1区域中挑选出特定的序列，根据碱基互补特点，设计并合成出3’末端经过氨基化的DNA片段；
(2)固定探针：将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上；先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针划在膜上，通过探针末端的氨基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固的将探针固定在膜上；
(3)制备基因芯片：利用NaOH停止反应，封闭未结合探针的表面负电荷基团，制得基因芯片。
本发明还提供了一种快速、高通量的检测样本中HPV各亚型的检测试剂盒，包括：
(i)基因芯片，固定于其上的检测探针为SEQ ID No.9-37的核苷酸序列；
(ii)检测用引物序列，用于扩增临床样本中的人乳头瘤病毒DNA序列，所述的引物序列为：
G1：5’-CARGGACATAAYAATGGYATTTGCTG-3’(SEQ ID No.1)
G2：5’-CARGGACATAAYAATGGYATTTGTTG-3’(SEQ ID No.2)
G3：5’-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCCTC-3’(SEQ ID No.3)
G4：5’-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCTTC-3’(SEQ ID No.4)
16：5’-CATGCGGGTGGTCAGGTAATAT-3’(SEQ ID No.5)
18：5’-CATTTTGGGAATAATGTAATTGATTGT-3’(SEQ ID No.6)
(iii)用于扩增临床样本中的人GAPDH基因，末端标记有生物素，其引物序列为：
GP1：5’-GCTTCTCTGCTGTAGGCTCATT-3’(SEQ ID No.7)
GP2：5’-GTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’(SEQ ID No.8)
(iv)人乳头瘤病毒专用裂解液，其成分为20mmol/Tris.HCL pH8.0，0.5％Triton-X-100，10％chelex-100；
(v)PCR反应液；
(vi)显色试剂。
进一步地，所述检测用引物序列的5’和3’端均带有生物素标记；所述PCR反应液包括：2X PCR Mix，20mM Tris-HCl(pH8.9)，50mM KCl，3mM MgCl2，0.4mM dNTPs，1mM DTT，10％glycerol，0.16％NP-40，0.1mM Tween-20，50U/mlTaq DNA polymerase。
本发明的HPV检测试剂盒中，HPV16/18与染色体整合扩增的引物为SEQ IDNo.5-6，可检测2种高危型HPV整合情况。
本发明的阳性对照为人GAPDH，其扩增引物为SEQ ID No.7-8，与HPV同时扩增，同时检测。
利用本发明所述的HPV检测试剂盒检测HPV感染，具体步骤如下：
(1)扩增样品：将临床样本中提取的DNA通过HPV基因分型检测试剂盒进行扩增，所用引物的5’和3’端均标记有生物素，扩增得到5’和3’端均带有生物素标记的DNA产物；
(2)杂交：将上述扩增得到的DNA与基因芯片上分布的DNA探针进行反应；
(3)显色：滴加显色试剂，肉眼直接观察结果。
本发明的用于检测HPV的试剂盒能够快速、准确的检测出HPV感染及鉴定具体的亚型，操作简单，灵敏度高，对于宫颈癌的早期诊断、预防、治疗和术后跟踪具有重大意义。
附图说明
图1是使用本发明的HPV检测试剂盒检测临床样本的结果图。
具体实施方式
实施例1：基因芯片的制备
根据世界范围内的HPV感染研究结果和国内的实际HPV感染情况，选出27种HPV亚型，包括22种高危型及中危型HPV，5种低危型HPV和2种整合型(16/18型)。针对每种HPV亚型，设计合成3’端带有氨基的特异性探针(SEQID No.9-37)。
将膜条按要求裁剪；浸泡于新鲜配制的EDAC溶液中30min；用蒸馏水洗膜3次，2min/次，在滤纸上晾干，将膜片固定在滤纸上；按照膜上的格子按顺序每格划探针3次；点好的膜于室温放置20min晾干；用0.5N NaOH浸泡膜条5min；弃去NaOH，用蒸馏水洗涤3次，2min/次；充分晾干后，干燥瓶内保存备用。
实施例2：样品制备
采用煮沸法制备和纯化临床样本中的DNA。
PCR反应体系为20ul，具体配方如下：
2X PCR Mix 10μl
Plus solution 2μl
SeqNo.1-2(100uM) 0.03μl
SeqNo.2-4(100uM) 0.03μl
SeqNo.5-6(100uM) 0.03μ1
去离子水 5.91μl
模板DNA 2ul
每次实验设立一个阴性对照，即以2ul无菌水为模板。
按以下条件进行扩增：
Stage1：94℃ 3min
Stage2：94℃ 20s
51℃ 1min
72℃ 30s
40cycles
Stage3：72℃ 2min
实施例3：HPV DNA检测
将实施例2中扩增得到的DNA样品用实施例1中制备的基因芯片进行杂交反应，最后根据显色情况进行判读，有显色的位置表示相应的HPV亚型。
1、杂交
取5ml离心管，标明患者编号，放入同样标有患者编号的膜条，加入3ml杂交液(0.3mol/L NaCl，10mmol/L NaH2PO4，2mmol/L EDTA，0.1％SDS，pH7.4)及PCR产物，沸水浴10min；51℃杂交1h。
取50ml离心管，加入40ml B液预热至51℃。
对照：取10ul PC加入阴性对照的杂交管中进行杂交，方法同上。
2、洗膜
取出膜条，移至装有预热洗膜液(75mmol/L NaCl，2.5mmol/L NaH2PO4，0.5mmol/L EDTA，0.1％SDS，pH7.4)的50ml离心管中，于51℃轻摇洗涤15min(每管40ml溶液，最多可同时洗涤5张膜)。
3、显色
用杂交液配制1∶2000的POD(过氧化物酶)溶液(五张膜条可用6ul POD母液，配制成12ml使用液)，室温轻摇浸泡30min，弃去POD溶液。用杂交液室温轻摇洗涤2次，5min/次。用0.1mol/L柠檬酸钠室温洗膜1-2min，同时新鲜配制显色液(19ml 0.1mol/L柠檬酸钠，1ml TMB，10ul 3％H2O2)。将膜条浸泡于显色液中避光显色5min左右可见斑点显现，将膜条浸泡于清水中结束显色反应，并于4℃保存。
4、结果判读
作为对照，在膜条的阳性质控PC位置会出现蓝色斑点，提示本次杂交、显色工作正常，此次结果判读视为有效。
结果见图1所示，
阳性质控：PC正常
高危型：HPV16/HPV33/
低危型：HPV42
整合型：HPV16
序列表
<110>济南艾迪康医学检验中心有限公司
<120>检测人乳头瘤病毒的基因芯片及试剂盒
<130>
<160>37
<170>PatentIn version 3.3
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<211>26
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gaaaaayaaa ctgyaaatca taytcctc 28
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cattttggga ataatgtaat tgattgt 27
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agctactcgg gaggctgagg c 21
Claims (6)
1.一种检测人乳头瘤病毒的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的人乳头瘤病毒检测探针，其特征在于，所述检测探针由SEQ ID No.9-37的核苷酸序列组成：
HPV6:5’-AACTACATCTTCCACATACAC-3’ （SEQ ID No.9）
HPV11:5’-GTCTAAATCTGCTACATACAC-3’ （SEQ ID No.10）
HPV16:5’-ATTATGTGCTGCCATATCTACTT-3’ （SEQ ID No.11）
HPV18:5’-ACAGTCTCCTGTACCTGGG-3’ （SEQ ID No.12）
HPV31:5’-CCAATATGTCTGTTTGTGCTGC-3’ （SEQ ID No.13）
HPV33:5’-GTACTAATATGACTTTATGC-3’ （SEQ ID No.14）
HPV35:5’-GTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT-3’（SEQ ID No.15）
HPV39:5’-TATAGAGTCTTCCATACCT-3’ （SEQ ID No.16）
HPV40:5’-CCCCACACCAACCCCATATAA-3’ （SEQ ID No.17）
HPV42:5’-CATGACTTTGTGTGCCACTG-3’ （SEQ ID No.18）
HPV43:5’-CGTTATGTGCCTCTACTGACC-3’ （SEQ ID No.19）
HPV44:5’-CTACACAGTCCCCTCC-3’ （SEQ ID No.20）
HPV45:5’-CTCTACACAAAATCCTGTG-3’ （SEQ ID No.21）
HPV51:5’-CTGCTGCGGTTTCC-3’（SEQ ID No.22）
HPV52:5’-TTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG-3（SEQ ID No.23）
HPV53:5’-CGCAACCACACAGTCTATG-3’ （SEQ ID No.24）
HPV54:5’-ACAGCATCCACGCAGG-3’ （SEQ ID No.25）
HPV56:5’-CAGAACAGTTAAGTAAATATGAT-3’ （SEQ ID No.26）
HPV58:5’-CACTGAAGTAACTAAGG-3’ （SEQ ID No.27）
HPV59:5’-TTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA-3’（SEQ ID No.28）
HPV66:5’-TAATGCAGCTAAAAGC-3’ （SEQ ID No.29）
HPV68:5’-TTTGTCTACTACTACTGAATCA-3’（SEQ ID No.30）
HPV70: 5’-AACGGCCATACCTGCTGTATAT-3’ （SEQ ID No.31）
HPV73:5’-TAGGTACACAGGCTAGTAG-3’ （SEQ ID No.32）
HPV83:5’-GCTACACAGGCTAATGAATACACA-3’（SEQ ID No.33）
HPVmm4:5’-CACTGCTGTTACTCAATCTG-3’ （SEQ ID No.34）
HPVCP8304:5’-GCTACATCTGCTGCT-3’ （SEQ ID No.35）
GP: 5’-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3’ （SEQ ID No.36）
ALU: 5’-AGCTACTCGGGAGGCTGAGGC-3’ （SEQ ID No.37）
2.如权利要求1所述的检测人乳头瘤病毒的基因芯片，其特征在于，所述固相载体为尼龙膜。
3.如权利要求2所述的检测人乳头瘤病毒的基因芯片，其特征在于，所述检测探针的3’端具有氨基标记。
4.一种用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，包括：
（i）如权利要求1-3之一所述的基因芯片；
（ii）检测用引物序列，用于扩增临床样本中的人乳头瘤病毒DNA序列，所述的引物序列为：
G1: 5’-CARGGACATAAYAATGGYATTTGCTG-3’ （SEQ ID No.1）
G2: 5’-CARGGACATAAYAATGGYATTTGTTG-3’ （SEQ ID No. 2）
G3: 5’-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCCTC-3’ （SEQ ID No.3）
G4: 5’-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCTTC-3’ （SEQ ID No.4）
16:5’-CATGCGGGTGGTCAGGTAATAT-3’ （SEQ ID No.5）
18: 5’-CATTTTGGGAATAATGTAATTGATTGT-3’ （SEQ ID No.6）
（iii）用于扩增临床样本中的人GAPDH基因，末端标记有生物素，其引物序列为：
GP1：5’-GCTTCTCTGCTGTAGGCTCATT-3’ （SEQ ID No.7）
GP2：5’- GTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’ （SEQ ID No.8）
（iv）人乳头瘤病毒专用裂解液，其成分为20mmol Tris.HCl pH8.0, 0.5%Triton-X-100,10%chelex-100；
（v）PCR反应液；
（vi）显色试剂。
5.如权利要求4所述的用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测用引物序列的5’和3’端均带有生物素标记。
6.如权利要求4所述的用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：2 X PCR Mix ，20 mM Tris-HCl ，pH8.9，50 mM KCl，3 mM MgCl2，0.4 mM dNTPs，1 mM DTT，10 % glycerol，0.16% NP-40，0.1mM Tween-20，50U/ml Taq DNA polymerase。
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