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CN101801405A - 包含于酸性水溶液中的gdf-5的蛋白质配方 - Google Patents

包含于酸性水溶液中的gdf-5的蛋白质配方 Download PDF

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CN101801405A
CN101801405A CN200880101944A CN200880101944A CN101801405A CN 101801405 A CN101801405 A CN 101801405A CN 200880101944 A CN200880101944 A CN 200880101944A CN 200880101944 A CN200880101944 A CN 200880101944A CN 101801405 A CN101801405 A CN 101801405A
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acid
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P·丹尼尔
A·C·森
苏东灵
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Abstract

本发明提供用于使骨形态发生蛋白的溶液稳定化的改进组合物和方法。所述组合物包含GDF-5和生物相容性酸如盐酸、乙酸、磷酸或三氟乙酸的水溶液，其中所述溶液的pH为约3.0至约3.6，从而使得GDF-5蛋白在低温下处理和长时间保存过程中的稳定性改进。

Description

包含于酸性水溶液中的GDF-5的蛋白质配方
技术领域
本发明涉及在低温下处理和长时间保存过程中具有改进的稳定性的骨形态发生蛋白液体组合物。更具体地讲，本发明涉及包含于pH为约3.0至约3.6的酸性溶液中的GDF-5、在低温下处理和长时间保存过程中具有改进的蛋白质稳定性的生物相容性液体组合物。
背景技术
GDF-5是骨形态发生蛋白(BMP)的一个成员，BMP是蛋白质的TGF-β超家族的一个亚类。GDF-5包括几种变体(variant)和突变体(mutant)，包括最初由Lee(美国专利No 5,801,014)从小鼠分离得到的mGDF-5在内。其他的变体包括：MP52，为GDF-5的人形式的专利名称(WO95/04819)，GDF-5的人形式也称hGDF-5，亦称LAP-4(Triantfilou等人，Nature Immunology 2，338-345(2001))；还有CDMP-1，为hGDF-5的等位基因蛋白质变体(WO 96/14335)；还有rhGDF-5，为在细菌中产生的重组人形式(EP 0955313)；还有rhGDF-5-Ala83，为rhGDF-5的单聚变体；还有BMP-14，为hGDF-5/CDMP-1样蛋白的统称；还有Radotermin，为世界卫生组织给出的国际非专有名称；还有HMW MP52，为MP52的高分子量蛋白质变体；还有C465A，为其中负责分子间交联的半胱氨酸残基被丙氨酸置换的单聚版本；还有其他的活性单体和单一氨基酸置换突变体，包括N445T、L441P、R438L和R438K在内。出于本申请的目的，术语“GDF-5”意在包括GDF-5蛋白的所有变体和突变体，其中rhGDF-5是具有119个氨基酸的示例性成员。
BMP家族的所有成员共享包括羧基末端活性结构域在内的共同结构特征，和共享高度保守模式的半胱氨酸残基，所述残基产生三个分子内二硫键和一个分子间二硫键。活性形式可为单个家族成员的二硫键键合同型二聚体，或者为两个不同成员的异型二聚体(参见Massague等人，Annual Review of Cell Biology 6：957(1990)；Sampath等人，Journal ofBiological Chemistry 265：13198(1990)；Celeste等人，PNAS 87：9843-47(1990)；美国专利No.5,011,691和美国专利No.5,266,683)。GDF-5蛋白的正确折叠和这些二硫键的形成对于生物机能是必要的，错折叠会导致产生无活性聚集体和切割片断。
从遗传修饰的细菌产生BMP(特别是产生GDF-5)是利用质粒载体来转化大肠杆菌，从而以高收率产生单体GDF-5蛋白(参见例如Hotten的US 6,764,994和Makishima的US 7,235,527)。所述单体从内含体获得，经过纯化，然后再折叠成GDF-5蛋白的同型二聚体，以产生GDF-5蛋白的生物活性二聚体。通向二聚体的各步骤利用到各种药学上不可接受的材料来修饰溶解度，以便能够分离和纯化GDF-5蛋白。
一般蛋白质的降解在文献中已有充分的记述，但是骨形态发生蛋白特别是GDF-5的保存和溶解度未得到充分的记述。当pH在6以下时，BMP-2在大于1mg/ml的浓度下都容易溶解，在pH 6以上时，可通过添加1M NaCl、30％异丙醇或0.1mM肝素提高溶解度(Ruppert等人，EurJ Biochem 237，295-302(1996))。GDF-5在生理pH的范围和缓冲液中几乎不可溶，在极端pH下仅可溶于水(Honda等人，Journal of Bioscienceand Bioengineering 89(6)，582-589(2000))。GDF-5在约9.5至12.0的碱性pH下可溶，但是在这些条件下蛋白质会快速降解，因此使用酸性条件来制备GDF-5蛋白。
GDF-5蛋白的生物相容性组合物对于在获得该蛋白质合理的溶解度的同时又获得稳定性提出了极大的挑战。现行的GDF-5蛋白保存方法是利用pH 2下的10mM HCl和-80℃进行长期保存，但即使是这些条件也会造成该蛋白质发生一定的降解，特别是在反复冷冻-解冻循环情况下。我们对GDF-5蛋白的迟洗脱物质(late eluting species)进行了胰蛋白酶消化，用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析发现了非胰蛋白酶酶切肽片断，这表明该蛋白质在保存过程中发生酸催化的切割并随后发生片断的聚集。我们还单独对GDF-5蛋白溶液进行相续的冷冻-解冻循环和长时间的高温暴露。这两个试验都表明该蛋白质在现行的10mM HCl保存溶剂中会发生降解。因此，需要用于处理和保存GDF-5蛋白溶液的改进的组合物。
发明内容
本发明提供用于在低温下处理和长期保存GDF-5溶液、使GDF-5蛋白的稳定性改进的组合物。通过将保存溶液的pH从2提高到约3，实现了GDF-5蛋白稳定性的显著改进，而又不会不利地影响该蛋白质的溶解度。合适的溶剂体系包括但不限于盐酸(HCl)、乙酸、三氟乙酸(TFA)和磷酸，用量为能提供约3.0至约3.6的pH的量。
附图说明
图1显示各种还原型和非还原型GDF-5组合物的SDS-PAGE分析。
图2显示各种GDF-5组合物的圆二色性分析。
图3显示用水进一步稀释的10mM HCl GDF-5储备溶液的圆二色性分析。
图4a显示于10mM HCl中的GDF-5的DSC谱图。
图4b显示于1mM HCl中的GDF-5的DSC谱图。
图4c显示于0.01％(v/v)TFA中的GDF-5的DSC谱图。
图4d显示于0.01％(v/v)磷酸中的GDF-5的DSC谱图。
图4e显示于0.01％(v/v)乙酸中的GDF-5的DSC谱图。
图5a显示于10mM HCl中的GDF-5参考标准的rp-HPLC色谱图。
图5b显示于10mM HCl中的GDF-5在5次冷冻-解冻循环后的rp-HPLC色谱图。
图5c显示于50mM乙酸中的GDF-5在5次冷冻-解冻循环后的rp-HPLC色谱图。
图5d显示于0.01％(v/v)TFA中的GDF-5在5次冷冻-解冻循环后的rp-HPLC色谱图。
图5e显示于1mM HCl中的GDF-5在5次冷冻-解冻循环后的rp-HPLC色谱图。
图6显示图5b-e中所示的各样品的峰1的变化百分数。
图7显示于12mM HCl中的GDF-5在室温下6天后的rp-HPLC色谱图。
图8显示GDF-5在室温下在不同溶剂中的降解倾向。
图9显示GDF-5在2-8℃下在不同溶剂中的降解倾向。
具体实施方式
我们研究了使用几种不同的溶剂体系，旨在改进GDF-5蛋白溶液在处理和保存过程中的稳定性，并在本文中描述了适用于这种蛋白质的可用组合物。自从发现了GDF-5并随后开发出其重组人形式以来，一直是将GDF-5于10mM HCl溶剂体系中-80℃下保存。GDF-5与被大量科学文献所报道的其他BMP(包括BMP-2在内)相比溶解度较差，这部分上是因为它缺乏糖基化。有关GDF-5的溶解度和稳定性的报道即使有也很少。从转化了质粒的细菌制备和分离GDF-5单体并随后使其再折叠成二聚体，这提出了与生物活性二聚体的处理和保存不同的一组难题和问题。另一方面，操作生物相容性组合物中的成熟二聚GDF-5蛋白，提出的是另外一组问题，而文献给出的关于GDF-5蛋白的溶解度和稳定性的物理化学信息极少。
本发明的一个目标是提供GDF-5蛋白于溶剂体系中的组合物，该组合物使得GDF-5蛋白在处理和保存过程中稳定性改进。本发明的另一个目标是提供在低温下长时间保存过程中稳定的GDF-5蛋白生物相容性溶液。本发明的另一个目标是提供在室温下处理过程中稳定的GDF-5蛋白生物相容性溶液。本发明的另一个目标是提供通过提供pH为约3.0至约3.6的溶剂体系来保藏GDF-5蛋白溶液的方法，其中GDF-5蛋白得到稳定化，对酸催化切割的敏感性降低，同时仍保持有用的溶解度。
出于本申请的目的，以下术语的定义会是有用的。术语“GDF-5”意在包括GDF-5蛋白分子的所有同义词、变体和突变体，包括但不限于GDF-5、mGDF-5、hGDF-5、MP-52、LAP-4、radotermin、CDMP-1、C465A和rhGDF-5，其中rhGDF-5这组中的示例性成员。术语“GDF-5”还理解为包括已被证实具有生物活性的单聚GDF-5蛋白。术语“室温”(本文缩写成“RT”或“R.T.”)理解为意指普通办公室或实验室的环境温度，为约18至约25℃。本文当涉及“本体蛋白质(bulk protein)”或“本体溶液(bulk solution)”时所用的术语“本体(bulk)”理解为意指GDF-5从生产过程分离和纯化后于10mM HCl中-80℃下保存的溶液，等同于术语“储备(stock)”、“储备蛋白质(stock protein)”和“储备溶液(stocksolution)”。
我们对本体GDF-5溶液进行了几个研究，以确定蛋白质降解的程度，和确定对用于处理和保存GDF-5蛋白的改进溶剂体系和条件的需求。我们在对从HEALOSTM矿物化胶原海绵(其加载GDF-5蛋白10mMHCl溶液后进行冻干)分离的GDF-5蛋白提取物的迟洗脱峰(聚集体)进行胰蛋白酶消化后，进行了MALDI-TOF分析。我们观察到非胰蛋白酶酶切片断，这表明GDF-5蛋白发生酸催化切割。
为了探索用于处理和保存GDF-5的改进组合物，我们研究了该蛋白质在以下五种不同溶剂环境中的物理化学特性：10mM HCl(现行用于本体蛋白质的溶剂体系)、1mM HCl、0.01％(v/v)乙酸、0.01％(v/v)TFA和0.01％(v/v)磷酸。在位于美国马萨诸塞州波士顿的Dana-Farber癌症研究所的Mass Spectrometry Core Facility进行了GDF-5蛋白的MALDI-TOF分析。将样品与芥子酸混合，点滴在不锈钢板上并让其干燥，然后在Voyager DE-STR质谱仪(Applied Biosystems，Framingham，MA制造)上以线性模式进行分析。发现由峰高分析估计到的聚集体百分数，在10mM HCl中为约23.5％，而在其余四种溶剂中为8-12％。在这个估计中，我们假定任何大于27kDa的物质团为聚集体。应指出的是MALDI并不是定量技术，因此每种溶剂中的聚集体绝对百分数只是近似值。尽管如此，数据清楚表明在10mM HCl中比在其他四种溶剂中有更大比例的聚集体。
我们在同一组溶剂体系中进行了GDF-5的SDS-PAGE分析。图1显示还原型和非还原型GDF-5在五种不同溶剂环境(10mM HCl、1mMHCl、0.01％(v/v)TFA、0.01％(v/v)乙酸和0.01％(v/v)磷酸)中的SDS-PAGE分析。在非还原凝胶中观察到少量的聚集体，而在还原凝胶中清楚表明存在着可能由酸切割产生的低分子量物质。没有观察到在五种不同溶剂环境中复水的GDF-5的迁移概况(migration profile)有显著差异。
我们还在同样的五种溶剂环境(10mM HCl、1mM HCl、0.01％(v/v)TFA、0.01％(v/v)乙酸和0.01％(v/v)磷酸)中进行了GDF-5蛋白的远紫外圆二色性(CD)分析。结果在图2中显示为叠加图，证明在10mM HCl中的GDF-5具有与在其他溶剂中的CD谱截然不同的独特CD谱。当将其余四种溶剂环境互相比较时，没有观察到GDF-5的二级结构分布有显著差异。在另一个实验中，用水稀释本体GDF-5溶液(3.8mg/mL，于10mM HCl中)以达到0.2mg/mL的期望蛋白质浓度并同时提高pH(通过稀释)，然后用水作为空白进行CD分析。CD谱在图3中显示，清楚表明GDF-5有微妙的依赖于pH的结构变化。与更低pH下的CD谱相比，在pH 3下GDF-5蛋白变得相对更加结构化，无规成分较少，β成分较多。
我们在同样的五种溶剂环境(10mM HCl、1mM HCl、0.01％(v/v)乙酸、0.01％(v/v)TFA和0.01％(v/v)磷酸)中对GDF-5蛋白进行了差示扫描量热分析(DSC)。图4a至4e显示在进行仪器基线和溶剂扣除和浓度归一化后的样品DSC热量数据。于10mM HCl中的本体GDF-5(图4a)显示弱的热转变，Tm＜30℃，还有接近65℃处的明显(broad)弱转变。热转移很差。相反，对1mM HCl(图4b)、0.01％(v/v)TFA(图4c)和0.01％(v/v)磷酸(图4d)透析的GDF-5蛋白显示出接近40℃处的大转变和接近85℃处的较小吸热转变。在0.01％(v/v)乙酸(图4e)中，结果显示以下两个转变显著增加：TM1～60℃和TM2～94℃。在0.01％(v/v)乙酸中，热力学参数即ΔH值和ΔS值也显著较高。这个结果提示，在乙酸环境中或者在较高pH下，GDF-5蛋白的热稳定性要高得多。在较早的研究中，我们注意到不能形成分子间二硫键的C465A单体没有显示接近40℃处的第一吸热作用，这提示这个转变代表两个单体单元之间的二硫化物相互作用。
在另一组实验中，我们证实于10mM HCl中的GDF-5即使进行少至两次冷冻-解冻循环，也会导致片断和降解产物大大增加，如rp-HPLC所显示。图5a显示本体GDF-5的参考标准的rp-HPLC色谱图，表明纯度良好，额外峰极少。图5b显示本体GDF-5在5次冷冻-解冻循环后的rp-HPLC色谱图，表明作为额外的峰(峰1和峰2)出现的片断增加。图5c显示于50mM乙酸中的GDF-5在5次冷冻-解冻循环后的rp-HPLC色谱图，表明作为额外的峰(峰1和峰2)出现的片断的增加即使有也很少。图5d显示于0.01％(v/v)TFA中的GDF-5在5次冷冻-解冻循环后的rp-HPLC色谱图，表明作为额外的峰(峰1和峰2)出现的片断的增加即使有也很少。图5e显示于1mM HCl中的GDF-5在5次冷冻-解冻循环后的rp-HPLC色谱图，表明作为额外的峰(峰1和峰2)出现的片断的增加即使有也很少。
图6显示直接比较仅仅峰1的变化的坐标图，显示出于10mM HCl中的GDF-5蛋白这个样品在仅仅2次冷冻-解冻循环后峰1就大约增加30％，而其他溶剂体系显示出在5次冷冻-解冻循环后峰1的变化也极小。在5次冷冻-解冻循环后，本体10mM HCl溶液的峰1的变化百分数大约为75％，而其他溶剂体系显示出峰1的变化非常小。
在另一组实验中，我们研究了各种溶剂体系在2-8℃温度下和在室温(RT，大约25℃)下对液体GDF-5蛋白溶液提供改进的稳定性的潜力。在这些实验中，在以下溶剂体系中通过rp-HPLC评估GDF-5蛋白的稳定性：1.3mM HCl、5mM HCl、12mM HCl、0.01％(v/v)TFA和50mM乙酸。通过用选定溶剂在2-8℃下透析过夜制备GDF-5蛋白溶液样品，并作为等分试样转移到小瓶中，约1mL/小瓶，然后相应地置于2-8℃下或室温下。在每个指定时间点，从每组取一个小瓶，于-80℃下保存以备进行分析。结果显示，GDF-5在50mM乙酸(pH 3.3)溶液和0.01％(v/v)TFA(pH 3.3)溶液中室温下三天后都稳定，在1.3mM HCl(pH 3.3)中两天后也稳定，但它在5mM HCl(pH 2.5)或12mM HCl(pH 2.1)中室温下两天后不稳定(参见图7和8)。
在2-8℃下，GDF-5蛋白在50mM乙酸溶液或0.01％(v/v)TFA溶液中稳定至少30天，在1.3mM HCl中稳定至少6天。与此对比，GDF-5蛋白在5mM HCl溶液和12mM HCl溶液中在2-8℃下发生降解，两天后形成降解物质，如rp-HPLC所证明(参见图9)。
以下实例实质上仅意在说明本发明，而非限制本发明的范围。本领域技术人员会容易想到也会被认为落入本发明范围内的其他实施方案。
实例1
对四种不同的溶剂体系，即1mM HCl、0.01％(v/v)乙酸、0.01％(v/v)TFA和0.01％(v/v)磷酸，试验了它们提供比现行使用的标准10mM HCl溶剂体系改进的GDF-5蛋白稳定性的能力。从刚解冻的样品获取大约1-2ml的本体GDF-5蛋白(3.8mg/ml)于10mM HCl中的溶液，在2-8℃下用试验溶液透析24小时(其中更换3次试验溶液，每次1升)，以产生GDF-5蛋白于四种不同溶剂体系的每一种中的溶液。透析液的浓度是从对于1mg/ml溶液和1cm光程长度使用1.16的消光系数于280nm处的吸光值进行确定。然后对GDF-5蛋白溶液进行SDS-PAGE、圆二色性(CD)、差示扫描量热(DSC)和MALDI-TOF分析。
SDS-PAGE
将GDF-5蛋白样品与(还原型)或不与(非还原型)50mM二硫苏糖醇(DTT)一起稀释于Bio-Rad 8-16％梯度凝胶适用样品缓冲液(厂商提供)中。将样品在90℃下加热5分钟进行变性，然后在5000rpm下稍作离心。在8-16％Bio-Rad criterion凝胶上，用1x tris-甘氨酸-SDS运行缓冲液，以恒定200伏进行电泳1小时。然后将凝胶在100mL 10％甲醇，7％乙酸(Ruby固定/脱色溶液)中在轨道式振荡器上45rpm温育1小时。倾析掉固定溶液，加入80mL Sypro-Ruby(Bio-Rad)。将凝胶在轨道式振荡器上45rpm黑暗温育过夜。倾析掉Sypro-Ruby，加入100mL脱色溶液。将凝胶在轨道式振荡器上45rpm温育3小时。最后，将凝胶在Bio-Rad Gel Doc成像系统上成像。
在非还原凝胶中观察到少量的聚集体，而在还原凝胶中清楚表明存在着可能由酸切割产生的低分子量物质。没有观察到在五种不同溶剂环境中复水的GDF-5的迁移概况(migration profile)有显著差异。
圆二色性
在AVIV型号60DS圆二色性分光偏振计上进行圆二色性分析。对于每个样品，在190和250nm之间进行扫描。对于每次扫描，以1nm间隔收集数据，每个间隔持续2秒钟。扫描温度为23℃。最终蛋白质浓度为0.2mg/mL。数据代表三次扫描的平均值。还在相同条件下纪录缓冲液空白，将该缓冲液空白的CD谱从样品的CD谱扣除。所有运行均用0.01％TFA作为空白来进行。比色皿的光程长度为1mm。各次扫描用平均残基重量(数值为115)代入以下方程式进行归一化：
[θ]＝[0.1×残基]/[浓度(mg/mol)×光程长度]。
在每个波长下计算[θ]值，以得出平均残基椭圆率(mean residueellipticities)。最后，用程序PROSEC v.2.1(AVIV Associates版权所有1987)进行二级结构的估计。
差示扫描量热分析
图4a至4e显示了GDF-5蛋白在五种不同溶剂环境中在进行仪器基线和溶剂扣除和浓度归一化后的DSC热量数据。将样品在-80℃下保存；解冻并在室温下真空下搅拌脱气8分钟，然后加载到DSC池中，在MicroCal VP-DSC上以60℃/小时的速度从5到100℃进行扫描，重复两次。所有样品的蛋白质浓度均为0.51mg/mL。于10mM HCl中的本体GDF-5显示弱的热转变，Tm＜30℃，还有接近65℃处的明显弱转变。热转移很差。相反，对1mM HCl、0.01％(v/v)TFA和0.01％(v/v)磷酸透析的蛋白质显示出接近40℃处的大转变和接近85℃处的较小吸热转变。在0.01％乙酸中，结果显示以下两个转变显著增加：TM1～60℃和TM2～94℃。在0.01％乙酸样品中，热力学参数即ΔH值和ΔS值也显著较高。这个结果提示，在乙酸环境中或者在较高pH下，蛋白质的热稳定性要高得多。我们在较早的研究中注意到不能形成分子间二硫键的C465A单体没有显示接近40℃处的第一吸热作用，这提示这个转变代表两个单体单元之间的二硫化物相互作用。
MALDI-TOF：
在位于美国马萨诸塞州波士顿的Dana-Farber癌症研究所的MassSpectrometry Core Facility进行了于五种不同溶剂环境中的完整蛋白质的MALDI-TOF分析。将样品与芥子酸混合，点滴在不锈钢板上并让其干燥，然后在Voyager DE-STR质谱仪(Applied Biosystems，Framingham，MA制造)上以线性模式进行分析。在任何这些溶剂中，没有观察到主要二聚体以及其他更高寡聚体物质的重均分子量的显著差异。所有五个谱图的27kDa峰都归一化成100％相对强度。发现由峰高分析估计到的聚集体百分数，在10mM HCl中为约23.5％，而在其余四种溶剂中为8-12％。在这个估计中，我们假定任何大于27kDa的物质团为聚集体。应指出的是MALDI并不是定量技术，因此每种溶剂中的聚集体绝对百分数只是近似值。尽管如此，数据清楚表明在10mM HCl中比在其他四种溶剂中有更大比例的聚集体。
总的来讲，各种结果结合起来表明，在四种不同溶剂体系的每一种中，试验的GDF-5蛋白都在系列稀释中具有良好的线性，且显示出比10mM HCl组合物改进的稳定性。
实例2
尝试评估了GDF-5于20mM乙酸中的溶解度。用3,500切割分子量的膜，将GDF-5于10mM HCl中的储备溶液(3.8mg/mL)对20mM乙酸进行透析，然后进行冷冻干燥，最后将干燥的物质团在20mM乙酸中复水。于280nm处测定OD。注意到，容易获得澄清溶液，于20mM乙酸中有约6.5mg/mL GDF-5。在另一个试验中，将于20mM乙酸中的GDF-5蛋白进行冷冻干燥，然后在1mM HCl中复水。同样于280nm处测定OD，结果表明可容易获得澄清溶液，GDF-5蛋白浓度约6.5mg/mL。
实例3
通过在不同的保存溶剂中进行五次冷冻/解冻循环评估GDF-5蛋白的稳定性，所述保存溶剂包括1mM HCl、10mM HCl、0.01％(v/v)TFA和50mM乙酸。将GDF-5于10mM HCl中的本体溶液从-80℃取出，在2-8℃下解冻。然后用选定的溶剂将GDF-5蛋白溶液在2-8℃下透析过夜(透析盒：Pierce，目录号66380，10000切割分子量)。将透析样品转移到小瓶中，约1mL/小瓶，置于-80℃下。在每次冷冻/解冻循环中，将试验样品在-80℃下冷冻至少19小时，然后在室温下解冻至少5小时。在每次循环结束时，每个溶剂样品取出一个小瓶，保存在-80℃下以备分析，使得所有的样品都在同一时间进行视觉外观、rp-HPLC、紫外光谱和pH的分析。
检查玻璃小瓶中的试验样品的澄清度和颗粒。样品小瓶是对着黑色背景用垂直光线进行检查。将试验样品的澄清度与纯水样品进行比较。所有样品看来都澄清和透明；GDF-5蛋白在五次冷冻/解冻循环后在3.6mg/mL的浓度下仍可溶。
使用非还原rp-HPLC方法来监测GDF-5蛋白含量和降解物质。简单地讲，用1mM HCl将试验样品稀释成0.1mg GDF-5/mL，将稀释的样品(50μl)直接注射到HPLC柱(Vydac 218TP52，C18柱)上，该柱子用0.15％(v/v)TFA水溶液和0.15％(v/v)TFA乙腈溶液作为流动相进行洗脱。在214nm处监测洗脱峰。将峰面积与参考标准面积进行比较，确定GDF-5蛋白含量。计算每个峰面积的百分比，以监测主峰和小峰(降解峰)的变化。
图5a-e中显示代表性色谱图。各图中标出GDF-5的主峰和其他降解峰。在所有保存条件下，都没有观察到样品蛋白质浓度的显著变化。GDF-5在1mM HCl溶液、50mM乙酸溶液和0.01％(v/v)TFA溶液中稳定，在五次冷冻/解冻循环后主峰100％恢复。但是，GDF-5在10mM HCl溶液中不够稳定，因为在第二次冷冻/解冻循环后峰1剧增(参见图6)。
还通过紫外光谱法测定蛋白质含量。分析前，将试验样品用适当的溶剂稀释。GDF-5的浓度是在280nm下用1.16mL/mg*cm的消光系数计算。紫外结果表明在研究过程中所有样品的蛋白质浓度都没有显著变化。由紫外光谱法和HPLC法测出的蛋白质浓度相似。样品的pH是不经稀释直接用经校准的pH计测量。所有样品的pH都稳定，保存条件没有使pH偏移。
结果表明，GDF-5在1mM HCl溶液、50mM乙酸溶液和0.01％(v/v)TFA溶液中在五次冷冻/解冻循环后稳定。与此对比，GDF-5在10mMHCl溶液中不够稳定，在第二次冷冻/解冻循环后开始形成降解物质。
实例4
在本实例中，评估GDF-5蛋白在不同的酸性溶剂中长时间暴露于2-8℃温度以及室温(大约25℃)的稳定性，所述酸性溶剂包括1.3mMHCl、5mM HCl、12mM HCl、0.01％(v/v)TFA和50mM乙酸。将GDF-5于10mM HCl中的本体溶液从-80℃取出，在2-8℃下解冻。然后用选定的溶剂将GDF-5蛋白溶液在2-8℃下透析过夜(透析盒：Pierce，目录号66380，10000切割分子量)。将透析样品作为等分试样转移到小瓶中，约1mL/小瓶，并相应地置于2-8℃或室温下。在每个指定时间点，从每组取一个小瓶，于-80℃下保存，以备使用rp-HPLC、紫外光谱法和pH计进行分析。
结果显示，GDF-5在50mM乙酸(pH 3.3)溶液和0.01％(v/v)TFA(pH3.3)溶液中室温下稳定三天，在1.3mM HCl(pH 3.3)中稳定两天，但它在5mM HCl(pH 2.5)或12mM HCl(pH 2.1)中室温下不稳定。在2-8℃下，GDF-5蛋白在50mM乙酸溶液或0.01％(v/v)TFA溶液中稳定至少30天，在1.3mM HCl中稳定至少6天。与此对比，GDF-5在5mM HCl溶液以及12mM HCl溶液中在2-8℃下快速降解，在6天内形成降解物质，如HPLC所证明(参见图9)。用HCl进行的研究在第6天结束。
已参照具体的实施例对本发明进行了描述，不过，用于提高GDF-5蛋白溶液的pH的方法和手段的变化方案和修改方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这种变化方案和修改方案意在落入所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种组合物，包含于pH为约3.0至约3.6的酸性水溶液中的GDF-5和生物相容性酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述pH为约3.2至约3.4。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物相容性酸选自由盐酸、乙酸、磷酸和三氟乙酸组成的组。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述生物相容性酸是以约1.0至约1.3mM的量存在的盐酸。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述生物相容性酸是以约20至约50mM的量存在的乙酸。
6.一种使GDF-5蛋白的溶液稳定化的方法，包括以下步骤：
a.提供于pH为约3.0至约3.6的酸性水溶液中的GDF-5样品和生物相容性酸，和
b.将所述GDF-5溶液冷却到约2°至约8℃的温度。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述溶液进一步冷却到约-20℃。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述溶液进一步冷却到约-80℃。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述GDF-5是rhGDF-5。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述GDF-5是rhGDF-5，所述生物相容性酸是1mM盐酸。
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