CN101809144A

CN101809144A - 生产流感病毒的方法

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Publication number: CN101809144A
Application number: CN200880108968A
Authority: CN
Inventors: C·格迪尔; C·莫斯特; I·勒加斯特洛伊斯; M·巴布洛特; F·-X·勒格罗斯
Original assignee: Meriaal Ltd; Sanofi Pasteur SA
Current assignee: Meriaal Ltd; Sanofi Pasteur SA
Priority date: 2007-09-26
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2028-09-26
Also published as: BRPI0817247A2; ES2541551T3; EP2195420A2; US7871807B2; RU2484136C2; KR101744014B1; EP2195420B1; US20110212129A1; US20090081255A1; FR2921387A1; CN101809144B; MX2010003202A; AR068541A1; IL204361A; TWI485247B; ZA201001480B; AU2008313576B2; FR2921387B1; CA2700288C; WO2009050390A3

Abstract

本发明涉及生产流感病毒的方法，其包括：a)向母鸡给药流感疫苗；b)收集接种疫苗的母鸡的鸡蛋；c)触发胚胎发生过程；d)通过在尿囊腔内接种流感病毒而感染含胚鸡蛋；e)在允许病毒复制的温度和湿度条件下孵化感染的含胚鸡蛋；和f)收集含有病毒的尿囊液。

Description

生产流感病毒的方法

本发明涉及用于生产流感病毒的方法，其使用来自于经免疫抵抗流感的母鸡的鸡蛋，以及本发明还涉及这类方法用于制造流感疫苗的用途。

目前已知三类流感病毒(A、B和C)，其中A型病毒引起动物和人类的病症，而B型和C型病毒则特别地对于人类是致病性的。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原结构，A型病毒被细分为一些亚型，其中所述血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是病毒包膜的主要糖蛋白。存在有16种HA亚型(H1～H16)和9种NA亚型(N1～N9)。因此，A型病毒的亚型是由在病毒包膜上存在的HA亚型和NA亚型所限定的。野生禽类构成了所有A亚型流感的仓库(reservoir)。某些A型流感病毒的亚型地方性地或流行性地(年度流行病)感染家禽(各种亚型包括H5N1和H9N2)、马(主要是H3N8)、猪(主要是H1N1，H3N2和H1N2)以及人类(主要是H1N1和H3N2)。狗、猫和其他野生物种也能够偶尔被某些亚型所感染(在狗中为H3N8和H5N1；在猫中为H5N1)。

在兽医领域中，饲养家禽，更具体地小鸡、雏鸡、母鸡和公鸡代表了最易于受到流感病毒影响的群体数目。H5和H7亚型的禽流感株可以是两种病变型的：低病原性(或LP)病变型和高病原性(或HP)病变型。HP株引起禽流感，并且衍生自LP株H5和H7在突变/插入之后，特别是在血凝素切割位点(存在多个碱性氨基酸)。到目前为止，严格的卫生措施和正规的控制在农场中是强烈推荐的，以防止禽流感，以及特别是H5和H7亚型的感染。

在人类中，推荐免疫接种抵抗季节性流行的病毒株，这些病毒株引起传染病，这些传染病根据年份或多或少严重的。大多数目前的疫苗是使用含胚鸡蛋进行生产的，其中这些鸡蛋被感染三种不同的流感病毒株(具有H3N2和H1N1亚型的两种A型流感病毒株，和一种B型病毒株)。使用来自还未被针对流感进行免疫的母鸡的含胚鸡蛋以防止任何可能损害病毒复制的干扰现象。事实上，已知的是，母体的抗体在鸡蛋中一段时间后会转移给小鸡，并保护它们在生命的头几天免于微生物感染，但如果这些小鸡被提前针对微生物试剂进行免疫，同时仍然存在针对该试剂的保护性母体抗体，则这些抗体会引起免疫缺陷。H.Stone等(1992，Avian Dis.36：1048-1051)已经显示新生小鸡可以通过接种来自鸡蛋的卵黄被动地免疫抵抗新城疫病(maladie de Newcastle)，其中所述鸡蛋来自于针对新城疫病病毒(NDV)进行免疫的母鸡。然而，如果给药鸡蛋黄之后，小鸡使用NDV病毒进行免疫，则观察到针对疫苗的免疫应答的降低。根据Hamal等(2006，Poultry Science 65：1364-1372)的研究，还已知保护性母体抗体向新生小鸡的转移比率，特别是针对NDV病毒或感染性支气管炎病毒(IBV)的抗体的转移比率为30％～40％(在三天大的小鸡的血液中循环的母鸡血浆的抗体量的百分比)，这表明大量的母体抗体在鸡蛋中被隐蔽(séquestrés)。这得到了J.R.Beck等(2003，Avian Dis.47：1196-1199)研究的确认，其显示了在使用灭活流感病毒株对母鸡进行免疫后大约3星期，所有的鸡蛋都含有抗-HA抗体。最后，根据Fontaine等(1963，Pathobiologie，11/9：611-613)的研究已知如果含胚鸡蛋被接种抗-流感血清，则这些鸡蛋被保护抵抗流感病毒感染。所有这些原因都已经引导本领域技术人员考虑如果使用来自已经被针对流感进行免疫的母鸡的鸡蛋，则由于将母体针对流感的抗体转移入鸡蛋中，所述鸡蛋将不能产生流感病毒。

自进入21世纪起，随着高感染性和致病性禽流感病毒株的出现，家禽农场中禽流感所造成的经济损失就一直没有停止过增长，这些禽流感病毒杀死了全部饲养家禽，或者在不太严重的情况中，使得被感染的母鸡停止产卵。高度致病性病毒株的HA分型显示它们几乎所有都具有H5或H7亚型。目前担心具有H5或H7亚型的病毒株会适应人类，并且可能在人类中引起实际的流感大流行；已经报道了牵涉这些亚型的经确实分离的严重人类流感病例。

面对这样的风险，即鸡蛋的供应可能不再能确保用于制造流感疫苗，新的生产抵抗流感的疫苗的方法目前被指向使用细胞培养系统。

发明内容

虽然新的用于生产流感疫苗的方法，然而还需要能够在任何情况下在短期内并且以很大的数量生产流感病毒用于制造流感疫苗。本发明通过描述了一种生产流感病毒的方法满足了该需要，出乎意料地，该方法基于使用来自于预先针对流感进行免疫的母鸡的鸡蛋。

事实上，本发明的主题涉及：

生产流感病毒的方法，根据该方法：

a.向母鸡给药流感疫苗，

b.从经免疫的母鸡获得鸡蛋，

c.触发胚胎发生过程，

d.通过将流感病毒接种入尿囊腔中来感染含胚鸡蛋，

e.在允许病毒复制的温度和湿度条件下孵化被感染的含胚鸡蛋，和

f.收获包含病毒的尿囊液。

优选地，疫苗保护母鸡抵抗禽流感。

典型地，流感疫苗在它的组合物中含有呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素。

按照一个方面，流感疫苗的组合物包含灭活的完整流感病毒。

按照另一个方面，流感疫苗的组合物包含来源于完整流感病毒的产品。

按照另一方面，疫苗的组合物还包含佐剂。

在另一个方面，流感疫苗的组合物包含减毒的流感病毒。

按照另一种方式，流感疫苗含有载体，所述载体含有编码流感病毒的血凝素的基因。

优选，载体是痘病毒。

在一个具体的方面中，所述载体还含有编码流感病毒的神经氨酸酶的基因。

按照另一方面，疫苗的组合物还包含佐剂。

按照本发明方法的一种实施方式，包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有不同的亚型。

按照另一种实施方式，包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有相同的亚型。

按照另一种实施方式，包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素是一致的。

按照另一种实施方式，包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的流感病毒与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒是一致的。

在特别优选的实施方式中，包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有H5、H6、H7或者H9亚型。

在另一个特别优选的实施方式中，包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有H5或者H7亚型。

在具体的方面中，本发明的方法包含纯化病毒的附加步骤。

在另一个具体的方面中，本发明的方法包含灭活病毒的附加步骤。

本发明还涉及使用本发明的方法获得的流感疫苗。

本发明的主题还是本发明的方法用于制造用于防止流感的疫苗的用途。

在具体的方面中，使用本发明的方法用来制造用于防止人类的大流行性流感的疫苗。

在另一个具体的方面中，使用本发明的方法用来制造用于防止人类的流行性流感的疫苗的用途。

本发明还涉及用于防止人类中流感病毒流行株感染或者流感病毒大流行株感染的方法，其中所述方法包括为人类给药有效量的使用本发明的方法获得的流感疫苗。

在另一方面具体的方面中。使用本发明的方法用来制造用于防止在马科、猪科、犬科、猫科、鼬科和禽类物种中的流感的疫苗。

本发明还涉及防止在选自马科、猪科、犬科、猫科、鼬科和禽类物种的动物中的流感的方法，其中所述方法包括向动物给药有效量的使用本发明的方法获得的流感疫苗。

本发明的主题还是来自针对流感进行免疫的母鸡的鸡蛋用于生产流感病毒的用途。

按照优选的方面，使用来自针对流感进行免疫的母鸡的鸡蛋用于制造流感疫苗。

最后，按照最后的方面，使用来自针对流感进行免疫的母鸡的鸡蛋用于生产流感病毒或者制造流感疫苗，根据该用途，鸡蛋包含针对流感病毒的血凝素的抗体，特别地鸡蛋包含针对具有H5、H6、H7或者H9亚型的流感病毒的血凝素的抗体。

发明的详细说明

措词″流感病毒或流感的病毒″表示产生自野生型菌株的流感病毒和产生自重配株(souche réassortante)的流感病毒二者，其中所述重配株是通过一种或更多种野生型株与″主体(master)″株的基因组区段重配产生的，其中所述主体株由于其在鸡蛋中的强生长能力而被选择。重配株获得″主体″株的特征但是保持至少野生型株的HA和NA的特征，这意味着重配株的HA和NA的蛋白质序列与野生型株的HA和NA的蛋白质序列之间的同一性为至少95％，优选至少98％，更优选至少99％，并且甚至更优选100％，其通过完整序列比较程序测定的。重配株可以通过将敏感细胞共感染野生型株和主体株，随后通过用于选择期望的重配株的适当手段而获得。它还可以通过反向遗传学由来自野生型株和″主体″株核酸核酸，并在多质粒表达系统中表达而获得，如在WO01/83794和WO03/091401和Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96：9345-9350(1999)中所述的。在高病原性株例如H5和H7株的情况中，可以进行对含有多个碱性氨基酸的切割位点进行修饰以赋予重配株低病原性。

为了语言的方便，术语″疫苗株″或者″疫苗病毒″被无差异进行使用以表示用来制造流感疫苗的流感病毒；类似地，术语″感染株″或者″感染病毒″用来表示用于感染生物材料(鸡蛋、动物)的流感病毒。

而且，术语″来自经免疫的母鸡的鸡蛋″用来表示受精母鸡的鸡蛋，其来自预先被免疫并且接触到公鸡的母鸡。

通常，被用来免疫母鸡的流感疫苗可以是由任何流感病毒株制造的。疫苗株可能是A型病毒，也可以是B或者C型病毒。当它是A型病毒株时，病毒可以是任何HA亚型和/或任何NA亚型。例如它可以是具有H1N1或者H3N2亚型的病毒株，其目前引起A型流行性流感。

一旦当免疫赋予抵抗禽流感的保护，利用流感病毒免疫母鸡的好处是重要的。

禽流感可能被忽略过去或者可以通过一组现象而被表征，通常为呼吸和/或肠内等级的，或大或小强度的特征，禽流感会或多或少地削弱母鸡的整体状况，并且在病毒株高度致病性时禽流感会导致动物死亡。禽流感通常导致产卵活性的降低或者甚至消失。属于H6N2或者H9N2或者甚至H5或者H7亚型的低病原性病毒株引起轻微形式的禽流感，通常导致产蛋量的降低或者消失，但是没有大的死亡率。相反地，属于H5和H7亚型高病原性病毒株(特别地H5N1、H5N2、H5N9、H7N1、H7N4或者H7N7)是高度病毒性的并且在母鸡农场中引起很高的死亡率。

HA是在针对流感的保护性免疫的产生中关键的抗原。用于本发明的方法的疫苗在它的组合物中至少包含呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的HA。

术语″基因″的意思是对应于开放阅读框(phase ouverte de lecture)并且编码蛋白质的核苷酸序列。在表达调控序列(启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子等)控制下的基因被插入到载体的核酸(特别地质粒或者病毒)中，这些调控序列可以是是那些通常与开放阅读框(内源序列)相关的那些，或者来自不同起源(外源序列)。

其可以是人类流感病毒株的HA，但其对于母鸡不是致病性的。优选，其包含所关心的HA，即与引起禽流感的病毒株(期望免疫抵抗该病毒株并保护母鸡)的HA具有相同的亚型。优选，存在于疫苗中的HA的蛋白质序列和期望保护母鸡所抵抗的株的蛋白质序列之间同一性为至少80％，优选至少90％，并且甚至更优选至少95％，其通过整体序列比较程序(例如Blast程序)测定的。

通常，含有HA的疫苗是包含灭活的完整流感病毒的组合物形式的，或者为来源于灭活的完整流感病毒的产品。

表达″来源于灭活的完整病毒的产品″的意思是灭活的(即非传染性的)疫苗组合物，其是从病毒株制备的并且至少包含所述病毒株的HA。来源于完整病毒株的产品可以是片段化(或者分裂的)病毒，并且在这种情况下被称为″分裂的(splitté)″疫苗。另一个来源于完整病毒株的产品是该本身株的HA，或者同样地与通过使用提取和纯化方法获得的NA有关，并且在这种情况下被称为″亚单位″疫苗。HA也可以被再次结合到病毒体中。含有灭活的完整流感病毒的疫苗组合物或者来源于灭活的完整病毒的产品也可以包含一种或更多种助剂或者佐剂制剂。作为非限制性佐剂制剂的实例，可以提到油包水或水包油乳剂，例如

乳剂(Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach由M.Powell和M.Newman编辑，Plenum Press，1995第183页)，基于脂质体的制剂，以及基于MPL的制剂(Vaccine Design-The Subunit and AdjuvantApproach由M.Powell和M.Newman编辑，Plenum Press，1995第1186-187页)，基于Avridine的制剂(Vaccine Design-The Subunit and AdjuvantApproach由M.Powell和M.Newman编辑，Plenum Press，1995第148页)，基于二甲基双十八烷基溴化铵的制剂(Vaccine Design-The Subunitand Adjuvant Approach由M.Powell和M.Newman编辑，Plenum Press，1995第157页)，基于小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)的制剂，基于皂角苷的制剂，基于溶血卵磷脂的制剂，基于泊洛沙姆衍生物的制剂(Hunter H.等1991，vaccine，9：250-256)(Vaccine Design-The Subunit andAdjuvant Approach由M.Powell和M.Newman编辑，Plenum Press，1995第200页和第297-311页)，基于铝盐的制剂，或基于它们的组合的制剂(Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach由M.Powell和M.Newman编辑，Plenum Press，1995第249-276页)。优选，油包水乳剂是由液体石蜡构成的，由亲水性表面活性剂例如聚山梨酸酯80或聚山梨酸酯85构成的，以及由亲脂性表面活性剂例如油酸失水山梨糖醇酯或三油酸失水山梨糖醇酯构成的。在母鸡中使用的乳剂的实例描述于下列中：Stone等(1983，Avian Dis.，27：688-697；1993；Avian Dis.，37：399-405；1991，Avian Dis.，35：8-16)；M.Brugh等(1983，Am.J；Vet.Res.，44：72-75)；WoodwardL.等(1985，Vaccine，3：137-144)；(Vaccine Design-TheSubunit and Adjuvant Approach由M.Powell和M.Newman编辑，PlenumPress，1995第219页)。疫苗株通常来自于野生型株，其已经在母鸡、火鸡、鸭、鹅或在其他禽类物种中得到分离，最通常这种株对于母鸡是低病原性的。作为用于制备保护母鸡抵抗禽流感的亚型H5或H7的疫苗的分离物(野生型株)的例子，提到的是A/火鸡/威斯康星/68或A/小鸡/意大利/22A/98分离物(具有H5N9亚型病毒株)，A/火鸡/英格兰/N-28/73，A/小鸡/墨西哥/238/94/CPA，A/小鸡/墨西哥/232/94/CPA或A/鸭/波茨坦/1402/86分离物(具有H5N2亚型的病毒株)，A/鹅/广东/1/1996分离物(具有H5N1亚型的HP病毒株)，A/小鸡/意大利/AG-473/1999或者A/小鸡/意大利/1067/1999分离物(具有H7N1亚型的病毒株)，A/小鸡/巴基斯坦/95分离物(具有H7N3亚型的HP株)，以及A/鸭/波茨坦/15/80分离物(具有H7N7亚型的病毒株)。作为用于保护家禽抵抗H9亚型禽流感的H9N2病毒株的实例，可以提到的是A/小鸡/伊朗/AV12221/98和A/小鸡/UAE/415/99分离物。作为用于保护母鸡抵抗H6亚型禽流感的H6N2病毒株的实例，可以提到的是A/火鸡/意大利/90分离物。用于制造疫苗的疫苗株还可以是野生型株的重配株，特别的是通过反向遗传学获得的。特别地，可以提到的是Re-1疫苗株，其是通过反向重组H5N1野生型株A/鹅/广东/1/96与“主体”株A/PR/8/34而获得的重配株，其在鸡蛋中非常好地再生产(Tian等，2005，Virology，341：153-162)。通过反向遗传学获得的重配株的另一个实例是通过遗传重配获得的H5N3株，其含有A/小鸡/越南/C58/04 H5N1株的H5血凝素，A/鸭/德国/1215/73 H2N3株的神经氨酸酶，以及A/PR/8/34“主体”株的内部基因(Webster等，2006，Virology，351：301-311)。

针对禽流感的疫苗通常含有单一灭活流感病毒株的病毒(单价疫苗)，但在某些情况中，有利的是使用含有多种灭活流感病毒株的多价疫苗。特别地，其是基于H7N1和H5N9株的疫苗，其为含有A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)和A/小鸡/意大利/1067/1999(H7N1)的灭活疫苗株的水包油乳剂。灭活的疫苗还可以含有不同的效价，例如抗H9N2禽流感和新城疫病的二价疫苗。通常，通过肠胃外(肌内或者皮下)给药所述灭活的疫苗。它们还可以以喷剂的形式给药，如在Investigacion Aplicada销售的Aerovac AI疫苗情况中，其含有灭活的疫苗株A/小鸡/墨西哥/232/94/CPA(H5N2)。免疫方案通常包括一次或者间隔2～4周的两次给药。所给药的疫苗剂量根据动物的年龄而变化，但通常包含在灭活前具有10⁸～10¹⁰EID₅₀/ml滴度的10～200μl尿囊液的等同物。通常在0.05～1ml范围内的体积中给药所述疫苗剂量。灭活禽流感疫苗的制备描述于H.Stone(1987，Avian Dis.31：483-490)。在疫苗株HA亚型与引起致病性禽流感的株的HA亚型相同，以及基于约80％～90％的通过整体序列对比程序测定的两种HA的蛋白质序列之间的同一性的情况下，所获得的抵抗禽流感临床症状(发病率和死亡率)的保护率通常大于80％，优选大于90％。这是通过M.Bublot等，2007，Avian Dis.51：332-337的研究确认的，该研究显示疫苗株HA的蛋白质序列与致病性感染株HA的蛋白质序列之间约80％～90％的同一性程度足以获得该保护率。此外，为了获得该保护率，疫苗株的HA亚型不必要与致病性感染株的NA亚型相同。此外，禽流感疫苗大大地降低了病毒在用感染性病毒攻击的经免疫动物中的排泄，这是通过口腔和泄殖腔样品中观察到的病毒负载的非常明显降低得到证实(M.Bublot等，2007，Avian Dis.51：332-337)。禽流感疫苗的另一个有利的效果是降低病毒在母鸡农场中的扩散。

按照本发明的方法的另一种实施方式，用于免疫母鸡的疫苗是含有减毒流感病毒株的组合物形式的。疫苗株通常是重配株(réassortant)形式的，其在表达所关心的HA和次要地表达所关心的NA的野生型株与已经冷适应和/或对温度敏感的″主体″株之间进行遗传重配后进行挑选。该重配株(réassortant)是在它的表面表达所关心的HA和次要地表达NA的病毒株，同时保持″主体″株的表型特征，其中所述″主体″涉及它仅在低于鸟内部温度的狭窄温度限制内的复制能力。结果，疫苗株在已经给药于母鸡之后会以有限地和局部地复制。获得这些重配株的方法对本领域技术人员是公知的，并且特别地描述在WO 03/091401与WO2006/063053中，以及在Wareing M.D.等，2002，Vaccine 20；2082-2090中。通常通过喷雾法进行疫苗的给药。另一种生产减毒株的方法是截短编码NS1蛋白质的基因(Richt J.A.等，Vaccination of pigs against swineinfluenza viruses by using an NS1-truncated modified live-virus vaccine，2006，J.Virol.，80：11009-18；Quinlivan M.等，Attenuation of equineinfluenza viruses through truncations of the NS1 protein，2005，J.Virol.，79：843 1-9)。

可以以任何方式生产疫苗株，通过使用在细胞如Vero细胞、MDCK细胞、PER.C6细胞或者小鸡胚细胞(CEK，PCJ)的培养技术和/或使用传统的在含胚鸡蛋上生产的方法。用于收获、纯化和根据所述情况下的灭活病毒的方法也是本领域技术人员所公知的。

根据本发明的另一种实施方式，疫苗是以在体外表达系统中产生的蛋白质的形式。例如HA可以在使用重组杆状病毒的表达系统在昆虫细胞中产生(Crawford J.等，Baculovirus-derived hemagglutinin vaccinesprotect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes，1999，Vaccine，17：2265-74)。血凝素还可以在体外以“病毒样颗粒”(VLP)的形式表达(Prel A.等，Assessment of the protection afforded by triplebaculovirus recombinant coexpressing H5，N3，M1 proteins against ahomologous H5N3 low-pathogenicity avian influenza virus challenge inMuscovy ducks，2007，Avian Dis.，51：484-9；Pushko P.等，Influenzavirus-like particles comprised of the HA，NA，and M1 proteins of H9N2influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice，2005，Vaccine，23：5751-9)或者以基于反转录病毒的假模标本的形式表达(Szecsi J.等，2006，Virol.J.，3：70)。体外生产的蛋白质或者所产生的病毒颗粒被或多或少地纯化，随后用各种佐剂进行辅助，诸如在灭活疫苗中所使用的那些。

根据本发明方法的另一个实施方案，流感疫苗包含载体，所述载体含有编码流感病毒HA的核酸片段。

术语″载体″是指核酸结构，其可以在生物体、细胞或者细胞组分中增殖和/或转移到生物体、细胞或者细胞组分中。特别地，这包括质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬粒与人工染色体，其能够自主复制，或者其能够整合到宿主细胞的染色体中。

表达″含有编码流感病毒的HA和/或NA的基因的载体″理解为其含有编码所关心的HA和/或NA的核酸，并且其在引入到禽类细胞之后，能在该细胞中表达HA和/或NA的核酸的载体。其可以是表达所关心的HA的质粒，但其通常是病毒载体，该病毒载体在其基因组中包含编码所关心的HA并且能在受感染细胞中表达所关心的HA的核酸。编码HA的核酸整合到病毒载体的基因组中通常是通过分子生物学技术进行的，特别地通过遗传重组、克隆、反向遗传学等等。HA可以或者不可以在病毒载体的表面上表达。优选，病毒载体已经通常通过多次体外传代进行减毒，或者通过缺失某些基因而被减毒，以便载体病毒在禽类细胞中的复制被充分地限制并且对母鸡的整体状况没有影响，因此被认为是不致病的。作为病毒载体的例子，可以提到的是禽类副粘病毒(Ge J.，等，Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protectschicks and mice from lethal challenge of homologous and heterologousH5N1 avian influenza viruses，2007，J Virol.，81：150-8)；火鸡疱疹病毒(HVT)或者马立克氏病(Marek’s disease)疱疹病毒(Sondermeijer等，1993，Vaccine，11，349-358)；传染性喉气管炎病毒(ILTV)(Veits J.，等，Deletionof thenon-essential UL0 gene of infectious laryngotracheitis(ILT)virusleads to attenuation in chicks，and UL0 mutants expressing influenza virushaemagglutinin(H7)protect against ILT and fowl plague，2003，JGen.Virol.，84：3343-52；LuschowD.等，Protection of chicks from lethalavian influenza A virus infection by live-virus vaccination with infectiouslaryngotracheitis virus recombinants expressing thehemagglutinin(H5)gene，2001，Vaccine，19：4249-59)；腺病毒(Francois A.等，Avian adenovirus CELO recombinants expressing VP2 of infectiousbursal disease virus induce protection against bursal disease in chickens，2004，Vaccine，22：2351-60；Gao W.等，Protection of mice and poultry fromlethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization，2006，J Virol.，80：1959-64；Toro H.等，Protective avian influenza in ovovaccination with non-replicating human adenovirus vector，2007，Vaccine，25：2886-91)；冠状病毒(Cavanagh，2007，Vet Res.38：281-97；Eriksson，2006，Clin.Dev.Immunol.13：353-60)，但优选使用痘病毒用于免疫母鸡，特别是牛痘病毒，NYVAC(缺失牛痘病毒)，牛痘病毒MVA株，特别是禽痘(avipoxes)，尤其是金丝雀痘，ALVAC(减毒金丝雀痘)，鸽子痘，鹌鹑痘，火鸡痘，麻雀痘和最特别地家禽痘(fowl pox)，TROVAC(减毒的家禽痘)，其特别地被描述于AU 701599B、AU 701781B和US 5,756,103中。如果需要，减毒的病毒载体仅表达所关心的HA：特别地，其是含有表达H5N8流感病毒株(A/火鸡/爱尔兰/1378/83)的HA的TROVAC家禽痘载体的疫苗。在其他的情况中，减毒的病毒载体同时表达所关心的HA和所关心的NA的组合，例如描述于2003，Avian Pathology，32：25-32的重组痘病毒，其同时表达来源于H5N1流感病毒株的HA和NA。所关心的NA是这样的NA，其通常与寻求免疫并保护母鸡抵抗的病毒株的NA具有相同的亚型。在其他情况中，减毒的载体表达多种属于不同亚型的所关心的HA，正如在MingXiao M.等，2006，Vaccine，24：4304-4311所描述的重组痘病毒的情况中，其同时表达H5和H7亚型。通过向其引入编码发挥免疫刺激能力的细胞因子和/或趋化因子(如IL-1，IFN，CSF，GM-CSF，IL-2，IL-12，IL-18或者TNF5)的基因可以进一步增强这些载体的免疫原性能力(Vaccine，(2006)，24：4304-4311)。基于编码流感病毒HA的疫苗还可以被辅助(adjuvés)以提高它们的免疫原性。

特别地，根据载体，可以通过各种途径给药含有病毒载体的疫苗组合物：例如借助或不借助针通过肌内、皮下或者透皮路线刺穿翅基膜(痘病毒载体)(任何载体)，通过卵内路线(在17-19天含胚鸡蛋中；例如HVT/Marek与腺病毒载体)，通过眼睛或者口鼻路线，通过喷雾，或者在饮用水中(副粘病毒、冠状病毒、腺病毒载体)，通过一次注射或者间隔至少15天的分开两次注射。对于家禽痘载体而言，所给药的疫苗剂量是大约1～7个log₁₀50％感染单位，其中优选2～4个log₁₀的剂量。与使用灭活或者减毒完整流感病毒的传统免疫相比，基于病毒载体的免疫的优点存在于这样的事实，即可以将所免疫的动物与受到感染的动物区分开。此外，利用病毒载体的免疫促进了细胞免疫的产生，这能够增强对动物的保护。正如在Avian Dis.，(2007)，51：325-331和Avian Dis.，(2007)，51：498-500中所述的，在母鸡中所获得的保护程度以及在家禽农场中病毒扩散的降低与利用含有灭活流感病毒的传统疫苗所观察到的大致相等。

如果对母鸡的免疫包括多次注射，则在首次给药中使用的疫苗可以与在第二次注射或者后续注射中所使用的疫苗不同。可以使用两种不同的减毒病毒载体，例如在第一次免疫中使用表达所关心的HA的重组ALVAC载体，以及在后续免疫中使用表达所关心的相同HA的重组TROVAC或者NYVAC载体，以便针对ALVAC载体的抗体应答不阻止用重组TROVAC或者NYVAC的载体感染母鸡细胞并因此阻止在感染的细胞中HA的表达。还可以使用“初始-增强(prime-boost)”方法，其包括在首次注射中使用表达HA的减毒的病毒载体，在所述一次或多次增强注射中使用含有例如一种或者更多种灭活疫苗株的疫苗，所述灭活疫苗株与在首次免疫中所使用的HA属于相同的亚型，或者，以相反的顺序进行。最后，可以在首次注射中使用表达所关心的HA的质粒进行DNA免疫，随后使用含有灭活疫苗株和/或减毒病毒载体的疫苗进行增强注射，其中所述灭活疫苗株和/或减毒病毒载体表达与在首次免疫中所使用的HA属于相同亚型的HA，或者与首次免疫中所使用HA相同的HA。

无论给药何种类型的疫苗或者采用何种免疫方案，通常在给药疫苗剂量后7～18天的时间内都可以相当快速地为母鸡提供抵抗禽流感的保护。然而，为了确保在它们整个产卵活性期(大约持续1年)内保护母鸡抵抗禽流感，推荐在首次疫苗给药后，在3～16周的期间内进行一次或者两次增强接种。许多利用灭活疫苗的接种方案可以用于产卵的母鸡中：例如2次注射，首次在3～6周大时进行第一次，在刚好在开始产卵之前16～19周大时进行第二次；或者3次注射，在大约2～4周时进行第一次，3～4周之后进行第二次，以及刚好在开始产卵之前16～19周大时进行第三次。在产卵过程中给药增强剂。在使用两种不同的疫苗的“初始-增强”方案中，可以在第一天大时用基于禽痘载体的疫苗对小鸡进行免疫；随后它们接受用含有灭活流感病毒进行的一次免疫(在正好在开始产卵之前的16～19周大时)，或者两次免疫(在第3～6周大时，以及在正好在开始产卵之前的16～19周大时)

在实施本发明的方法时，优选从这些母鸡获取鸡蛋一次，确保保护母鸡抵抗禽流感，所述保护通常在给药疫苗后7～18天的期间内发生(Bublot M.等(2006，Annals of the New York Academy of Sciences1081：193-201)；Van der Goot等(2005，Proc.Natl.Acad.Sc.，102：18141-6)；Ellis等(Avian Pathol.2004，33，405-412))。

尽管在来自经免疫母鸡的鸡蛋中存在流感病毒，尤其是针对HA的抗体，特别是存在抑制血凝的抗体(IHA)(其阻断流感病毒渗入敏感细胞中)，但用于从来源于经免疫抵抗流感的母鸡的含胚鸡蛋生产流感病毒的方法是常规的。使用来自优选已经在可控环境中喂养9天～14天的经免疫母鸡的含胚鸡蛋。以下列方式控制胚胎发生过程：使用已经在10～20℃之间，优选16～18℃之间的温度下通常不超过产卵后一周时间保存的鸡蛋。通过在潮湿室中在37.5℃±1℃的温度下孵化鸡蛋9～14天而触发胚胎发生过程，其中所述潮湿室具有70±10％的相对湿度。通过透照验蛋来挑选含胚鸡蛋，并且利用在小体积(大约0.1～0.2ml)的通常为2～7个log₁₀TCID₅₀的病毒剂量感染它们的尿囊腔。在温度下(其也可以根据病毒株的表型以及它们的冷适应或者热适应的程度而变化)使病毒扩增一段时间(通常为1～4天，这取决于病毒株的毒力)。用于流感病毒扩增的温度通常在28～39℃的范围内，并且通常为在33～39℃的温度范围内。随后收获感染性尿囊液，并且根据期望进行的的用途而进行处理。

这种方法可以用于生产流感病毒，其HA亚型与在用于免疫母鸡的疫苗中所包含的HA的亚型不同。例如其为这样一种情况：利用灭活病毒H5N9对母鸡进行免疫以保护母鸡抵抗H5禽流感的情况，而来自这些母鸡的鸡蛋被感染H1N1或者H3N2流感病毒，或者甚至B型流感病毒，以制备抵抗目前人类流感流行形式的疫苗。根据本发明方法的变型，通过使用来自经免疫母鸡的含胚鸡蛋而生产的流感病毒的HA亚型具有与用于免疫母鸡的HA不同的亚型，但另一方面，所生产的流感病毒的NA与疫苗中所使用病毒的NA具有相同的亚型。例如其为这样一种情况：用灭活H5N1病毒株或表达H5和N1的重组痘病毒免疫母鸡以保护母鸡抗禽流感，而来自经免疫母鸡的含胚鸡蛋被感染H1N1病毒株。

根据本发明方法的另一个模式，在来自经免疫母鸡的含胚鸡蛋上生产的流感病毒的HA具有与在用于免疫母鸡的疫苗中所含有的HA相同的亚型。例如其为这样的情况：利用灭活H5N1病毒或表达H5的重组痘病毒免疫母鸡，而来自经免疫母鸡的鸡蛋被感染H5N1或者H5N9流感病毒。尽管在鸡蛋中存在“亚型”特异性交叉反应性的抗HA抗体(当在疫苗组合物中含有的HA具有与感染来自经免疫母鸡的含胚鸡蛋的流感病毒株的HA相同的亚型时，其为这样情况)，其对病毒的复制没有负面影响。

更加令人吃惊地，在用于感染来自经免疫母鸡的含胚鸡蛋的流感病毒与用于免疫这些母鸡的流感病毒之间存在完全同一性的情况中，这种复制未受到影响。在这种情况中，这一点表现为在鸡蛋中存在更宽的一系列抗HA抗体，因为同时发现亚型特异性交叉反应性抗HA抗体和该株的非常特异性的抗HA抗体(也成为株特异性抗体)(参见实施例3)。因此，与广泛建立的观点不同，抗流感抗体在鸡蛋中的存在，特别是抗HA抗体的存在不影响流感病毒的复制。在来源于鸡蛋(该鸡蛋来自于已经针对流感进行免疫的母鸡)的被感染的尿囊液中收获的病毒和/或血凝抗原的量与在来源于产自未经免疫母鸡的鸡蛋的被感染的尿囊液中收获的量大致相同(参见实施例1和2)。

还可以利用本发明的方法用于制造重配病毒株。在这种情况中，在第一步骤中，用野生型病毒株和主体病毒株共感染来自经免疫母鸡的含胚鸡蛋，其中所述主体病毒株在含胚鸡蛋中复制良好，例如A/PR/8/34株。在第二步骤中，收集被感染的尿囊液，其基本上含有重配株和主体株的混合物，而较差复制能力的野生型株通常是非常少量的。随后通过连续克隆步骤(在每个克隆步骤中混合根据本领域技术人员公知的方法收获的具有对A/PR/8/34特异性的抗-HA和抗-NA抗体的感染性尿囊液)，进行选择同时表达A/PR/8/34株的表型特征(即它在含胚鸡蛋中良好的复制能力)以及野生型株的HA和NA的重配株。为了获得减毒活病毒疫苗，还可以制造冷适应和热敏感重配株。在这种情况中，在第一步骤中，用野生型病毒株和主体株(其具有冷适应和热敏感的表型特征)共感染来自经免疫母鸡的含胚鸡蛋。在这种情况中，用于孵化被感染鸡蛋的温度比正常温度低(该温度通常低于35℃，或者甚至低于30℃)。在第二步骤中，收集基本上含有重配株和主体株的混合物的被感染的尿囊液，因为冷敏感性的野生株未被复制。随后通过连续克隆步骤(在每个克隆步骤中混合根据本领域技术人员公知的方法收获具有对主体株特异性抗-HA和抗-NA抗体的感染性尿囊液)，进行选择同时表达主体株表型特征(尤其是冷适应和/或其热敏感性)和野生型株的HA以及NA的重配株。

最重要的，进行本发明的方法用于制备疫苗，所述疫苗用于保护饲养的母鸡，以及更通常地饲养的家禽(鸭、火鸡、鹅等等)抵抗禽流感。在禽流感的无症状或温和形式中所牵连的病毒株可以是任何亚型的，特别是H9N2、H6N2、H7N2、H7N3或H7N1亚型。它们在饲养群体中不引起大的死亡率，但是可以是产蛋暂时减少的原因。在引起在饲养群体中大的死亡率的禽流感严重形式中所牵连的高病原性病毒株通常属于H5和H7亚型，特别是H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N1、H7N3、H7N4或H7N7。

通常，包含于在本发明方法步骤a)中用来使免疫母鸡抵抗禽流感的疫苗组合物中的流感病毒的血凝素，与用于在方法的步骤c)中感染含胚鸡蛋的病毒的血凝素具有相同的亚型，并特别地选自H5、H6、H7和H9亚型，因为它们是主要地在引起禽流感的病毒株中发现的那些。

在具体的方面中，包含于在本发明方法步骤a)中用来免疫母鸡抵抗禽流感的疫苗组合物中的流感病毒的血凝素，与在方法的步骤c)中用于感染含胚鸡蛋的病毒的血凝素具有相同的亚型，并选自H5和H7亚型，因为它们是在引起禽流感和人流感严重形式的病毒株中发现的那些。已经被表征的引起禽流感和/或人流感的严重形式的病毒株通常属于H5N1、H5N2、H7N1、H7N3或H7N7亚型。

如此，非常具体地，本发明的主题是：

用于生产流感病毒的方法，根据该方法：

a.利用灭活的完整流感病毒免疫母鸡，其中病毒的血凝素具有H5或H7亚型，

b.从经免疫的母鸡获得鸡蛋，

c.触发胚胎发生过程，

d.通过将与用于免疫的流感病毒一致的流感病毒引入含胚鸡蛋的尿囊腔中来感染所述含胚鸡蛋，

e.在允许病毒复制的温度和湿度的条件下孵化感染的含胚鸡蛋，和

f.收获包含病毒的尿囊液。

当母鸡免疫方案考虑两次注射时，可以利用疫苗组合物(其包含载体(通常为痘病毒)代替灭活的完整的流感病毒，其中所述载体包含编码H5或H7亚型流感病毒的血凝素的基因)进行第一次注射.

当感染的尿囊液用于生产流感疫苗时，本发明的方法通常包括额外的净化病毒株步骤，以及任选地在其之后或之前有病毒灭活步骤，该灭活步骤使用如在FR 2201079或在FR 1538322中所描述的那些本领域技术人员公知的技术。

纯化可以是简化的并且可以限定为在通常已经澄清感染的尿囊液后通过离心浓缩病毒的步骤。纯化可以被补充有区带离心步骤，其例如借助蔗糖密度梯度进行(EP 07760362)。也可以进行层析法以纯化病毒。如此获得包括在灭活的完整疫苗或减毒疫苗组合物中的纯化的完整病毒的悬浮液。

通过传统的方式进行病毒悬浮液的灭活，其使用β-丙醇酸内酯(E.Budowsky等1991，Vaccine，9：319-325；1991，Vaccine，9：398-402；1993，Vaccine，11：343-348)、吖丙啶或者衍生物(D.King 1991，AvianDis.35：505-514)或者甲醛(EP07760362).

可以利用一种或者更多种佐剂配制基于灭活的完整病毒的疫苗组合物。虽然通常这些疫苗可以利用铝盐或在油包水或水包油乳剂中进行配制(在禽流感疫苗的情况中)，但通常使用由液体石蜡、亲水表面活性剂例如聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯83或聚山梨酸酯85以及亲脂表面活性剂例如脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯或脱水山梨糖醇三油酸酯组成的油包水乳剂。可以使用任何能增加针对流感的体液和/或细胞应答的佐剂。作为佐剂配方的非限制性例子，可以提到的是乳剂，基于脂质体的制剂、基于MPL的制剂、基于小棒状杆菌的制剂、基于皂角苷的制剂、基于溶血卵磷脂的制剂、基于泊洛沙姆衍生物的制剂、或者他们的组合。

纯化的病毒悬浮液还可以经历后续处理。因此，获得了流感病毒衍生的产品。例如，可以使用去污剂或者脂类溶剂根据本领域技术人员公知的方法对病毒悬浮液进行片段化以制造例如含有流感病毒的血凝素的基于片段化或分裂的病毒的疫苗、病毒体或者亚单位疫苗。从纯化的病毒获得的片段化或者分裂的病毒、含有流感病毒的血凝素的病毒体和含有流感病毒的血凝素的亚单位疫苗被认为是流感病毒衍生的产品。类似地，可以利用一种或者更多种佐剂配制含有这些衍生产品的疫苗。

通过本发明方法获得的疫苗用于保护人类和动物抵抗流感。

在兽医领域，疫苗主要用于禽流感防治领域，但其也可以用于防止或者减少流感症状和/或在马科成员特别是马、犬科成员特别是狗、猫科成员特别是猫、猪科成员特别是猪、貂科成员特别是貂和雪貂和禽类物种特别是母鸡、鸭、火鸡、鹌鹑、珠鸡、鹅和鸵鸟中的病毒排泄物。当疫苗组合物包含灭活完整病毒株或衍生产品时，它通常被皮下或肌内或任选地以喷雾材料

的形式在饲养家禽群体中给药。当疫苗以减毒活病毒的形式时，则其通常通过口鼻、通过喷雾、在饮用水中或者作为眼睛的滴液进行给药。免疫方案通常考虑用于注射或者在注射后进行增强。所给药的疫苗剂量取决于动物的尺寸和年龄。通常含有20～200μl尿囊液，其在灭活之前具有10⁸～10¹⁰EID₅₀/ml的滴度，以0.05～1ml之间的体积进行注射。

在人类中，疫苗用于流行性流感和大流行性流感预防领域。虽然流行性流感影响已经通过接触(通过感染)或者免疫接种一种或者更多种流感病毒株而敏化的人类群体(对于所述流感病毒，与引起流行的病毒株的HA存在抗原性联系(parentéantigénique)，并在所述流感病毒中，存在某些免疫性)，但大流行性流感影响未被新病毒株敏化的人类群体(即使其仅仅是部分有效的)，因为这种新株的HA与现有循环的病毒株没有或几乎没有抗原性联系。

流行性流感疫苗是用于保护人类群体以抵抗季节性流感形式，这些季节性流感形式是由季节性循环流感病毒株引起的，所述季节性循环流感病毒株与现有已经循环的病毒株具有抗原性联系。目前，引起流行性流感的流感病毒株(其为流行性流感病毒株)是A型的，并且属于H1N1或者H3N2亚型，或者是B型的。

大流行性流感疫苗是用于保护人类群体抵抗大流行性流感病毒株的感染，其中所述大流行性流感病毒株是新型的流感病毒株，就HA而言，其没有与现有循环的病毒株的抗原性联系。

流行性或者大流行性流感病毒可以是减毒活疫苗或者灭活疫苗的形式，尽管优选灭活疫苗用于预防大流行性流感。疫苗可以为单价疫苗(从单种流感病毒株制备的疫苗)，或者是多价疫苗(从多种流感病毒株制备的疫苗)形式。流行性流感疫苗的组合物目前是三价疫苗形式的，其是从H3N2和H1N1株和从B型病毒株制备的。通常，灭活疫苗通常是完整病毒、片段化病毒(分裂病毒)或者病毒体或者含有HA的亚单位形式，以及任选地含有一种或者更多种佐剂(如上面所提到的那些)。虽然，通常通过口腔或者鼻途径给药减毒活疫苗，以促进粘膜免疫性的产生，但还可以肠胃外(肌内或者皮下)、皮内或者甚至经粘膜(甚至鼻内)或者甚至通过组合两种不同的给药路线(如在WO01/22992中所描述的)而给药。免疫方案通常考虑注射或者在注射后进行增强。所给药的疫苗剂量依赖于个体的年龄，依赖于存在或者不存在佐剂。通常，疫苗剂量含有15μg包含于疫苗中的各种疫苗株的HA的等同物。在对疫苗进行佐剂化时，该剂量可以降低到大约1～2μgHA，或者在患有免疫缺陷的或年长的个体中提高至30μgHA或者甚至更多。

最后，本发明的主题是：

来自针对流感经免疫的母鸡的鸡蛋用于生产流感病毒或者用于制造流感疫苗的用途。与广泛建立的观点相反，在来自经免疫母鸡的鸡蛋中存在针对流感病毒的血凝素的抗体不影响在感染它们的尿囊腔之后产生的流感病毒量。

下面的实施例以非限制性方式描述了本发明的各种实施方式。

图1表示了供体质粒pJY1394.1的完整核苷酸序列。

图2表示在供体质粒pJY1394.1中插入的核苷酸序列，其包含侧翼插入基因座F8的臂，以及H6牛痘启动子，之后为在编码A/小鸡/印度尼西亚/7/03株的HA的切割位点被修饰的合成基因。

这些序列的各个起点如下：

1-53：克隆质粒的部分序列，其包含M13F引物的序列(下划线)。

54-1483：侧翼TROVAC家禽痘载体基因组中F8插入基因座的″左臂″序列

1484-1568：左臂和H6启动子之间的连接序列。

1569-1692：牛痘病毒H6启动子的序列。

1693-3387：A/小鸡/印度尼西亚/7/03株的经修饰的合成HA基因序列；氨基酸序列是使用每个氨基酸一个字母代码在核苷酸序列上面所显示的。

3388-3414：HA基因和右臂之间的连接序列，其含有禽痘早期基因的TTTTTAT转录终止序列。

3415-4790：侧翼TROVAC家禽痘载体基因组中F8插入基因座的″左臂″的序列。

4791-4885：克隆质粒的部分序列，其包含M13F引物的序列(下划线)。

实施例1：生产两种疫苗株的方法，这两种疫苗株为A/新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)和A/纽约/55/04(H3N2)，其用于使用来自母鸡的含胚鸡蛋制备抵抗人类流行性流感的疫苗，其中所述母鸡已经通过两次注射含有禽流感病毒株A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)的灭活疫苗而被免疫，或者通过注射编码H5N1株的HA的重组禽痘病毒随后再第二次注射含有禽流感病毒株A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)的灭活疫苗而被免疫

1.1)操作规程

1.1.1)重组载体vFP2211的构建

vFP2211是重组家禽痘病毒，在其基因组中已经插入了编码A/小鸡/印度尼西亚/7/03H5N1株的血凝素(HA)的合成基因。合成HA基因以便获得开放阅读框，其编码与GenBank核苷酸序列数据库中以参考号EF473080(或者Genpept蛋白质序列数据库以参考号ABO30346)描述的A/小鸡/印度尼西亚/7/03株的天然序列(除了切割位点之外)一致的氨基酸序列。利用RE----TRG序列置换位于位点339和347之间的RERRRKKRG氨基酸序列(对应于高病原性株的切割位点)。如此所修饰的该切割位点对应于亚型H5的低病原性株的切割位点。

在第一步骤中，构建了包含合成HA基因的供体质粒，该合成HA基因在H6牛痘启动子的控制下进行修饰(Taylor J.等，Vaccine，1988，6：504-508；Guo P.等，J.Virol.，1989，63：4189-4198；Perkus M.等，J.Virol.，1989，63：3829-3836)并且由F8插入基因座的侧翼臂围绕以允许将HA基因插入到禽痘载体基因组的F8插入基因座中。F8插入基因座对应于Srinivasan和Tripathy(2005，Veterinary Microbiology 108：215-223)所描述的编码光解酶的禽痘基因；该基因还以名称FPV158描述于禽痘基因组的完整序列中(GenBank，参考号AF198100)。将HA基因和H6启动子插入到F8基因座中结果是从重组禽痘病毒基因组缺失FPV158基因。质粒pJY1394.1的完整核苷酸序列以及一系列围绕HA基因的核苷酸序列(其也存在于质粒的完整序列中)被分别描述在图1和2中。

随后通过质粒pJY1394.1的侧翼臂和禽痘基因组之间的双重组(double recombinaison)而获得重组病毒vFP2211。为此，使用利用NotI线性化的质粒pJY1394.1转染原代小鸡胚原始细胞，并用亲代禽痘株(TROVAC载体)感染(感染强度为10)。TROVAC载体衍生自由Merial生产的在小鸡中抵抗禽痘的Diftosec的疫苗株。通过在裂解斑上用检测所插入HA基因的探针的特异性杂交来选择重组病毒。进而在旋转的瓶子中，在小鸡胚细胞上产生了分离的vFP2211。

1.1.2)灭活H5N9疫苗的制备

根据等同于H.Stone(1987，Avian Dis.31：483-490)所描述的方法，制备了灭活的H5N9疫苗，其由低病原性A/小鸡/意大利/22A/98 H5N9株(Ilaria Capua实验室(Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie，Laboratorio Virologia，padova，意大利)提供)和油包水乳剂构成，其中所述低病原性A/小鸡/意大利/22A/98H5N9株是在含胚鸡蛋上生产的并且用β-丙酸醇内酯(BPL)灭活，所述油包水乳剂由液体石蜡、脱水山梨糖醇油酸酯和聚山梨酸酯80构成。乳剂的表面活性剂混合物的HLB(亲脂亲水平衡)具有5.3的数值。疫苗剂量等同于在灭火之前具有10^8.9EID₅₀/ml滴度的60μl尿囊液。

1.1.3)使产卵的母鸡免疫

形成两组(G1和G2)1天(0天)Leghorn类型小鸡，其具有“无特异病原组织”(EOPS)状态。随后将下面的免疫方案应用于组G1：1天(0天)小鸡在颈部的底部皮下接受(使用胰岛素注射器)0.2ml vFP2211病毒悬浮液(其具有3.0log₁₀CCID₅₀/0.2ml滴度)。在8周大(S8)时，使小鸡交配。将大约25只小母鸡和16只公鸡饲养并集合在一起。在17周大(S17)时，它们接受增强注射在0.5ml的单价灭活H5N9疫苗体积中的疫苗剂量。

将下面的免疫方案应用于组G2：使用胰岛素注射器通过在胸骨中IM途径，3周大的EOPS小鸡接受在0.3ml单价灭活H5N9疫苗体积中的疫苗剂量。在8周大(S8)时，使小鸡交配。将大约25只小母鸡和16只公鸡饲养并集合在一起。在17周大(S17)时，它们接受增强注射0.5ml体积的单价灭活H5N9疫苗体积的疫苗剂量。

1.1.4)利用A/新喀里多尼亚/20/99 IVR-116(H1N1)或者A/纽约/55/04X-157(H3N2)病毒株感染来自组G1和G2的母鸡的鸡蛋以及来自未免疫母鸡的鸡蛋的规程

在来自组G1的母鸡的鸡蛋(其是在40～41周(测试2)和49～50周(测试3)大时产下的)中在来自组G2的母鸡的鸡蛋(其是在26～27(测试1)、40～41(测试2)和49～50周(测试3)大时产下的)中，评估了重配疫苗株A/新喀里多尼亚/20/99(xPR8)(称为A/新喀里多尼亚/20/99 IVR-116(H1N1))和A/纽约/55/04(xPR8)(称为A/纽约/55/04 X-157(H3N2))复制的能力。平行地，以相同的方式在来自未免疫SPE母鸡(对照组)的对照鸡蛋中评估病毒株A/新喀里多尼亚/20/99(xPR8)(H1N1)和A/纽约/55/04(xPR8)(H3N2)复制的能力。

将在该星期内产下的所有鸡蛋都保存在控制温度的室内(12～15℃)。将来自相同动物组和相同测试的鸡蛋合并在一起，随后在37～38℃以每在相对湿度为大约70～80％的室内孵化鸡蛋10天而触发胚胎发生过程。在孵化10天后，借助透照验蛋装置确认各个鸡蛋中胚胎的成活力，并且用十字叉标出尿囊腔。将来自相同动物组的相同测试的含胚鸡蛋通过8个鸡蛋组合(pools de 8 oeuf)进行合并。在对蛋壳消毒和穿孔之后，而使用在十字叉的位置以200μl体积注射的相同感染剂量的流感病毒感染相同组合的含胚鸡蛋。对10²，10³和10⁴EID₅₀(50％鸡蛋感染剂量)的A/新喀里多尼亚/20/99(xPR8)(H1N1)和A/纽约/55/04(xPR8)(H3N2)病毒的感染剂量进行测试。在测试1和2的鸡蛋中测试每个鸡蛋10³和10⁴EID₅₀的感染剂量。在测试3的鸡蛋中测试每个鸡蛋10²和10³EID₅₀的感染剂量。随后，在相对湿度为80％的室内，将被感染的含胚鸡蛋在34℃下孵化48小时，随后置于+4℃过夜。随后，从各个鸡蛋提取被感染的尿囊液。通过测量UHA(血凝单位)滴度而对所提取的各尿囊液评估感染滴度。为了测量被A/纽约/55/04(xPR8)(H3N2)株感染的尿囊液的UHA滴度，使用了火鸡红细胞。为了测量被A/新喀里多尼亚/20/99(xPR8)(H1N1)感染的尿囊液的UHA滴度，使用了母鸡红细胞。UHA滴度是由被感染的尿囊液的最终稀释度的倒数表达的，其在母鸡或火鸡红细胞在0.5％磷酸盐缓冲液中的悬浮液中存在时显示出可见的血凝。

1.2)结果

在表I和II中给出了从鸡蛋中获得的UHA滴度的平均值，所述鸡蛋来自于各个经免疫和未免疫母鸡组，所述UHA滴度的平均值是作为注射入鸡蛋中病毒感染剂量以及对取出鸡蛋的时间的函数。

表I：在尿囊液中获得的血凝滴度，其作为所使用A/新喀里多尼亚/20/99(xPR8)的感染剂量、鸡蛋来源(G1，G2，未免疫的对照)以及产蛋的时刻(测试1，测试2，测试3)的函数。

^*：使用在各个条件中所包含的8个鸡蛋的尿囊腔所获得的8个UHA滴度/50μl的几何平均值的形式表达血凝滴度。

NA：不可应用

表II：在尿囊液中获得的血凝滴度，其作为所使用的A/纽约/55/04(xPR8)(H3N2)的感染剂量，鸡蛋来源(G1，G2，未免疫对照)以及产蛋时间(测试1，测试2，测试3)的函数

NA：不可应用

在表I和II中获得的结果显示来自于经免疫的母鸡(G1和G2)的鸡蛋的尿囊液的UHA滴度的平均值等同于来自于未免疫母鸡的鸡蛋的尿囊液的UHA滴度的平均值。

进行统计分析以研究免疫与剂量因素。将UHA的各个数值转化为log₂，随后使用方差模型进行分析。使用该减小范围(étendue réduite)的测试来检验方差的非齐次性(héterogénéitédes variances)，其使用模型余数进行(SAS v8.2软件)。

对UHA滴度的各个数值进行的统计分析显示没有免疫效应。也没有任何与用于感染鸡蛋的病毒剂量有关的效应。在所研究的产蛋期间(26周(测试1)～50周(测试3))，UHA滴度基本上不会变动。

实施例2：用于生产两种大流行性疫苗株A/小鸡/意大利 /22A/98(H5N9)和A/越南/1194/04 NIBRG14(H5N1)的方法，其使用来自母鸡的含胚鸡蛋，其中所述母鸡已经利用两次注射含有禽流感病毒株 A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)的灭活疫苗，或者利用注射编码H5N1株的HA的重组禽痘病毒随后第二次注射含有禽流感病毒株的灭活H5N9 疫苗而进行免疫

2.1.1)免疫母鸡

用于免疫母鸡的规程与实施例1中所使用的规程一致。

2.1.2)用于感染来自于组G1和G2的母鸡的鸡蛋和利用A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)和A/越南1194/04 NIBRG14(H5N1)病毒株免疫的母鸡的鸡蛋的规程

除了下列修改，感染规程与实施例1所使用的感染规程相同：

将来自于Laboratoire Istituto Zooprofilattico Sperimentale delleVenezie，Laboratorio Virologia，padova，意大利的低病原性A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)禽流感株(souche aviaire)与减毒流行性重配疫苗株A/越南/1194/04 NIBRG14(H5N1)用于感染鸡蛋。其中后者病毒株是由National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC)实验室，South Mimms，Potters Bar，Herts EN6 3QG，UK提供的，并且通过反向遗传学获得，正如C.Nicolson等，Generation of influenza vaccine viruseson Vero cells by reverse genetics：an H5N1 candidate vaccine strainproduced under a qualitysystem，2005，Vaccine，23：2943-2952所描述的。

对于这两株测试10²，10³，10⁴和10⁵EID₅₀(50％鸡蛋感染剂量)。在测试1的鸡蛋中，测试了每个鸡蛋10³，10⁴和10⁵EID₅₀的感染剂量。在测试2的鸡蛋中，测试了每个鸡蛋10⁴和10⁵EID₅₀的感染剂量。在测试3中，测试了每个鸡蛋10²和10³EID₅₀的感染剂量。

使用母鸡红细胞以测量被A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)或者A/越南/1194/04 NIBRG14(H5N1)感染的尿囊液的UHA滴度。

2.2)结果

表III和IV中汇集了在来自于不同组的经免疫和未免疫母鸡的鸡蛋中获得的UHA滴度(作为注射入鸡蛋的病毒的剂量的函数以及作为获得鸡蛋的时间的函数)。

表III：在尿囊液中获得的血凝滴度，其作为所使用A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)的感染剂量、鸡蛋来源(G1，G2，未免疫对照)以及产蛋时间(测试1，测试2，测试3)的函数

^*：使用在各个条件中所包含的8个鸡蛋的尿囊液所获得的8个UHA滴度/50μl的几何平均值的形式表达血凝滴度。

NA：不可应用

表IV：在尿囊液中获得的血凝滴度，其作为所使用A/越南/1194/04(H5N1)RG14的感染剂量、鸡蛋来源(G1，G2，未免疫对照)以及产蛋时间(测试1，测试2，测试3)的函数

NA：不可应用

在表III和表IV中给出的结果以及统计分析显示来自于经免疫的母鸡(G1和G2)的鸡蛋的尿囊液的UHA滴度与来自于未免疫母鸡的尿囊液的UHA滴度相似，即使在这样的情况下，即与用于感染来自于这些母鸡的含胚鸡蛋(在用A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)株免疫的组G1和G2情况中)相同的株进行免疫这些母鸡。没有任何与用于感染鸡蛋的病毒剂量有关的效应。在所研究的产蛋期间(26周(测试1)～50周(测试3))，UHA滴度基本上不会变动。

如同实施例1地进行统计分析。

实施例3：分析鸡蛋中抗-H5母体抗体应答，其中所述鸡蛋来自于已经用A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)疫苗株进行免疫

3.1)操作规程

测量G1和G2组的母鸡的鸡蛋中所存在的抗-H5抗体，其中所述母鸡已经根据段1.1.1)中所描述的规程用A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)株免疫。平行地，还在来自于未免疫母鸡(对照组)的卵黄中分析抗-H5应答

在鸡蛋黄(或者卵黄体)中分析抗-H5应答，其中所述鸡蛋在测试1(S26-27)，2(S40-41)和3(S49-50)的时间获得。在胚胎发生之前(0天)和胚胎发生之后(第10天)(即：在37℃孵化10天之后的阶段)进行测试1的鸡蛋的卵黄中抗-H5应答的分析。仅在胚胎发生之后(第10天)，进行在测试2和3的鸡蛋的卵黄中抗H5应答的分析。还利用来源于未免疫母鸡的鸡蛋进行相同的分析(参见3.2.2))。还在胚胎发生后(第10天)测试2的鸡蛋的尿囊液中研究了抗H5应答。使用一次性套管的移液器的吸取出鸡蛋黄。除了测试1(其中鸡蛋黄保持冷冻而未被预稀释)之外，将测试2和3的鸡蛋黄和尿囊液在冷冻前在磷酸盐缓冲液中预稀释至1/5。将稀释的鸡蛋黄和尿囊液冷冻保存，直到抗H5抗体的定量时间，其中所述定量通过使用通过抑制母鸡红细胞血凝(IHA)的定量方法来进行，其中所述血凝在存在A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)株时发生。所述定量基于特异性针对并对HA的中和抗体抑制病毒“血凝”活性的能力。在该测试中，使用NISBC提供的抗-A/越南/1194/04绵羊血清作为阳性对照，并且使用天然小鼠血清作为阴性对照。在圆锥底微孔板中进行连续两倍稀释提取物(稀释的鸡蛋黄或者尿囊液)，以获得每孔50μl的各种稀释度。将50μl病毒悬浮液加入到各个孔中，其中所述病毒悬浮液具有4个血凝单位(4HAU)的滴度，并且来自于澄清的尿囊液，所述尿囊液由Ilaria Capua实验室(Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie，Laboratorio Virologia，padova，意大利)提供的A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)株感染。将其在实验室温度下温育1小时，之后加入50μl在磷酸盐缓冲液中0.5％母鸡红细胞溶液。在+4℃下保持1小时后，读取测试结果。抑制血凝的存在表现为在微孔底部出现红斑点，而血凝的出现则表现为微孔中出现桃红色的晕(halo)。IHA抗体滴度通过最后一个稀释度(其中在微孔中没有观察到血凝)的倒数表示。

3.2)结果

3.2.1)测试1的鸡蛋黄中抗-H5应答的分析

在0天，8个分析的未免疫组的鸡蛋黄中的8个在IHA测试中是阴性的，而来源于组2的8个鸡蛋黄中的6个在IHA测试中是阳性的，这说明存在抗H5抗体。

在第10天，4个分析的未免疫组的鸡蛋黄中的4个在IHA测试中是阴性的，而来源于组2的4个鸡蛋黄中的4个在IHA测试中是阳性的。

3.2.2)测试2的鸡蛋黄和尿囊液中抗-H5应答的分析

在第10天，5个分析的未免疫组的鸡蛋黄中的5个在IHA测试中是阴性的，而来源于组1的5个鸡蛋黄中的4个和来源于组2的5个鸡蛋黄中的4个在IHA测试中是阳性的，这说明在这些组中存在抗-H5抗体。在表V中给出了所获得的IHA滴度的各个数值。

表V：胚胎发生后提取的鸡蛋黄的IHA滴度(第10天)

^*：在第10天，来源于不同鸡蛋黄的滴度

另一方面，来源于组1和2的全部尿囊液在IHA测试中都是阴性的，这意味着在尿囊液中没有可检测出的抑制H5N9流感病毒血凝的抗体。

3.2.3)测试3的鸡蛋黄中抗-H5应答的分析

在第10天，5个分析的未免疫组的鸡蛋黄中的5个在IHA测试中是阴性的，而来源于组1的5个鸡蛋黄中的5个在IHA测试中是阳性的。

在表VI中给出了IHA滴度的各个数值。

表VI：胚胎发生后提取的鸡蛋黄的IHA滴度(第10天)，其作为鸡蛋来源的函数

总之，在实施例2和3结果的基础上，母体的抗H5N9抗体的存在(在3个测试的鸡蛋黄中得到显示)对用H5N1或H5N9株感染的尿囊液病毒生产力没有关联(incidence)。

实施例4：被A/小鸡/意大利/22A/98(H5N9)疫苗株免疫的母鸡以及在来自这些经免疫母鸡的鸡蛋中存在的母体抗-H5抗体的血清学应答的分析

在第28和36周大时，从组1和2的经免疫母鸡提取血液样品。在第27周和37周收集这些母鸡产下的鸡蛋，以评估母体抗体转移入鸡蛋黄中的重要性。借助血凝抑制测试评估抗-H5抗体应答，其使用于灭活疫苗株同源的A/小鸡/意大利/22A/98 H5N9株作为抗原。在表VII中以log₁₀表达了结果。

表VII：在经免疫产卵母鸡的血清中以及在这些母鸡所产鸡蛋的卵黄体中抑制血凝的抗体比率(A/小鸡/意大利/22A/98 H5N9抗原)

	血清	卵黄体	血清	卵黄体
	血清	卵黄体	血清	卵黄体	周龄	28	27	36	37
G1	2.10±0.61(15)^*	1.96±0.94(21)^**	1.92±0.91(15)	1.63±0.89(10)	周龄	28	27	36	37
G1	2.10±0.61(15)^*	1.96±0.94(21)^**	1.92±0.91(15)	1.63±0.89(10)	G2	2.20±0.62(15)	1.81±0.88(13)	2.26±0.65(15)	1.43±0.89(14)

^*抑制血凝的抗体滴度的几何平均值，其表达为log₁₀±标准偏差(每组所测试样品的数目)

^**对卵黄体所测试的最低稀释度是1/10(1log₁₀)；为了计算平均值和标准偏差，将在1/10稀释度为阴性的鸡蛋的数值置于0.7log₁₀。

表VIII：在组1和组2的经免疫鸡所产下鸡蛋的卵黄体中的抑制血凝的抗体比率(A/火鸡/威斯康星/68 H5N9抗原)

	卵黄体
	卵黄体	周龄	27
G1	1.67±0.79(21)^*	周龄	27
G1	1.67±0.79(21)^*	G2	1.39±0.80(13)

^*抑制血凝的抗体滴度的几何平均值，其表达为log₁₀±标准差(每组所测试样品的数目)；所测试的最低稀释度是1/10(1log₁₀)；为了计算平均值和标准偏差，将在1/10稀释度为阴性的鸡蛋的数值置于0.7log₁₀。

这些结果确认母体抗体传递到组1和2的经免疫母鸡所产下鸡蛋的鸡蛋黄中。

在卵黄体中同源性抗-H5N9抗体比率(表VII)大于异源抗-H5N9滴度(表VIII)，尽管该差异在统计学上不是显著的。

实施例5：在鸡蛋上生产A/火鸡/威斯康星/68 H5N9株，其中所述鸡蛋由利用组2经灭活的H5N9疫苗(A/小鸡/意大利/22A/98株)免疫的母鸡产下

5.1.操作规程

在第28和29周，从组2的母鸡提取鸡蛋(大约220-230)，所述母鸡被灭活的H5N9疫苗(A/小鸡/意大利/22A/98株)在3和17周龄时免疫两次。在控制的温度下(12～15℃)存储后，将这些鸡蛋在37℃下孵化11天。在透照验蛋以确定胚胎具有良好生活力之后，将这些鸡蛋在尿囊腔中接种0.2mlA/火鸡/威斯康星/68 H5N9存储病毒溶液的稀释液，其具有9.68log₁₀EID₅₀/ml的滴度(接种体)。形成七个大约30个鸡蛋的组。将四个组(G1～G4)接种下列接种体的稀释度：10^-5、10^-4、10^-3和10^-2。另外三个组(G5～G7)接种10^-3的接种体的稀释度。在接种后，将鸡蛋在37℃±1.5℃温度、70％±10％湿度下孵化。孵化20小时后，对鸡蛋进行透照验蛋以除去由于接种而产生的死蛋，随后将他们在相同的条件下重新孵化。在接种后42小时，将鸡蛋冷却，之后收集尿囊腔。汇集组1～4的鸡蛋的尿囊液(每个组，一个液体池(pool))。将4个鸡蛋组的尿囊液在-70℃下保存，之后以血凝单位和50％鸡蛋感染剂量(EID₅₀)进行滴定。

5.2.表

在表IX中给出了结果。

表IX：在鸡蛋上生产A/火鸡/威斯康星/68H5N9株后获得的血凝和感染滴度，其中所述鸡蛋来自于用灭活疫苗免疫的母鸡，所述疫苗含有A/小鸡/意大利/22A/98 H5N9株

组	接种体稀释度	滴定，血凝单位(log₁₀)	感染滴定EID₅₀(log₁₀/ml)
组	接种体稀释度	滴定，血凝单位(log₁₀)	感染滴定EID₅₀(log₁₀/ml)	1	10^-5	2.25	9.50
2	10^-4	2.40	9.33	1	10^-5	2.25	9.50

组	接种体稀释度	滴定，血凝单位(log₁₀)	感染滴定EID₅₀(log₁₀/ml)
组	接种体稀释度	滴定，血凝单位(log₁₀)	感染滴定EID₅₀(log₁₀/ml)	3	10^-3	2.25	9.67
4	10^-2	2.40	9.88	3	10^-3	2.25	9.67

这些结果显示在这些组之间存在很相似的滴度，因此接种体的稀释度没有影响。此外，所获得的滴度非常高，可以与在没有母体抗-H5N9抗体的鸡蛋上获得的滴度(历史实验数据)相当。因此，这些结果证实在所测试的条件下，母体抗体在鸡蛋中的存在不会干扰相同亚型的流感病毒的生产。

序列表

<110>Sanofi Pasteur

MERIAL Limited

<120>生产流感病毒的方法

<130>PM 0706

<140>0757884

<141>2007-09-26

<160>3

<170>PatentIn vers ion 3.3

<210>1

<211>564

<212>PRT

<213>禽流感病毒

<220>

<221>禽流感病毒A/小鸡/印度尼西亚/7/03的HA蛋白的序列

<222>(1)..(564)

<223>由在切割为点被修饰的合成HA基因编码的氨基酸序列

<400>1

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Leu Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Ile Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile

340 345 350

Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His

355 360 365

Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln

370 375 380

Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys

385 390 395 400

Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu

405 410 415

Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp

420 425 430

Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg

435 440 445

Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val

450 455 460

Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe

465 470 475 480

Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn

485 490 495

Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg

500 505 510

Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile

515 520 525

Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met

530 535 540

Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys

545 550 555 560

Arg Ile Cys Ile

<210>2

<211>7618

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒供体pJY1394.1

<400>2

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtgacccttt 660

acaagaataa aagaagaaac aactgtgaaa tagtttataa atgtaattcg tatgcagaaa 720

acgataatat attttggtat gagaaatcta aaggagacat agtttgtata gacatgcgct 780

cttccgatga gatattcgat gcttttctaa tgtatcatat agctacaaga tatgcctatc 840

atgatgatga tatatatcta caaatagtgt tatattattc taataatcaa aatgttatat 900

cttatattac gaaaaataaa tacgttaagt atataagaaa taaaactaga gacgatattc 960

ataaagtaaa aatattagct ctagaagact ttacaacgga agaaatatat tgttggatta 1020

gtaatatata acagcgtagc tgcacggttt tgatcatttt ccaacaatat aaaccaatga 1080

aggaggacga ctcatcaaac ataaataaca ttcacggaaa atattcagta tcagatttat 1140

cacaagatga ttatgttatt gaatgtatag acggatcttt tgattcgatc aagtatagag 1200

atataaaggt tataataatg aagaataacg gttacgttaa ttgtagtaaa ttatgtaaaa 1260

tgcggaataa atacttttct agatggttgc gtctttctac ttctaaagca ttattagaca 1320

tttacaataa taagtcagta gataatgcta ttgttaaagt ctatggtaaa ggtaagaaac 1380

ttattataac aggattttat ctcaaacaaa atatgatacg ttatgttatt gagtggatag 1440

gggatgattt tacaaacgat atatacaaaa tgattaattt ctataatgcg ttattcggta 1500

acgatgaatt aaaaatagta tcctgtgaaa acactctatg cccgtttata gaacttggta 1560

gatgctatta tggtaaaaaa tgtaagtata tacacggaga tcaatgtgat atctgtggtc 1620

tatatatact acaccctacc gatattaacc aacgagtttc tcacaagaaa acttgtttag 1680

tagatagaga ttctttgatt gtgtttaaaa gaagtaccag taaaaagtgt ggcatatgca 1740

tagaagaaat aaacaaaaaa catatttccg aacagtattt tggaattctc ccaagttgta 1800

aacatatttt ttgcctatca tgtataagac gttgggcaga tactaccaga aatacagata 1860

ctgaaaatac gtgtcctgaa tgtagaatag tttttccttt cataataccc agtaggtatt 1920

ggatagataa taaatatgat aaaaaaatat tatataatag atataagaaa atgattttta 1980

caaaaatacc tataagaaca ataaaaatat aattacattt acggaaaata gctggtttta 2040

gtttaccaac ttagagtaat tatcatattg aatctatatt gctaattagc taataaaaac 2100

ccgggttaat taattagtca tcaggcaggg cgagaacgag actatctgct cgttaattaa 2160

ttagagcttc tttattctat acttaaaaag tgaaaataaa tacaaaggtt cttgagggtt 2220

gtgttaaatt gaaagcgaga aataatcata aattatttca ttatcgcgat atccgttaag 2280

tttgtatcgt aatggagaaa atcgtgctgc tgctggccat cgtgagcctg gtgaaaagcg 2340

atcagatctg catcggctac cacgccaaca acagcacaga gcaagtggac acaatcatgg 2400

aaaagaacgt gaccgtgaca cacgcccagg acatcctgga aaagacacac aacgggaagc 2460

tgtgcgatct ggatggagtg aagcctctga tcctgagaga ttgcagcgtg gccggatggc 2520

tgctggggaa cccaatgtgc gacgaattca tcaacgtgcc cgaatggagc tacatcgtgg 2580

agaaggccaa cccagccaac gacctgtgct acccagggaa cctgaacgac tacgaagaac 2640

tgaaacacct gctgagcaga atcaaccact ttgagaaaat ccagatcatc cccaaaagca 2700

gctggtccga tcacgaagcc agcagcggag tgagcagcgc ctgcccatac cagggaaagt 2760

ccagcttttt tagaaacgtg gtgtggctga tcaaaaagaa cagcgcctac ccaacaatca 2820

agagaagcta caacaacacc aaccaggaag atctgctggt gctgtggggg atccaccacc 2880

ctaacgatgc cgccgagcag acaaggctgt accagaaccc aaccacctac atctccgtgg 2940

ggacaagcac actgaaccag agactggtgc caaaaatcgc catcagatcc aaagtgaacg 3000

ggcagagcgg aagaatggag ttcttctgga caatcctgaa acccaacgat gccatcaact 3060

tcgagagcaa cggaaacttc atcgccccag aatacgccta caaaatcgtg aagaaagggg 3120

acagcgccat catgaaaagc gaactggaat acggcaactg caacaccaag tgccagaccc 3180

caatgggggc catcaacagc agcatgccat tccacaacat ccaccctctg accatcgggg 3240

aatgccccaa atacgtgaaa agcaacagac tggtgctggc caccgggctg agaaacagcc 3300

ctcagagaga gaccagagga ctgtttggag ccatcgccgg ctttatcgag ggaggatggc 3360

agggaatggt ggatggctgg tacggatacc accacagcaa cgagcagggg agcggatacg 3420

ccgccgacaa agaatccacc cagaaggcca tcgacggcgt gaccaacaaa gtgaacagca 3480

tcatcgacaa aatgaacacc cagtttgagg ccgtgggaag ggagtttaac aacctggaaa 3540

ggagaatcga gaacctgaac aagaagatgg aggacggatt cctggatgtg tggacctaca 3600

acgccgaact gctggtgctg atggaaaacg agagaaccct ggactttcac gacagcaacg 3660

tgaagaacct gtacgacaaa gtgaggctgc agctgaggga taacgccaag gagctgggca 3720

acggctgctt cgagttctac cacaaatgcg ataacgaatg catggaaagc atcagaaacg 3780

gaacctacaa ctacccccag tacagcgaag aagccagact gaaaagagaa gaaatctccg 3840

gagtgaaact ggaatccatc ggaacctacc agatcctgag catctacagc acagtggcct 3900

cctccctggc cctggccatc atgatggccg gactgagcct gtggatgtgc tccaacggaa 3960

gcctgcagtg cagaatctgc atctgactcg agtttttatt gactagttaa tcataagata 4020

aataatatac agcattgtaa ccatcgtcat ccgttatacg gggaataata ttaccataca 4080

gtattattaa attttcttac gaagaatata gatcggtatt tatcgttagt ttattttaca 4140

tttattaatt aaacatgtct actattacct gttatggaaa tgacaaattt agttatataa 4200

tttatgataa aattaagata ataataatga aatcaaataa ttatgtaaat gctactagat 4260

tatgtgaatt acgaggaaga aagtttacga actggaaaaa attaagtgaa tctaaaatat 4320

tagtcgataa tgtaaaaaaa ataaatgata aaactaacca gttaaaaacg gatatgatta 4380

tatacgttaa ggatattgat cataaaggaa gagatacttg cggttactat gtacaccaag 4440

atctggtatc ttctatatca aattggatat ctccgttatt cgccgttaag gtaaataaaa 4500

ttattaacta ttatatatgt aatgaatatg atatacgact tagcgaaatg gaatctgata 4560

tgacagaagt aatagatgta gttgataaat tagtaggagg atacaatgat gaaatagcag 4620

aaataatata tttgtttaat aaatttatag aaaaatatat tgctaacata tcgttatcaa 4680

ctgaattatc tagtatatta aataatttta taaattttaa taaaaaatac aataacgaca 4740

taaaagatat taaatcttta attcttgatc tgaaaaacac atctataaaa ctagataaaa 4800

agttattcga taaagataat aatgaatcga acgatgaaaa attggaaaca gaagttgata 4860

agctaatttt tttcatctaa atagtattat tttattgaag tacgaagttt tacgttagat 4920

aaataataaa ggtcgatttt tattttgtta aatatcaaat atgtcattat ctgataaaga 4980

tacaaaaaca cacggtgatt atcaaccatc taacgaacag atattacaaa aaatacgtcg 5040

gactatggaa aacgaagctg atagcctcaa tagaagaagc attaaagaaa ttgttgtaga 5100

tgttatgaag aattgggatc atcctctcaa cgaagaaata gataaagttc taaactggaa 5160

aaatgataca ttaaacgatt tagatcatct aaatacagat gataatatta aggaaatcat 5220

acaatgtctg attagagaat ttgcgtttaa aaagatcaat tctattatgt atagttatgc 5280

tatggtaaaa ctcaattcag ataacgaaac attgaaagat aaaattaagg attattttat 5340

agaaactatt cttaaagaca aacgtggtta taaacaaaag ccattaccct agagcggccg 5400

ccaccgcggt ggagctccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaatttc gagcttggcg 5460

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 5520

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 5580

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 5640

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 5700

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 5760

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 5820

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 5880

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 5940

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 6000

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 6060

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 6120

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 6180

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 6240

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 6300

tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 6360

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 6420

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6480

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 6540

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 6600

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 6660

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 6720

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 6780

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 6840

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 6900

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 6960

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 7020

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 7080

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 7140

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 7200

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 7260

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 7320

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 7380

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 7440

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 7500

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 7560

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccac 7618

<210>3

<211>4885

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pJY1394.1插入物的核苷酸序列

<220>

<221>克隆质粒的部分序列，其包含M13R引物的序列

<222>(1)..(53)

<220>

<221>侧翼TROVAC家禽痘载体基因组中F8插入基因座的“左臂”的序列

<222>(54)..(1483)

<220>

<221>左臂和H6启动子之间的连接序列

<222>(1484)..(1568)

<220>

<221>疫苗病毒的启动子H6的序列

<222>(1569)..(1692)

<220>

<221>A/小鸡/印度尼西亚/7/03株的经修饰的合成HA基因的序列

<222>(1693)..(3387)

<220>

<221>HA基因和右臂之间的连接序列

<222>(3388)..(3414)

<223>包含禽痘早期基因TTTTTAT转录终止序列的序列

<220>

<221>侧翼TROVAC禽痘载体基因组中F8插入基因座的“右臂”的序列

<222>(3415)..(4790)

<220>

<221>克隆质粒的部分序列，其包含M13R引物的序列

<222>(4791)..(4885)

<400>3

gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggtgaccctt 60

tacaagaata aaagaagaaa caactgtgaa atagtttata aatgtaattc gtatgcagaa 120

aacgataata tattttggta tgagaaatct aaaggagaca tagtttgtat agacatgcgc 180

tcttccgatg agatattcga tgcttttcta atgtatcata tagctacaag atatgcctat 240

catgatgatg atatatatct acaaatagtg ttatattatt ctaataatca aaatgttata 300

tcttatatta cgaaaaataa atacgttaag tatataagaa ataaaactag agacgatatt 360

cataaagtaa aaatattagc tctagaagac tttacaacgg aagaaatata ttgttggatt 420

agtaatatat aacagcgtag ctgcacggtt ttgatcattt tccaacaata taaaccaatg 480

aaggaggacg actcatcaaa cataaataac attcacggaa aatattcagt atcagattta 540

tcacaagatg attatgttat tgaatgtata gacggatctt ttgattcgat caagtataga 600

gatataaagg ttataataat gaagaataac ggttacgtta attgtagtaa attatgtaaa 660

atgcggaata aatacttttc tagatggttg cgtctttcta cttctaaagc attattagac 720

atttacaata ataagtcagt agataatgct attgttaaag tctatggtaa aggtaagaaa 780

cttattataa caggatttta tctcaaacaa aatatgatac gttatgttat tgagtggata 840

ggggatgatt ttacaaacga tatatacaaa atgattaatt tctataatgc gttattcggt 900

aacgatgaat taaaaatagt atcctgtgaa aacactctat gcccgtttat agaacttggt 960

agatgctatt atggtaaaaa atgtaagtat atacacggag atcaatgtga tatctgtggt 1020

ctatatatac tacaccctac cgatattaac caacgagttt ctcacaagaa aacttgttta 1080

gtagatagag attctttgat tgtgtttaaa agaagtacca gtaaaaagtg tggcatatgc 1140

atagaagaaa taaacaaaaa acatatttcc gaacagtatt ttggaattct cccaagttgt 1200

aaacatattt tttgcctatc atgtataaga cgttgggcag atactaccag aaatacagat 1260

actgaaaata cgtgtcctga atgtagaata gtttttcctt tcataatacc cagtaggtat 1320

tggatagata ataaatatga taaaaaaata ttatataata gatataagaa aatgattttt 1380

acaaaaatac ctataagaac aataaaaata taattacatt tacggaaaat agctggtttt 1440

agtttaccaa cttagagtaa ttatcatatt gaatctatat tgctaattag ctaataaaaa 1500

cccgggttaa ttaattagtc atcaggcagg gcgagaacga gactatctgc tcgttaatta 1560

attagagctt ctttattcta tacttaaaaa gtgaaaataa atacaaaggt tcttgagggt 1620

tgtgttaaat tgaaagcgag aaataatcat aaattatttc attatcgcga tatccgttaa 1680

gtttgtatcg taatggagaa aatcgtgctg ctgctggcca tcgtgagcct ggtgaaaagc 1740

gatcagatct gcatcggcta ccacgccaac aacagcacag agcaagtgga cacaatcatg 1800

gaaaagaacg tgaccgtgac acacgcccag gacatcctgg aaaagacaca caacgggaag 1860

ctgtgcgatc tggatggagt gaagcctctg atcctgagag attgcagcgt ggccggatgg 1920

ctgctgggga acccaatgtg cgacgaattc atcaacgtgc ccgaatggag ctacatcgtg 1980

gagaaggcca acccagccaa cgacctgtgc tacccaggga acctgaacga ctacgaagaa 2040

ctgaaacacc tgctgagcag aatcaaccac tttgagaaaa tccagatcat ccccaaaagc 2100

agctggtccg atcacgaagc cagcagcgga gtgagcagcg cctgcccata ccagggaaag 2160

tccagctttt ttagaaacgt ggtgtggctg atcaaaaaga acagcgccta cccaacaatc 2220

aagagaagct acaacaacac caaccaggaa gatctgctgg tgctgtgggg gatccaccac 2280

cctaacgatg ccgccgagca gacaaggctg taccagaacc caaccaccta catctccgtg 2340

gggacaagca cactgaacca gagactggtg ccaaaaatcg ccatcagatc caaagtgaac 2400

gggcagagcg gaagaatgga gttcttctgg acaatcctga aacccaacga tgccatcaac 2460

ttcgagagca acggaaactt catcgcccca gaatacgcct acaaaatcgt gaagaaaggg 2520

gacagcgcca tcatgaaaag cgaactggaa tacggcaact gcaacaccaa gtgccagacc 2580

ccaatggggg ccatcaacag cagcatgcca ttccacaaca tccaccctct gaccatcggg 2640

gaatgcccca aatacgtgaa aagcaacaga ctggtgctgg ccaccgggct gagaaacagc 2700

cctcagagag agaccagagg actgtttgga gccatcgccg gctttatcga gggaggatgg 2760

cagggaatgg tggatggctg gtacggatac caccacagca acgagcaggg gagcggatac 2820

gccgccgaca aagaatccac ccagaaggcc atcgacggcg tgaccaacaa agtgaacagc 2880

atcatcgaca aaatgaacac ccagtttgag gccgtgggaa gggagtttaa caacctggaa 2940

aggagaatcg agaacctgaa caagaagatg gaggacggat tcctggatgt gtggacctac 3000

aacgccgaac tgctggtgct gatggaaaac gagagaaccc tggactttca cgacagcaac 3060

gtgaagaacc tgtacgacaa agtgaggctg cagctgaggg ataacgccaa ggagctgggc 3120

aacggctgct tcgagttcta ccacaaatgc gataacgaat gcatggaaag catcagaaac 3180

ggaacctaca actaccccca gtacagcgaa gaagccagac tgaaaagaga agaaatctcc 3240

ggagtgaaac tggaatccat cggaacctac cagatcctga gcatctacag cacagtggcc 3300

tcctccctgg ccctggccat catgatggcc ggactgagcc tgtggatgtg ctccaacgga 3360

agcctgcagt gcagaatctg catctgactc gagtttttat tgactagtta atcataagat 3420

aaataatata cagcattgta accatcgtca tccgttatac ggggaataat attaccatac 3480

agtattatta aattttctta cgaagaatat agatcggtat ttatcgttag tttattttac 3540

atttattaat taaacatgtc tactattacc tgttatggaa atgacaaatt tagttatata 3600

atttatgata aaattaagat aataataatg aaatcaaata attatgtaaa tgctactaga 3660

ttatgtgaat tacgaggaag aaagtttacg aactggaaaa aattaagtga atctaaaata 3720

ttagtcgata atgtaaaaaa aataaatgat aaaactaacc agttaaaaac ggatatgatt 3780

atatacgtta aggatattga tcataaagga agagatactt gcggttacta tgtacaccaa 3840

gatctggtat cttctatatc aaattggata tctccgttat tcgccgttaa ggtaaataaa 3900

attattaact attatatatg taatgaatat gatatacgac ttagcgaaat ggaatctgat 3960

atgacagaag taatagatgt agttgataaa ttagtaggag gatacaatga tgaaatagca 4020

gaaataatat atttgtttaa taaatttata gaaaaatata ttgctaacat atcgttatca 4080

actgaattat ctagtatatt aaataatttt ataaatttta ataaaaaata caataacgac 4140

ataaaagata ttaaatcttt aattcttgat ctgaaaaaca catctataaa actagataaa 4200

aagttattcg ataaagataa taatgaatcg aacgatgaaa aattggaaac agaagttgat 4260

aagctaattt ttttcatcta aatagtatta ttttattgaa gtacgaagtt ttacgttaga 4320

taaataataa aggtcgattt ttattttgtt aaatatcaaa tatgtcatta tctgataaag 4380

atacaaaaac acacggtgat tatcaaccat ctaacgaaca gatattacaa aaaatacgtc 4440

ggactatgga aaacgaagct gatagcctca atagaagaag cattaaagaa attgttgtag 4500

atgttatgaa gaattgggat catcctctca acgaagaaat agataaagtt ctaaactgga 4560

aaaatgatac attaaacgat ttagatcatc taaatacaga tgataatatt aaggaaatca 4620

tacaatgtct gattagagaa tttgcgttta aaaagatcaa ttctattatg tatagttatg 4680

ctatggtaaa actcaattca gataacgaaa cattgaaaga taaaattaag gattatttta 4740

tagaaactat tcttaaagac aaacgtggtt ataaacaaaa gccattaccc tagagcggcc 4800

gccaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattt cgagcttggc 4860

gtaatcatgg tcatagctgt ttcct 4885

Claims

1.生产流感病毒的方法，根据该方法：

a.向母鸡给药流感疫苗，

b.从经免疫的母鸡获得鸡蛋，

c.触发胚胎发生过程，

d.通过将流感病毒接种入尿囊腔中来感染所述含胚鸡蛋，

e.在允许病毒复制的温度和湿度条件下孵化所述感染的含胚鸡蛋，和

f.收获包含病毒的尿囊液。

2.权利要求1所述的方法，其中疫苗保护母鸡抵抗禽流感。

3.权利要求1或2所述的方法，其中流感疫苗在它的组合物中包含呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中流感疫苗的组合物包含灭活的完整流感病毒。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中流感疫苗的组合物包含来源于完整流感病毒的产品。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中疫苗的组合物还包含佐剂。

7.权利要求1-3任一项所述的方法，其中流感疫苗的组合物包含减毒的流感病毒。

8.权利要求1-3任一项所述的方法，其中流感疫苗包含载体，所述载体包含编码流感病毒的血凝素的基因。

9.权利要求8所述的方法，其中所述载体是痘病毒。

10.权利要求8或9所述的方法，其中载体还包含编码流感病毒神经氨酸酶的基因。

11.权利要求8-10任一项所述的方法，其中疫苗的组合物还包含佐剂。

12.权利要求3-11任一项所述的方法，其中包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有不同的亚型。

13.权利要求3-11任一项所述的方法，其中包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有相同的亚型。

14.权利要求3-11任一项所述的方法，其中包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素是一致的。

15.权利要求4，6或者7所述的方法，其中，包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的流感病毒与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒是一致的。

16.权利要求12-15任一项所述的方法，其中包含在给药于母鸡的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有H5、H6、H7或者H9亚型。

17.权利要求16所述的方法，其中包含在用于使母鸡免疫抗流感的疫苗组合物中的呈蛋白质和/或编码该蛋白质的基因形式的流感病毒的血凝素，与用来感染来自经免疫的母鸡的含胚鸡蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有H5或者H7亚型。

18.权利要求1-17任一项所述的方法，其包含纯化病毒的附加步骤。

19.权利要求1-18任一项所述的方法，其包含灭活病毒的附加步骤。

20.使用权利要求1-19任一项所述的方法获得的流感疫苗。

21.权利要求1-19任一项所述的方法用于制造疫苗的用途，其中所述疫苗用于防止流感。

22.权利要求1-19任一项所述的方法用于制造疫苗的用途，其中所述疫苗用于防止人类的大流行性流感。

23.权利要求1-19任一项所述的方法用于制造疫苗的用途，其中所述疫苗用于防止人类的流行性流感。

24.用于防止流感病毒流行株或者流感病毒大流行株在人类中感染的方法，所述方法包括向人类给药有效量的权利要求20中所述的抗流感疫苗。

25.权利要求1-19任一项所述的方法用于制造疫苗的用途，其中所述疫苗用于防止在马科、猪科、犬科、猫科、鼬科和禽类物种中的流感。

26.用于防止在选自马科、猪科、犬科、猫科、鼬科和禽类物种的动物中的流感的方法，其中所述方法包括向动物给药有效量的权利要求20中所述的流感疫苗。

27.来自针对流感进行免疫的母鸡的鸡蛋用于生产流感病毒的用途。

28.来自己针对流感进行免疫的母鸡的鸡蛋用于制造流感疫苗的用途。

29.权利要求27或28所述的来自针对流感进行免疫的母鸡的鸡蛋的用途，其中所述鸡蛋含有针对流感病毒的血凝素的抗体。

30.权利要求29所述的用途，其中所述抗体针对具有H5、H6、H7或者H9亚型的流感病毒的血凝素。