CN101721751B - 负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学材料制备技术领域，特别涉及负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架及其制备方法和用途。本发明的人体组织工程支架是通过装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶自组装为装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球，然后将其负载到由电纺丝方法制备得到的高分子聚合物纤维基材上而得到的。具有内核的中空二氧化硅亚微米球作为细胞生长因子缓释载体，通过负载并缓慢释放细胞生长因子，促进细胞增殖和分化。本发明的人体组织工程支架全方位模仿细胞生长微环境，在组织修复和组织重建的组织工程支架领域有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料制备技术领域，特别涉及负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架及其制备方法和用途。
背景技术
人体组织，特别是人体重大器官的来源匮乏，一直是修复或改善人体病损组织或人体器官组织移植的一大障碍；用于修复或改善人体病损组织或人体器官的结构、功能的生物活性替代物的人体组织工程产品的开发，将有助于大大提高人类健康水平。人体组织工程产品将人体外培养扩增的正常组织细胞负载在一种具有优良细胞相容性并可以被人的机体降解吸收的生物材料上，然后将负载了正常组织细胞的生物材料复合物植入人体组织的病损部位或器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被人的机体降解吸收的同时，细胞不断增殖及分化，并形成在形态与功能方面与人体组织的病损部位或器官的病损部位的组织一致的新的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。
人体组织工程支架为构建人体组织的细胞提供三维支架，有利于细胞的粘附、增殖及分化，为细胞生长提供合适的外环境。理想的人体组织工程支架应具备如下特点：1)具备良好的生物相容性，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；2)具有可降解性及适宜的降解速率，当移植的新的人体组织细胞或人体组织在受体内存活时，支架材料可自行降解；3)具有符合人体细胞、人体组织器官要求的生物力学强度；4)具有良好的人体细胞界面关系，能相互作用以保存和促进人体细胞功能；5)便于加工成理想的二维或三维结构，而且移植到人体内后能保持原有形状。
除了人体组织工程支架外，细胞生长因子对促进细胞的分裂增殖，迁移，基因表达和分化起着至关重要的作用。在培养体系中加入细胞生长因子，模拟细胞微环境，可以延长细胞存活时间，构建具有结构和功能的组织。将细胞生长因子复合到人体组织工程支架中成为近几年研究的热点。
目前，已经发展了多种方法制备各种结构的人体组织工程支架，但是得到的人体组织工程支架一般力学强度差、不具备缓释细胞生长因子的功能。发明专利“一种壳聚糖管状支架的制备方法”(公开号：CN1568904)中公开了一种用纺织方法制备的壳聚糖管状支架的制备方法，但是这种支架不具有缓释细胞生长因子的功能；发明专利“一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法”(公开号：CN1511592)中通过冷冻干燥法得到含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架，但是得到的组织工程支架强度较差。
本发明针对人体外细胞培养的需求，通过简单的制备方法设计制备了人体组织工程支架。这种人体组织工程支架采用具有内核的中空二氧化硅亚微米球缓释细胞生长因子，继而自组装为二氧化硅/明胶复合球，负载到电纺丝方法制备的聚合物纤维上，得到人体组织工程支架。这种人体组织工程支架全面模拟人体细胞微环境，包括细胞的细胞外基质的微米和纳米结构、缓释细胞生长因子，具备人体细胞高活力培养的理想条件。该人体组织工程支架具有良好的机械性能和细胞相容性，适用范围广，可用于骨、软骨、神经、血管、膀胱、肾脏、肝脏等组织器官的修复。
发明内容
本发明的目的之一是提供负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架。
本发明的目的之二是提供负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架的制备方法。
本发明的目的之三是负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架的用途。
本发明的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，是通过装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶自组装为装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球，然后将其负载到由电纺丝方法制备得到的作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维上而得到的。
本发明的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架是：在作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维上负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为1μm～1000μm。
所述的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球中还装载了营养物质，得到在作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维上负载了缓释细胞生长因子和营养物质的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为1μm～1000μm。
本发明的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架的制备方法包括以下步骤：
1)将具有内核的中空二氧化硅亚微米球浸泡在细胞生长因子水溶液中，在温度为4℃下搅拌，然后在温度为4℃下离心，用去离子水清洗所得固体产物，冷冻干燥，得到装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球；
2)将步骤1)得到的装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球超声分散在明胶水溶液中，然后冷冻干燥，得到装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球；
3)将步骤2)得到的装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)，室温下充分反应，之后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物上的氨基共价偶联的羧基活化基团；将得到的羧基活化的复合球分散到含有通过电纺丝方法制备得到的作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应，取出浸泡后的高分子聚合物纤维，用磷酸盐缓冲液洗涤，得到负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架。
步骤1)中是将10-3～10g具有内核的中空二氧化硅亚微米球浸泡在浓度为10-3～10mmol/L的细胞生长因子水溶液中；在细胞生长因子水溶液中还进一步含有营养物质。
步骤2)装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球在明胶水溶液中的终浓度为10-3～100mg/mL，明胶水溶液的质量浓度为0.05～10％；或者步骤2)装载了细胞生长因子和营养物质的具有内核的中空二氧化硅亚微米球在明胶水溶液中的终浓度为10-3～100mg/mL，明胶水溶液的质量浓度为0.05～10％。
步骤3)中装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球，或者装载了细胞生长因子和营养物质的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球，在乙醇溶剂中的浓度为10-2～102mg/mL；N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在乙醇溶剂中的浓度分别为10-7～10-3mol/L。
步骤3)中磷酸盐缓冲分散液中含有的通过电纺丝方法制备得到的作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维是10-2～102mg/ml。
所述的营养物质选自维生素A、维生素B(包括B1、B2、B6、B12、PP、肌醇、M等)、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、嘌呤、嘧啶、葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、胆酸、胆碱、固醇、肌酸、前列腺素、肾上腺素、胰岛素、胆固醇、磷脂、糖脂、血红蛋白、核糖、脱氧核糖等中的一种或大于一种以上。
步骤1)的在温度为4℃下搅拌的时间是12～72小时。
步骤3)的室温下充分反应的时间是15～60分钟；在4℃下反应的时间是4～72小时。
所述的具有内核的中空二氧化硅亚微米球具有中空介孔结构，作为缓释载体，通过装载、缓慢释放细胞生长因子刺激人体的细胞生长、增殖与分化。
所述的具有内核的中空二氧化硅亚微米球的制备及其作为缓释载体可参见专利申请号CN200610089184.9和专利申请号CN200610113976.5。
所述的具有内核的中空二氧化硅亚微米球的粒径在100～1000nm之间，外壳厚度在20～200nm之间；在该中空二氧化硅亚微米球的中空腔内有一粒径为50～500nm的可移动的球形二氧化硅内核；该中空二氧化硅亚微米球具有介孔结构，介孔的孔径为3～50nm；该中空二氧化硅亚微米球的比表面积为100～1000m2/g。
其中，按照专利申请号为CN200610089184.9所述的方法，将专利申请号为CN200610089184.9中所述的氢氟酸摩尔浓度从1×10-3～5×10-1mol/L扩展为1×10-4～10×10-1mol/L，即可得到具有内核的中空二氧化硅亚微米球的介孔的平均孔径由3～10nm扩展为3～50nm，比较面积由140～500m2/g扩展为140～1000m2/g。
所述的细胞生长因子选自转化生长因子，表皮生长因子，血管内皮生长因子，碱性成纤维生长因子，神经生长因子，软骨调节素，神经胶质生长因子，血小板衍化生长因子，肝细胞生长因子，人角朊细胞生长因子，胰岛素样生长因子，骨形态发生蛋白等中的一种或大于一种以上。
所述的作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维的直径为10nm～1000μm，复合具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球后的人体组织工程支架直径为1010nm～2000μm。
所述的高分子聚合物纤维根据所选用的聚合物种类和分子量不同，在人体内的降解时间为1天～1年左右。高分子聚合物为氨基聚乙烯醇、端氨基聚乳酸、端氨基丙交酯与乙交酯的无规嵌段共聚物、端氨基丙交酯-乙二醇-乙交酯的无规或嵌段共聚物、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙二胺、聚酰胺、聚乙醇胺、端氨基聚乙二醇、聚赖氨酸、聚γ-谷氨酸、聚天冬氨酸、聚精氨酸、聚天冬酰胺、甲壳素、壳聚糖、聚氨基-β-环糊精、明胶、胶原、氨基聚糖、蚕丝蛋白、蜘蛛丝蛋白、氨基纤维素或氨基淀粉等。
用电纺丝设备加工作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维的工艺可为：将所配置的高分子聚合物纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为0.01ml/h～100ml/h，施加电压1～50kV进行电纺丝，在喷丝口上方0.1cm～100cm处的接收器上得到高分子聚合物纤维。
本发明的负载了缓释细胞生长因子或者进一步含有营养物质的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架的制备成本低，适合大规模生产，可以作为多种人体组织或器官的修复或重建的支架；所述的人体组织或器官包括肝脏、神经、骨、软骨、肾脏、膀胱、血管、皮肤或心脏。
本发明的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架与现有人体组织工程支架相比，具有以下优点和突出效果：1)本发明制备的人体组织工程支架采用生物相容性佳的材料，具有分级结构，比表面积大，有利于细胞黏附和生长；2)细胞生长因子等装载在具有内核的中空二氧化硅亚微米球中，大大节省了昂贵的细胞生长因子的用量；3)将细胞生长因子装在到具有内核的中空二氧化硅亚微米球中，增加细胞对支架的趋向性和黏附力，促进细胞向支架内增殖，从而促进细胞之间的汇合与细胞外基质成分的释放；4)高分子聚合物纤维随细胞增殖成组织，可被完全降解，具有内核的中空二氧化硅随尿液和粪便排泄，不会引起机体免疫反应和炎症反应；5)进一步含有营养物质可对创口的愈合起到辅助疗效。
具体实施方式
实施例1.
1.0.001g具有内核(内核大小为50nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为100nm，外壳厚度为22nm，介孔孔径为3nm，比表面积为100m2/g)浸泡在0.001mmol/L神经生长因子水溶液中，在温度为4℃下搅拌12小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载神经生长因子的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载神经生长因子的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为1％的明胶水溶液中，装载神经生长因子的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为10-3mg/mL，冷冻干燥，得到装载了神经生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为1μm。
3.将1g壳聚糖溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为0.1ml/h，施加电压5kV进行电纺丝。在喷丝口上方15cm处的接收器上得到壳聚糖纤维。纤维平均直径约950微米。
4.将步骤2得到的装载了神经生长因子的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了神经生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为1mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为10-7mol/L，混合均匀，室温充分反应15分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的壳聚糖纤维上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球1mg/ml分散到含有浓度为1mg/ml的通过步骤3制备得到的壳聚糖纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应4小时，取出浸泡后的壳聚糖纤维，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释神经生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的壳聚糖纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的神经受到损伤时，在对神经进行修复时将其作为神经的修复支架使用。
实施例2.
1.10g具有内核(内核大小为500nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为980nm，外壳厚度为20nm，介孔孔径为10nm，比表面积为400m2/g)浸泡在10mmol/L表皮生长因子水溶液中，在温度为4℃下搅拌72小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载表皮生长因子的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载表皮生长因子的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为0.1％的明胶水溶液中，装载表皮生长因子的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为100mg/mL，冷冻干燥，得到装载了表皮生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为1000μm。
3.将1g氨基聚乙烯醇溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为100ml/h，施加电压50kV进行电纺丝。在喷丝口上方85cm处的接收器上得到氨基聚乙烯醇纤维。纤维平均直径约300nm。
4.将步骤2得到的装载了表皮生长因子的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了表皮生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为100mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为10-3mol/L，混合均匀，室温充分反应60分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的氨基聚乙烯醇纤维上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球100mg/ml分散到含有浓度为100mg/ml的通过步骤3制备得到的氨基聚乙烯醇纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应4小时，取出浸泡后的氨基聚乙烯醇纤维，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释表皮生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的氨基聚乙烯醇纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的血管受到损伤时，在对血管进行修复时将其作为血管的修复支架使用。
实施例3.
1.0.1g具有内核(内核大小为250nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为700nm，外壳厚度为50nm，介孔孔径为20nm，比表面积为1000m2/g)浸泡在0.1mmol/L骨形态发生蛋白水溶液中，在温度为4℃下搅拌48小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载骨形态发生蛋白的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载骨形态发生蛋白的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为9.8％的明胶水溶液中，装载骨形态发生蛋白的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为1mg/mL，冷冻干燥，得到装载了骨形态发生蛋白的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为180μm。
3.将0.2g明胶溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为1ml/h，施加电压5kV进行电纺丝。在喷丝口上方0.1cm处的接收器上得到明胶纤维。纤维平均直径约40微米。
4.将步骤2得到的装载了骨形态发生蛋白的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了骨形态发生蛋白的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为0.05mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为5×10-6mol/L，混合均匀，室温充分反应30分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的明胶纤维上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球0.05mg/ml分散到含有浓度为0.05mg/ml的通过步骤3制备得到的明胶纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应24小时，取出浸泡后的明胶纤维，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释骨形态发生蛋白的具有内核的中空二氧化硅球的明胶纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的软骨受到损伤时，在对软骨进行修复时将其作为软骨的修复支架使用。
实施例4.
1.1g具有内核(内核大小为230nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为500nm，外壳厚度为50nm，介孔孔径为45nm，比表面积为650m2/g)浸泡在1mmol/L肝细胞生长因子水溶液中，在温度为4℃下搅拌50小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为5％的明胶水溶液中，装载肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为10mg/mL，冷冻干燥，得到装载了肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为50μm。
3.将1g蚕丝蛋白溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为10ml/h，施加电压15kV进行电纺丝。在喷丝口上方10cm处的接收器上得到蚕丝蛋白纤维。纤维平均直径约90微米。
4.将步骤2得到的装载了肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为0.01mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为10-5mol/L，混合均匀，室温充分反应30分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的蚕丝蛋白纤维上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球0.01mg/ml分散到含有浓度为0.01mg/ml的通过步骤3制备得到的蚕丝蛋白纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应48小时，取出浸泡后的蚕丝蛋白纤维，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的蚕丝蛋白纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的肝脏受到损伤时，在对肝脏进行修复时将其作为肝脏的修复支架使用。
实施例5.
1.0.01g具有内核(内核大小为250nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为700nm，外壳厚度为40nm，介孔孔径为25nm，比表面积为800m2/g)浸泡在5mmol/L肝细胞生长因子水溶液中，在温度为4℃下搅拌12小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为2％的明胶水溶液中，装载肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为0.1mg/mL，冷冻干燥，得到装载了肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为160μm。
3.将0.5g聚乳酸溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为0.1ml/h，施加电压10kV进行电纺丝。在喷丝口上方20cm处的接收器上得到聚乳酸纤维。纤维平均直径约100微米。
4.将步骤2得到的装载了肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为10mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为10-5mol/L，混合均匀，室温充分反应45分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的聚乳酸纤维上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球10mg/ml分散到含有浓度为10mg/ml的通过步骤3制备得到的聚乳酸纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应24小时，取出浸泡后的聚乳酸纤维，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释肝细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的聚乳酸纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的肝脏受到损伤时，在对肝脏进行修复时将其作为肝脏的修复支架使用。
实施例6.
1.0.5g具有内核(内核大小为80nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为220nm，外壳厚度为40nm，介孔孔径为25nm，比表面积为800m2/g)浸泡在1mmol/L转化生长因子β水溶液中，在温度为4℃下搅拌36小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载转化生长因子β的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载转化生长因子β的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为0.05％的明胶水溶液中，装载转化生长因子β的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为0.05mg/mL，冷冻干燥，得到装载了转化生长因子β的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为250μm。
3.将0.5g淀粉溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为0.5ml/h，施加电压20kV进行电纺丝。在喷丝口上方5cm处的接收器上得到淀粉纤维。纤维平均直径约460微米。
4.将步骤2得到的装载了转化生长因子β的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了转化生长因子β因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为1mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为5×10-5mol/L，混合均匀，室温充分反应50分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的淀粉纤维上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球1mg/ml分散到含有浓度为1mg/ml的通过步骤3制备得到的淀粉纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应50小时，取出浸泡后的淀粉纤维，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释转化生长因子β的具有内核的中空二氧化硅球的淀粉纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的肾脏受到损伤时，在对肾脏进行修复时将其作为肾脏的修复支架使用。
实施例7.
1.0.2g具有内核(内核大小为200nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为600nm，外壳厚度为30nm，介孔孔径为50nm，比表面积为600m2/g)浸泡在1mmol/L血小板衍化生长因子水溶液中，在温度为4℃下搅拌60小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载血小板衍化生长因子的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载血小板衍化生长因子的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为0.5％的明胶水溶液中，装载血小板衍化生长因子的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为0.2mg/mL，冷冻干燥，得到装载了血小板衍化生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为150μm。
3.将1g胶原溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为10ml/h，施加电压30kV进行电纺丝。在喷丝口上方55cm处的接收器上得到胶原纤维。纤维平均直径约180微米。
4.将步骤2得到的装载了血小板衍化生长因子的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了血小板衍化生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为0.2mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为2×10-4mol/L，混合均匀，室温充分反应30分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的胶原纤维上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球0.2mg/ml分散到含有浓度为0.2mg/ml的通过步骤3制备得到的胶原纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应48小时，取出浸泡后的胶原纤维，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释血小板衍化生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的胶原纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的皮肤受到损伤时，在对皮肤进行修复时将其作为皮肤的修复支架使用。
实施例8.
1.0.05g具有内核(内核大小为100nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为300nm，外壳厚度为30nm，介孔孔径为20nm，比表面积为850m2/g)浸泡在0.1mmol/L软骨调节素水溶液中，在温度为4℃下搅拌40小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载软骨调节素的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载软骨调节素的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为1％的明胶水溶液中，装载软骨调节素的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为0.02mg/mL，冷冻干燥，得到装载了软骨调节素的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为40μm。
3.将1g聚乙醇胺溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为1ml/h，施加电压15kV进行电纺丝。在喷丝口上方20cm处的接收器上得到聚乙醇胺纤维。纤维平均直径约100微米。
4.将步骤2得到的装载了软骨调节素的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了软骨调节素的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为0.05mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为1×10-4mol/L，混合均匀，室温充分反应20分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的聚乙醇胺纤维上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球0.05mg/ml分散到含有浓度为0.05mg/ml的通过步骤3制备得到的聚乙醇胺纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应40小时，取出浸泡后的聚乙醇胺纤维，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释软骨调节素的具有内核的中空二氧化硅球的聚乙醇胺纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的软骨受到损伤时，在对皮肤进行修复时将其作为软骨的修复支架使用。
实施例9
1.0.4g具有内核(内核大小为90nm)的中空二氧化硅亚微米球(粒径为260nm，外壳厚度为30nm，介孔孔径为10nm，比表面积为600m2/g)浸泡在0.01mmol/L表皮生长因子水溶液中(含有0.01mol/L的L-谷氨酰胺)，在温度为4℃下搅拌52小时。在温度为4℃下离心，去离子水清洗3遍所得固体产物，冷冻干燥，得到装载表皮生长因子和L-谷氨酰胺的具有内核的中空二氧化硅球。
2.将得到的装载表皮生长因子和L-谷氨酰胺的具有内核的中空二氧化硅球超声分散在质量浓度为0.5％的明胶水溶液中，装载表皮生长因子和L-谷氨酰胺的具有内核的中空二氧化硅球在明胶水溶液中的终浓度为0.2mg/mL，冷冻干燥，得到装载了表皮生长因子和L-谷氨酰胺的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球。复合球的粒径为15μm。
3.将1g聚赖氨酸溶解在10ml水中，制成电纺丝液。将所配置的纺丝液加入到电纺丝装置的储液槽中，采用9号平头喷丝头，纺丝液流速为0.5ml/h，施加电压5kV进行电纺丝。在喷丝口上方15cm处的接收器上得到聚赖氨酸纤维。纤维平均直径约600微米。
4.将步骤2得到的装载了表皮生长因子和L-谷氨酰胺的具有内核的中空二氧化硅球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，装载了表皮生长因子和L-谷氨酰胺的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为0.4mg/mL；加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，使N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在上述乙醇溶剂中的浓度分别为1×10-3mol/L，混合均匀，室温充分反应30分钟，之后用磷酸盐缓冲液洗2次，在复合球的表面得到可与作为人体组织工程支架基材的胶原上的氨基共价偶联的羧基活化基团。将得到的羧基活化的复合球0.4mg/ml分散到含有浓度为0.4mg/ml的通过步骤3制备得到的聚赖氨酸纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应24小时，取出浸泡后的聚赖氨酸，用磷酸盐缓冲液洗3遍左右，得到负载有装载了可缓释表皮生长因子和L-谷氨酰胺的具有内核的中空二氧化硅球的聚赖氨酸纤维人体组织工程支架。
该人体组织工程支架可在人的皮肤受到损伤时，在对皮肤进行修复时将其作为皮肤的修复支架使用。
Claims (18)
1.一种负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，是通过装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶自组装为装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球，然后将其负载到由电纺丝方法制备得到的高分子聚合物纤维基材上而得到的；其特征是：
在作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维上负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球；
所述的高分子聚合物为氨基聚乙烯醇、端氨基聚乳酸、端氨基丙交酯与乙交酯的无规嵌段共聚物、端氨基丙交酯-乙二醇-乙交酯的无规或嵌段共聚物、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙二胺、聚酰胺、聚乙醇胺、端氨基聚乙二醇、聚赖氨酸、聚γ-谷氨酸、聚天冬氨酸、聚精氨酸、聚天冬酰胺、甲壳素、壳聚糖、聚氨基-β-环糊精、明胶、胶原、氨基聚糖、蚕丝蛋白、蜘蛛丝蛋白、氨基纤维素或氨基淀粉。
2.根据权利要求1所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，其特征是：所述的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球中还装载了营养物质。
3.根据权利要求1或2所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，其特征是：所述的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球的粒径为1μm～1000μm。
4.根据权利要求1或2所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，其特征是：所述的具有内核的中空二氧化硅亚微米球的粒径在100～1000nm之间，外壳厚度在20～200nm之间；在该中空二氧化硅亚微米球的中空腔内有一粒径为50～500nm的可移动的球形二氧化硅内核；该中空二氧化硅亚微米球具有介孔结构，介孔的孔径为3～50nm；该中空二氧化硅亚微米球的比表面积为100～1000m2/g。
5.根据权利要求3所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，其特征是：所述的具有内核的中空二氧化硅亚微米球的粒径在100～1000nm之间，外壳厚度在20～200nm之间；在该中空二氧化硅亚微米球的中空腔内有一粒径为50～500nm的可移动的球形二氧化硅内核；该中空二氧化硅亚微米球具有介孔结构，介孔的孔径为3～50nm；该中空二氧化硅亚微米球的比表面积为100～1000m2/g。
6.根据权利要求1所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，其特征是：所述的细胞生长因子选自转化生长因子，表皮生长因子，血管内皮生长因子，碱性成纤维生长因子，神经生长因子，软骨调节素，神经胶质生长因子，血小板衍化生长因子，肝细胞生长因子，人角朊细胞生长因子，胰岛素样生长因子，骨形态发生蛋白中的一种或大于一种以上。
7.根据权利要求2所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，其特征是：所述的营养物质选自维生素A，维生素B，维生素C，维生素D，维生素E，维生素K，色氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，缬氨酸，赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，L-谷氨酰胺，嘌呤，嘧啶，葡萄糖，果糖，半乳糖，乳糖，蔗糖，麦芽糖，胆酸，胆碱，固醇，肌酸，前列腺素，肾上腺素，胰岛素，胆固醇，磷脂，糖脂，血红蛋白，核糖，脱氧核糖中的一种或大于一种以上。
8.根据权利要求1所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架，其特征是：所述的作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维的直径为10nm～1000μm。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
1)将具有内核的中空二氧化硅亚微米球浸泡在细胞生长因子水溶液中，在温度为4℃下搅拌，然后在温度为4℃下离心，用去离子水清洗所得固体产物，冷冻干燥，得到装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球；
2)将步骤1)得到的装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球超声分散在明胶水溶液中，然后冷冻干燥，得到装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球；
3)将步骤2)得到的装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球分散在乙醇溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，混合均匀，室温下充分反应，之后用磷酸盐缓冲液洗涤，在复合球的表面得到与作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物上的氨基共价偶联的羧基活化基团；将得到的羧基活化的复合球分散到含有通过电纺丝方法制备得到的作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维的磷酸盐缓冲分散液中，4℃下反应，取出浸泡后的高分子聚合物纤维，用磷酸盐缓冲液洗涤，得到负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球的人体组织工程支架；
所述的高分子聚合物为氨基聚乙烯醇、端氨基聚乳酸、端氨基丙交酯与乙交酯的无规嵌段共聚物、端氨基丙交酯-乙二醇-乙交酯的无规或嵌段共聚物、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙二胺、聚酰胺、聚乙醇胺、端氨基聚乙二醇、聚赖氨酸、聚γ-谷氨酸、聚天冬氨酸、聚精氨酸、聚天冬酰胺、甲壳素、壳聚糖、聚氨基-β-环糊精、明胶、胶原、氨基聚糖、蚕丝蛋白、蜘蛛丝蛋白、氨基纤维素或氨基淀粉。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征是：步骤1)中是将10-3～10g具有内核的中空二氧化硅亚微米球浸泡在浓度为10-3～10mmol/L的细胞生长因子水溶液中。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征是：细胞生长因子水溶液中还含有营养物质。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征是：装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球在明胶水溶液中的终浓度为10-3～100mg/mL。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征是：装载了细胞生长因子和营养物质的具有内核的中空二氧化硅亚微米球在明胶水溶液中的终浓度为10-3～100mg/mL。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其特征是：明胶水溶液的质量浓度为0.05～10％。
15.根据权利要求9所述的方法，其特征是：步骤3)中装载了细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅亚微米球与明胶组成的复合球在乙醇溶剂中的浓度为10-2～102mg/mL；N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺在乙醇溶剂中的浓度分别为10-7～10-3mol/L。
16.根据权利要求9所述的方法，其特征是：步骤3)中磷酸盐缓冲分散液中含有的通过电纺丝方法制备得到的作为人体组织工程支架基材的高分子聚合物纤维是10-2～102mg/mL。
17.一种根据权利要求1～8任一项所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架的用途，其特征是：所述的负载了缓释细胞生长因子的具有内核的中空二氧化硅球的人体组织工程支架用于制备作为人体组织或器官的修复或重建的支架。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征是：所述的人体组织或器官包括肝脏、神经、骨、软骨、肾脏、膀胱、血管、皮肤或心脏。
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