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CN101622345B - 新β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶、编码该酶的基因和提高酶活性的方法 - Google Patents

新β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶、编码该酶的基因和提高酶活性的方法 Download PDF

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CN101622345B CN2008800069620A CN200880006962A CN101622345B CN 101622345 B CN101622345 B CN 101622345B CN 2008800069620 A CN2008800069620 A CN 2008800069620A CN 200880006962 A CN200880006962 A CN 200880006962A CN 101622345 B CN101622345 B CN 101622345B
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Abstract

本发明提供反应最适pH在中性至碱性范围内的、极其有用的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶以及编码该唾液酸转移酶的核酸。本发明进一步提供含有编码该唾液酸转移酶的核酸的载体，以及用该载体转化的宿主细胞，并且提供制备重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的方法。

Description

新β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶、编码该酶的基因和提高酶活性的方法
技术领域
本发明涉及：新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶、编码该酶的基因、以及该酶的生产方法，所述该酶的生产方法中使用了用编码该酶的基因转化的微生物。 
背景技术
糖转移酶是与生物体内的糖蛋白、糖脂等(以下称复合糖)的糖链的生物合成相关的酶。其反应生成物即复合糖的糖链在生物体内具有非常重要的功能。例如，已知糖链是一种重要的分子，其主要在哺乳动物细胞中作为处于分化、发育的细胞间及细胞-细胞外基质间的信号传导、复合糖的靶标而发挥作用。 
作为其应用例，可以列举出生产血液中的红血球的激素——促红细胞生成素。天然的促红细胞生成素存在效果持续性差的缺点。因此，促红细胞生成素本来是一种糖蛋白，通过附加新的糖链开发了可延长在生物体内的寿命的重组促红细胞生成素蛋白，并生产且实现了商品化。今后，此类附加或改变糖链的医药品、功能性食品等的开发也会越来越多。因此，寻求开发一种可任意合成/生产糖链的方法。其中，一种最有效的方法是糖转移酶的开发，其重要性越来越明显。 
至今为止，已经从人、小鼠、大鼠和酵母等真核生物中分离出约150种以上的糖转移酶基因。并已进一步在CHO细胞、大肠杆菌等宿主细胞中表达了该基因，且生产出具有糖转移酶活性的蛋白质。另一方面，从原核生物细菌中也分离出约20～30种糖转移酶基因，并已进一步在使用大肠杆菌的重组生产系统中表达具有糖转移酶活性的蛋白质，还阐明了其底物特性、各种酶化学性质。 
由于唾液酸多存在于糖链的非还原末端，对于糖链功能的表达，是极为重要的糖。于是，在糖转移酶中，唾液酸转移酶是需求最大的酶的一种。关于β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其基因，有很多动物，特别是哺乳类 动物来源的酶的报道(Hamamoto，T.，et al.，Bioorg.Med.Chem.，1，141-145(1993)；Weinstein，J.，et al.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987))。但由于这些动物来源的酶很难纯化，不能大量获得，所以其价格很高，而且存在酶稳定性差的问题。另一方面，有报导称已从属于美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的微生物中获得了细菌来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其基因(国际公开第WO98/38315号；美国专利6255094号公报；Yamamoto，T.，et al.，J.Biochem.，120，104-110(1996))。 
有报导称：目前已知的各种哺乳动物、细菌来源的唾液酸转移酶的反应最适pH范围均在5～6的酸性范围内(Paulson，J.C.et al.，J.Biol.Chem.，252，2363-2371(1977)、Yamamoto，T.，et al.，J.Biochem.，120，104-110(1996))。众所周知，结合在各种糖蛋白、糖脂等复合糖糖链或单纯糖链上的唾液酸在酸性条件下会缓慢分解。而且，已知CMP-唾液酸是唾液酸转移酶的糖供体底物，其价格极其昂贵，该CMP-唾液酸在酸性条件下迅速分解，但在碱性条件下极其稳定。因而，在使用唾液酸转移酶将唾液酸转移到各种复合糖、糖链上时，无论从反应后所得的含唾液酸的糖链的稳定性/保存性的观点来看，还是从有效利用唾液酸转移反应中使用的CMP-唾液酸的观点来看，均要求反应最适pH在中性至碱性的唾液酸转移酶。 
专利文献1：国际公开第WO98/38315号小册子 
专利文献2：美国专利6255094号公报 
非专利文献1：Hamamoto，T.，et al.，Bioorg.Med.Chem.，1，141-145(1993) 
非专利文献2：Weinstein，J.，et al.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987) 
非专利文献3：Yamamoto，T.，et al.，J.Biochem.，120，104-110(1996) 
非专利文献4：Paulson，J.C.et al.，J.Biol.Chem.，252，2363-2371(1977) 
发明内容
发明所要解决的问题 
本发明的课题是：提供属于弧菌科发光杆菌属的微生物来源的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶、和编码该酶的基因。更具体地，本发明的目的是：提供反应最适pH为中性至碱性的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶和编码 该酶的基因。 
此外，本发明的课题是：提供利用本发明的编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的基因、通过基因重组技术高效生产该酶的方法。 
本发明的课题的目的还在于：提供提高利用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行的唾液酸转移反应的效率的方法。 
解决问题的方法 
本发明人等分离了来自日本全国的4000个菌株以上的微生物，对其性质进行了深入研究，结果在属于发光杆菌属(Photobacterium)的微生物菌株中发现了产生β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的菌株。然后，将公知基因即美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的DNA作为探针，由该菌株克隆了新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因。使该新基因在大肠杆菌中表达，结果发现该基因编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，该酶蛋白的反应最适pH为7～9.5。进而，将该新重组酶纯化，详细分析后结果发现，该重组酶将唾液酸以α2，6键高效转移至单糖糖链中的半乳糖残基、N-乙酰半乳糖胺残基等处，从而完成了本发明。本发明提供反应最适pH在中性至碱性范围的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其编码核酸、以及生产该唾液酸转移酶的方法。 
以下，对本发明进行详细说明。 
β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶
本发明提供新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶。在本说明书中，“β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶”是指，具有使唾液酸由一磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转移至下述位置的活性的蛋白质，所述位置为：复合糖糖链或游离糖链中的半乳糖残基的6位，或者存在于乳糖或N-乙酰半乳糖胺等寡糖中的半乳糖残基的6位，或者半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖等可构成复合糖且6位的碳上有羟基的单糖的6位。在本说明书中，“β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性”指β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的上述活性。此外，这里所述的唾液酸是指属于唾液酸家族的神经氨酸衍生物。具体地是指N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)、5-脱氨基-5羟基神经氨酸(KDN)、二唾液酸(ジシァル酸)(二N-乙酰神经氨酸：Neu5Acα2，8(9)Neu5Ac)等。 
本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶是含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。此外，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶还可以是含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO：4的氨基酸序列为在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中去除第1-15位的氨基酸、并在其N末端添加甲硫氨酸而得到的序列。如后述的实施例2所示，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质保持了与包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质相同的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性。这表明：SEQ ID NO：2中存在至少氨基酸16-497即可保持β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性。因此，本发明的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶还可以是包含在SEQ ID NO：2的氨基酸1-497中缺失氨基酸1-15的全部或一部分而成的氨基酸序列的蛋白质、或者包含SEQ ID NO：2的氨基酸16-497的氨基酸序列的蛋白质。 
此外，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶是由包含SEQ ID NO：1的碱基序列的核酸编码的蛋白质。本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶还可以是由包含SEQ ID NO：3的碱基序列的核酸编码的蛋白质。SEQ IDNO：3的碱基序列相当于在SEQ ID NO：1的碱基46-1494的碱基序列的5’末端添加起始密码子(ATG)而得到的序列。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的碱基序列分别编码SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。此外，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶还可以是由包含SEQ ID NO：1的碱基46-1494的碱基序列的核酸编码的蛋白质。 
本发明还包括下述变体蛋白，其为上述本发明β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的变体，且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性。这样的变体蛋白也包含于本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶中。 
本发明的变体蛋白可以是含有下述氨基酸序列、且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质：所述氨基酸序列是在选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4的氨基酸序列中包含1个或多个或者1个或数个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而得到的氨基酸序列。取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。 
因氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而成的变体可以通过对编码野 生型蛋白质的DNA实施例如公知的定点诱变(参见例如Nucleic AcidResearch，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用其全文引入本说明书)来产生。在本说明书中，“一个或多个氨基酸”指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。 
就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，以上述合成寡核苷酸为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50％的新菌落含有作为单链的具有突变的噬菌体，其余的50％携带原序列。在合适的温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶而标记的合成探针杂交，所述合适的温度指该温度下所述探针与和带有目的突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。 
而且，在保持其活性的同时对酶等生物活性肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变物处理基因的方法，以及选择性地断开基因，然后删除、取代、插入或添加选定核苷酸，再进行连接的方法。 
本发明的变体蛋白可以是由包含下述碱基序列的核酸编码且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质：其中所述碱基序列是在选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：3中的碱基序列中包含1个或多个或者1个或数个的核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加而成的碱基序列。核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加除了定位诱变外，还可采用上述方法进行。 
本发明的变体蛋白还可以是含有下述氨基酸序列且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少60％以上，优选65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上，更优选99.5％以上的氨基酸同一性。 
此外，本发明的变体蛋白还可以是由下述核酸编码且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，所述核酸与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3的碱基序列具有至少70％以上，优选75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上，更优选99.5％以上 的同一性。 
两个氨基酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定。或者两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Bol.，48：443-453，1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来决定。GAP程序优选的默认参数包括：(1)Henikoff，S.以及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)所记载的得分/矩阵、blosum62；(2)一个空位扣12分；(3)连续空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。 
也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比，例如：Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)中记载的可用BLAST程序对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bank ofJapan(DDBJ)网站使用。在相同站点，对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常用默认值进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。 
两个核酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定，此外，该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG；威斯康星州Madison)的威斯康星·软件包、10.0版“GAP”程序(Devereux，等.，1984，Nucl.Acids R es.，12：387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列、并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。此处，“GAP”程序的优选默认参数包括：(1)实行关于核苷酸的(包括相同物质为1，不同物质为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG时，如Schwartz和Dayhoff主编的“多肽序列及结构图谱(Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)”(国立生物医学研究财团，353-358页，1979年)所记载的Gribskov及Burgess(Nucl.AcidsRes.，14：6745，1986)的加权氨基酸比对矩阵；或其它可比对的比对矩阵；(2)氨基酸的各空位罚分30，各空位中的各记号追加1罚分；此外，核苷酸序列的各空位罚分50，各空位中的各记号追加3罚分；(3)末端空位不罚分；以及(4)长空位没有最大罚分。技术人员使用的其它序列比较程序 中，可使用例如美国国立医学图书馆的网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html提供的版本2.2.7的BLASTN程序、或UW-BLAST2.0算法。关于UW-BLAST2.0标准默认参数的设定，以下网站：http://blast.wustl.edu中有记载。而且，BLAST算法使用BLOSUM62氨基酸得分矩阵，可使用的选择参数如下：(A)包含括具有低组成复杂性的提问序列片断(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)确定；参考Wootton及Federhen，1996”序列数据库中组成偏移区域的分析(Analysis of compositionally biasedregions in sequence databases)”Methods Enzymol.，266：544-71)，或掩蔽短周期性内部重复形成片段(由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序确定)的滤器，以及(B)用于报告数据库序列匹配的有统计学意义的阈值，或根据E-得分(Karlin和Altschul，1990)统计学模型得到的单纯偶然发现匹配的期待几率；某种匹配引起的有统计学意义的差值大于E-得分阈值时，不能报告该匹配；优选E-得分阈值的数值为0.5，此外按照优选度增大的顺序依次为0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、1e-100。 
本发明的变体蛋白也可以是由含有下述碱基序列的核酸编码的、具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，所述碱基序列在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3中的碱基序列的互补链杂交。 
此处，所说的“严格条件下”是指在中度或高度的严格条件下进行杂交。中度严格条件的具体例为根据DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人员能够容易的确定。基本条件如Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版，第6-7章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001所示，而且关于硝基纤维素滤膜，其可使用的情况包括：5×SSC、0.5％SDS、1.0mEDTA(pH8.0)的预洗涤溶液、约40-50℃约50％的甲酰胺、2×SSC-6×SSC(或约42℃、约50％甲酰胺中的Stark’s溶液等其它类似的杂交液)的杂交条件，以及例如在约40℃-60℃，0.5-6×SSC，0.1％SDS的洗涤条件下使用。优选中度严格条件包括约50℃，6×SSC的杂交条件(以及洗涤条件)。关于高度严格条件，例如根据DNA长度，本领域技术人员能够容易的确定。 
通常，该条件包括较中度严格条件更高温度和/或更低盐浓度的杂交(例如：约65℃，6×SSC-0.2×SSC，优选6×SSC，更优选2×SSC，最优选0.2×SSC 的杂交)和/或洗涤，例如可定义为上述杂交条件以及伴随大约65℃-68℃，0.2×SSC，0.1％SDS的洗涤。关于杂交及洗涤的缓冲液，可以SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4以及1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl以及15mM柠檬酸钠)使用，在杂交结束后15分钟进行洗涤。 
此外，也可使用探针中不使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体可以举例，使用ECL direct labeling&detection system(Amersham公司制)的杂交等。严格杂交条件的例子为，向试剂盒的杂交缓冲液中加入封闭试剂5％(w/v)、NaCl 0.5M，于42℃进行杂交4小时，关于洗涤，在0.4％SDS、0.5xSSC中，55℃条件下每次20分钟，洗涤两次，在2xSSC中，室温条件下，每次5分钟，洗涤一次。 
唾液酸转移酶活性可以采用公知方法测定，例如采用J.Biochem.，120，104-110(1996)(通过引用将其全文引入本文)中记载的方法。例如，以CMP-NeuAc(N-乙酰神经氨酸)为糖供体底物、以乳糖为糖受体底物进行酶反应，通过评价反应生成物唾液酸乳糖的量可以评价酶活性。此外，1单位(1U)酶为每分钟转移1微摩尔唾液酸的酶量。 
作为确定转移至糖受体底物的唾液酸的结合形式的方法，可以采用任何本领域技术人员公知的方法进行，例如但不限于使用吡啶氨基化糖链的方法、采用核磁共振分光法(NMR)对反应生成物进行分析等。使用吡啶氨基化糖链的方法中包括以吡啶氨基化糖链为糖受体底物进行酶反应。具体地，以吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio产品)为糖受体底物、以CMP-NeuAc为糖供体底物进行酶反应，对反应生成物进行高效液相色谱(HPLC)分析，由反应生成物的保留时间判断唾液酸转移的位置。 
在本发明的一类实施方式中，本发明的酶是源自属于发光杆菌属的微生物。本发明的酶只要是来自属于发光杆菌属的微生物即可，没有特别的限制，也可以是源自属于发光杆菌属新种的微生物的酶。在优选实施方式中，本发明的酶来源于属于鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)的微生物。 
本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的酶学性质和理化性质，除以具有上述定义的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性为特征外，并非限定，其最适pH在pH7～pH9.5的范围，优选pH7.5～pH9.5、pH7.5～pH9、pH8～pH9的范围，更优选pH8。此外，β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的特征还可以 是最适温度为25～30℃、和/或分子量用SDS-PAGE分析为50,000±5,000Da左右。 
此外，与在其它缓冲液例如醋酸缓冲液、二甲胂酸缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、TAPS缓冲液、CHES缓冲液、CAPS缓冲液等中使用相比，在含磷酸缓冲液的反应液中使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，显示高酶活性。因此，本发明提供本本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的应用，其中，在具有含磷酸缓冲液的组成的反应液中使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶。在本说明书中，磷酸缓冲液应理解为本领域技术人员通常使用的含义。在优选的实施方式中，磷酸缓冲液是指含磷酸根离子(PO4 3-)作为缓冲剂的构成成分的缓冲液。在更优选的实施方式中，磷酸缓冲液可以为包含选自磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、以及它们的组合中的缓冲剂的缓冲液。此外，当在含磷酸缓冲液的反应液中使用本发明的酶时，优选在最适pH即pH7～pH9.5的范围进行使用。 
编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸
本发明提供编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸。 
本发明的核酸是编码含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4中的氨基酸序列的蛋白质的核酸。此外，本发明的核酸是含有选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：3中的碱基序列的核酸。 
本发明的核酸还可以是上述核酸的变体，所述变体编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质。这样的核酸也包含于本发明的编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸之中。 
这样的核酸的变体是编码含有下述氨基酸序列且具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质的核酸：所述氨基酸序列是在选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4中的氨基酸序列中发生1个或多个、或者1个或数个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而成的氨基酸序列。此外，本发明的核酸的变体是含有下述碱基序列的核酸，所述碱基序列是在选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3的碱基序列中发生1个或多个、或者1个或数个核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加而成的碱基序列。氨基酸或核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加可通过上述方法导入。 
此外，这样的核酸的变体还可以是编码含有下述氨基酸序列、且具有β- 半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质的核酸：所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少60％以上，优选65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上，更优选99.5％以上的同一性。本发明的核酸的变体还可以是与如下所述的碱基序列具有优选70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上，更优选99.5％以上的同一性且编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质的前述核酸：所述碱基序列选自对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3进行添加而得到的序列中的碱基序列。这里，氨基酸序列或碱基序列的同一性可以用前面描述的方法确定。 
这样的核酸的变体还可以是含有下述碱基序列、且编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质的前述核酸：所述碱基序列在严格条件或高度严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3中的碱基序列的互补链杂交。这里，严格条件或高度严格条件的定义同上。 
本发明的核酸编码的蛋白质除以具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性为特征外，并非限定，其酶活性的最适pH在pH7～pH9.5的范围，优选pH7.5～pH9.5、pH7.5～pH9、pH8～pH9的范围，更优选pH8。此外，本发明的核酸编码的蛋白质的特征还可以是最适温度为25～30℃、和/或该蛋白质的分子量用SDS-PAGE分析为50,000±5,000Da左右。 
表达β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的微生物
本发明人发现，属于弧菌科发光杆菌属的微生物表达新的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶。因而，本发明提供表达本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的分离出的微生物。本发明的微生物是属于发光杆菌属且具有产本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶能力的分离出的微生物。在优选的实施方式中，本发明的微生物是属于鳆发光杆菌、且具有产本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的能力的分离出的微生物。而且，上述的发光杆菌属微生物通常为海洋性细菌，其可从海水中或海产鱼贝类中分离。 
本发明的微生物例如可以采用诸如以下说明的筛选方法进行分离。以海水、海砂石、海泥或海产鱼贝类作为微生物源。将海水、海砂石或海泥直接或用灭菌海水稀释后作为接种源。对于海产鱼贝类，可以用接种环擦取其表面粘液等作为接种源，或者以在灭菌海水中磨碎其内脏而得的液体 作为接种源。将这些涂布在Marine Broth Agar 2216培养基(Becton·Dickinson产)、添加了氯化钠的Nutrient Agar培养基(Becton·Dickinson产)等平板培养基上，获得在各种温度条件下生长的海洋微生物。按常规方法对所得的微生物进行纯培养后，使用Marine Broth 2216培养基(Becton·Dickinson产)、添加了氯化钠的Nutrient Broth(Becton·Dickinson产)等液体培养基对各微生物进行培养。在微生物充分生长后，由培养液通过离心分离收集菌体。向收集的菌体加入含表面活性剂即0.2％TritonX-100(关东化学产)的20mM二甲胂酸盐(カコジレ一ト)缓冲液(pH6.0)，悬浮菌体。在冰冷却条件下对该菌体悬液进行超声波处理，破碎细胞。以此细胞破碎液为酶溶液，按常规方法测定唾液酸转移酶活性，可以获得具有唾液酸转移酶活性的菌株。 
鳆发光杆菌JT-SHIZ-145株是采用上述的筛选方法得到的，其生产作为本发明的酶描述的、具有反应最适pH在7.0～9.5的特征的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶。 
生产重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的方法
本发明还涉及本发明的生产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的方法。在优选实施方式中，本发明的方法生产本发明的酶。 
本发明提供包含编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。而且，本发明还提供通过在适合重组蛋白表达的条件下培养包含该表达载体的宿主细胞并回收表达的重组蛋白来生产重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的方法。 
为了生产本发明的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白，根据使用的宿主选择表达载体，在该载体上插入编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸序列，其中所述编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸序列可操作地连接于衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因等的适当的转录或翻译调控核苷酸序列。调控序列例如有转录启动子、操纵基因或增强子、mRNA核糖体结合位点以及调控转录和翻译的起始和终止的适宜序列。 
插入本发明的载体的编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸序列为编码上述本发明β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸的碱基序列。该序列可以含有也可以不含有前导序列。含有前导序列时，可以是相当于SEQ IDNO：1的核苷酸1-45的前导序列，此外上述前导序列还可以替换为其它生物 来源的前导序列。通过对前导序列进行替换，可以设计表达系统使得表达的蛋白质分泌至宿主细胞外。 
此外，本发明的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白还可以表达为融合蛋白的形式，这是通过在载体上插入下述核酸而实现的：该核酸中在编码该酶的核酸之后连接了编码His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶等的核酸。以这样的融合蛋白的形式表达本发明的酶，可以使该酶易于纯化和检测。 
适于β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的表达的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。可在细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主中使用的适宜克隆和表达载体记载于例如Pouwels等、Cloning Vectors：ALaboratory Manual，Elsevier，New York，(1985)(通过引用将其全部内容并入本文)。 
原核生物中包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌或枯草杆菌。当用大肠杆菌这样的原核细胞作为宿主时，为了易于原核细胞内表达重组多肽，可以使β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白包含N末端甲硫氨酸残基。这个N末端甲硫氨酸残基可以在表达后从重组α2，6-唾液酸转移酶蛋白上切除。 
在原核宿主细胞内使用的表达载体一般含有1个或2个以上可以进行表型选择的标记基因。可以进行表型选择的标记基因例如赋予抗生素抗性或独立营养缺陷型(独立栄養要求性)的基因。适于原核宿主细胞的表达载体的例子包括pBR322(ATCC37017)这样的商品化质粒或者它们的衍生物。pBR322携带氨苄青霉素抗性和四环素抗性基因，易于对转化细胞进行鉴定。该pBR322载体内可以插入合适的启动子和编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的核酸的DNA序列。其它的商品化载体还包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(PromegaBiotech.，Madison，Wisconsin，America)等。 
在用于原核宿主细胞的表达载体中通常使用的启动子序列包括tac启动子、β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子、乳糖启动子(Chang等、Nature 275：615，1978；和Goeddel等、Nature 281：544，1979；通过引用，其全文引入本说明书)等。 
此外，可以在酵母宿主内表达重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。 优选使用酵母属(Saccharomyces，例如酿酒酵母(S.Cerevisiae))，也可以使用毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)等其它的酵母的属。酵母载体大多含有来自2μ酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区、用于聚腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列以及可选择的标记基因。使用酵母α因子前导序列可以促使重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白分泌。适于用来促进重组多肽从酵母宿主中分泌的其它前导序列也是公知的。转染酵母的方法记载于例如Hinnen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：1929-1933，1978(通过引用将其全部内容并入本文)。 
使用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统也可以表达重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。也可以使用哺乳动物起源的确立细胞系(株化細胞系)。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译调控序列可以从病毒基因组获得。常用的启动子序列和增强子序列源自多瘤病毒、腺病毒2等。可以使用由SV40病毒基因组例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接位点和聚腺苷酸化位点衍生的DNA序列，赋予哺乳动物宿主细胞内结构基因序列表达所需的其它基因元件。在哺乳动物宿主细胞内使用的载体可以采用例如Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.，3：280，1983，通过引用将其全部内容并入本文)的方法构建。 
生产本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的一种方法包括在该蛋白质得以表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞，其中所述表达载体包含编码β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的核酸序列。然后，根据使用的表达系统，由培养培养基或细胞提取液回收β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。 
纯化重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的操作根据使用的宿主的形式以及本发明的蛋白质是否分泌至培养基中等重要因素适宜地选择。例如纯化重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的操作包括阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、CDP-己醇胺琼脂糖柱、CMP-己醇胺琼脂糖柱、疏水柱等柱层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等，或者它们的组合。此外，当与易化重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶纯化的标签等融合表达时，可以利用采用亲和层析的纯化方法。例如，当与组氨酸标签、FLAGTM标签或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等融合时，可以分别使用Ni-NTA(次氨基三乙酸)柱、结合有抗FLAG抗体的柱子或结合有谷胱甘 肽的柱子等、通过亲和层析进行纯化。 
重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶可以纯化至电泳单一条带，但由于部分纯化品也具有充分的活性，所以本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶可以是纯化品，也可以是部分纯化品。 
抗体
本发明提供抗本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白的抗体。本发明的抗体可以针对本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白或其片段进行制备。这里，本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的片段是具有下述序列的片段：所述序列包含该酶的氨基酸序列中至少6个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸或至少30个氨基酸。 
抗体可以用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶或其片段免疫本技术领域中用于抗体制备的动物进行制备，所述动物例如但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊等。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。抗体可以基于本领域技术人员公知的抗体制备方法进行制备。 
本发明的抗体可以用于亲和纯化回收本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。本发明的抗体可以用于在Western印迹、ELISA等测定法中检测本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶蛋白。 
提高β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的活性的方法
本发明还涉及在使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶来进行糖转移反应时，提高该反应的效率的方法。 
本发明人等发现：在使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应时，如果在其反应液中添加一价金属离子，则该反应的效率提高。 
因而，在一类实施方式中，本发明涉及：在使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应时，通过在一价金属离子的存在下进行该反应，使该反应的效率与不存在该一价金属离子的情况相比提高的方法。优选一价金属离子为钠离子、钾离子或锂离子，更优选为钠离子或钾离子。 
在本发明的方法中，以反应体系的总量为基准，一价金属离子的量为0.05M～2.0M、优选0.05M～1.5M、0.1M～1.5M、0.05M～1.0M、0.1M～1.0M。 
本发明人等发现：在使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应时，如果在其反应液中添加钙离子，则该反应的效率提高。 
因而，在一类实施方式中，本发明涉及：在使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应时，通过在钙离子的存在下进行该反应，使该反应的效率与不存在钙离子的情况相比提高的方法。 
在本发明的方法中，以反应体系的总量为基准，钙离子的量为1.0mM～2.0M、优选1.0mM～1.0M、1.0mM～500mM、1.0mM～100mM、5.0mM～2.0M、5.0mM～1.0M、5.0mM～500mM、5.0mM～100mM、5.0mM～50mM、5.0mM～25mM、5.0mM～20mM、10mM～100mM、10mM～50mM、10mM～25mM、10mM～20mM。 
此外，本发明者发现：在使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应时，如果在其反应液中添加选自磷酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子、硼酸根离子、氯离子、和氟离子中的阴离子，则该反应的效率提高。 
因而，在一类实施方式中，本发明涉及：在使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应时，通过在选自络离子(所述络离子选自磷酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子和硼酸根离子)、氯离子、氟离子以及它们的任意组合中的阴离子的存在下进行该反应，使该反应的效率与不存在该阴离子的情况相比提高的方法。在优选的实施方式中，阴离子为选自络离子(所述络离子选自磷酸根离子、硫酸根离子和硝酸根离子)、氯离子以及它们的任意组合中的阴离子。 
在本发明的方法中，以反应体系的总量为基准，阴离子的量为0.05M～2.0M，优选0.05M～1.5M、0.1M～1.5M、0.05M～1.0M、0.1M～1.0M。 
此外，在其它实施方式中，本发明涉及：在使用本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应时，通过在一价金属离子或钙离子与选自络离子(所述络离子选自磷酸根离子、硫酸根离子和硝酸根离子)和氯离子中的阴离子形成的盐的存在下进行该反应，使之与不存在该盐的情况相比，该反应的效率提高的方法。 
在本发明的方法中，对于进行酶反应的条件没有特殊限制，只要是本发明的唾液酸转移酶进行反应的条件即可。并非限定，酶反应溶液可以使用二甲胂酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、Bis-Tris缓冲液、TAPS缓冲液、CHES缓冲液、CAPS缓冲液等缓冲液。反应溶液的pH只要是本发明的唾液酸转移酶进行反应的条件即可，但更优选为pH7～9.5，进一步优 选为本发明的唾液酸转移酶的最适pH。此外，反应溶液的反应温度只要是本发明的唾液酸转移酶进行反应的条件即可，优选为本发明的唾液酸转移酶的最适温度。对于糖供体和糖受体浓度的条件没有特殊限制，只要是糖转移酶进行反应的条件即可，本领域技术人员能够适宜地设定这些浓度。 
在本发明的方法中，对于向糖转移酶的反应体系中添加一价金属离子、钙离子、阴离子和/或盐的时期没有特殊限制。例如，可以在酶反应前使其溶解在酶反应用缓冲液、酶溶液、糖受体底物溶液或糖供体溶液中；或者，可以与这些分开来制备适当浓度的一价金属离子、钙离子、阴离子和/或盐溶液，并将其添加到反应体系中。在与酶反应成分分开来制备一价金属离子、钙离子、阴离子和/或盐溶液的实施方式中，可以在即将开始反应前或反应途中将一价金属离子、钙离子、阴离子和/或盐添加到反应体系中。 
在本说明书中，一价金属离子、钙离子、阴离子和/或盐的存在下是指下述状态：除反应溶液的缓冲剂之外，另行在反应液中添加了一价金属离子、钙离子、阴离子和/或盐。 
在本发明的方法中，酶活性提高或反应效率提高是指：通过在一价金属离子、钙离子、阴离子和/或盐的存在下进行该反应，该反应的效率与不存在其的情况相比有所提高。在优选的实施方式中，酶活性提高或反应效率提高是指：通过在一价金属离子、钙离子、阴离子和/或盐的存在下进行该反应，与不存在其的情况相比，酶的相对活性大于1倍、更优选大于1.1倍、更优选大于1.2倍。对于增加后的酶活性的上限没有特殊限制，优选为10倍以下、5倍以下、3倍以下、2倍以下。 
发明的效果 
本发明提供新的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其编码核酸，从提供已逐渐明确在生物体内具有重要功能的糖链的合成/生产手段的观点考虑做出了贡献。尤其是本发明的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，与现有酶相比，反应最适pH为中性至碱性，而且受体底物特异性范围广。唾液酸多存在于生物体内复合糖糖链的非还原末端，从糖链功能的角度考虑是极为重要的糖，因此唾液酸转移酶是糖转移酶中需求最高的酶之一，而本发明提供新的唾液酸转移酶正回应了这样的高需求。 
附图说明
图1-1为显示从培养大肠杆菌所得的菌体制备的粗酶液在吡啶氨基化乳糖(PA-乳糖)和CMP-唾液酸中反应后反应液的HPLC分析结果的图，其中，所述大肠杆菌是用包含鳆发光杆菌JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因(SEQ ID NO：3)的表达载体转化的。保留时间为3.967分钟的峰是PA-乳糖，保留时间为4.452分钟的峰是PA-6’-唾液酸乳糖。 
图1-2为显示将从培养大肠杆菌所得的菌体制备的粗酶液与吡啶氨基化(PA)乳糖混合后的HPLC分析结果的图，其中，所述大肠杆菌是用包含鳆发光杆菌JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因(SEQ ID NO：3)的表达载体转化的。与图1-1的实验相比较，图1-2为反应液中未混合唾液酸供体CMP-唾液酸的对比实验结果。保留时间为3.962分钟的峰是PA-乳糖。 
图1-3为显示PA-乳糖标准品的HPLC分析结果的图。PA-乳糖体现为保留时间为3.973分钟的峰。 
图1-4为显示公知酶美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶在PA-乳糖和CMP-唾液酸中反应后的反应液(生成吡啶氨基化α2，6-唾液酸乳糖)的HPLC分析结果的图。保留时间为3.981分钟的峰为PA-乳糖，保留时间4.470分钟的峰为PA-6’-唾液酸乳糖。 
图1-5为显示公知酶美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶在PA-乳糖中反应后的反应液的HPLC分析结果的图。与图1-4的实验相比较，图1-5为反应液中未混合CMP-唾液酸的对比实验。保留时间为3.976分钟的峰是PA-乳糖。 
图2-1为图表，显示了反应pH对鳆发光杆菌JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的酶活性的影响。所用的缓冲液的种类、pH范围如下：醋酸缓冲液(pH4-5)、二甲胂酸缓冲液(pH5-6)、Bis-Tris缓冲液(pH6-7)、磷酸缓冲液(pH6-9.5)、Tris-盐酸缓冲液(pH7-9)、TAPS缓冲液(pH8-9)、CHES缓冲液(pH9-10)、CAPS缓冲液(pH10-11)。 
图2-2为图表，显示了反应温度对鳆发光杆菌JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性的影响。 
图3为图表，显示了各种盐的添加对鳆发光杆菌JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的酶活性的效果。 
图4为图表，显示了各种1价金属离子的添加对鳆发光杆菌JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ IDNO：4)的酶活性的影响。 
图5为图表，显示了钙离子的添加对鳆发光杆菌JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的酶活性的影响。 
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。基于本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。 
实施例1：生产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的微生物的筛选与菌株的鉴定
(1)筛选
以海水、海砂、海泥或海产鱼贝类作为接种源。将该接种源涂布在由Marine Broth Agar 2216培养基(Becton·Dickinson产)构成的平板培养基上，获取在15℃、25℃或30℃生长繁育的微生物。按常规方法对所得的微生物进行纯培养后，使用由Marine Broth 2216培养基(Becton·Dickinson产)构成的液体培养基对各微生物进行培养。在微生物充分生长后，由培养液通过离心分离收集菌体。向收集的菌体中加入含0.2％Triton X-100(关东化学产)的20mM二甲胂酸盐缓冲液(pH6.0)，悬浮菌体。在冰冷却条件下对该菌体悬液进行超声波处理，破碎细胞。以此细胞破碎液为粗酶溶液测定唾液酸转移酶活性，得到具有唾液酸转移酶活性的菌株JT-SHIZ-145株。 
唾液酸转移酶活性采用J.Biochem.，120，104-110(1996)(通过引用将其全部内容并入本文)中记载的方法测定。具体地说，使用反应溶液(30μl)进行酶反应，所述反应溶液中添加了糖供体底物CMP-NeuAc(70nmol、含20,000cpm用14C标记NeuAc的CMP-NeuAc。NeuAc表示N-乙酰神经氨酸)、糖受体底物乳糖(1.25μmol)和NaCl(使NaCl浓度为0.5M)，并 含有依照前文所述方法制备的酶。酶反应在25℃进行10-180分钟。反应结束后，向反应溶液中加入5mM磷酸缓冲液(pH6.8)1.97ml，所得溶液上样于Dowex1×8(PO4 3-型、0.2×2cm、BIO-RAD产)柱。测定该柱的洗脱液(0～2ml)中所含的反应生成物即唾液酸乳糖中所含的放射活性，可以计算出酶活性。1单位(1U)酶为每分钟转移1微摩尔唾液酸的酶量。 
然后，为了明确唾液酸的连接方式，进行以PA-乳糖为底物的反应。用所得粗酶液，以吡啶氨基化糖链为糖受体底物进行酶反应。作为吡啶氨基化糖链使用吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio制造)进行了分析。向5μL粗酶液中加入1.5μL的5mM的CMP-NeuAc以及1.5μL的10pmol/μL的糖受体底物，25℃反应18小时。反应结束后，100℃处理反应溶液2分钟以使酶失活。然后用HPLC对反应生成物进行分析。HPLC系统使用Shimadzu LC10A(岛津制作所制造)，分析柱使用Takara PALPAK TypeR(TaKaRa Bio产品)。将加有72μL洗脱液A(100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)的反应液注入用含0.15％正丁醇的100mM醋酸-三乙胺(pH5.0)平衡的柱中。吡啶氨基化糖链的洗脱使用洗脱液A(100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)和洗脱液B(含0.5％正丁醇的100mM醋酸-三乙胺，pH5.0)，通过30～50％的洗脱液B的直线浓度梯度法(0-20分钟)和100％的洗脱液B(21～35分钟)，依次洗脱吡啶氨基化糖链。此外，分析采用以下的条件进行(流速：1ml/min、柱温：40℃、检测：荧光(Ex：320nm、Em：400nm))。结果表明：JT-SHIZ-145株具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性(图1-1～图1-5)。 
(2)基于16S rRNA基因碱基序列解析的JT-SHIZ-145株的细菌学鉴定
以采用常规方法从JT-SHIZ-145株抽提的基因组DNA为模板，通过PCR扩增了16S rRNA基因的部分碱基序列，并测定了碱基序列。 
可知：JT-SHIZ-145株的16S rRNA基因的DNA碱基序列与鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)模式株ATCC25521的16S rRNA基因的序列之间的同源性最高，其同源率为99.8％。由该结果，鉴定为：JT-SHIZ-145株是属于弧菌科发光杆菌属的微生物，其属于鳆发光杆菌。 
实施例2：JT-SHIZ-145株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的克隆和碱基序列的确定，以及该基因在大肠杆菌中的表达
(1)JT-SHIZ-145株中存在β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的确认
为了确认已明确具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的JT-SHIZ-145株中是否存在美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因(Yamamoto et al.(1996)J Biochem 120：104-110)、或JT-ISH-224株(保藏号：NITE BP-87)来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因(PCT/JP2006/304993)的同源物，实施了基因组Southern杂交。由约0.75g的JT-SHIZ-145株的菌体离心沉淀物(ペレット)，用Qiagen Genomic-tip500/G(Qiagen公司制)，按照试剂盒说明书的记载，制备约100μg的基因组DNA。然后，将数μg的JT-SHIZ-145株基因组DNA用限制性酶EcoRI、HindIII、BamH I、Xho I分别消化，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分级，电泳后，使用0.4M NaOH对凝胶进行碱印迹，将DNA转印到Hybond-N+尼龙滤膜(GE HEALTH BIOSCIENCES公司产)上。对于该滤膜，使用美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因(GenBank登录号：E17028)的部分片段(从ATG至HindIII的约1.2kb的EcoRI-HindIII片段)和JT-ISH-224株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因(N1C0克隆、PCT/JP2006/304993)作为探针，进行Southern杂交。杂交实验使用ECL directlabelling&detection system(GE HEALTH BIOSCIENCES公司产)。按试剂盒所附的说明书标记探针。杂交是在试剂盒的杂交缓冲液中加入5％(w/v)的封闭试剂及0.5M的NaCl，37℃(通常42℃)进行4小时。清洗是在0.4％SDS、0.5×SSC中50℃(通常55℃)进行2次、每次20分钟；然后在2×SSC中室温进行1次、5分钟。信号的检测按试剂盒所附的说明书进行。其结果：在使用JT0160株来源的探针时，检出了用EcoRI消化的约5.5kb的条带，用HindIII消化的约4.8kb的条带，以及用BamH I消化的4.8kb的条带；此外，在使用JT-ISH-224株来源的探针时，检出了用HindIII消化和BamH I消化的约4.8kb的条带。而且，将JT-SHIZ-145株的基因组DNA分别用限制性酶PstI、HincII进行消化，并同样地进行了杂交。其结果：使用美人鱼发光杆菌JT0160株来源和JT-ISH-224株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因这两个探针时，检出了用PstI消化的约1.6kb的条带、用HincII消化的约1.3kb的条带。由此可知：JT-SHIZ-145株中存在美人鱼发光杆菌JT0160株来源和JT-ISH-224株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因的同源物。 
(2)JT-SHIZ-145株中的包含β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的基因组片段的次级克隆
将1.6kb的PstI片段插入质粒载体pUC18，并通过菌落杂交进行了筛选，如上述，所述1.6kb的PstI片段被认为包含JT-SHIZ-145株来源β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的全长、且容易导入质粒载体。 
再次将JT-SHIZ-145株的基因组DNA用PstI消化，在TAE缓冲液中进行使用低熔点琼脂糖(SeaPlaqueGTG)的琼脂糖凝胶电泳。然后，切下包含1.6kb左右的DNA片段的部分的凝胶，加入与凝胶等量(v/w)的200mM的NaCl，在70℃处理10分钟，凝胶溶解。该样品分别用苯酚、苯酚·氯仿、氯仿各抽提一次，然后通过乙醇沉淀回收1.6kb的DNA片段。使用连接试剂盒(Takara公司产)将该片段连接于质粒载体pUC18的PstI部位(预先经脱磷酸化处理)。连接反应后，通过电穿孔将DNA转化入大肠杆菌TB1中，用含有氨苄西林(100g/mL)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LA琼脂培养基进行了培养。将被认为有DNA片段插入的400个白色菌落接种在添加了上述抗生素的其它LA琼脂培养基上。使Hybond-N+尼龙滤膜(GE HEALTH BIOSCIENCES公司产)与有菌落形成的平板的表面相接触，从而将菌落转印到膜上。然后，按膜附带的说明书进行碱处理，使DNA变性，固定在膜上。对于该膜，使用JT-ISH-224株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因作为探针进行了菌落杂交，结果在4个菌落中检出了信号。而且，探针的标记、杂交条件采用ECL系统按与上述相同的方法进行。 
将这些菌落接种在含氨苄西林的LB液体培养基上，37℃振荡培养一夜，按常规方法(Sambrook et al.1989，Molecular Cloning，A laboratory manual，2nd edition(其通过引用全部并入本说明书))抽提质粒，通过限制性酶分析确认了1.6kb片段的插入。 
(3)JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的全长碱基序列的确定
对于上述确认了插入DNA的质粒中的一个，使用M13引物(Takara公司产)，用ABI PRISM荧光测序仪(Model 310 Genetic Analyzer，PerkinElmer公司产)测定1.6kb的PstI片段两端的碱基序列。所得DNA序列用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETIC制作)翻译成氨基酸序列，通过BLAST程序对National Center for Biotechnology Information(NCBI)的 GeneBank数据库进行同一性检索。结果由一条DNA序列翻译而成的氨基酸序列与美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的氨基酸序列显示出有显著意义的同一性。显示同一性的区域的方向性表明1.6kb的PstI片段中含有完整的JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物。 
然后，为了完全确定JT-SHIZ-145株来源的该酶基因同源物的DNA序列，在由1.6kb PstI片段得到的DNA序列的基础上，合成下述两种引物： 
SHIZ145 26 N1(5’-GCCATCATTACAGCAGTTAATG-3’(22mer)，SEQID NO：5) 
SHIZ145 26 N2(5’-TGAGTATTCACAGAATGAGCGC-3’(22mer)，SEQID NO：6)， 
用于测定碱基序列。 
使用该引物测定了碱基序列，结果得到序列表中SEQ ID NO：1的序列。该序列为JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的开放阅读框(ORF)的全长碱基序列。JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的ORF由1494个碱基对组成，编码497个氨基酸。该氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO：2。用GENETYX Ver.7对DNA序列以及氨基酸序列进行分析时，JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的DNA序列与美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因有68.2％的同源性；此外，氨基酸序列方面与美人鱼发光杆菌JT0160株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶(JC5898)具有66.3％的同源性。而且，相对于JT-ISH-224株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因，碱基序列方面显示63.7％的同源性，而氨基酸序列方面显示55.1％的同源性。 
(4)JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物的表达载体的构建
为了确定克隆的基因是否编码具有唾液酸转移酶活性的蛋白质，将该基因同源物全长以及除去了编码N末端信号肽的部分的删除型基因整合入表达载体，在大肠杆菌内生成蛋白质，测定了该表达蛋白质的活性。 
对于JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物所编码的氨基酸序列，用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7进行分析时， 预测出N末端的15个氨基酸为信号肽。于是，设计、合成了用于克隆基因全长(本实施例中记为SHIZ145-N0C0)的引物组： 
SHIZ145N0 BspHI 
(5’-AAAGGGTCATGAAAAGAATATTTTGTTTA-3’(29mer)，SEQ ID NO：7)； 
和 
SHIZ145 C0 Hind 
(5’-ATGAGCAAGCTTTCAGCACCAAAATAGAACATC-3’(33mer)，SEQ IDNO：8)； 
以及用于克隆编码信号肽部分氨基酸删除型蛋白质的基因(本实施例中记为SHIZ145-N1C0)的引物组 
SHIZ145 N1 Pci 
(5’-TATACATGTGTAATGATAATCAGAATACAG-3’(30mer)，SEQ IDNO：9)；和 
SHIZ145 C0 Hind 
(5’-ATGAGCAAGCTTTCAGCACCAAAATAGAACATC-3’(33mer)，SEQ ID NO：8)。 
以含有1.6kb PstI片段的质粒为模板，使用这些引物进行PCR，扩增用于整合入表达载体的JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因同源物。PCR的反应条件按如下进行设定。50μL的反应液中含有模板DNA 500ng、10×PyroBest buffer II 5μl、2.5mM的每种dNTP 4μl、引物各50皮摩尔、PyroBest DNA Polymerase(Takara公司产)0.5μl，使用程序温度控制系统PC-700(ASTEK公司)进行PCR反应，条件为1个循环的96℃3分钟；5个循环的96℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟；1个循环的72℃6分钟。其结果是，SHIZ145-N0C0扩增了约1.5kb PCR产物，SHIZ145-N1C0扩增了约1.45kb PCR产物。将这些PCR产物克隆于载体pCR4TOPO(Invitrogen产)上。连接反应按载体试剂盒所附说明进行。采用电穿孔法将DNA导入大肠杆菌TB1，按常规方法(Sambrook等.1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版)提取质粒DNA。对于确认了插入的克隆，使用M13引物(Takara公司产)用ABI PRISM荧光测序仪(Model 310Genetic Analyzer，Perkin Elmer公司产)从PCR产物的两端开始测定其碱基序列。其结果，确认克隆了没有突变的SHIZ145-N0C0(SEQ ID NO：1)和 SHIZ145-N1C0(SEQ ID NO：3)。 
对于确认了碱基序列的SHIZ145-N0C0以及SHIZ145-N1C0的克隆，经限制酶BspHI和HindIII(对于SHIZ145-N0C0)、或限制酶PciI和HindIII(对于SHIZ145-N1C0)双重消化后，像上述那样进行了DNA片段的凝胶纯化。大肠杆菌表达用载体使用pTrc99A(Pharmacia LKB产)。使用连接试剂盒(Takara公司产)将用限制酶NcoI和HindIII对该载体进行双重消化、纯化后的产物与如上述制备的SHIZ145-N0C0以及SHIZ145-N1C0的DNA片段进行连接，并转化大肠杆菌TB1。用常规方法提取质粒DNA，进行限制酶分析，确认了DNA片段整合到表达载体中，从而制作了SHIZ145-N0C0/pTrc99A以及SHIZ145-N1C0/pTrc99A。 
(5)诱导表达和活性测定
在上述得到的2种表达载体中，使用SHIZ145-N1C0/pTrc99A，进行蛋白质诱导表达实验。将携带整合了SHIZ145-N1C0克隆(SEQ ID NO：3)的表达载体pTrc99A的大肠杆菌TB1的单菌落接种于含抗生素氨苄西林(终浓度100μg/mL)的LB培养基(6ml)中，30℃进行前培养至A600＝0.5左右，然后加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷，和光纯药工业产)开始诱导表达，30℃进一步振荡培养一夜。通过离心分离收集2ml培养液中的菌体。将这些菌体悬浮于400μl含0.336％TritonX-100的20mMBis-Tris缓冲液(pH6.0)中，在冰冷却下进行超声波破碎。所得的破碎液作为粗酶液，用于唾液酸转移活性的测定。方法按J.Biochem.，120，104-110(1996)(其通过引用全部并入本说明书)的记载进行。具体地说，混合糖供体底物CMP-NeuAc(70nmol、含20,000cpm用14C标记NeuAc的CMP-NeuAc。NeuAc表示N-乙酰神经氨酸)、0.5M的NaCl、糖受体底物120mM的乳糖和按上述方法制备的粗酶液5μl，在30℃进行反应30分钟。然后，用5mM磷酸缓冲液(pH6.8)1.97ml终止反应，将该溶液上样于Dowex1×8(PO4 3- 型、0.2×2cm、BIO-RAD产)柱。测定该柱的洗脱液中所含的反应生成物，即唾液酸乳糖中所含的放射活性，计算出了酶活性。测定进行2次，表明：含SHIZ145-N1C0的大肠杆菌的粗酶液中存在将糖供体CMP-NeuAc中的 14C标记的NeuAc转移至糖受体底物乳糖的活性、即唾液酸转移酶活性。具体地，使用由整合了未插入插入物的pTrc99A载体的大肠杆菌制备的破碎液时(阴性对照)，放射活性为156cpm；与此相对，使用由整合了带有 SHIZ145-N1C0克隆的表达载体pTrc99A的大肠杆菌制备的破碎液时，放射活性为8326cpm。 
由以上可知：克隆的同源物是编码JT-SHIZ-145株来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶(SEQ ID NO：4)的基因(SEQ ID NO：3)。 
[表1] 
表1由导入了SHIZ145-N1C0/pTrc99A的大肠杆菌制备的粗酶溶液的酶活性 
Figure DEST_PATH_G60314349150138000D000021
(6)β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移活性的确认
考察了上述(5)的导入了SHIZ145-N1C0/pTrc99A的大肠杆菌所表达的唾液酸转移酶是否具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性。与实施例1相同，使用吡啶氨基化乳糖(Galβ1-4Glc-PA，TaKaRa Bio公司产PA-SugarChain 026)作为糖受体进行酶反应。其结果是，与实施例1相同，检测出了PA-6’-唾液酸乳糖(Neu5Acα2-6Galβ1-4Glc-PA)。由这些结果可以证明发光杆菌属JT-SHIZ-145株的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶基因被克隆，且在大肠杆菌内表达。 
实施例3：从携带整合了SHIZ145-N1C0克隆的表达载体pTrc99A的大肠杆菌TB1抽提、纯化β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶
由在LBAmp平板培养基上传代培养的携带整合了SHIZ145-N1C0克隆(SEQ ID NO：3)的表达载体pTrc99A的大肠杆菌TB1的菌落用接种环采集菌体，接种在添加了30μL的×200氨苄西林(400mg/20mL)的6mL LB液体培养基10mL 中，30℃、180转/分钟振荡培养8小时。 
主培养按以下程序进行。向容积为1000ml的带挡板烧瓶中注入300ml混合有1.5mL的×200氨苄西林(400mg/20mL)和300μL 1M的IPTG(1.192g/5mL)的LB培养基，共准备9瓶(合计2.7L)该样品。向各烧瓶中接种12ml前培养液，30℃、180转/分钟振荡培养24小时。离心分离培养液，收集了菌体。 
将该菌体悬浮于990ml含0.336％TritonX-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)中，使其浓度为1.6g/26mL，在冰冷却条件下进行超声波破碎。4℃、 100,000×g离心分离菌体破碎液1小时，获得上清。 
使该粗酶液吸附于用含0.336％TritonX-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)平衡的Hiload 26/10Q Sepharose HP(Amersham产)阴离子交换柱，从含0.336％TritonX-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)至另含1M氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，回收了氯化钠浓度0.25M附近处洗脱出的具有酶活性的级分。 
回收的级分用20mM磷酸缓冲液(pH7.0)稀释，使之吸附于预先用含0.336％TritonX-100的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石(Bio-Rad产)，从含0.336％Triton X-100的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)至含0.336％Triton X-100的500mM磷酸缓冲液(pH7.0)用直线浓度梯度法进行洗脱。其结果，回收了磷酸缓冲液浓度125mM左右洗脱出的具有酶活性的级分。 
然后，该显示酶活性的级分上样于预先用含0.2M氯化钠和0.336％Triton X-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)平衡化的凝胶过滤柱Superdex(Amersham公司产)，进行凝胶过滤，回收了显示唾液酸转移活性的蛋白质级分。 
然后，再次使该显示酶活性的级分吸附于MonoQ 5/50GL(Amersham公司产)阴离子交换柱，从含0.336％Triton X-100的20mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)至另含1M氯化钠的相同缓冲液用直线浓度梯度法进行洗脱，并回收了具有酶活性的级分。 
对显示酶活性的级分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺凝胶的浓度为12.5％)，其结果，目的酶呈单一条带，分子量为约50,000。 
关于由粗酶液纯化SHIZ145-N1C0克隆的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，经过上述各纯化工序的样品的酶活性如表2所示。与实施例1记载的方法相同，同样以J.Biochem.120，104-110(1996)记载的方法为基准，测定了酶活性。此外，蛋白质的定量使用Coomassie Protein Assay Reagent(PIERCE产)，按其中的说明书进行蛋白质的定量。酶的1个单位(1U)设定为在1分钟内转移1微摩尔唾液酸的酶量。 
[表2] 
表2由导入了SHIZ145-N1C0/pTrc99A的大肠杆菌纯化重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的纯化表 
  样品   体积  (ml)   单位/ml   总蛋白质   总活性   特异性  活性   收率  (％)   纯化度  (倍)
  粗酶溶液   360   0.14   750.46   52.1   0.07   100.00   1.000
  Q sepharose   29.5   4.40   238.04   129.8   0.55   248.89   7.847
  HAP   3.6   21.41   47.71   77.1   1.62   147.83   23.256
  Superdex   5   1.01   3.88   5.1   1.31   9.71   18.761
  Mono Q   3.5   1.27   2.43   4.4   1.82   8.51   26.264
实施例4：JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的酶活性的最适pH、最适温度
使用实施例3中制备的纯化酶，考察了JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的最适pH、最适温度。 
(1)JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性的最适pH
分别制备了醋酸缓冲液(pH4-5)、二甲胂酸缓冲液(pH5-6)、Bis-Tris缓冲液(pH6-7)、磷酸缓冲液(pH6-9.5)、Tris-盐酸缓冲液(pH7-9.5)、TAPS缓冲液(pH8-9)、CHES缓冲液(pH9-10)和CAPS缓冲液(pH10-11)，用这些缓冲液在30℃测定了各pH下的酶活性。 
其结果如图2-1所示，表明：JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的最适pH为pH7.0～9.5的范围。此外，其在磷酸缓冲液中显示特别高的活性，且在pH8.0时酶活性为最大。而且，各pH下的酶活性是以相对活性来进行评价的，所述相对活性以使用磷酸缓冲液时在pH8.0的酶活性为1。 
(2)JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性的最适温度
使用磷酸缓冲液(pH8.0)，测定了10℃-50℃每间隔5℃反应温度下的酶活性。 
其结果如图2-2所示，在30℃时酶活性最大。而且，各温度时的酶活性是以相对活性来进行评价的，所述相对活性以30℃时的酶活性为100。 
实施例5：JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的糖受体底物特异性
使用实施例3中制备的JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的纯化酶，以各种单糖/二糖为糖受体底物， 进行唾液酸转移反应。反应按J.Biochem.，120，104-110(1996)中描述的方法进行。 
作为糖受体底物使用了8种单糖，即：甲基-α-D-吡喃半乳糖苷(Gal-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷(Gal-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Glc-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Glc-β-OMe)、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(Man-α-OMe)、甲基-β-D-吡喃甘露糖苷(Man-β-OMe)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)；使用了3种二糖，即：乳糖(Gal-β1，4-Glc)、N-乙酰乳糖胺(Gal-β1，4-GlcNAc)和Gal-β1，3-GalNAc。 
其结果表明：在此次作为糖受体底物使用的11种单糖和二糖中，唾液酸能够有效地转移至甲基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-乙酰半乳糖胺、乳糖、N-乙酰乳糖胺和Gal-β1，3-GalNAc(表3)。而且，针对各受体底物的相对活性是以针对乳糖的唾液酸转移活性为100来表示的。 
[表3] 
表3由导入了SHIZ145-N1C0/pTrc99A的大肠杆菌纯化的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0向单糖、二糖的唾液酸转移 
 糖受体底物   ％(nmol)
 Gal-α-OMe   2％
 Gal-β-OMe   59％
 Glc-α-OMe   0％
 Glc-β-OMe   0％
 Man-α-OMe   0％
 Man-β-OMe   0％
 GalNAc   35％
 GlcNAc   6％
 Gal-β1，4-GlcNAc   205％
 Gal-β1，4-Glc   100％
 Gal-β1，3-GalNAc   71％
实施例6：JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)对糖蛋白的受体底物特异性的比较
糖受体底物使用脱唾液酸胎球蛋白、脱唾液酸粘蛋白。将2mg脱唾液酸胎球蛋白或脱唾液酸粘蛋白溶解于1mL的20mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)中，作为糖受体底物。糖供体底物使用CMP-NeuAc。将糖受体底物溶液 40μL、糖供体底物5μL、酶溶液5μL混合，于30℃保温0.5小时进行唾液酸转移反应。反应结束后，将反应溶液上样于用0.1M氯化钠平衡的SephadexG-50super fine(0.8×18.0cm)，进行凝胶过滤。收集含糖蛋白的凝胶过滤洗脱液级分(2-4ml的级分)，用液体闪烁计数器测定该级分的放射活性，对转移至糖受体底物的唾液酸进行定量。 
其结果表明：唾液酸转移至任何一种糖受体底物上。 
[表4] 
表4由导入了SHIZ145-N1C0/pTrc99A的大肠杆菌纯化的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0向糖蛋白的唾液酸转移 
实施例7：各种离子对JT-SHIZ-145株来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0(SEQ ID NO：4)的酶活性的影响
(1)络离子对JT-SHIZ-145株来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性的效果
制备硝酸钾(KNO3)水溶液、硝酸钠(NaNO3)水溶液、硫酸钾(K2SO4)水溶液、硫酸钠(Na2SO4)水溶液、磷酸二氢钠(NaH2PO4)水溶液、磷酸氢二钠(Na2HPO4)水溶液和磷酸钾(KH2PO4+K2HPO4(简称KPB))水溶液，使用Tris-HCl缓冲液在30℃将反应液中的阴离子浓度分别调整至0.1M，测定了酶活性。 
其结果如图3所示，添加磷酸钾(KPB)或磷酸氢二钠时，酶活性为最大。此外，不仅是添加磷酸根离子，在添加含硫酸根离子、硝酸根离子等络离子的盐时，与未添加的情况相比较，酶活性也有显著意义地提高。而且，添加了各种溶液的反应液中的酶活性是以相对活性来进行评价的，所述相对活性以未添加条件(仅Tris-HCl)下的酶活性为1。 
(2)Na + 和K + 离子对JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性的效果
制备硝酸钾(KNO3)水溶液、硝酸钠(NaNO3)水溶液、硫酸钾(K2SO4)水溶液、硫酸钠(Na2SO4)水溶液、磷酸二氢钠(NaH2PO4)水溶液、磷酸氢二钠(Na2HPO4)水溶液和磷酸钾(KH2PO4+K2HPO4(简称KPB))水溶液，使用Tris-HCl缓冲液在30℃分别将反应液中的阴离子浓度调整为0.1M，测定了酶活性。 
其结果如图3所示，在添加磷酸钾(KPB)或磷酸氢二钠时，酶活性为最大。此外，在添加其它钾/钠水溶液时，与未添加的情况相比较，酶活性也有有显著意义地提高。而且，添加了各种溶液的反应液的酶活性是以相对活性来评价的，所述相对活性以未添加条件(仅Tris-HCl)下的酶活性为1。 
(3)Na + 、K + 和Li + 离子对JT-SHIZ-145株来源的重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性的效果
制备氯化钾(KCl)水溶液、氯化钠(NaCl)水溶液、氯化锂(LiCl)水溶液，使用Tris-HCl缓冲液，在30℃分别将反应液中的阳离子浓度调整为0.1M、0.2M或0.5M，测定了酶活性。 
其结果如图4所示，与未添加的情况相比，酶活性有显著意义地提高。而且，添加了各种溶液的反应液的酶活性是以相对活性来评价的，所述相对活性以未添加条件(仅Tris-HCl)下的酶活性为1。 
(4)钙离子对JT-SHIZ-145株来源重组β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶N1C0的酶活性的影响
使用粗酶液测定了酶活性，其中，向反应液中添加氯化钙和/或EDTA，并使得钙离子的终浓度为10mM，EDTA的终浓度为50mM。 
其结果如图5所示，与未添加的情况相比较，钙离子存在下的酶活性显著增加。而且，当在反应体系中与钙离子一起添加螯合剂EDTA时，酶活性与未添加钙离子时基本相同。 
实施例8：JT-SHIZ-145株以外的鳆发光杆菌菌株中唾液酸转移酶活性的确认
对于鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)模式株NCIMB2193(ATCC25521)株、以及鳆发光杆菌菌株NCIMB1511(ATCC25587)株和NCIMB2134(ATCC33469)株，分别使用Sea·Water·Yeast·蛋白胨培养基(酵母提取3.0g/l和蛋白胨5.0g/l)6ml进行培养，按前述实施例2-(5)的方法制备了粗酶液，用于唾液酸转移酶活性的测定。 其结果，如表5所示，不含粗酶液仅含缓冲液时(阴性对照)和含粗酶液时的放射活性均为500～600cpm。该结果表明：本技术领域能够获得的多个鳆发光杆菌株不具有唾液酸转移酶，或者仅具有检测限以下的极其微弱的酶活性。相比之下，JT-SHIZ-145株虽是鳆发光杆菌株，但却具有高唾液酸转移酶活性。 
[表5] 
表5其它鳆发光杆菌菌株中的唾液酸转移酶活性 
  菌株名称   转移NeuAc(cpm)
  -   566
  NCIMB2193   518
  NCIMB1511   541
  NCIMB2134   615
工业实用性
本发明提供新的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其编码核酸，从而提供已明确在生物体内具有重要功能的糖链的合成/生产手段。特别是唾液酸在生物体内的复合糖链中多存在于非还原末端，从糖链功能的观点来看是极为重要的糖，因此唾液酸转移酶是糖转移酶中需求最高的酶之一。本发明的新唾液酸转移酶可以用于开发利用糖链的医药产品、功能性食品等。 
Figure IYZ000006031435000021
Figure IYZ000006031435000031
Figure IYZ000006031435000051
Figure IYZ000006031435000061
Figure IYZ000006031435000071
Figure IYZ000006031435000081

Claims (13)

1.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性，其为：
(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成的蛋白质；或者
(b)由(a)的蛋白质以及选自His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶中的标签构成的融合蛋白质。
2.一种分离的蛋白质，该分离的蛋白质具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性且由下述碱基序列构成的核酸编码：
(a)SEQ ID NO：3的碱基序列；或者
(b)(a)的碱基序列和编码选自His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶中的标签的碱基序列。
3.权利要求1或2所述的分离的蛋白质，其来源于属于发光杆菌属的微生物。
4.权利要求1或2所述的分离的蛋白质，其反应最适pH为pH7～pH9.5的范围。
5.一种分离的核酸，该分离的核酸编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质，编码的所述蛋白质为：
(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成的蛋白质；或者
(b)由(a)的蛋白质以及选自His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶中的标签构成的融合蛋白质。
6.一种分离的核酸，该分离的核酸编码具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质且由下述碱基序列构成：
(a)SEQ ID NO：3的碱基序列；或者
(b)(a)的碱基序列和编码选自His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶中的标签的碱基序列。
7.包含权利要求5或6的核酸的表达载体。
8.用权利要求7的表达载体转化的宿主细胞。
9.一种生产具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的重组蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
1)用包含权利要求5或6的核酸的表达载体转化宿主细胞；
2)培养所得的转化细胞；以及
3)从培养所得的转化细胞或其培养上清分离具有β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶活性的蛋白质。
10.β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶在唾液酸转移反应中的应用，其中，在具有下述组成的反应液中使用所述β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶，所述组成中包含pH7.0～pH9.5的磷酸缓冲液，
且所述β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶为：
(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)由SEQ IDNO：3的碱基序列构成的核酸编码的蛋白质；或者
(c)由(a)或(b)的蛋白质与选自His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶中的标签构成的融合蛋白质。
11.一种提高使用β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应的效率的方法，其中，通过在存在选自钠离子、钾离子的一价金属离子与选自磷酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子中的阴离子形成的盐的条件下进行所述反应，所述阴离子的浓度为0.1M，使得所述反应的效率与不存在该盐的情况相比有所提高，
其中，所述β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶为：
(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)由SEQ ID NO：3的碱基序列构成的核酸编码的蛋白质；或者
(c)由(a)或(b)的蛋白质与选自His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶中的标签构成的融合蛋白质。
12.一种提高使用β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行糖转移反应的效率的方法，其中，通过在存在选自钠离子、钾离子和锂离子的一价金属离子与氯离子形成的盐的条件下进行所述反应，所述金属离子的浓度为0.1M～0.5M，使得所述反应的效率与不存在所述盐的情况相比有所提高，
其中，所述β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶为：
(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)由SEQ ID NO：3的碱基序列构成的核酸编码的蛋白质；或者
(c)由(a)或(b)的蛋白质与选自His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶中的标签构成的融合蛋白质。
13.一种提高使用β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶进行的糖转移反应的效率的方法，其中，通过在存在钙离子与氯离子形成的盐的条件下进行该反应，所述钙离子的浓度为10mM，使得所述反应的效率与不存在所述盐的情况相比有所提高，
其中，所述β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶为：
(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成的蛋白质；
(b)由SEQ ID NO：3的碱基序列构成的核酸编码的蛋白质；或者
(c)由(a)或(b)的蛋白质与选自His标签、FLAGTM标签、谷胱甘肽-S-转移酶中的标签构成的融合蛋白质。
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Takeshi Yamamoto,et al.A β-galactoside α2,6-sialyltransferase produced by a marine bacterium,Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145, is active at pH 8.《Glycobiology》.2007,第17卷(第11期),1167–1174.

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