CN101629162A - 组织工程细胞片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织工程领域，具体涉及一种组织工程细胞片及其制备方法。该细胞片通过以下方法制备：首先通过电子加速器辐射在细胞培养支持物表面合成聚N－异丙基丙烯酰胺水凝胶；然后控制温度使聚N－异丙基丙烯酰胺水凝胶为疏水相，在此相上培养细胞；改变温度，使水凝胶为亲水相，通过高分子膜吸附或夹具钳夹方法，分离出组织工程细胞片。得到的细胞片通过多层化培养或者通过蛋白黏附液黏附得到多层细胞片。本发明得到的细胞片可以保持细胞与细胞间的桥粒结构、ZO－1紧密连接结构和其它细胞间连接结构，可以保留基底膜蛋白及其与黏合有关的许多成分如整合素等，还具有一定的强度。

Description

组织工程细胞片及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程领域，具体涉及一种由温敏性材料-N异丙基丙烯酰胺水凝胶培养得到的组织工程细胞片及其制备方法。

背景技术

聚-N异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide)，PIPAAm)水凝胶为温度响应性智能聚合物，它在某一温度，也就是通常所说的最低临界溶解温度(lower critical solutiontemperature，LCST)附近存在可逆的不连续的体积相转变，PNIPAAm水凝胶的LCST在32℃左右。这种材料在机械、化学和生物医药等领域具有非常广泛的应用前景。近年来其在组织工程领域的应用越来越受到人们的重视，由于LCST的存在，其用作细胞培养时具有突出的效果。这是因为，当环境温度稍稍高于LCST时，PIPAAm水凝胶体积会突然剧烈收缩，此时是疏水的，将细胞种植在其上，细胞可以黏附生长；当环境温度降到LCST以下时，水凝胶会重新溶胀，此时水凝胶是亲水的，细胞就从它的表面分离。所以我们可以在水凝胶疏水的时候接种细胞，然后进行培养。当细胞增殖到一定的程度时，可以通过降低温度到LCST以下，使水凝胶表面亲水，这样细胞就脱离水凝胶，从而获得整个细胞片，避免了运用酶消化所带来的对细胞的损害，所得细胞片可用于体内移植重建三维组织。

PNIPAAm水凝胶的合成方法主要有化学聚合和辐射聚合。化学聚合PIPAAm水凝胶方法已经很成熟，文献已多有报道。化学合成方法制备的温度响应PIPAAm水凝胶因具有以下的缺点而限制了其在组织工程细胞片制备中的应用：(1)化学合成方法，残留物较多，对于后续细胞培养有一定的毒性。(2)化学合成方法不能将PIPAAm水凝胶接枝到聚苯乙烯类培养器皿上，因此，也不能使培养细胞贴壁于PIPAAm水凝胶表面，更不能获得细胞片。辐射聚合是利用电离辐射能来引发有机单体的聚合反应获得高分子化合物。辐射聚合与引发剂引发的聚合反应(即化学聚合)的主要差别是在于引发方式的不同，链反应一经开始，随后的连增长和链终止就与普通方法没有什么区别了。辐射聚合可在进行PNIPAAm单体聚合的同时，将PNIPAAm接枝到普通的聚苯乙烯培养皿或培养板内，用此培养皿或培养板即可培养细胞。辐射聚合按辐射源主要又分为放射性核素、紫外照射和电子加速器引发的聚合。相比于其它两种辐射方式，电子加速器的电子束是定向的，还具有剂量率高、功率大、辐射时间短、处理量大和电子束穿透力低的特点，特别适合制作薄层的PIPAAm温度响应水凝胶培养皿。但是，单纯电子加速器聚合PIPAAm水凝胶时，当总辐射剂量低于240kGy时，不易于形成网络状的聚合物，通常仅形成线性的聚合物，用离子水浸泡后线性聚合物会溶解(图1)。傅里叶红外图谱发现，未加交联剂电子加速器辐射聚合后产生的PIPAAm的图像与线性PIPAAm的图像一致，提示未加交联剂电子加速器辐射聚合后产生的PIPAAm仅表现出线性PIPAAm，未能形成网络状交联的PIPAAm水凝胶(图2)。如果一次采用200kGy以上剂量的电子加速器交联PIPAAm水凝胶，虽然可以获得网络状的聚合物，但高剂量的电子加速伴随瞬间的高温，通常引起聚苯乙烯类的培养器皿变形受损(图3)。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的首先在于提供一种以PIPAAm水凝胶培养得到的组织工程细胞片。

本发明的另一目的是提供上述组织工程细胞片的制备方法。

上述目的通过以下的技术方案来实现：

一种组织工程细胞片的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)在细胞培养支持物表面覆盖含质量浓度为0.1％～1.5％交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的N-异丙基丙烯酰胺单体溶液；所述N-异丙基丙烯酰胺单体的质量浓度为40％～60％。

(2)对步骤(1)所得溶液进行电子加速器辐射合成，总辐射剂量为240kGy～300kGy，连续分三～六次辐射合成，每次辐射量低于200kGy。得到覆盖了聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶的细胞培养支持物；

(3)将步骤(2)得到的细胞培养支持物放到4℃的去离子水中，浸泡5～8天，期间换水4～7次，烤干并灭菌后，密封备用；

(4)控制温度使聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶为疏水相，将细胞接种到步骤(3)得到的细胞培养支持物中，培养细胞；改变温度，使聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶为亲水相，通过高分子膜吸附或夹具钳夹方法，分离出组织工程细胞片。

步骤(1)所述N-异丙基丙烯酰胺单体优选使用经过重结晶的单体。单体的重结晶优选采用体积比为1∶1的苯和异丙醇进行。

步骤(1)所述N-异丙基丙烯酰胺单体溶液优选采用异丙醇作为溶剂的。用水作为NIPAAm单体溶剂时，溶液不能均匀伸展铺在培养器皿表面，则可能与水是极性溶剂，而异丙醇是非极性溶剂有关。另外，用水作为NIPAAm单体溶剂进行的电离辐射交联效果也不均匀，某些局部效果好，某些部位不能完全交联。因此，以异丙醇为NIPAAm单体溶剂较好。

步骤(1)所述细胞培养支持物表面的N-异丙基丙烯酰胺单体覆盖量优选为3mg～5mg/cm²。

步骤(1)所述交联剂的加入量优选为10μg～30μg/cm²。

步骤(1)所述细胞培养支持物优选为聚苯乙烯板或者聚四氟乙烯材质，例如聚苯乙烯培养皿(tissue culture polystyrene，TCPS)或六孔板上，或者MILLICELL-CM插入式培养皿(直径：30mm，孔径：0.4μm，聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE)滤膜材料)。

优选地，步骤(2)所述电子加速器的真空度≤2.2×10^-6KPa。

步骤(3)所述灭菌优选采用环氧乙烷灭菌。

步骤(4)中利用相转变温度对组织工程细胞片进行分离优选以下方案：

接种细胞到接枝PIPAAm水凝胶的培养器皿上；置5％CO₂培养箱37℃培养，当培养细胞达到80～90％融合时，将培养器皿转移到20℃的孵箱，培养1小时后，细胞成片浮出于溶胀增厚的水凝胶表面，通过高分子膜吸附或夹具钳夹方法，分离出无载体的组织工程细胞片。

上述细胞的接种适用细胞培养常规的接种方法，例如：取培养中处于指数生长期的细胞，吸取培养液，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA，以淹没细胞为宜，置培养箱中(5％CO₂，37℃)消化数分钟，当发现贴壁细胞变为圆形时，立即加含血清的培养基终止消化。用吸管吹打成单个细胞悬液，离心。去上清，加入培养液，吹打成单细胞悬液，按所需的浓度，接种到接枝PIPAAm水凝胶的培养器皿上。

本发明当然也提供了上述方法得到的组织工程细胞片，由于从PIPAAm水凝胶表面分离出的生物工程细胞片保留了天然的ECM成分，这些ECM成分具有黏合剂的作用，因此，可以方便地将这些细胞片黏合于需要进行移植治疗的组织器官，无需缝合。

接枝PIPAAm水凝胶的插入式培养皿可以同样进行细胞片的培养，方法同上，另外，可以进行底部培养皿培养饲细胞，PIPAAm水凝胶的插入式培养皿构建细胞片，通过共培养细胞的方法获得活力更好细胞片；PIPAAm水凝胶的插入式培养皿也可以通过气-液培养技术，获得具有分层细胞的上皮细胞片。

本发明还提供了一种多层细胞片，该多层细胞片将上述组织工程细胞按常规方法进行多层培养得到的，或者通过黏附蛋白液纵向整合得到；

所述黏附蛋白液包括以下蛋白质中至少一种：

10μg～100μg/ml层粘连蛋白、5μg～50μg/ml纤维连接蛋白、100μg～1mg/ml肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-丝氨酸四肽(Arg-Gly-Asp-Ser，RGDS)、100mg～300mg/ml纤维蛋白原，10μg～100μg/mL I型胶原、10μg～100μg/ml IV型胶原；

所述胶原用0.006～0.1mol/L乙酸稀释，其它蛋白用pH 8.3的NaHCO₃溶液稀释；

所述纤维蛋白原加入后，需加入等量的凝血酶200～1000U/ml和等量的10％氯化钙液。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、PNIPAm水凝胶的合成采用结合化学交联和和电子加速器辐射的方法，克服了两种方法单独使用时的缺点。既获得了网络状的PIPAAm水凝胶聚合物以及与聚苯乙烯类的培养器皿接枝的效果，又没有出现培养器皿变形受损，加入极少量的交联剂，合成为聚合物后，通过浸泡处理，残留物极少或无，对于细胞生长基本是无毒性的。

2、温度响应PIPAAm水凝胶制作的细胞片可以保持细胞与细胞间的桥粒结构、ZO-1紧密连接结构和其它细胞间连接结构，可以保留基底膜蛋白及其与黏合有关的许多成分如整合素等，完整的组织工程细胞片还具有一定的强度。

3、目前多层细胞片都是通过多个单细胞片重叠放置，依靠细胞片自身的粘附蛋白质黏合整合为多层细胞片，但是，在某些情况下，这种重叠放置整合的多层细胞片可能黏合程度不够，易于松散，而应用黏附蛋白液可以弥补这种不足。

附图说明

图1显示了电子加速器聚合PIPAAm水凝胶时，当总辐射剂量低于240kGy时，不易于形成网络状的聚合物，通常仅形成线性的聚合物，用离子水浸泡后线性聚合物会溶解。

图2为PIPAAm水凝胶傅里叶红外图谱发现：未加交联剂电子加速器辐射聚合后产生的PIPAAm的图像(下方线条)与线性PIPAAm的图像一致(上方线条)。

图3显示了电子加速器聚合PIPAAm水凝胶时，一次采用200kGy以上剂量的电子加速伴随瞬间的高温，通常引起聚苯乙烯类的培养器皿变形受损，NIPAAm单体未见聚合，变成爆米花状。

图4显示了接枝PIPAAm水凝胶的培养器皿在温度高于LCST时的形态。

图5显示了接枝PIPAAm水凝胶的培养器皿在温度低于LCST时的形态。

图6为加交联剂电子加速器辐射聚合后产生的PIPAAm的傅里叶红外图谱。

图7为化学方法合成的PIPAAm水凝胶傅里叶红外图谱。

图8为PIPAAm水凝胶的傅里叶红外图谱：其中，上部曲线代表NIPAAm单体经过电子加速器辐射聚合后产生的PIPAAm水凝胶；下部曲线代表化学交联产生的PIPAAm水凝胶。

图9为PIPAAm水凝胶原子力显微镜2D图像。

图10为PIPAAm水凝胶原子力显微镜3D图像。原子力显微镜检查发现，PIPAAm水凝胶表面形貌有轻微的粗糙。

图11为PIPAAm水凝胶扫描电子显微镜图像，PIPAAm水凝胶表面致密平滑，未见明显皱褶，水凝胶边缘凹凸粗糙较明显。

图12是NIPAAm单体覆盖量大于5mg/cm²时形成的爆米花状形态。

图13是环氧乙烷灭菌器中消毒灭菌后待用的接枝PIPAAm水凝胶的培养器皿。

图14是酶消化组织块进行细胞分离培养的角膜上皮细胞第5天的倒置显微镜下的图像，可见组织块残留。

图15是角膜上皮细胞培养9天的倒置显微镜下的图像，可见融合成片的角膜上皮细胞及其边缘结构。

图16是在PIPAAm水凝胶表面贴壁生长的口腔黏膜上皮细胞。

图17是在PIPAAm水凝胶表面贴壁生长的角膜基质细胞。

图18是在PIPAAm水凝胶表面边缘贴壁生长的角膜基质细胞，显示整齐的角膜基质细胞片边缘结构。

图19是无载体的含复层细胞的单片角膜基质细胞片的H&E染色的组织切片图像。

图20是单片角膜基质细胞片的扫描电子显微镜图像，显示出细胞排列紧密的表面结构。

图21是单片角膜基质细胞片的扫描电子显微镜图像，显示出角膜基质细胞片的边缘结构。

图22是在PIPAAm水凝胶表面贴壁生长的3T3细胞。

图23是无载体的两片复合角膜基质细胞片的H&E染色的组织切片图像。

图24是多片复合角膜基质细胞片的扫描电子显微镜图像，显示出细胞排列紧密的表面结构。

图25是无载体的多片复合角膜基质细胞片形成早期的H&E染色的组织切片图像，每个细胞片之间粘合不够紧密。

图26是无载体的多片复合角膜基质细胞片形成的H&E染色的组织切片图像，每个细胞片之间粘合紧密，形成完整的7-10层角膜基质细胞片。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。

实施例1角膜上皮细胞片的构建

1、PNIPAm水凝胶接枝培养皿的制备

(1)重结晶单体

将购买来的N-异丙基丙烯酰胺单体(N-isopropylacrylamide，NIPAAm)(上海物竞科技有限公司)，运用体积比为1∶1的苯和异丙醇进行重结晶，重结晶后的NIPAAm单体干燥后待用。

(2)配制单体溶液

配制质量浓度为40％的NIPAAm单体溶液，含质量浓度为0.1％交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylene bisacrylamide，MBA)，以上均为通过溶液异丙醇配制，震荡混匀后待用。

(3)辐射合成单体溶液

取上述已配制好的NIPAAm单体溶液，加入到35mm的聚苯乙烯板(tissue culturepolystyrene，TCPS)培养皿上，通过单体溶液自身的张力而均匀伸展铺在培养器皿表面。单体在培养器皿表面的覆盖量为4mg/cm²。将其放到电子加速器(地那米加速器，中科院上海原子核研究所制造)的小车上进行电子辐射合成，电子加速器辐射合成时的数据是：辐射剂量为240kgy，用小车连续分三次辐射合成，电子加速器真空度为2.2×10^-6KPa。经过电子加速器辐射作用，使NIPAAm单体聚合为PIPAAm水凝胶，与此同时，NIPAAm单体与培养器皿接枝聚合。

本实施例接枝的PIPAAm水凝胶具有温度响应特点：当温度高于LCST时，体积收缩，变为乳白色薄层(图4)，当温度低于LCST时，体积溶胀，变为透明的水凝胶(图5)。PIPAAm水凝胶傅里叶红外图谱发现，在1644cm-1附近出现的谱带是由酰胺的羧基伸缩振动产生的，即酰胺I带；而在1538cm-1处的谱带为酰胺II带，是由酰胺基团中的N-H弯曲振动和C-H伸缩振动的组合吸收产生的。另外，波数在1386cm-1和1367cm-1附近都出现了吸收峰，这是NIPAAm的异丙基-CH(CH₃)₂中对称C-H振动的特征谱。加入少量交联剂后的PIPAAm水凝胶傅里叶红外图谱图像与化学合成的主要成分图像一致，提示NIPAAm单体经过电子加速器辐射聚合后产生的PIPAAm水凝胶成分与化学交联产生的PIPAAm水凝胶主要成分相近(图6，图7，图8)。Autoprobe CP Research型原子力显微镜(美国THERMO公司)检查发现，PIPAAm水凝胶表面形貌有轻微的粗糙(图9，图10)。JEOLT-300SEM扫描电子显微镜(日本电子株式会社)检查进一步证实，PIPAAm水凝胶表面致密平滑，未见明显皱褶，水凝胶边缘凹凸粗糙较明显(图11)。单体在培养器皿表面的覆盖量为3mg～5mg/cm²，覆盖量少于3mg/cm²时，不能辐射聚合为成片状的PIPAAm水凝胶；覆盖量大于5mg/cm²时，容易形成爆米花样，并不能形成薄层的PIPAAm水凝胶(图12)。另外，培养细胞也难以贴附于其上。培养细胞贴附在PIPAAm水凝胶表面的生长是与细胞的黏附蛋白(例如纤维连接蛋白)吸附于水凝胶相关的，如果单体覆盖量太大，形成厚层的PIPAAm水凝胶，难以吸附纤维连接蛋白等成分。MBA加入量一般为10μg～30μg/cm²，MBA过少交联少或仅形成线性交联，吸水后松散；MBA过大交联度太大，失去吸水特性。

用水作为NIPAAm单体溶剂时，溶液不能均匀伸展铺在培养器皿表面，则可能与水是极性溶剂，而异丙醇是非极性溶剂有关。另外，用水作为NIPAAm单体溶剂进行的电离辐射交联效果也不均匀，某些局部效果好，某些部位不能完全交联。因此，以异丙醇为NIPAAm单体溶剂较好。

(4)辐射合成后的PIPAAm水凝胶的处理

将辐射合成后的温敏水凝胶放到4℃的去离子水中，浸泡5天，期间换水4次，放入50℃烤箱中烤干。接枝PIPAAm水凝胶的培养器皿通过封口机将纸塑包装封口，封口之前放一张环氧乙烷灭菌指示试纸，将其放到HM-23环氧乙烷灭菌器(沈阳德龙电子有限公司)中消毒灭菌，当试纸由红色变为蓝色，表示灭菌消毒达标，取出后待用，进行细胞培养时再拆封使用(图13)。

2、水凝胶上的细胞培养和移植

(1)培养液

培养液：A.添加激素的上皮细胞培养液(supplemental hormonal epithelial medium，SHEM)：DMEM/F12(3∶1)，10μg/L表皮生长因子、1000U/L胰岛素、0.1mg/L霍乱毒素、0.18mM/L腺嘌呤、0.5mg/L氢化可的松、1.2g/L NaHCO3、10％胎牛血清(FBS)、10万U/L青霉素和100mg/L链霉素。B.低钙角质形成细胞培养基(keratinocyte serum freemedium，KSFM)，Ca²⁺的浓度为0.07mM～0.09mM。培养试剂除特别说明外，采用美国Gibco公司产品。其他化学试剂除除特别说明外，采用美国Sigma公司产品。

(3)取材

尽可能地在灭菌条件下使用灭菌的器具进行相关操作。离体眼球取材：分离宽约2mm的角膜缘环形组织，将其平均剪为8片。自体活体眼球取材：浅层分离角膜缘约2×3×1mm³。

(4)酶消化组织块进行细胞分离

将上述角膜缘组织小块置4℃无血清含1.2U/ml中性蛋白酶和100mM山梨醇的角膜上皮细胞培养液中，约10小时，解剖显微镜下，将松动的上皮层用显微镊子分离。置于15ml离心管，离心管内加入约5ml胰蛋白酶液(0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA)，37℃下消化30分钟，终止消化后置1000rpm/min离心，5分钟。离心后吸走上清液，加入10％胎牛血清，DMEM/F12培养液吹打，制成细胞悬液，以2×10⁴/ml细胞数接种，进行细胞原代培养。DM/L倒置生物显微镜(德国徕卡公司)下检查发现酶消化组织块进行细胞分离培养的角膜上皮以及融合成片的角膜上皮细胞(图14，图15)。以1×10⁵/ml细胞密度接种于培养器皿进行传代细胞培养，使用培养5代内的传代细胞。

(5)复层细胞的角膜上皮细胞片

将培养的角膜缘上皮细胞以2×10⁴/ml的细胞密度接种于步骤1得到的所述培养皿表面，进行单细胞培养。

(6)角膜上皮细胞片的分离获取

采用硝酸纤维膜粘附细胞片直接分离。

(7)角膜上皮细胞片移植

移植对象：(1)实验动物：对新西兰白兔或其它动物，自距角膜缘外4mm处，用弯剪刀除去约0.1～1mm的角膜上皮及结膜上皮，制作眼表面干细胞缺乏症动物模型，用荧光素眼表染色确认角膜上皮细胞完全去除。4周后，该动物眼表面被周围残存的结膜上皮所覆盖，出现角膜表面混浊和角膜新生血管。(2)临床患者：包括化学伤急性期的迁延性角膜上皮缺损患者、化学伤慢性期的疤痕组织侵入引起角膜新生血管和角膜混浊的患者、角膜缘干细胞缺乏的眼表疾病、角膜缘功能障碍等角膜病变、眼类天疱疮等患者。移植的没有任何生物材料的角膜上皮细胞片可以用于各种角膜疾病的治疗，这样就有望很好的解决因为生物材料的降解或体内组织与生物材料的作用而出现的各种术后反应。采用自体的健康角膜上皮细胞进行培养可以获得自体角膜上皮细胞片，将其进行移植可以解决角膜供体不足的矛盾以及去除异体角膜上皮细胞片移植出现的术后排斥反应。

手术方法：将病变角膜全浅层板层分离切除，去除混浊、结膜上皮化和新生血管化的角膜表面组织，充分止血和清洗，暴露透明的角膜基质，制作出受体植床。将上述与硝酸纤维膜粘附的功能活性人工角膜上皮片与植床接触贴附，通过细胞片黏附蛋白与角膜基质之间的组织黏合，达到细胞片移植，移植后去除硝酸纤维膜。必要时可以使用绷带型角膜接触镜保护移植的细胞片。术后，局部使用抗生素滴眼液及眼膏，2次/日。角膜上皮细胞片移植体内后，应用荧光素染色检查移植的角膜上皮细胞片是否具有屏障机能，确认上皮细胞片的移植效果。

上述角膜上皮细胞片的构建和移植的种子细胞除了应用角膜缘上皮细胞，也可以应用口腔粘膜上皮细胞(图16)和其它细胞。当难以获得健康的自体角膜缘上皮细胞时，可以应用自体的口腔粘膜上皮细胞和其它细胞作为替代种子细胞，同样具有解决角膜供体不足的矛盾以及减少异体角膜上皮细胞片移植出现的术后排斥反应的优点。

实施例2角膜上皮细胞片的构建

1、PNIPAm水凝胶接枝培养皿的制备

(1)重结晶单体

同实施例1。

(2)配制单体溶液

配制质量浓度为60％的NIPAAm单体溶液，含质量浓度为0.4％交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylene bisacrylamide，MBA)，以上均为通过溶液异丙醇配制，震荡混匀后待用。

(3)辐射合成单体溶液

取上述已配制好的NIPAAm单体溶液，加入到MILLICELL-CM插入式培养皿[直径：30mm，孔径：0.4μm，聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE)(Millipore公司，美国)滤膜材料]表面上，通过单体溶液自身的张力而均匀伸展铺在培养器皿表面。单体在培养器皿表面的覆盖量为4.5mg/cm²。将其放到电子加速器的小车上进行电子辐射合成，电子加速器辐射合成时的数据是：辐射剂量为300kgy，用小车连续分六次辐射合成，电子加速器真空度为2.2×10^-6KPa。经过电子加速器辐射作用，使NIPAAm单体聚合为PIPAAm水凝胶，与此同时，NIPAAm单体与培养器皿接枝聚合。

得到的接枝的PIPAAm水凝胶与实施例得到的水凝胶具有相类似的特点。

(4)辐射合成后的PIPAAm水凝胶的处理

将辐射合成后的温敏水凝胶放到4℃的去离子水中，浸泡8天，期间换水7次，放入50℃烤箱中烤干。此后的处理同实施例1。

2、水凝胶上的细胞培养和移植

(1)培养液

同实施例1。

(3)取材

同实施例1。

(4)酶消化组织块进行细胞分离

将上述角膜缘组织小块置4℃无血清含2.4U/ml中性蛋白酶和100mM山梨醇的角膜上皮细胞培养液中，约18小时，解剖显微镜下，将松动的上皮层用显微镊子分离。置于15ml离心管，离心管内加入约5ml胰蛋白酶液(0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA)，37℃下消化30分钟，终止消化后置1000rpm/min离心，5分钟。离心后吸走上清液，加入10％胎牛血清，DMEM/F12培养液吹打，制成细胞悬液，以1×10⁶/ml细胞数接种，进行细胞原代培养。以1×10⁶/ml细胞密度接种于培养器皿进行传代细胞培养，使用培养5代内的传代细胞。

(5)复层细胞的角膜上皮细胞片

将培养的角膜缘上皮细胞以1×10⁶/ml的细胞密度接种于步骤1得到的插入式培养皿表面，进行细胞共培养：预先将培养融合的3T3成纤维细胞或人胚胎成纤维细胞与4μg/mL的丝裂霉素C共孵育2小时，PBS洗涤2次，胰酶消化后，以1×10⁴/cm²接种培养皿或培养板内。其后才在此培养皿或培养板内放入含角膜缘上皮细胞的插入式培养皿。放入5％的CO₂培养箱中37℃培养，97％湿度，每2～3天换液1次，常规培养7～10天后，进行气液培养，即减少培养液加入量，加培养液平面仅达插入式培养皿表面，使培养的上皮细胞表面更多接触空气，每周加已用丝裂霉素处理的饲细胞，气液培养7～10天后获得复层角膜上皮细胞片。

(6)角膜上皮细胞片的分离获取

获取复层角膜上皮片的方法为：在上述复层角膜上皮细胞片培养完成后，减少插入式培养皿内培养液，在培养细胞上覆盖硝酸纤维膜，放入培养箱20℃培养30分钟，在20℃以下温度条件下，将黏合整张细胞片的硝酸纤维膜从亲水性的疏松线团结构的PIPAAm剥离。

(7)角膜上皮细胞片移植

可用与实施例相同的方法将细胞片进行移植。

实施例3角膜内皮细胞片

按角膜内皮细胞常规培养方法进行种子细胞培养，采用实施例1或2所述角膜上皮细胞片构建类似的方法构建角膜内皮细胞片。角膜内皮细胞片移植可以治疗角膜内皮细胞病变和内皮细胞功能失代偿等患者：去除病变的角膜后板层及角膜内皮层，通过类似于穿透性角膜移植、深板层角膜内皮移植和后弹力层剥除角膜内皮移植等手术方法进行角膜内皮细胞片移植。角膜内皮细胞片移植通常不需要缝线缝合，采用细胞片黏附蛋白与角膜后板层之间的组织黏合，达到细胞片移植。或采用上述至少一种的黏附蛋白液将细胞片黏附到角膜后板层。裂隙灯观察角膜透明情况，检查是否出现角膜水肿，确认角膜内皮细胞片移植效果。上述角膜内皮细胞片的构建和移植的种子细胞除了应用角膜内皮细胞，也可以应用其它细胞。

实施例4角膜基质细胞片

按角膜基质细胞常规培养方法进行种子细胞培养，采用上述角膜上皮细胞片构建类似的方法构建角膜基质细胞片(图17，图18))，通过上述方法降低温度分离可获取无载体的角膜基质细胞片。角膜基质细胞片的H&E染色的组织切片在光学显微镜下组织学检查发现，无载体单片角膜基质细胞片内细胞排列紧密，含2-3层的复层细胞结构(图19)。扫描电子显微镜下检查发现单片角膜基质细胞片细胞排列紧密的表面结构(图20)和边缘结构(图21)。角膜基质细胞片移植可以治疗角膜病变患者：去除角膜基质层病变组织，通过类似于板层角膜移植手术方法进行角膜基质细胞片移植，角膜基质细胞片移植通常不需要缝线缝合，采用细胞片黏附蛋白与角膜之间的组织黏合，达到细胞片移植。或采用上述至少一种的黏附蛋白液将细胞片黏附到角膜组织。裂隙灯观察角膜情况，确认角膜基质细胞片移植效果。上述角膜基质细胞片的构建和移植的种子细胞除了应用角膜基质细胞，也可以应用其它细胞(图22)。

实施例5多片复合角膜基质细胞片的制备

按角膜基质细胞常规培养方法进行种子细胞培养，采用上述角膜上皮细胞片构建类似的方法构建单片角膜基质细胞片，采用上述细胞片分离获取的方法获取多个单片角膜基质细胞片。按照以下单片重叠放置整合多片培养方法获得多片复合角膜基质细胞片：采用上述角膜基质细胞片构建类似的方法构建角膜基质细胞片后，减少培养器皿的培养液至培养器皿的底部，将上述多个单片角膜基质细胞片逐片纵向重叠放置整合为多层细胞片，防止细胞片卷曲和脱离，静置数分钟至数小时后，加入足够的培养液，常规培养数小时至数日。采用上述细胞片分离获取的方法获取一个多片复合角膜基质细胞片，制作出可移植的两片(图23)或多片复合角膜基质细胞片(图24)。多片复合角膜基质细胞片形成早期，每个细胞片之间粘合不够紧密(图25)，放置数小时至数日培养后，每个细胞片之间粘合紧密，可以形成完整的7-10层角膜基质细胞片(图26)。由于从PIPAAm水凝胶表面分离出的单片角膜基质细胞片保留了天然的ECM蛋白成分，这些ECM蛋白具有黏合剂的作用，因此，单片重叠放置整合多片培养方法可以获得细胞结构紧密完整的多片复合角膜基质细胞片。多片复合角膜基质细胞片的移植方法同实施例4。

实施例6多种细胞片纵向整合的多片复合角膜细胞片

将上述三种角膜细胞片(角膜上皮细胞片、角膜内皮细胞片和角膜基质细胞片)中的至少两种通过以下三种方法获得多种细胞片纵向整合的多片复合角膜细胞片：

方法一是单片重叠放置整合多片培养法：采用实施例5的多片复合角膜基质细胞片的制备的单片重叠放置整合多片培养方法，利用细胞片之间天然的ECM蛋白黏合作用获得多种细胞片纵向整合的多片复合角膜细胞片。

方法二是黏附蛋白液黏附法：  采用上述细胞片构建类似的方法构建三种角膜细胞片后，减少培养器皿的培养液至培养器皿的底部，采用上述黏附蛋白液，黏附蛋白液一种或者多种使用，将上述三种角膜细胞片单片逐片纵向黏附，防止细胞片卷曲和脱离，静置数分钟至数小时后，加入足够的培养液，常规培养数小时至数日。采用上述细胞片分离获取的方法获取一个多种细胞片纵向整合的多片复合角膜细胞片。

方法三是上述两种方法混合应用：单片重叠放置整合多片培养法是依靠细胞片自身的粘附蛋白质黏合整合为多片复合角膜细胞片，但是，在某些情况下，这种重叠放置整合的多片复合细胞片可能黏合程度不够，易于松散，而混合应用黏附蛋白液可以弥补这种不足。

上述多种细胞片纵向整合的多片复合角膜细胞片包括：角膜上皮细胞片(单片)与角膜基质细胞片(多片)纵向整合后可以进行前板层角膜移植；角膜内皮细胞片(单片)与角膜基质细胞片(多片)纵向整合后可以进行后板层角膜移植；角膜上皮细胞片(单片)与角膜基质细胞片(多片)以及角膜内皮细胞片(单片)纵向整合可以进行全层角膜移植。上述角膜移植可以治疗角膜不同部位的相关病变。

实施例7视网膜色素上皮细胞片

酶消化或组织块贴壁法进行视网膜色素上皮细胞的分离和原代培养，常规培养视网膜色素上皮细胞，按照上述角膜上皮细胞片构建类似的方法构建视网膜色素上皮细胞片，将视网膜色素上皮细胞片移植于视网膜下间隙，可以治疗因为视网膜色素上皮细胞代谢障碍导致的眼底疾病。视网膜色素上皮细胞片移植优于视网膜色素上皮细胞悬液注射移植之处在于前者移植后可以保持视网膜色素上皮细胞生理状态下正常的极性，而正确的极性分布对维持视网膜色素上皮细胞的功能具有重要的意义。上述视网膜色素上皮细胞片的构建和移植的种子细胞除了应用视网膜色素上皮细胞、虹膜上皮细胞外，也可以应用其它的色素上皮细胞。

实施例8视网膜神经感觉层细胞片

按视网膜神经感觉层细胞(光感受器细胞、中间神经元、神经节细胞)常规培养方法进行种子细胞培养，采用上述角膜上皮细胞片构建类似的方法构建视神经细胞片。视网膜神经感觉层细胞片移植可以治疗视网膜病变患者。上述视网膜神经感觉层细胞片的构建和移植的种子细胞除了应用视网膜前体细胞(retinal progenitor cells)外，也可以应用其它细胞。

实施例9视网膜细胞片

将上述视网膜色素上皮细胞片和视网膜神经感觉层细胞片通过单细胞片重叠放置纵向整合或通过黏附蛋白液黏附纵向整合为复合视网膜细胞片，黏附蛋白液一种或者多种使用，视网膜细胞片移植可以治疗多种视网膜病变患者。

实施例10皮肤细胞片

与角膜细胞片的构建类似，既可以分别构建表皮上皮细胞片和真皮细胞片进行移植治疗，也可以将表皮上皮细胞片和真皮细胞片通过重叠整合或黏附纵向整合为多片复合皮肤细胞片，再进行移植，治疗皮肤病变。

实施例11牙周组织细胞片

通过酶消化组织块法分离牙周膜成纤维细胞并进行常规细胞培养，按上法构建牙周膜成纤维细胞片，移植于牙周，术后可以观察到牙龈的再生，再生牙龈与牙齿粘附紧密，可以治疗牙龈萎缩或其它牙龈病变。

实施例12心肌细胞片

按上法构建心肌细胞片，多个心肌细胞片可以重叠放置纵向整合为多片复合心肌细胞片，也可以通过黏附纵向整合为多片复合细胞片。可以观察到多片复合细胞片的搏动及电生理活动，多片复合细胞片可以移植到心肌缺损部位。

按上述还可以构建肝组织、泌尿系统、呼吸系统等细胞片并进行移植治疗。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1、一种组织工程细胞片的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)在细胞培养支持物表面覆盖含质量浓度为0.1％～1.5％交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的N-异丙基丙烯酰胺单体溶液；

所述N-异丙基丙烯酰胺单体的质量浓度为40％～60％。

(2)对步骤(1)所得溶液进行电子加速器辐射合成，总辐射剂量为240kGy～300kGy，连续分三～六次辐射合成，每次辐射量低于200kGy，得到覆盖了聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶的细胞培养支持物；

(3)将步骤(2)得到的细胞培养支持物放到4℃的去离子水中，浸泡5～8天，期间换水4～7次，烤干并灭菌后，密封备用；

(4)控制温度使聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶为疏水相，将细胞接种到步骤(3)得到的细胞培养支持物中，培养细胞；改变温度，使聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶为亲水相，通过高分子膜吸附或夹具钳夹方法，分离出组织工程细胞片。

2、根据权利要求1所述的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述N-异丙基丙烯酰胺单体经过重结晶。

3、根据权利要求2所述的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于：所述重结晶是使用体积比为1∶1的苯和异丙醇进行的。

4、根据权利要求1所述的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述细胞培养支持物表面的N-异丙基丙烯酰胺单体覆盖量为3mg～5mg/cm²，所述交联剂的加入量为10μg～30μg/cm²。

5、根据权利要求1所述的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述细胞培养支持物为聚苯乙烯或者聚四氟乙烯材质。

6、根据权利要求1所述的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述电子加速器的真空度≤2.2×10^-6KPa。

7、根据权利要求1所述的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述灭菌为环氧乙烷灭菌。

8、根据权利要求1所述的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，具体采用以下方法分离得到所述组织工程细胞片：

接种细胞到接枝聚-N异丙基丙烯酰胺水凝胶的培养器皿上；置5％CO₂培养箱37℃培养，当培养细胞达到80～90％融合时，将培养器皿转移到20℃的孵箱，培养1小时，细胞成片浮出于溶胀增厚的水凝胶表面，通过高分子膜吸附或夹具钳夹方法，分离出无载体的组织工程细胞片。

9、一种权利要求1-8任一项所述方法得到的组织工程细胞片。

10、一种多层化组织工程细胞片，其特征在于：是由权利要求9所述的组织工程细胞片纵向重叠放置，经多层化培养得到；或者通过黏附蛋白液纵向整合得到；

所述黏附蛋白液包括以下蛋白质中至少一种：

10μg～100μg/ml层粘连蛋白、5μg～50μg/ml纤维连接蛋白、100μg～1mg/ml肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-丝氨酸四肽、100mg～300mg/ml纤维蛋白原、10μg～100μg/mL I型胶原、10μg～100μg/ml IV型胶原；

所述胶原用0.006～0.1mol/L乙酸稀释，其它蛋白用pH 8.3的NaHCO₃溶液稀释；

所述纤维蛋白原加入后，需加入等量的200～1000U/ml凝血酶和等量的10％氯化钙液。

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