CN101611155A - 虾病原体诊断用序列 - Google Patents

Abstract

分离到了可用来诊断检测Taura综合征病毒(TSV)的引物。这些引物是基于TSV基因组的新的部分，可用于引物指导的扩增或核酸杂交测定方法中。

Description

虾病原体诊断用序列

相关申请的交叉引用

本申请按照美国法典第35篇第119条(35 U.S.C.§119)要求2006年8月24日提交的美国临时申请系列号60/839864的优先权。

发明领域

本发明涉及诊断试验领域。更具体的说，开发出了用于检测Taura综合征病毒这一虾病原体的新引物。

发明背景

商业养虾场因多种普通病原体的影响而遭受极大的损失。Taura综合征病毒(TSV)是养殖对虾(penaeid shrimp)的最严重病毒病原体之一。它在许多国家分布广泛，宿主广。最易感TSV的虾种类有太平洋白虾(Pacific white shrimp，Liptopenaeus vannamei)和白虾(whiteshrimp，Liptopenaeus schmitti)。其他易感种类包括褐虾(Farfantepanaeus aztecus)、粉红虾(Farfantepanaeus duorarum)和白虾(Liptopenaeus setiferus)。TSV是单链RNA病毒，其完整基因组已得到测序(GenBank AF277675)。

TSV会在幼虾被放养到室外养殖池塘后两到四星期内感染幼虾，可造成很高的死亡率。对孵卵场亲虾和仔虾进行TSV检测，可以避免受感染的虾进入商业生产系统中。因此，已开发出多种检测虾TSV的方法，包括基于核酸的方法和免疫学方法(You et al. Current Topicsin Virology 4：63-73(2004)；和Lightner et al.，Aquaculture164(1)：201-220(1998))。基于聚合酶链反应(PCR)的方法因简便、快速和灵敏而特别引人关注。用于检测TSV的反转录酶链式反应(RT-PCR)方法已有描述，这些方法是基于扩增基因组的不同诊断区域(参见例如Tang et al.，J.Virol.Methods 115(1)：109-114(2004)；Mouillesseaux etal.，J.Virol.Methods 11(2)：121-127(2003)；Nunan et al.，Dis.Aquat.Org.34(2)：87-91(1998)；Dhar et al.，J.Virol.Methods 104(1)：69-82(2002)和Nunan et al.，Aquaculture 229(1-4)：1-10(2004))。

所有上述方法都可用于检测TSV；但是，它们通常缺乏特异性和灵敏度，或者繁杂和耗时。另外，由于病毒中基因突变速率高，针对基因组的不同区域的试验将会是有用的。因此，存在着对快速、准确和容易在现场使用的高灵敏TSV测定法的需求。由于发现了基于TSV基因组的新的部分(portion)的引物，上述问题在本发明中得到了解决。本文所确定的引物可用于引物指导的扩增(primer directedamplification)或核酸杂交测定方法中用来检测TSV，而又没有之前的方法所存在的问题。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供SEQ ID NO：1-6中的任何一个所示的分离TSV诊断引物序列，或者与SEQ ID NO：1-6完全互补的分离核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明提供由两个不同的本文所公开的TSV诊断引物序列组成的引物对，其中该引物对能够引发扩增TSV基因组当中的某核酸区域的核酸扩增反应。

在另一个实施方案中，本发明提供检测TSV的试剂盒，所述试剂盒包含至少一对本文所公开的TSV诊断引物序列。

在另一个实施方案中，本发明提供检测样品中是否存在TSV的方法，所述方法包括：

(i)从怀疑含有TSV的样品提供RNA；和

(ii)用衍自SEQ ID NO：1-6中的任何一个所示的分离TSV诊断引物序列的探针，在合适的杂交条件下对该RNA进行探测；

其中如鉴定到可杂交的核酸片段，则证明存在TSV。

在其他实施方案中，检测方法对不受TSV感染的DNA样品进行鉴定。

在另一个实施方案中，本发明提供检测样品中是否存在TSV的方法，所述方法包括：

(i)从怀疑含有TSV的样品提供RNA；

(ii)使用反转录酶和至少一个本文所公开的TSV诊断引物序列，合成出与所述RNA互补的DNA；

(iii)用至少一对本文所公开的TSV诊断引物序列扩增所述互补DNA，产生出扩增产物；

其中若存在扩增产物，则证明存在TSV。

在另一个实施方案中，本发明提供定量样品中的TSV的量的方法，所述方法包括：

(i)从怀疑含有TSV的样品提供RNA；

(ii)使用反转录酶和至少一个本文所公开的TSV诊断引物序列，合成出与所述RNA互补的DNA；

(iii)用至少一对本文所公开的TSV诊断引物序列，在核酸结合荧光剂或荧光标记探针的存在下，通过在至少变性温度和延伸温度之间进行的热循环，扩增所述互补DNA；

(iv)测量出核酸结合荧光剂或荧光标记探针在热循环过程中所产生的荧光量；

(v)确定出核酸结合荧光剂或荧光标记探针所产生的荧光量达到基线值以上的某固定阈值时的阈循环数；和

(vi)通过将该对样品中的TSV确定出的阈循环数与这样的标准曲线进行比较，来计算出样品中的TSV的量，该标准曲线是阈循环数与用已知浓度的标准溶液测定出的模板浓度的对数的曲线。

附图简述和序列描述

由下文的发明详述和所附的构成本申请一部分的序列描述，可更加完全地理解本发明的各个实施方案。

图1A显示了实施例8中所描述的，对TSV病毒RNA和肌动蛋白DNA同时进行PCR扩增所形成的TSV2产物和肌动蛋白内样品对照产物的解链曲线。TSV2产物和肌动蛋白产物的解链温度(Tm)在它们的相应解链曲线上标出。

图1B显示了实施例8中所描述的，含有对TSV病毒RNA和肌动蛋白DNA同时进行PCR扩增所形成的TSV2产物和肌动蛋白内样品对照产物的各样品的琼脂糖凝胶电泳分离结果。TSV和虾DNA的量在每个泳道上方显示；“M”是100-bp DNA梯。

以下序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求——序列规则”)，符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)及EPO和PCT的序列表要求(Rules5.2和49.5(a-bis)，及行政规程(Administrative Instructions)的Section208和Annex C)。核苷酸和氨基酸序列数据所用的符号和格式符合37C.F.R.§1.822提出的规则。

SEQ ID NO：1-6是可用于检测TSV的TSV诊断引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7-9是实施例的“一般方法”中描述的合成TSV模板的核苷酸序列。这些序列也是用各对本文所述TSV诊断引物获得的扩增产物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10-13是实施例8中描述的内样品对照引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14-15是实施例9和10中描述的荧光标记探针的核苷酸序列。

发明详述

本文所公开的是可在检测Taura综合征病毒的测定法中使用的引物。所述引物可在核酸扩增方法中及在杂交测定中使用，以有效地检测和定量恶性的Taura综合征病毒。

在本公开说明书中，用到多个术语和缩写。提供了以下定义，在解释本说明书和权利要求书时应参照这些定义。

“聚合酶链式反应”缩写为PCR。

“Taura综合征病毒”缩写为TSV。

术语“分离TSV诊断引物序列”指这样的序列，它对应于TSV基因组中的能确诊TSV的存在的部分。

本文所用的“分离核酸片段”是这样的RNA或DNA聚合物，它是单链的或双链的，任选含有合成的、非天然的或被改变了的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段所构成。

术语“扩增产物”或“扩增子”指在引物指导的扩增反应过程中产生的核酸片段。引物指导的扩增的典型方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或者其他的等温扩增方法。如果选择PCR方法，复制组合物通常会包括例如：脱氧核苷酸三磷酸、两个具有适当序列的引物、热稳定性DNA聚合酶和蛋白质。这些试剂以及描述它们在扩增核酸中的使用的程序的详细内容，在美国专利第4,683,202号(1987，Mullis等)和第4,683,195号(1986，Mullis等)中提供。如果选择LCR方法，则核酸复制组合物会包含例如：热稳定性连接酶(例如T.aquaticus连接酶)、两组相邻寡核苷酸(adjacentoligonucleotide)(其中每组中有一个成员与靶标链之一互补)、Tris-HCl缓冲液、KCl、EDTA、NAD、二硫苏糖醇和鲑精DNA(参见例如Taboret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074-1078(1985))。

术语“反转录后进行聚合酶链反应”或者“RT-PCR”指对基因表达、克隆、cDNA文库构建、探针合成和原位杂交中信号放大进行定量分析的灵敏技术。该技术由以下两部分构成：通过反转录(RT)从RNA合成cDNA，和通过聚合酶链反应(PCR)扩增特定的cDNA。反转录酶是RNA依赖性DNA聚合酶，它能催化使用模板DNA、RNA或RNA:DNA杂交物进行的核苷酸聚合。重要的是采用能产生没有显著量的基因组DNA污染的RNA的总RNA分离技术，因为随后的PCR不能区别通过反转录合成的cDNA靶标与基因组DNA污染。

术语“引物”指这样的寡核苷酸(合成的或天然的)，它在被置于聚合酶能催化互补链的合成的条件下时，能够充当沿着该互补链进行的核酸合成或复制的起始点。

术语“热循环”指在某些核酸扩增方法(如PCR和LCR)的过程中使用的整个温度变化模式。这个过程是本领域通用和公知的。参见例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2^nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press：ColdSpring Harbor，NY(1989)；和Mullis等的美国专利第4,683,202号和Mullis等的美国专利第4,683,195号。一般来说，PCR热循环包括初始的高温变性步骤，接着是设计来让模板变性、引物退火和聚合酶延伸退火引物的反复一系列温度循环。

术语“阈循环数”在本文中也称“CT”，指热循环过程中由产物形成所产生的荧光量达到基线值以上的某固定阈值时的循环数。

术语“探针”指这样的寡核苷酸(合成的或天然的)，它能明显地与靶标序列(在本文中也称“片段”，即待检测的序列或待检测的序列的一部分)互补，通过与靶标序列的至少一条链杂交形成双链体结构。探针可进行标记以便于检测，例如用荧光标记或配体标记来进行标记。

术语“复制抑制部分”指任何与寡核苷酸的3′末端羟基连接的、会阻断核酸链的复制所需的链延伸的引发的原子、分子或化学基团。其实例包括但不限于3′脱氧核苷酸(例如蛹虫草菌素)、二脱氧核苷酸、磷酸盐、配体(例如生物素和二硝基苯酚)、报道分子(例如荧光素和罗丹明)、碳链(例如丙醇)、错配的核苷酸或聚核苷酸或者肽核酸单位。

术语“非参与性”指探针或引物没有参与到扩增核酸分子的反应中。具体的说，非参与性探针或引物是不会充当DNA聚合酶的底物或被DNA聚合酶延伸的探针或引物。“非参与性探针”在本质上不能够被聚合酶进行链延伸。它可具有或不具有复制抑制部分。

某核酸分子当其单链形式能在合适的温度和溶液离子强度条件下与其他核酸分子退火时，则该核酸分子与别的核酸分子(如cDNA、基因组DNA或RNA)“可杂交”。杂交和洗涤条件是公知的，在以下文献中有举例说明：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，NY(1989)，特别是其中的第11章和表11.1(通过引用整体结合到本文中)。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格性”。对于同源核酸的初步筛选，可使用对应于55℃的解链温度(Tm)的低严格杂交条件，例如5X SSC，0.1％SDS，0.25％牛奶，无甲酰胺；或者30％甲酰胺，5X SSC，0.5％SDS。中严格杂交条件对应于更高的Tm，例如是40％甲酰胺加5X或6X SSC。杂交要求两个核酸含有互补的序列，不过视杂交的严格性而定，碱基之间可以允许有错配。使核酸发生杂交所用的适当严格性取决于核酸的长度、互补程度、本领域公知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，具有这些序列的核酸的杂交体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序下降：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度大于100核苷酸的杂交体，已经得出计算Tm的方程式(参见Sambrook et al.，出处同上，9.50-9.51)。对于与更短的核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，且寡核苷酸的长度决定了它的特异性(参见Sambrook et al.，出处同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15核苷酸，更优选至少约20核苷酸；最优选长度为至少30核苷酸。此外，技术人员会认识到，可根据诸如探针长度等因素，按需调节温度和洗涤溶液盐浓度。

“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括编码序列上游的调节序列(5′非编码序列)和下游的调节序列(3′非编码序列)。“天然基因”指自然界中所发现的带有自身调节序列的基因。“嵌合基因”指任何不是天然基因的基因，它包含在自然界中不一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含衍自不同来源的调节序列和编码序列，或者衍自相同来源、但以不同于自然界中所见的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”指在生物的基因组中的其天然位置中的天然基因。“外来”基因指通常不在宿主生物中存在、而是通过基因转移引入到该宿主生物中的基因。外来基因可包含被插入到非天然生物中的天然基因，或者嵌合基因。“转基因”是已通过转化程序引入到基因组中的基因。

术语“可操作地连接(operably linked)”指各核酸序列在单一核酸片段上发生联系，使得一个序列的功能受到另一个序列的影响。例如，启动子当能够影响编码序列的表达(即该编码序列在该启动子的转录控制下)时，则与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以正义或反义方向与调节序列可操作地连接。

本文所用的术语“表达”指衍自本发明核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可指mRNA向多肽的翻译。

术语“质粒”、“载体”和“盒(cassette)”指这样的染色体外元件，它往往携带有不属于细胞的中心代谢的一部分的基因，且通常为环形双链DNA分子的形式。这种元件可以是自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，它们为线性或环形，属单链或双链DNA或RNA，衍自任何来源，其中有多个核苷酸序列被结合或重组成这样的单一构造(unique construction)，该构造能够向细胞中引入启动子片段和选定基因产物的DNA序列连同适当的3′未翻译序列。“转化盒”指这样的具体载体，它含有外来基因，且除了外来基因外还具有能促进特定宿主细胞的转化的元件。“表达盒”指这样的具体载体，它含有外来基因，且除了外来基因外还具有能使该基因在异种宿主中的表达增强的元件。

术语“序列分析软件”指任何可用于分析核苷酸或氨基酸序列的计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可市售获得，或者可独立开发。典型的序列分析软件会包括但不限于GCG程序包(WisconsinPackage Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)、DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)和Vector Nti版本7.0。应认识到，在本申请的情形中，如将序列分析软件用于分析，分析的结果要基于所涉及的程序的“默认值”，除非另有指明。本文所用的“默认值”是指软件第一次初始化时最初装入的任何一组数值或参数。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，在如下文献中有描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，NY(1989)(hereinafter“Maniatis”)；和Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)出版。

Taura综合征病毒基因组

Taura综合征病毒(TSV)是主要的虾病原体，致死率高，宿主范围广。TSV的完整基因组已得到测序(GenBank AF277675)。该基因组由含有10,205个碱基和2个开放阅读框(ORF)的单链RNA组成。

TSV诊断引物序列

本文所公开的是可用于多个测定程式(assay format)中以高灵敏地检测TSV的诊断引物序列。这些引物靶向TSV基因组中的之前不被用于TSV检测的区域。

引物序列是用一系列的“在计算机芯片上的(in silica)”(即基于计算机的)序列分析工具凭经验得到鉴定的。在这个方法中，汇编了包含所有已知的TSV序列的数据库。先对这些序列进行比对，然后使用Vector

软件(InforMax Inc.，Bethesda，MD)，基于与其他TSV序列的同源性、指定的扩增子长度、盐浓度、Tm(解链温度)、C+G含量和发夹的避免出现(freedom from hairpin)及二级结构参数进行引物位点分析。然后比对GenBank序列筛选出预期的引物。选择出那些被确知含有小于5碱基的与其他非靶标基因序列的同源性的引物，进行PCR扩增效率和最小引物二聚物形成方面的实验研究。选择出同时显示高扩增效率和最小引物二聚物形成的引物，用一批(a panelof)分离自感染各种虾病原体的虾的DNA和分离自证明无病的虾的DNA进行试验。那些能扩增所有的TSV毒株、同时对分离自感染非TSV病原体的虾的DNA和对分离自不同种类的证明无病的虾的DNA没有显示响应的引物，被选择作为有用的引物。

表1给出了被发现可用于检测TSV的引物序列和它们在TSV基因组中的位置。这些引物可用标准的亚磷酰胺化学法进行合成，或者可从诸如Sigma Genosys(The Woodlands，TX)的公司购买。

表1

TSV诊断引物序列

引物，方向	SEQ IDNO：	ORF	TSV基因组位置(GenBankAF277675)
				TSV2F，正向	1	1	475-498
TSV2R，反向	2	1	568-592
				TSV3F，正向	3	1	4953-4976
TSV3R，反向	4	1	5053-5075
				TSV5F，正向	5	2	7377-7401
TSV5R，反向	6	2	7470-7494

测定方法

本文所公开的引物序列可用于多个测定程式中进行TSV的检测和定量。两个最便利的程式基于核酸杂交方法或引物指导的扩增方法如PCR。

引物指导的扩增测定方法

在一个实施方案中，本发明TSV诊断引物序列可用于引物指导的核酸扩增中，用来检测TSV的存在。由于TSV是RNA病毒，故采用反转录来将RNA序列转换成双链DNA拷贝，后者然后可用下文所述的核酸扩增方法之一进行扩增。反转录和核酸扩增可分两个单独的步骤来进行，或者可结合在一个步骤中，其中所述两个步骤的所有所需试剂都存在。

反转录通常是在这样的组合物中进行，该组合物包含能与靶标RNA杂交以引发拷贝DNA的合成的引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(即dATP、dCTP、dTTP和dGTP)的混合物、MgCl₂、反转录酶和反转录酶缓冲液。另外，该组合物还任选含有RNA酶(RNase)抑制剂如异硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯、SuperaseIn^TM(Ambion Inc.，Austin，TX)、RNaseBlock(Stratagene，La Jolla，CA)，人胎盘核糖核酸酶抑制剂，猪肝RNA酶抑制剂(Takara Mirus Bio，Madison，WI)、Anti-Rnase(Novagen Inc.，Madison，WI)、Ribonuclease Inhib III(PanVera.Madison，WI)、RNAlater^TM(Ambion)或RNA Protect Bacteria Reagent(Qiagen，Valencia，CA)。合适的反转录酶是本领域公知的，包括但不限于HIV反转录酶(Ambion)、Transcriptor反转录酶(Roche Appled Science，Indianapolis，IN)、Thermoscript反转录酶(Invitrogen)。

不管反转录和扩增是作为两个步骤还是作为一个步骤来进行，都是首先进行反转录步骤，该步骤通常由在约37℃至约70℃之间的某温度下进行的单一温度温育所组成。不同的温度适合于不同的反转录酶和不同的引物，这是本领域技术人员知道的。

有多种引物指导的核酸扩增方法为本领域所公知，它们适合与本文所公开的引物一起使用。这些核酸扩增方法包括热循环方法(例如聚合酶链反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR))以及等温方法和链置换扩增(SDA)。

LCR方法是本领域公知的(参见例如Tabor et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074-1078(1985))。通常，LCR核酸扩增组合物包含例如：热稳定性连接酶(例如T.aquaticus连接酶)、两组相邻寡核苷酸引物(其中每组中有一个成员与靶标链之一互补)、Tris-HCl缓冲液、KCl、EDTA、NAD、二硫苏糖醇和鲑精DNA。

SDA方法也是本领域公知的。Walker等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992))对SDA方法进行了深入的讨论。通常在SDA中，使用两个寡核苷酸引物，每个引物具有只与靶标中的一条链互补的区域。在热变性后，单链靶标各片段与过量存在的各自引物发生结合。两个引物都含有位于靶标结合序列的5’的不对称限制酶识别序列。每个引物-靶标复合物在限制酶、DNA聚合酶和三种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和一种脱氧核苷酸α-硫代三磷酸(dNTP[aS])的存在下循环经历切口步骤和聚合/置换步骤。

优选的使用本文所公开的诊断引物序列检测TSV的方法是PCR，在Mullis等的美国专利第4,683,202号和第4,683,195号中有描述，这两个专利通过引用特地结合到本文中。在PCR方法中，将本文所公开的TSV诊断引物序列及其完全互补序列成对使用，所述引物对能够引发扩增TSV基因组当中的某区域的核酸扩增反应。可使用TSV诊断引物序列及其互补序列的各个组合。合适的引物对包括但不限于SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6及SEQ IDNO：3和6。通常，将该两个引物与如上所述通过反转录产生的样品DNA、四种脱氧核苷酸三磷酸(即dATP、dCTP、dTTP和dGTP)的混合物、热稳定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶在缓冲溶液中进行混合。然后使用热循环仪将这一混合物进行热循环，以扩增所需的靶标区域。热循环仪可从多个来源市售获得(例如Applied Biosystems(Foster City，CA)；Brinkmann(Westbury，NY)；MJ Research(Waltham，MA)和Stratagene(La Jolla，CA))。

一般来说，PCR热循环包括初始的高温变性步骤，接着是设计来让模板变性、引物退火和聚合酶延伸退火引物的反复一系列温度循环。通常，样品最初在约95℃下初始加热约2-10分钟，以使双链DNA样品变性。然后，在每个循环的开始，使样品变性约10-60秒钟，时间长度取决于样品和所用仪器类型。变性后，让引物在约40℃至约60℃的较低温度下与靶标DNA退火约20-60秒钟。聚合酶对引物的延伸往往是在约60℃至约72℃的温度下进行。延伸所用的时间长度要取决于扩增子的大小和扩增所用的酶的类型，可容易地通过常规实验确定。另外，退火步骤可与延伸步骤结合，由此得到两步循环方法。热循环还可包括PCR测定中的另外的温度漂移(temperature shift)。测定中所用的循环数取决于多个因素，包括所用的引物、所存在的样品DNA的量和热循环条件。任何测定中要用到的循环数可容易地由本领域技术人员通过常规实验进行确定。任选地，在热循环完成后可加上最后延伸步骤，以确保所有的扩增产生得到合成。

在扩增后，可将扩增到的核苷酸序列与合适的载体连接，然后用所述载体转化合适的宿主生物。由此确保扩增到的序列有更容易获得的供应量。或者如下所述，在扩增后，可将扩增到的序列或其部分进行化学合成，供用作在杂交测定中使用的核苷酸探针。在任一情况中，可变区的DNA序列都可用诸如二脱氧方法(dideoxy method)的方法来确定(Sanger，F.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.74：5463-5467(1977))。所获得的序列用来指导针对该生物的探针的选择，选出最适当的序列。

为了用反转录和引物指导的核酸扩增方法的组合来检测怀疑含有TSV的样品(例如虾或其他甲壳类)中的TSV的存在，来自该样品的RNA必须以适合于反转录和随后的扩增的形式提供。通常，RNA必须脱离细胞，且可进行处理以除去蛋白质和其他细胞成分。RNA可从任何合适的组织、流体或样品材料获得，包括但不限于虾组织(例如鳃、腹肢、血淋巴、肌肉、尾巴、眼柄、胃、腿和结缔组织)、洗涤流体和池塘水样品。样品可因任何原因而被怀疑含有TSV，包括接近了已知的污染物或别的原因，或者仅仅由TSV常见于商业虾行业中这一点就可怀疑受到污染。因此，怀疑含有TSV的样品可以是任何上述RNA样品。

从组织提供适合使用的RNA的方法是本领域公知的。这些方法可包括将样品材料在缓冲液中进行匀化，离心除去固体碎片、用苯酚/氯仿-异戊醇萃取RNA、离心、氯仿萃取、沉淀、干燥和再悬浮。通常，用DNA酶处理RNA以除去任何污染的DNA。另外，可使用市售的RNA分离试剂盒，将RNA以合适的形式提供，所述RNA分离试剂盒例如Qiagen RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit(Qiagen，ValenciaCA)、High Pure RNA tissue kit(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)或TRI

(Molecular Research Center Inc.，Cincinnati，OH)。

然后，使用至少一个本文所公开的分离TSV诊断引物序列，用如上所述的反转录酶合成出所提供的RNA的互补DNA。合适的TSV诊断引物序列包括但不限于SEQ ID NO：1、3和5。

然后使用如上所述的核酸扩增方法，用至少一对本文所公开的诊断引物序列，在如上所述的单独步骤或同一步骤中，将所产生的互补DNA进行扩增。还可使用不同的各对诊断引物序列的组合。如下所述检测到的扩增产物的存在，证明了样品中TSV的存在。在一个实施方案中，用PCR来扩增DNA。

在核酸扩增方法中，试验结果可能会因为试剂失灵、程序错误和仪器故障而被曲解。另外，由于样品材料中存在着抑制性物质，或者样品DNA或RNA在样品加工和核酸回收过程中发生降解，会有问题出现。为克服这些问题，可在进行TSV测定的同时联合进行内对照试验，以给使用者提醒这些类型的错误和帮助对试验结果的定量。

有两种类型的内对照试验可使用。一个方法是基于“内模板对照”(ITC)的共扩增，该ITC是在反应前加到核酸扩增试剂混合物的。另一个方法是基于“内样品对照”(ISC)的共扩增，该ISC含在样品中。在两种情况中，内对照DNA或RNA的序列都不同于TSV RNA的序列。

内样品对照可以是在样品材料(例如虾组织和血淋巴)中保存着或一贯存在着的DNA或RNA基因序列。将用以扩增ISC靶标DNA或RNA的引物加以选择，使其不会扩增TSV RNA，将TSV试验引物加以选择，使其不会扩增内样品对照DNA或RNA靶标。这样，ISC靶标和TSV靶标独立地扩增。在测定中，ISC靶标和TSV靶标都用相同的试剂和条件进行加工。此外，两种靶标模板都用相同的试剂和反应条件扩增。由于ISC模板和引物存在于试验样品中，ISC产物应该在扩增过程中产生。如果没有形成ISC产物，这表明试验化学研究(test chemistry)没有得到正确的进行，TSV试验结果不正确，不应信赖。如果出现了正确的ISC产物形成，这表明试验化学研究得到了正确的进行，可认为TSV样品加工和试验反应已得到正确的运行，从而TSV试验可得到更为准确的解释。

ISC引物可选自编码易受TSV感染的病原宿主物种的结构蛋白质、代谢酶或核糖体产物的基因的基因序列。例如，ISC引物可以是衍自虾肌动蛋白基因，或者虾的18S、23S或5S核糖体基因、或者其他组成型基因的基因序列。ISC引物对的合适实例包括但不限于衍自斑节对虾(Penaeus monodon)肌动蛋白1基因(GenBank AF100986)的SEQ ID NO：10、11和SEQ ID NO：12、13，如表2所示。

表2

内样品对照(ISC)引物序列

引物，方向	SEQ ID NO：	肌动蛋白1基因位置(GenBank AF100986)
			肌动蛋白F1，正向	10	41-62
肌动蛋白R1，反向	11	158-179
			肌动蛋白F3，正向	12	326-346
肌动蛋白R3，反向	13	553-574

在一个实施方案中，将至少一对ISC引物包括在核酸扩增试剂混合物中，以在扩增反应中产生内样品对照产物。在一个实施方案中，该至少一对ISC引物选自SEQ ID NO：10、11和SEQ ID NO：12、13。

另外，可将内模板对照(ITC)有利地与TSV试验引物一起使用，以帮助对试验响应的定量。对ITC引物的要求与对ISC引物的要求相似，例外的是ITC模板和引物同时加到扩增试剂混合物中。将ITC引物加以选择，使其不会从易受TSV的试验物种(如虾)扩增基因组DNA或RNA。ITC模板是以已知的浓度加入，使得每次反应的拷贝数是知道的。由于将ITC模板包括在扩增试剂混合物中，在扩增过程中有ITC产物产生。取决于反应的扩增效率和其他变量，ITC产物的量会随反应而异。由于同样这些变量也会影响TSV DNA扩增，所产生的TSV产物的量会与反应中所产生的ITC产物的量成比例。因此，TSV模板在测定中的拷贝数可从原先加入的ITC、所形成的ITC产物和所产生的TSV产物之间的比例来推断。相对产物形成可如下进行确定：当使用标记的内探针时以CT单位确定，或者通过在各产物的各自解链温度下的解链曲线的导数来确定。

ITC引物序列可从非试验物种(如其他病毒)的基因序列或试验样品中不存在的植物和动物基因进行理性地设计或衍生。这样，样品材料不含有其他会被ITC引物扩增的DNA或RNA。

在一个实施方案中，有至少一个内模板对照和至少一对ITC引物包括在核酸扩增试剂混合物中，以在扩增反应中产生至少一个ITC产物。

有多种本领域公知的检测方法可用于本文所公开的方法中。这些检测方法包括但不限于标准的非变性凝胶电泳(例如丙烯酰胺或琼脂糖)、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、毛细管电泳和荧光检测。

荧光检测方法能快速且灵敏地检测扩增产物。荧光检测还能够进行实时检测，其中在热循环过程中监测扩增产物的形成。另外，初始靶标的量可用荧光检测进行定量。荧光检测可通过在热循环过程之前或之后将核酸结合荧光剂加到反应混合物中来进行。优选地，核酸结合荧光剂是能够非共价插入在核酸双螺旋中的各堆积碱基对之间的嵌入染料。但是，非嵌入性核酸结合荧光剂也适用。可用于本发明方法的核酸结合荧光剂的非限制性实例有溴化乙锭和

Green I(获自Molecular Probes；Eugene，OR)。如Higuchi(美国专利第5,994,056号)所述，在热循环前将核酸结合荧光剂加到反应混合物中，可以对扩增产物的形成进行实时监测。能够进行实时荧光测量的热循环仪可从诸如Applied Biosystems(Foster City，CA)、MJ Research(Waltham，MA)和Stratagene(La Jolla，CA)的公司市售获得。在扩增后，扩增产物的确认可通过用本领域公知的方法确定产物的解链温度来进行，所述确定例如通过用荧光测量产生解链曲线来进行。

扩增产物的荧光检测还可用本领域公知的其他方法来完成，例如使用荧光标记探针。该探针包含与扩增产物的至少一部分互补的序列。这种探针的非限制性实例包括

探针(Applied Biosystems)和分子信标(Goel et al.，J.Appl.Microbiol.99(3)：435-442(2005))。例如，如下文实施例9和10中所详述，用以构建供与本文所公开的TSV引物一起使用的荧光标记探针的基因序列，可通过用市售的分析软件如Primer

v2.0(Applied BioSystems Inc.，Foster CityCalifornia)对TSV基因和试验扩增子进行分析来选择。将探针序列加以选择，使其落在特定的TSV试验扩增子的近端(proximal end)当中。合适的探针序列包括但不限于SEQ ID NO：14和15所示的序列。探针可用本领域公知的方法进行荧光标记，如下文所述的标记杂交探针的方法。对于实时荧光检测，可将探针进行双重标记。例如，探针的5’末端可用荧光团如6FAM^TM(Applied BioSystems)进行标记，3’末端可用猝灭染料如6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)进行标记。在小沟(minorgroove)结合探针的情况中，3’末端可用猝灭染料和小沟粘合剂复合物(binder complex)进行标记。荧光标记探针可获自商业渠道，如AppliedBioSystems。

在一个实施方案中，本发明提供定量样品中的TSV的量的方法。在这个实施方案中，如上所述从怀疑含有TSV的样品提供RNA，用反转录酶产生互补DNA。该DNA用至少一对本文所公开的寡核苷酸引物，在核酸结合荧光剂或荧光标记探针的存在下，通过在至少变性温度和延伸温度之间进行的热循环来进行扩增。在热循环过程中测量核酸结合荧光剂或荧光标记探针所产生的荧光量。由荧光测量值确定出核酸结合荧光剂或荧光标记探针所产生的荧光量达到基线值以上的某固定阈值时的阈循环数。阈循环数在本文中称为CT数或值。CT数可手工确定，或者通过仪器自动确定。为确定CT数，在初始扩增循环过程中测定每个样品的基线荧光。然后采用数学算法确定出为使荧光信号高于背景会需要多大的统计学上显著荧光变化。荧光超过这个阈值时的循环数称为CT数。通常，在热循环的开始样品中存在的DNA越多，达到阈值所需的循环数越少。因此，CT循环数与样品中的TSV初始量成反比关系。确定出TSV样品的CT数之后，通过将该对样品中的TSV确定出的阈循环数与这样的标准曲线进行比较，来计算出样品中原先存在的TSV的量，该标准曲线是阈循环数与用已知浓度的标准溶液测定出的模板浓度的对数的曲线，这是本领域公知的。

核酸杂交方法

TSV的核酸杂交试验的基本构成包括DNA探针、怀疑含有TSV的样品和特定的杂交方法。本发明的探针是单链的核酸序列，它与待检测的核酸序列互补，从而与该待检测的核酸序列“可杂交”。通常在杂交方法中，探针长度可从少至5个碱基到多至几千个碱基不等，要取决于所要进行的具体试验。探针分子只需有一部分与待检测的核酸序列互补即可。另外，探针和靶标序列之间的互补性不需要完美。杂交的确会在不完美地互补的分子之间发生，结果是杂交区域中有一部分碱基没有与适当的互补碱基发生配对。

本文所公开的DNA探针衍自上文所述的TSV诊断引物序列。本文所用的词语“衍自TSV诊断引物序列”意指该DNA探针可以是该TSV诊断引物序列、用核酸扩增方法从该TSV诊断引物序列获得的扩增产物序列、该TSV诊断引物序列或其扩增产物序列的部分(portion)、或者任何上述序列的完全互补序列。以上使用的术语“部分(portion)”指TSV诊断引物序列或从TSV诊断引物序列获得的扩增产物的任何一部分，这一部分比完全的序列小。优选地，用作探针的该部分(portion)的长度为至少约15个碱基，更优选至少约20个碱基。衍自TSV诊断引物序列的DNA探针的非限制性实例包括SEQ IDNO：1-6所示的TSV诊断引物序列，SEQ ID NO：7、8和9所示的扩增产物序列，和SEQ ID NO：1-9的完全互补序列。

探针可加以标记以促进检测。将标记连接到核酸探针的方法是本领域公知的。例如，探针可在合成过程中通过掺入被标记的核苷酸来进行标记。或者，可通过切口平移(nick translation)或末端标记来进行探针标记。标记可包含荧光检测用的荧光团，或者包含配体如生物素，在杂交后该配体用能结合它的酶标记结合分子(例如酶标记链霉亲和素)进行检测。

为了检测怀疑含有TSV的样品(如虾或其他甲壳类)中是否存在TSV，如上所述从样品提供RNA。要使样品RNA可接触到探针，以便探针和靶标分子可发生杂交。因此，RNA必须脱离细胞，且必须置于适当的条件下，才可发生杂交。另外在某些实施方案中，可能需要将RNA纯化，以除去蛋白质、脂质和其他细胞成分。有多种核酸纯化方法为本领域技术人员所熟知，如苯酚-氯仿萃取(Maniatis，出处同上)。另外，如上所述，可从商业渠道获得RNA萃取和纯化用的试剂盒。杂交前纯化对于标准的滤膜杂交测定来说特别有用。

在一个实施方案中，杂交测定可在细胞裂解物上直接进行，而不需要提取核酸。这可从样品处理过程中省去几个步骤，从而加速测定。为在粗细胞裂解物上进行这种测定，通常将离液剂加到如上所述制备的细胞裂解物中。离液剂通过抑制核酸酶活性而使核酸稳定。此外，离液剂有利于短寡核苷酸探针与RNA在室温下进行灵敏而严格的杂交(Van Ness和Chen，Nucl.Acids Res.19：5143-5151(1991))。合适的离液剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等等。通常，离液剂以约3M的最终浓度存在。如有需要，可向杂交混合物加入甲酰胺，通常为30-50％(体积)。

杂交方法是明确的(well defined)，包括溶液(即均相)和固体相(即非均相)杂交方法。通常，用衍自本文所公开的TSV诊断引物序列的探针探测样品RNA(即在会使核酸杂交得以发生的条件下接触样品RNA)。这涉及到使探针和样品RNA在无机或有机盐存在下、在适当的浓度和温度条件下进行接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使得探针和样品核酸之间可发生任何可能的杂交。混合物中的探针或靶标的浓度会决定使杂交发生所需的时间。探针或靶标浓度越高，所需的杂交温育时间越短。

有多种杂交溶液可供采用。通常，这些溶液可包含约20-60％(体积)、优选30％的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％(体积)甲酰胺、约0.15-1M氯化钠、约0.05-0.1M缓冲液如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9)、约0.05-0.2％去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5-20mM EDTA、FICOLL(AmershamBioscience Inc.，Piscataway，NJ)(分子量约300-500千道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮(分子量约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。典型的杂交溶液中还可包括未标记的载体核酸约0.1-5mg/mL、片段化核DNA(例如小牛胸腺或鲑精DNA，或酵母RNA)，和任选约0.5-2％(重量/体积)甘氨酸。还可包括其他的添加剂如消体积剂(volume exclusion agent)，它包括多种极性的水溶性或水溶胀性物质(例如聚乙二醇)、阴离子聚合物(例如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖聚合物(例如硫酸葡聚糖)。

核酸杂交适于多种测定程式。最合适的一种是夹心测定程式。夹心测定特别适于在非变性条件下进行的杂交。夹心类型的测定的主要组件是固相载体。固相载体吸附有或共价连接有固定化的核酸捕捉探针，该探针未被标记，与样品RNA序列的一部分互补。特别适用于本发明的探针是如上所述衍自本发明TSV诊断序列的探针。被捕捉的RNA用第二探针进行检测，该第二探针如上所述进行标记，与样品RNA序列的另一部分互补。该标记可用本领域公知的方法进行检测(例如荧光、化学发光、结合对酶测定等)。

杂交方法还可与核酸扩增方法如RT-PCR进行联合使用。例如，本发明的TSV诊断序列可在均相或非均相测定程式中用作3′阻断的(3′blocked)检测探针。例如，从本发明序列产生的探针可以是3′阻断的或非参与性的，因此不会被核酸扩增反应所延伸，或者不会参与核酸扩增反应。另外，探针掺有可充当反应性配体的标记，该配体起到探针/分析物杂交体的固定化的连接点的作用，或者起到产生可检测信号的报道分子的作用。因此，用反转录将从怀疑含有TSV的样品分离的RNA转变成互补DNA，该DNA通过标准的引物指导的扩增方法在过量的3′阻断的检测探针存在下进行扩增，从而产生出扩增产物。由于探针是3′阻断的，它不会参与或干扰靶标的扩增。在最后的扩增循环之后，检测探针与扩增到的DNA的相关部分退火，退火的复合物然后通过反应性配体被捕捉在载体上。

本发明的探针是通用的，可以以几种另选的形式设计。探针的3′末端可通过连接上复制抑制部分而被阻止参与引物延伸反应。典型的复制抑制部分包括但不限于二脱氧核苷酸，3′脱氧核苷酸，一段错配的核苷或核苷酸，3′磷酸基团和化学物质如生物素，二硝基苯酚，荧光素，罗丹明和碳链。可用标准的氰基乙基亚磷酰胺化学法，在化学合成过程中使复制抑制部分与非参与性探针的3′末端核苷酸的3′羟基共价连接。这个方法使用到固相合成化学法，其中3′末端与不可溶的载体(可控孔度玻璃或“CPG”)共价连接，而新合成的链在5′末端上生长。在本发明的情形中，3-脱氧脱氧核糖核苷酸是优选的复制抑制部分。最优选蛹虫草菌素(3-脱氧腺苷)。由于蛹虫草菌素会与探针的3′末端连接，合成是从与CPG共价连接的蛹虫草菌素、5-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰-3-脱氧腺苷(蛹虫草菌素)、2-琥珀酰基长链烷基氨基-CPG(Glen Research，Sterling，VA)引发的。将二甲氧基三苯甲基除去，链合成的引发在固相蛹虫草菌素的脱保护的5′羟基处开始。合成完成后，将寡核苷酸探针从固相载体上切割下来，在3′-末端连接的蛹虫草菌素上留下游离2′羟基。还可使其他试剂在非参与性探针的合成过程中与3′末端连接，以充当复制抑制部分。这些试剂包括但不限于其他的3-脱氧核糖核苷酸。生物素、二硝基苯酚、荧光素和地高辛。用这些试剂的每一种衍生的CPG载体可从商业渠道获得(例如Glen Research，Sterling，VA；和CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)。

或者，可使用不对称扩增来产生与检测探针互补的链。产生单链DNA的不对称PCR条件与上述的PCR条件类似；但是对引物浓度加以调整，使得一个引物过量，另一个引物限量。认为这个做法会增加方法的灵敏度。通过增加可供与检测探针结合的单链的数量，会使这一灵敏度上的改进得以发生。

感染风险和RNA损伤或TSV失活的评估

本文所公开的用以检测样品中是否存在TSV和定量TSV的方法，可用来评估RNA损伤或TSV失活的程度。例如，可将本文所公开的方法与化学处理联合使用，以改进虾的健康和养成(grow-out)。具体的说，在生产和养成过程中，将获自生产设施的样品或获自虾周围环境的样品进行取样，用本文所公开的方法检测是否存在TSV。如果发现TSV，则可对设施和/或虾进行处理，以杀灭或控制病毒。由于试验的灵敏度高，可早期检测出TSV，避免生产的破坏和损失。因此，将本文所公开的方法与化学干预联用，可改进生产效率和产量。化学处理的实例包括但不限于氧化性消毒剂如

S消毒剂(E.I.Du Pont de Nemours和Co.的注册商标)、过氧乙酸、过氧化氢、高锰酸、单过硫酸氢钾、次氯酸、次氯酸盐、碘等；益生菌剂(probiotics)、免疫刺激剂、饲料补充剂和能预防病毒宿主结合的重组蛋白质/核酸。在化学处理之后，可将生产环境中的虾进行取样和再试验，以确定该处理是否成功消除了病毒。

在另一个实施方案中，预期本文所公开的引物可以以多种组合进行使用，以明确病毒基因组的完整性和化学处理对病毒基因组造成的损害的程度。例如，可将TSV2(SEQ ID NO：1)正向引物和TSV3(SEQID NO：4)反向引物组合使用，以产生出大约5,000碱基的扩增产物。这一较长的产物只有在病毒基因组保持完整和不受损害的情况下才能形成。因此，通过比较较短产物(SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8)与扩增过程中形成的较长产物的比例(或者较长产物不存在)，可评估化学处理或干预所造成的病毒基因组损害的程度。这可帮助明确化学处理或干预的效果。

检测试剂盒

在另一个实施方案中，本发明提供用以基于核酸扩增方法检测TSV的试剂盒。如上文所述，该试剂盒包含至少一对TSV诊断引物序列。另外，该试剂盒还可包含至少以下试剂之一：反转录酶、热稳定性DHA聚合酶、四种不同的脱氧核苷酸三磷酸的混合物、核酸结合荧光剂、至少一对内样品对照引物、至少一个内模板对照和至少一对内模板对照引物、和包含与TSV基因组当中的核酸的至少一个区域的一部分互补的序列的探针，该“一部分”能够用试剂盒中所含的TSV诊断引物序列进行扩增。试剂盒的引物和其他试剂可以以各种形式呈现，如液体、干物或片剂，且可存在于任何合适的容器或多重容器(multiple container)中，如小瓶、管子等。

在另一个实施方案中，本发明提供用以基于夹心测定杂交方法检测TSV的试剂盒。这个试剂盒包含用以从怀疑接触了TSV的虾或其他甲壳类收集样品的第一组分和用以分配和裂解样品的缓冲液。第二组分包括干燥形式或液体形式的介质，该介质用以进行靶标和探针核酸的杂交及用以通过洗涤除去不需要的和未杂交的形式。第三组分包括固相载体(例如浸渍片(dipstick)、珠粒(bead)等)，该固相载体上固定有(或缀合有)衍自本文所公开的分离TSV诊断引物序列的未标记核酸探针。第四组分含有与该同一DNA链的另一不同区域互补的标记探针，该另一不同区域被第三组分的固定化的未标记核酸探针杂交。标记的探针还可衍自本文所公开的分离TSV诊断引物序列。

实施例

本发明在以下实施例作进一步的说明。应认识到，这些实施例虽然表示了本发明的优选实施方案，但仅仅是以例示方式给出。由以上的论述和这些实施例，本领域技术人员可明确本发明的必要特征，且可不背离本发明的精神和范围，作出本发明的各种变化和修改，以使它适应于各种用途和条件。

缩写的含义如下：“sec”意指秒、“min”意指分钟、“hr”意指小时、“d”意指天、“μL”意指微升、“mL”意指毫升、“L”意指升、“μM”意指微摩尔浓度、“mM”意指毫摩尔浓度、“nM”意指纳摩尔浓度、“M”意指摩尔浓度、“mmol”意指毫摩尔、“μmol”意指微摩尔、“ng”意指纳克、“fg”意指毫微微克、“μg”意指微克、“mg”意指毫克、“g”意指克、“nm”意指纳米、“mU”意指毫单位、“U”意指单位、“rxn”意指反应、“PCR”意指聚合酶链式反应、“g”意指万有引力常数、“OD”意指光密度、“OD₂₆₀”意指在260nm波长处测量的光密度、“OD₂₈₀”意指在280nm波长处测量的光密度、“OD_280/260“意指OD₂₈₀值与OD₂₆₀值之比、“rpm”意指每分钟转数、“CT”意指反应中荧光的积累超过检测阈时的循环数，“SPF”意指经认证的无特定病原。

一般方法

实施例中所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，在以下文献中有描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984；和Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience，N.Y.，1987。

基因组序列和指定引物(primer designate)的分析是用获自InforMax Inc.(Bethesda，MD)的Vector NTI Suite完成。

本文所用的酶和试剂购自以下供应商：

Applied Biosystems，Foster City，CA：AmpliTaq(目录号N808-0160)；

New England Biolabs，Beverly，MA：脱氧核苷酸溶液混合物(deoxynucleotide solution mix)(目录号N0447S)；

Sigma Genosys，The Woodlands，TX：寡核苷酸；

Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA：4％琼脂糖E凝胶(4％Agarose E-gels)(目录号G6018-02)；

Qiagen，Valencia，CA：蛋白酶K(Proteinase K)(目录号19131)；和RNase A，DNase-free(目录号19101)和RNase-free DNase set(目录号79254)；

Applied Biosystems，Foster City，CA：RNA酶抑制剂(RNaseInhibitor)

(目录号N8080119)

MultiScribe反转录酶(目录号4311235)，AmpliTaq(目录号N808-0160，焦碳酸二乙酯(Diethylprocarbonate，DEPC)水(目录号10813-012)。

另外，试剂盒和试剂购自以下供应商：

Green PCR MasterMix(Applied Biosystems，Foster City，CA；目录号4309155)；

Fibrous Tissue Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA；目录号74704)和QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA；目录号51304)。

虾RNA和DNA样品获自美国亚利桑那大学(位于亚利桑那州Tucson市，AZ85721)兽医科学和微生物学系的Donald V.Lightner。这些样品包括来自经认证无病虾(SPF)和含有以下病毒的受感染虾的样品：斑节对虾(Penaeus monodon)类型的杆状病毒(MBV)、Taura综合征病毒(TSV)、白斑综合症病毒(WSSV)、P.monodon的黄头病毒(YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV)。另外，感染TSV的干虾组织也是获自Donald V.Lightner。

模板和引物

用于合成TSV模板(synthetic TSV template)的合成的DNA寡核苷酸序列是从Taura综合征病毒(TSV)基因组(GenBank检索号AF277675)；Mari，J.，Poulos，B.T.，Lightner，D.V.和Bonami，J.R.，J.Gen.Virol.83(Pt 4)：915-926(2002)制备。它们是分别从碱基475-592和4953-5076和7377-7495合成的。合成TSV靶标用标准的亚磷酰胺化学法来合成，或者从商业渠道购买(Sigma Genosys Company，TheWoodlands，TX)。合成TSV靶标在单一反应中用作阳性对照，在实时RT-PCR测定中用作定量标准品。

合成模板靶标的浓度和拷贝数是从260nm处的分光光度测量值(OD₂₆₀)确定的。模板在纯化水中稀释至指定的拷贝数，用作阳性对照和测定定量标准品。表3显示了各模板靶标的基因组位置、序列标号和长度。

引物序列以类似方式合成或者从商业渠道购买(Sigma GenosysCompany，The Woodlands，TX)。可用于TSV检测的引物的序列以SEQID NO：1-6给出。

表3

模板序列

模板	大小(bp)	SEQ  IDNO：	TSV基因组位置(GenBank AF277675)
				TSV 2T	118	7	475-592
TSV 3T	123	8	4953-5075
				TSV 5T	118	9	7377-7494

从虾组织分离RNA

采用RNeasy fibrous tissue Mini Kit(Qiagen Inc.目录号74704)从虾组织分离RNA。使用试剂盒试剂和生产商程序回收总RNA。通常，这涉及到将按生产商说明制备的300μL β巯基乙醇RTL缓冲混合物加到1.5mL微量离心管中的10mg虾组织。用生产商提供的棒子碾压组织使其破开，以使组织匀化。将所得裂解物直接转移到置于2mL收集管中的QIA shredder Spin Column上，以最大速度离心2min。然后将无RNA酶的水(590μL)和10μL蛋白酶K溶液(2.5μg/10μL)加到样品中，将样品吸上吸下充分混合。将样品管在56℃下温育10min，然后在20-25℃下8000xg离心3min。将500微升的乙醇(96-100％)加到澄清的裂解物并混合。将样品流体转移到RNeasy Mini spin柱子，8000xg离心15秒。弃去洗脱液。然后将RW1洗涤缓冲液(350μL)加到该柱子，将该柱子8000xg离心15秒。弃去洗脱液。将该柱子放入干净的收集管后，向其中加入30U/80μL的DNA酶I溶液，将该柱子反转以促进混合。然后将该旋转柱子的内容物在室温下温育15min。然后再加入350μL的RW1洗涤缓冲液，将该柱子8000xg离心15秒。弃去洗脱液。加入RPE缓冲液(500μL)，将该柱子8000xg离心2min。弃去洗脱液。将该旋转柱子放入干净的1.5mL微量离心管后，向其中加入50μL的无RNA酶的水，将该离心管8000xg离心1min。将含有纯化的RNA的洗脱液收集在1.5mL微量离心管中。该纯化的RNA在无RNA酶的水中-20℃下保藏备用。

该纯化的RNA的纯度和含量是通过常规的OD_280/260比测量值进行评估，RNA量是从OD₂₆₀测量值进行确定。在一些情况中，样品用无RNA酶的水稀释以进行试验。

实施例1-3

用RT-PCR扩增条件检测TSV合成DNA靶标

这些实施例的目的是展示用RT-PCR扩增条件和本文所公开的引物对TSV合成DNA模板进行的检测。

模板标准品是通过将合成TSV模板(如上所述)在无DNA酶的水中进行10倍系列稀释制备的。通常，这些标准品的模板浓度在10⁷-0个拷贝/μL的范围。主混合液(master mix)是通过向25μL的

Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA；目录号4309155)加入各31.3nM的适当TSV正向引物和62.5nM的适当匹配反向引物(如表4所示)、12.5U的Multiscribe反转录酶、20U的Multiscribe RNA酶抑制剂和足够定容至45μL/反应的最终体积的DEPC水来制备的。该主混合液保持在冰上备用。

对于每个反应，首先向各PCR反应孔中加入5μL的模板标准品，然后加入45μL的主混合液。然后以如下热循环进行反应：起始步骤48℃30min，接着起始变性步骤95℃10min，然后95℃15秒和60℃1min的温度程序40个循环。扩增是用ABI PRISM 7900热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)在MicroAmp光学96孔反应板中进行。在每个循环过程中，通过监测由

Green报道染料与DNA扩增产物的相互作用引起的荧光增加，来检测PCR产物形成。在PCR完成后，产生出60℃-95℃范围内的解离曲线(解链曲线)。数据用ABI PRISM 7900SDS软件进行分析。另外，PCR产物形成还用4％琼脂糖E凝胶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录号G6018-02)按照生产商方案通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

表4中总结的结果显示，对于每个引物组，当存在适当的TSV模板时，有适当大小的扩增子产物产生。最小的可检测模板水平在1-10个拷贝/rxn之间。不含模板的样品没有产生可检测的正确TSV产物。

扩增(CT)和扩增子产物形成分别与起始模板浓度的对数成反比和正比。

表4

用RT-PCR条件进行的合成TSV靶标的扩增的检测限

实施例	正向引物，SEQ IDNO：	反向引物，SEQ IDNO：	模板SEQ IDNO：	产物大小(bp)	最小可检测模板(个拷贝/rxn)
						1	l	2	7	118	1-10
2	3	4	8	123	1-10
						3	5	6	9	118	1-10

实施例4-6

用RT-PCR测定从受感染虾组织检测和定量TSV病毒

这些实施例的目的是展示用RT-PCR测定和本文所公开的引物对受感染虾组织中的TSV的检测和定量。

在这些实施例中，适当合成模板DNA(如上所述)的10⁶-10⁰个拷贝/反应的系列稀释液，用实施例1-3中给出的条件进行扩增。标准曲线(未显示)是如下产生的：使用从每个合成模板浓度测定到的CT值，将这些CT值(95％置信区间)对标准品中的起始模板拷贝数的对数进行作图。然后用这一曲线(即CT对浓度对数)的斜率，从它们各自的CT值估计未知样品中的病毒基因组拷贝数。

使用了如上所述获自Donald V.Lightner(美国亚利桑那大学(位于亚利桑那州Tucson市，AZ85721)兽医科学和微生物学系)的基因组RNA或从感染有墨西哥TSV毒株的虾分离的基因组RNA。将分离自TSV感染的虾鳃的总RNA(71ng/μL)在无RNA酶的水中进行系列稀释，用以提供RNA浓度为1ng/μL-1fg/μL的系列样品。阴性对照包括不含模板的水对照和这样两个RNA虾样品(10ng/rxn)，该两个虾样品是通过从两品系的非感染(SPF)虾(Litopenaeus vannamei(26ng/μL)和Penaeus monodon(31μg/μL))提取RNA获得的。

然后将稀释的样品用表5所示的引物对以及如实施例1-3中所给出的扩增、主混合液、热循环条件和仪器进行扩增。接着从PCR扩增反应评估每个稀释的RNA样品的CT值。然后从CT值和标准CT对模板浓度对数的曲线的斜率评估样品中病毒基因组的拷贝数。RT-PCR产物还如实施例1-3所述通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

结果在表5中总结。在该表中，TSV拷贝数/反应是作为三个重复试验的平均值给出。结果表明，所有的引物组都从受感染虾RNA产生出正确的扩增子产物大小，在受感染虾样品中检测到TSV RNA。取决于所用的引物对，检测限的范围为约10个拷贝/rxn至约1000个拷贝/rxn的病毒基因组。在水对照样品或两个SPF虾样品中没有检测到扩增产物。阴性对照样品获得的结果证明，该测定对来自两个受试虾品系的非病毒RNA无响应。

表5

受感染虾组织TSV RNA的检测结果

实施例	正向引物SEQ IDNO：	反向引物SEQ IDNO：	受感染虾RNA/rxn(ng)	CT	TSV拷贝数/rxn
						4	1	2	1	24.3	11940
4	1	2	0.1	27.9	1150
						4	1	2	0.01	31.5	114
4	1	2	0.001	35.1	11
						4	1	2	0.0001	＞39	0
4	1	2	0.00001	＞39	0
						4	1	2	0.000001	＞39	0
4	1	2	0(水)	＞39	0
						4	1	2	0(SPF L.vannamei	＞39	0

			(10ng))
						4	1	2	0(SPF P.monodon(10ng))	＞39	0
5	3	4	1	23.6	351E6
						5	3	4	0.1	24.9	6.6E6
5	3	4	0.01	28.9	49,000
						5	3	4	0.001	32.1	924
5	3	4	0.0001	＞36	0
						5	3	4	0.00001	＞36	0
5	3	4	0.000001	＞36	0
						5	3	4	0(水)	＞36	0
5	3	4	0(SPF L.vannamei(10ng))	＞36	0
						5	3	4	0(SPF P.monodon(10ng))	＞36	0
6	5	6	1	22.6	138,000
						6	5	6	0.1	23.9	50,800
6	5	6	0.01	27.9	2780
						6	5	6	0.001	32.3	108
6	5	6	0.0001	＞37	0
						6	5	6	0.00001	＞37	0
6	5	6	0.000001	＞37	0
						6	5	6	0(水)	＞37	0
6	5	6	0(SPF  L.vannamei(10ng))	＞37	0
						6	5	6	0(SPF P.monodon(10ng))	＞37	0

实施例7

TSV引物的特异性

这个实施例的目的是证明，本文所公开的引物能扩增世界不同地理区域的TSV毒株的互补RNA，但不能扩增感染其他虾病原体的虾的RNA。

在这个实施例中，使用了从感染其他虾病原体的虾分离的RNA。具体的说，用实施例4-6中所述的引物和RT-PCR方法，对从感染不同地理区域(即夏威夷、泰国、墨西哥、伯里兹和委内瑞拉)的TSV毒株及感染非TSV虾病毒(MBV、WSSV、YHV、IHHNV和IMNV)的虾分离的RNA样品进行试验。

所有的TSV毒株都以类似于实施例4-6所述毒株的检测限被检测到。当试验受非TSV感染的虾RNA样品时，没有观察到扩增现象。这些发现一起证明，本文所公开的TSV诊断引物序列和方法对TSV有选择性，引物不会与虾RNA或其他受试虾病原体发生反应。

实施例8

联合内样品对照使用PCR检测TSV RNA

本实施例的目的是证明，本文所公开的TSV引物可与内样品对照(ISC)引物联合使用，除了产生TSV产物外还产生ISC产物。以下给出的结果证明，ISC引物独立地扩增样品DNA，不会干扰TSV RNA的扩增。ISC产物的存在提供了一种标志，该标志可用来表明已回收到足够数量和质量的样品RNA供进行试验。

ISC引物衍自Penaeus monodon肌动蛋白1基因序列(GenBank：AF100986)。为了促进TSV扩增子的优先扩增，将ISC引物设计成以较低的效率扩增DNA片段，或者其比靶标TSV扩增子大。ISC引物序列作为SEQ ID NO：10、11和SEQ ID NO：12、13给出(参见表2)。

含有TSV RNA和虾肌动蛋白DNA的样品，是用无DNA酶的水对得自受TSV感染的虾(Penaeus monodon)的基因组制品进行10倍系列稀释来制备的。样品的RNA含量范围为0.1ng-0.1pg/反应。然后将得自非受感染虾的虾基因组DNA(10ng)加到每个TSV样品和加到不含TSV RNA的阴性对照样品。

主PCR混合液是这样制备的：将15μL/反应的

Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA；目录号4309155)与一定体积的引物储备溶液(每个TSV引物为20μM，每个肌动蛋白引物为10μM)、0.25U的Multiscribe反转录酶、20U的Multiscribe RNA酶抑制剂和用以定容至25μL/反应的最终体积的无DNA酶的水进行组合，所述“一定体积”足以给出以下最终浓度：TSV2正向引物31nM，TSV2反向引物62nM(分别为SEQ ID NO：1和2)；肌动蛋白1正向引物31nM，肌动蛋白1反向引物62nM(分别为SEQ ID NO：10和11)。该主混合液保持在冰上备用。

对于每个反应，首先向各PCR反应孔中加入5μL的样品，然后加入25μL的主混合液。然后以如下热循环进行反应：48℃30min和95℃5min的温度程序40个循环，接着95℃15秒和60℃1min 40个循环。扩增是用ABI PRISM 7900热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)在MicroAmp光学96孔反应板中进行。

在每个循环过程中，如上所述通过从Green报道染料与DNA扩增产物的相互作用引起的荧光增加所测定到的CT值，来监测产物形成。40个循环后，产生出60℃-95℃范围内的解离曲线(解链曲线)。数据用ABI PRISM 7900SDS软件进行分析。另外，PCR产物形成还用4％琼脂糖E凝胶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录号G6018-02)按照凝胶生产商方案通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

用ISC肌动蛋白F2(SEQ ID NO：10)和肌动蛋白R2(SEQ IDNO：11)获得的结果在图1A和1B中显示，结果证明两个模板靶标同时得到扩增。该特定TSV RNA产生出解链温度为77.2℃的118bp产物。肌动蛋白ISC产生出139bp产物(Tm＝84.4℃)。TSV产物和肌动蛋白内对照产物是基于这些大小和解链温度差异通过解链曲线分析(图1A)和凝胶电泳(图1B)进行检测。在TSV靶标不存在下和在不同TSV靶标浓度下，ISC产物的形成作为84.4℃处的单一解链温度峰(如图1A所示)和通过电泳(如图1B所示)被检测到。在所有含有TSV模板的样品中，特定的TSV扩增子通过解链温度(Tm＝77.2℃)和通过凝胶电泳被检测到。这些结果证明，肌动蛋白ISC模板与TSV模板共扩增，且RT-PCR扩增和RT-PCR测定检测限(0.001ng/rxn)不受ISC的存在的影响。

实施例9和10

用荧光标记探针检测TSV

本实施例证明，可将本文所公开的TSV引物与荧光标记探针联合使用，对TSV进行实时检测和定量。

用以构建荧光标记探针的基因序列，是通过用购自AppliedBioSystems Inc.(Foster City，CA 94404)的Primer

v2.0软件对TSV基因和试验扩增子进行分析来选出的。将探针序列加以选择，使其落在特定的TSV试验扩增子的近端当中，且取决于扩增子的大小和序列，其长度为30-110个碱基。偏好这样区域作为探针序列：G/C含量为30-80％，C含量高于G含量，没有5’G。通常，选择其Tm比各试验引物的各自Tm高8-10℃的探针序列。不选择使用会与其他物种发生交叉杂交的探针序列。表6列举了所选出的符合这些标准的探针序列。

对于实时检测，将探针序列进行双重标记。采用两种不同的标记方法。探针的5’末端用荧光团(6FAM^TM，Applied Biosystems)进行标记。3’末端用猝灭染料进行标记，或者在小沟结合(MGB)探针的情况中，3’末端用猝灭染料和小沟结合剂复合物进行标记。标记的探针可制备得到，也可从Applied BioSystems购得。

表6

荧光标记探针序列

探针

SEQ ID NO：

GenBank No：

位置

5’标记

3’标记

TSV2PM	14	AF277675	522-543	FAM1	MGB2
						TSV3PT	15	AF277675	7434-7462	FAM	TAMRA3

¹FAM为6FAM^TM试剂Applied Biosystems

²MGB为MGB^TM Applied Biosystems

³TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明

模板标准品是通过将合成TSV模板(如上所述)在无DNA酶的水中进行10倍系列稀释制备的。通常，标准品的模板浓度范围在10⁷-0个拷贝/μL。主混合液如下制备：将25μL/反应的

UniversalMaster Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA；目录号4326708)与一定体积的表7所示适当储备溶液、50nM探针和0.25U的Multiscribe反转录酶、20U的Multiscribe RNA酶抑制剂进行组合，该“一定体积”可提供这样的最终反应浓度：TSV正向引物31nM，TSV反向引物62nM。加入无DNA酶的水，定容至25μL/反应的最终体积。该主混合液保持在冰上备用。

对于每个反应，首先向各PCR反应孔中加入5μL的样品，然后加入25μL的主混合液。然后以如下热循环进行反应：48℃30min和95℃5min的温度程序40个循环，接着95℃15秒和60℃1min 40个循环。扩增是用ABI PRISM 7900热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)在MicroAmp光学96孔反应板中进行。

在每个循环过程中，通过监测由荧光标记探针引起的荧光增加来检测PCR产物形成。数据用ABI SDS 2.2软件进行分析。另外，PCR产物形成还用4％琼脂糖E凝胶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA；目录号G6018-02)按照凝胶生产商方案通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

凝胶数据(这里未显示)和表7总结的结果证明，对于每个引物/探针组，当存在适当的TSV模板时，产生适当大小的扩增子产物。取决于所用的引物和探针，最小可检测模板水平在100-1000个拷贝/rxn之间。不含模板的样品没有产生可检测的产物。

扩增(CT)和扩增子产物形成分别与起始模板浓度的对数成反比和正比。

表7

用合成靶标进行的PCR扩增的结果

实施例	正向引物，SEQID NO：	反向引物SEQID NO：	模板SEQ IDNO：	探针SEQIDNO：	产物大小(bp)	最小可检测模板(个拷贝/rxn)
							9	1	2	7	14	118	1000
10	5	6	9	15	118	100

。

序列表

<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.

     Ebersole，Richard

<120>Sequences Diagnostic for Shrimp Pathogens

<130>CL 3545

<160>15

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

accgagcctt ctatgtgatg aacg                                24

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

ggaatgtgtg atttgtagcg tcgtg                               25

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

ggctttgaag cagagagtga ttcc                                24

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

tcttgctgtt ccatcgaatc ctg                                        23

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ttttacaagg agcattgtgg ctgtg                                      25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

ttcatctcaa tgccaggaaa tgatg                                      25

<210>7

<211>118

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成TSV模板

<400>7

accgagcctt ctatgtgatg aacgatgatg gagaaaaccg gatatattcg ttaattggaa  60

ctttgcgacg ggcccctgct tttaaggttg gttcacgacg ctacaaatca cacattcc   118

<210>8

<211>123

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成TSV模板

<400>8

ggctttgaag cagagagtga ttccatgcaa ggcgattgtt gttcgcctta tgtactgttt  60

aattcagcat cgagggctaa gatcgttgga ttacactgtg caggattcga tggaacagca 120

aga                                                               123

<210>9

<211>118

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成TSV模板

<400>9

ttttacaagg agcattgtgg ctgtggaata agatgaatgc taagcagaca tcaattattc    60

gacgcactct tacagaacac ctacgctcta ttacatcatt tcctggcatt gagatgaa     118

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

cttgtggttg acaatggctc cg                                             22

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

cgtaggcgtc cttctgaccc at                                             22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

gtcctcctta ctgaggctcc c                                              21

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

gaggtcacga ccagccaagt cg                                    22

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光标记探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>标记有FAM

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>标记有MGB

<400>14

tcgttaattg gaactttgcg ac                                    22

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光标记探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>标记有FAM

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>标记有TAMRA

<400>15

ttcgacgcac tcttacagaa cacctacgc                             29

Claims (26)

1.SEQ ID NO：1所示的分离TSV诊断引物序列或与SEQ IDNO：1完全互补的分离核酸分子。

2.SEQ ID NO：2所示的分离TSV诊断引物序列或与SEQ IDNO：2完全互补的分离核酸分子。

3.SEQ ID NO：3所示的分离TSV诊断引物序列或与SEQ IDNO：3完全互补的分离核酸分子。

4.SEQ ID NO：4所示的分离TSV诊断引物序列或与SEQ IDNO：4完全互补的分离核酸分子。

5.SEQ ID NO：5所示的分离TSV诊断引物序列或与SEQ IDNO：5完全互补的分离核酸分子。

6.SEQ ID NO：6所示的分离TSV诊断引物序列或与SEQ IDNO：6完全互补的分离核酸分子。

7.由两个不同的权利要求1-6任一项所述TSV诊断引物序列组成的引物对，其中该引物对能够引发扩增TSV基因组当中的某核酸区域的核酸扩增反应。

8.权利要求7所述的由两个不同的TSV诊断引物序列组成的引物对，其中该引物对选自SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQID NO：5和6及SEQ ID NO：3和6。

9.一种用以检测TSV的试剂盒，所述试剂盒包含至少一对权利要求7所述的TSV诊断引物序列。

10.权利要求9所述的用以检测TSV的试剂盒，其中所述试剂盒还包含至少一种选自以下的试剂：反转录酶、热稳定性聚合酶、四种不同的脱氧核苷酸三磷酸的混合物、核酸结合荧光分子、至少一对内样品对照引物、至少一个内模板对照和至少一对内模板对照引物，和包含与TSV基因组当中的核酸的至少一个区域的一部分互补的序列的探针，该“一部分”能够用至少一对TSV诊断引物序列进行扩增。

11.一种检测样品中是否存在TSV的方法，所述方法包括：

(i)从怀疑含有TSV的样品提供RNA；和

(ii)用衍自权利要求1-6任一项所述的分离TSV诊断引物序列的探针，在合适的杂交条件下对该RNA进行探测；

其中如鉴定到可杂交的核酸片段，则证明存在TSV。

12.权利要求11所述的检测样品中是否存在TSV的方法，其中所述衍自分离TSV诊断引物序列的探针选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9及其完全互补序列。

13.权利要求11所述的方法，其中所述探针在3′末端含有复制抑制部分。

14.权利要求13所述的方法，其中所述复制抑制部分选自二脱氧核苷酸、3′脱氧核苷酸、一段错配的核苷或核苷酸、3′磷酸基团和化学物质。

15.权利要求14所述的方法，其中所述3′脱氧核苷酸是蛹虫草菌素。

16.一种检测样品中是否存在TSV的方法，所述方法包括：

(i)从怀疑含有TSV的样品提供RNA；

(ii)使用反转录酶和至少一个权利要求1-6所述TSV诊断引物序列，合成出与所述RNA互补的DNA；

(iii)用至少一对权利要求9所述TSV诊断引物序列扩增所述互补DNA，产生出扩增产物；

其中若存在扩增产物，则证明存在TSV。

17.权利要求16所述的检测样品中是否存在TSV的方法，其中(iii)的扩增是用聚合酶链反应来进行。

18.权利要求16所述的检测样品中是否存在TSV的方法，其中(iii)的扩增是在核酸结合荧光剂或荧光标记探针的存在下进行，扩增产物的存在是用荧光检测来确认。

19.权利要求18所述的方法，其中所述荧光标记探针选自SEQID NO：14和SEQ ID NO：15。

20.权利要求16所述的方法，其中有至少一对内样品对照引物包括在(iii)的扩增中，以产生内样品对照产物。

21.权利要求20所述的方法，其中所述至少一对内样品对照引物选自SEQ ID NO：13、14和SEQ ID NO：15、16。

22.权利要求16所述的方法，其中有至少一对内模板对照引物和至少一个内模板对照包括在(iii)的扩增中，以产生内模板对照产物。

23.一种定量样品中的TSV的量的方法，所述方法包括：

(i)从怀疑含有TSV的样品提供RNA；

(ii)使用反转录酶和至少一个权利要求1-6所述TSV诊断引物序列，合成出与所述RNA互补的DNA；

(iii)用至少一对权利要求9所述TSV诊断引物序列，在核酸结合荧光剂或荧光标记探针的存在下，通过在至少变性温度和延伸温度之间进行的热循环，扩增所述互补DNA；

(iv)测量出核酸结合荧光剂或荧光标记探针在热循环过程中所产生的荧光量；

(v)确定出核酸结合荧光剂或荧光标记探针所产生的荧光量达到基线值以上的某固定阈值时的阈循环数；和

(vi)通过将该对样品中的TSV确定出的阈循环数与这样的标准曲线进行比较，来计算出样品中的TSV的量，该标准曲线是阈循环数与用已知浓度的标准溶液测定出的模板浓度的对数的曲线。

24.权利要求23所述的方法，其中所述荧光标记探针选自SEQID NO：14和SEQ ID NO：15。

25.权利要求11、16或23任一项所述的方法，其中所述方法用来评估RNA损害或TSV失活情况。

26.权利要求11、16或23任一项所述的方法，其中所述方法与化学处理联合使用，以改进虾的健康和养成。

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