CN101537046A

CN101537046A - 一种连翘降血脂有效部位及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101537046A
Application number: CN200810049394A
Authority: CN
Inventors: 康文艺; 许启泰; 王金梅; 李晓梅; 李彩芳; 宋艳丽
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2008-03-21
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2009-09-23

Abstract

本发明涉及一种连翘降血脂有效部位及其制备方法和应用，该有效部分为连翘叶经丙酮与水提取后经浓缩而得的乙酸乙酯部位。本发明所制备的化合物连翘脂素及其所在的有效部位——乙酸乙部位在体外具有较好的抗氧化活性，体内实验也表明乙酸乙酯部位和连翘脂素能降低高脂血症小鼠的血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，且可通过氧化途径(升高超氧化物岐化酶SOD、降低脂质过氧化产物-丙二醛MDA)来降低血脂水平。并且乙酸乙酯部位对高脂血症小鼠血清总胆固醇的降低作用，要好于连翘脂素和决明子降脂片，对连翘叶乙酸乙酯有效部位进行进一步开发，发挥其多靶点协同预防和治疗高血脂等疾病的作用，将具有很好的应用前景。

Description

一种连翘降血脂有效部位及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及了一种从连翘叶脂溶性部位提取制备降血脂有效部位，同时还涉及该有效部分的制备方法，以及从该有效部位在制备抗氧化药物中的应用。

背景技术

连翘(Forsythia suspense(thumb.)Vahl)为木犀科连翘属植物，性微寒，味苦，归肺、心、小肠经。具有清热解毒，消肿散结之功效，主治痈疽、瘰疬、温热、丹毒、小便淋闭等症。

高脂血症(Hyperlipaemia，HLP)主要是指血清总胆固醇(TC)或甘油三酯(TG)水平过高和(或)血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平过低。高脂血症是中老年的常见病和多发病，随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，该病的发病率明显增加，发病的年龄也有所提前。高脂血症所引起的动脉粥样硬化是造成冠心病、高血压和脑血管疾病的主要原因，严重危害到了人类生命健康。目前，西药调节血脂虽有肯定的疗效，但有不同程度的副作用，且作用靶点单一。目前公认为调脂最有效并广泛应用的西药是他汀类，但费用高，且有肝脏和肌肉毒性等副作用。近年来，中药调血脂以其疗效好、副作用小的优势而成为研究的热点。

连翘的茎、叶、果实、根均可入药，传统以果实入药，随着一些学者的研究，连翘叶化学工作与药理研究发现，连翘叶中的化学成分与果实中有极大的相似度，且连翘叶也具有良好的药理活性，如连翘叶茶具有清除自由基和抗氧化作用，作为一种纯天然的预防和治疗有活性氧引起的各种疾病(如衰老、心脑血管、高血压、老年性痴呆症甚至癌症等)的药物及新型的天然食品抗氧化剂具有广泛的应用前景。但目前，对连翘叶的应用开发主要集中在极性大的水部位进行，其主要活性成分是连翘苷或连翘酯苷，而对脂溶性部位的研究，特别是药效成分的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从连翘叶脂溶性部位提取制备乙酸乙酯有效部位。

同时，本发明的目的还在于提供一种该有效部分的制备方法。

另外，本发明的目的还在于提供一种该有效部分在制备抗氧化活性方面的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种连翘降血脂有效部位，该有效部分为连翘叶经丙酮与水提取后经浓缩而得的乙酸乙酯部位。

进一步讲，本发明的乙酸乙酯部位的制备方法为：将连翘叶或者连翘果实用丙酮与水按体积比7∶3配成的溶液重复冷浸3次，每次7天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓缩物，将浓缩的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。经体外抗氧化筛选发现，乙酸乙酯部位具有好的抗氧化活性，并且还具有良好的体内外降血脂作用。

更进一步地讲，将乙酸乙酯部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，石油醚-乙酸乙酯按体积比15∶1洗脱，洗脱物经过丙酮凝胶柱层析，氯仿∶环己烷∶甲醇＝9∶9∶2的体积比进行凝胶柱层析，得到连翘脂素。此单体化合物连翘脂素具有良好的体内外降血脂作用。

乙酸乙酯部位进一步制备而得的单体化合物经鉴定为连翘脂素，其结构式为：

连翘脂素(Phillygenin)

化合物连翘脂素，经体外抗氧化实验表明，具有良好的抗氧化活性。

本发明所制备的化合物连翘脂素及其所在的有效部位——乙酸乙部位在体外具有较好的抗氧化活性，体内实验也表明乙酸乙酯部位和连翘脂素能降低高脂血症小鼠的血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，且可通过氧化途径(升高超氧化物岐化酶SOD、降低脂质过氧化产物-丙二醛MDA)来降低血脂水平。并且乙酸乙酯部位对高脂血症小鼠血清总胆固醇的降低作用，要好于连翘脂素和决明子降脂片，对连翘叶乙酸乙酯有效部位进行进一步开发，发挥其多靶点协同预防和治疗高血脂等疾病的作用，将具有很好的应用前景。

体外抗氧化实验：

鉴于此，我们对连翘叶脂溶性部位进行研究，发现了降血脂有效部位为乙酸乙酯部位，并对此部位进行进一步研究得到了单体化合物。

材料与试剂：

连翘叶乙酸乙酯部位、水提取物、连翘脂素均由实验室制备提供。二苯代苦味肼基自由基DPPH(日本东京化成工业株式会社)；Fe³⁺-三吡啶三哑嗪TPTZ(Acros organics)；Trolox(Aldrich)；ABTS[2，2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐](Fluka)；BHT(Acros organics)；甲醇，醋酸钠，FeCl₃·6H₂O，冰醋酸，过二硫酸钾均为分析纯。

主要仪器：

UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼可上海仪器有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，旋转蒸发仪(东京理化)，电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)，超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

试验方法：

本实验采用清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、铁离子还原/抗氧化力测定法(ferric reducing/antioxidant power assay，FRAP)和清除ABTS自由基三种方法，并以BHT作为阳性对照，来研究连翘叶乙酸乙酯部位和化合物连翘脂素抗氧化活性。结果见表1：

表1样品的抗氧化活性

注：IC₅₀为半数抑制率，指清除率为50％时所需抗氧化剂的浓度(ug/ml)。

a为阳性对照品

b表示每克样品的自由基清除能力相当于Trolox的自由基清除能力的微摩尔数(单位为μmol/g)，即抗氧化当量(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity-Trolox)。(Trolox为参照物)，b值越大说明其抗氧化能力越强。

DPPH法测定结果：以上四种测试物的抗氧化顺序为连翘脂素＞BHT＞水提取物＞乙酸乙酯部位；ABTS法测定结果：连翘脂素＞BHT＞乙酸乙酯部位＞水提取物；FRAP法测定结果：连翘脂素＞BHT＞乙酸乙酯部位＞水提取物。

由表1三种抗氧化方法比较可知，乙酸乙酯部位的抗氧化活性要高于水提取物，连翘脂素的抗氧化活性最强，高于乙酸乙酯部位，和阳性对照品BHT。体内降血脂抗氧化试验：

动物：昆明小鼠，空腹体重为23±2g，全部雄性。由河南省医学动物实验中心提供。

材料与试剂：连翘叶乙酸乙酯部位、连翘脂素由河南大学天然药物研究所制备提供。决明子降脂片，吉林吉春制药有限公司批号：070501。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒，北京中生生物工程高技术公司提供。

试验方法：

高脂乳剂的配制：猪油20％、胆固醇10％、丙硫氧嘧啶1％、2％胆盐(配成10％溶液)、丙二醇2％和吐温801％。

动物分组与处理：取50只小鼠，平均体重23±2g，按实验要求分为正常对照组，高脂模型组，给药组(包括连翘脂素给药组和连翘乙酸乙酯部位给药组)，阳性对照组。正常对照组动物上午ig(灌胃)给于蒸馏水，下午ig0.5％CMC-Na，高脂模型组均于每天上午ig给于高脂乳剂(0.2ml/10g·d)，下午ig 0.5％CMC-Na，给药组分别于每天上午ig给于高脂乳剂(0.2ml/10g·d)，下午ig给药，给药量见表2。10天后，各组小鼠均禁食12h，眼底静脉丛取血，离心分离血清用于血脂及SOD、MDA的测定。

表2动物分组与处理

指标测定方法：TC，TG，LDL-C，HDL-C，MDA，SOD的测定按试剂盒说明方法进行

数据处理：实验数据x±s表示，实验统计采用spss10.0统计软件进行单因素方差分析。

结果：

(1)连翘叶乙酸乙酯部位和化合物连翘脂素对高脂血症小鼠血脂的影响，结果见表3。连翘乙酸乙酯部位、化合物连翘脂素、阳性给药组的血浆中TC，TG，LDL-C均较高脂模型对照组有所降低，数据差异有显著意义，而对HDL-C无显著影响；且连翘乙酸乙酯部位给药组与阳性药组相比，能更加显著的降低血浆中LDL-C的水平。

(2)连翘叶乙酸乙酯部位和化合物连翘脂素对高脂血症小鼠抗氧化能力的影响，由表3数据可知，连翘乙酸乙酯部位、化合物连翘脂素、阳性给药组与高脂模型对照组相比，血浆中MDA的含量均有所下降，数据差别有显著意义，且乙酸乙酯部位可使血浆中SOD酶的活性有所升高，可提高机体的抗氧化能力，抑制氧化低密度脂蛋白LDL-C的产生。表明连翘可能通过氧化途径(升高SOD、降低MDA)来降低血脂水平。

表3连翘叶乙酸乙酯部位与连翘脂素对营养性高脂血症小鼠

血脂及抗氧化能力的影响(x±s)

注：与正常对照组比较：△代表显著性差异，△△代表非常显著性差异，△△△代表极显著性差异；与高脂模型组比较：*代表显著性差异，**代表非常显著性差异，***代表极显著性差异。

由连翘的体内外实验可知，含有连翘脂素的部位作用效果上与单体相似，但对总胆固醇的降低作用有差异，好于单体和决明子降脂片的作用，可能是该部位含有不同的木脂素单体的原因，目前我们已经分离得到该部分的木脂素5个，经过结构确证发现都是骈四氢呋喃木脂素，同时，该部分还有槲皮素的存在，这些化合物可能是多靶点作用，并且有协同增效。另外，该部位也能极显著的降低LDL，已知LDL主要是与胆固醇呈现正相关，当LDL含量高的时候，TC和TG也相应的增多。以下是对连翘叶乙酸乙酯部位进行了有效成分的含量测定。

紫外法测定

仪器试剂：UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼可上海仪器有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，旋转蒸发仪(东京理化)，电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)，甲醇为国产分析纯。

样品的制备：取7月连翘叶1.1264g，8月叶1.0369g，分别用100ml乙酸乙酯提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，得7月叶浸膏0.1277g，8月叶浸膏0.1715g。取7月叶浸膏0.0076g，8月浸膏0.0080g，分别用甲醇溶解至3ml，再分别取100ul稀释至4ml备用。

标准曲线的建立：取标准品连翘脂素1.4mg，用甲醇配制成一系列浓度，并在280nm波长处用紫外分光光度计测定其吸光度，见表4。据表4做标准曲线，见图1。

表4

标准品浓度mg/ml 吸光度A

0.0175 0.351

0.028 0.422

0.056 0.655

0.07 0.757

0.28 0.912

样品的测定：以甲醇为空白对照，测定7月叶浸膏和8月叶浸膏的吸光度分别为0.366、0.533，根据标准曲线求出木脂素含量。

结果：

(1)7月采集连翘叶浸膏(乙酸乙酯提取)得率为11.34％，浸膏中总木脂素含量为315.2mg/g，原药材中木脂素含量35.73mg/g；

(2)8月叶浸膏(乙酸乙酯提取)得率为16.54％，浸膏中木脂素的含量为617.9mg/g，原药材中木脂素的含量为102.20mg/g。

附图说明

图1为标准品浓度与吸光度之间的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1

本实施例的有效部位——乙酸乙酯部位的制备方法如下：取干燥连翘叶，用丙酮与水按体积比为7∶3冷浸3次，每次7天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓缩物。将浓缩的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。

实施例2

取实施例1制得的乙酸乙酯部位，进行硅胶常压柱(200-300目)层析，石油醚-乙酸乙酯15∶1洗脱，洗脱物经过丙酮凝胶柱层析，氯仿∶环己烷∶甲醇＝9∶9∶2凝胶柱层析，得到化合物连翘脂素。

结构鉴定：

【性状】无色针状结晶(甲醇重结晶)

【鉴定】分子式：C₂₁H₂₄O₆，分子量：372

仪器材料：熔点用四川科学仪器厂生产的XRC-1型显微熔点仪测定，温度计未校正；1H，13C NMR图谱由Bruker am-400MHz核磁共振仪测定。

化合物连翘脂素，mp133～134℃。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：8.93(1H，S，4-OH)，6.7～7.0(6H，Ar-H)，4.79(1H，d，J＝5.9Hz，H-7′)，4.31(1H，d，J＝6.9Hz，H-7)，4.06(1H，dd，J＝9.2Hz，aH-9)，3.76、3.75、3.74(9H，3×OCH₃)，3.72、3.69(eH-9，eH-9′)，3.40(1H，m，aH-9′)，3.05(1H，m，H-8)，2.82(1H，m，H-8)。¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ：132.3(C-1)，110.2(C-2)，147.5(C-3)，145.9(C-4)，115.1(C-5)，118.6(C-6)，87.0(C-7)，53.9(C-8)，70.3(C-9)，131.2(C-1′)，109.3(C-2′)，148.4(C-3′)，147.5(C-4′)，111.4(C-5117.5(C-6′)，81.2(C-7′)，49.3(C-8′)，68.8(C-9′)，55.4、55.4、55.5(3×OCH₃)。¹³C-NMR谱中在δ100～150有12个不饱和碳信号，提示分子中可能存在两个不对称苯环。¹H-NMR谱中δ8.93(1H，s)为酚羟基质子信号，δ3.75(9H，s)为三个与芳环相连的甲氧基上的质子信号，结合¹³C-NMR谱中存在δ55.5，55.4，55.4三个连氧碳信号，提示分子中含有三个甲氧基。¹³C-NMR谱中除去两组苯环及三个甲氧基碳信号，还有六个脂肪碳及连氧碳信号，提示该化合物可能为非对称的木脂素类化合物。结合文献报道，鉴定该化合物为连翘脂素(phillygenin)。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1、一种连翘降血脂有效部位，其特征在于：该有效部分为连翘叶经丙酮与水提取后经浓缩而得的乙酸乙酯部位。

2、一种如权利要求1所述的连翘降血脂有效部位的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将连翘叶或者连翘果实用丙酮与水按体积比7∶3重复冷浸3次，每次7天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓缩物，将浓缩的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。

3、一种如权利要求1所述的连翘降血脂有效部位在制备降血脂及抗氧化活性药物方面的应用。

4、根据权利要求3所述的连翘降血脂有效部位在制备降血脂及抗氧化活性药物方面的应用，其特征在于：具体为将乙酸乙酯部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，石油醚-乙酸乙酯按体积比15∶1洗脱，洗脱物经过丙酮凝胶柱层析，氯仿∶环己烷∶甲醇＝9∶9∶2的体积比进行凝胶柱层析，得到连翘脂素。