CN101511865A - 在转基因植物中增加抗大豆锈病抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在转基因植物和/或植物细胞中增加对大豆锈病的抗性的方法，以及涉及核酸分子用于产生这些植物和/或植物细胞的用途。在这些植物中，与野生型相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性改变。此外，本发明涉及具有增加的抗大豆锈病抗性的转基因植物和/或植物细胞，以及包含下述序列的表达载体，所述序列与编码功能性或非功能性MLO或其片段的序列同一、同源或互补。
Description
发明背景
本发明涉及在转基因植物和/或植物细胞中增加抗大豆锈病抗性的方法，以及用于核酸分子产生这些植物和/或植物细胞的用途。在这些植物中，与野生型植物相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性被改变。此外，本发明涉及具有增加的抗大豆锈病抗性的转基因植物和/或植物细胞，以及包含下述序列的表达载体，所述序列与编码功能性或非功能性MLO或其片段的序列同一、同源或互补。
植物普遍遭遇致病微生物。由多种病原体如病毒、细菌和真菌引起的植物疾病可以导致栽培植物的生长中显著的作物损失，一方面是经济后果，另一方面还引起对人食品的安全性威胁。从上个世纪开始已经使用了化学杀真菌剂来控制真菌疾病。尽管使用这些物质使得植物疾病程度减少，但是直到现在还不能排除这些化合物是否对人、动物和环境具有有害作用。为了将常规杀虫剂的使用减到最小，因此重要的是检查多种植物对于不同的病原体的天然病原体防御，并且除了经典的培育方法外，系统性使用遗传工程(例如通过引入外部抗性基因或通过操作植物中内源基因表达)以产生病原体抗性植物。
抗性通常意思是植物防止或至少是减少有害病原体侵染和建群的能力。在天然存在的抗性中可以辨别出不同的机制，应用所述机制植物抵御致植物病生物的建群。病原体和宿主之间这些特异性的相互作用确定了感染过程(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie，Springer Verlag，Berlin-Heidelberg，德国)。
在品种特异性抗性(也称为宿主抗性)方面，相容和不相容相互作用之间有差异。在相容相互作用中，在强毒病原体和易感植物之间发生相互作用。病原体生存并且可以建立繁殖结构，而同时宿主死亡。另一方面，当病原体感染植物但是在弱的症状发展之前或之后其生长被抑制时，不相容相互作用发生。在后一种情形中，植物对各个病原体有抗性(Schopfer和Brennick，见上)。在相容和不相容相互作用中，发生了宿主对病原体的防御和特异性反应。
但是，在大自然中，由于病原体迅速的进化发展，这一宿主抗性通常被克服(Neu等人(2003)American Cytopathol.Society，MPMI 16 No.7：626-633)。与此相比，非宿主抗性提供了强的、广泛的和持久的对植物病原菌的保护。非宿主抗性意思是这样的现象，即病原体可以在某些植物物种中诱导疾病，但是在其他植物物种中不诱导(Heath(2002)Can.J.PlantPathol.24：259-264)。
除了这一有意思的特征外，迄今为止对于非宿主抗性的遗传和分子生物学基础理解的很少。存在这样的指示，即非宿主抗性是由不确定的物质诱导的，而且单个病原体蛋白质诱导非宿主抗性反应(Heath(1981)Phytopathology 71：1121-1123；Heath(2001)Physiol.Mol.Plant Pathol.58：53-54；Kamoun等人(1998)Plant Cell 10：1413-1425；Lauge等人(2000)Plant J.23：735-745；Whalen等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6743-6747)。非宿主抗性的现象也可以是基于植物物种的结构或化学性质，例如角质层的厚度或抑制性物质的存在。
除了基于形成的物理屏障的抗性外，植物最有效的非宿主防御系统是由保守的分子微生物结构的识别所代表的，这也被称为PAMP(病原体相关性分子图式)。由PAMP-受体识别PAMP触发了导致多个抗性机制活化的信号级联放大，所述抗性机制包括细胞壁强化、毒性化合物分泌和程序性细胞死亡。这些防御机制足够有效地停止大多数微生物尝试的袭击。这一先天免疫应答被认为是遗传学上复杂和持久的非宿主抗性防御机制组的完整部分。
仅有一些病原体物种进化出了特异性机制来避免或阻断单个植物物种的基础防御系统，并且因此成为这些物种的病原体。可以想象这些物种特异性防御破坏的关键步骤是靶向和操作特定的宿主蛋白质。
白粉病是许多单子叶植物和双子叶植物(如甜菜、多种谷类、黄瓜、莴苣、胡萝卜、豌豆、番茄，草莓，苹果，葡萄等)的普通真菌疾病。白粉病菌(白粉菌目(Erysiphales))属于子囊菌门(Ascomycota)。禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis)是引起草类中白粉病的真菌。大麦白粉病真菌(禾本科布氏白粉菌大麦专化型(Blumeria graminis f.sp.hordei，Bgh))是攻击大麦(Hordeum vulgare L.)表皮细胞的专性活体营养病原体。在将孢子与大麦叶的角质层相接触后，形成了附着器。真菌侵袭的下一关键步骤是细胞壁的穿入，接着是被称为“吸器”的特化的细胞内摄食结构的建立(不破坏质膜的完整性)。
在单子叶植物大麦中，七螺旋质膜定位的MLO蛋白质家族同种型的存在是白粉病菌成功侵入宿主细胞壁所需要的。缺乏这些MLO蛋白质(由于天然遗传变异或者在各个mlo基因中经诱导的损伤引起的)导致真菌孢子不能穿过植物细胞壁。缺乏功能性mlo基因的所有大麦基因型对于所有已知的大麦白粉菌的分离群是有抗性的。此外，在田地条件下，隐形遗传的mlo抗性是非常持久的。在过去的25年中，已经在大多数欧洲春季大麦品种中使用mlo突变。
MLO蛋白质是必需的质膜定位的蛋白质并且包含7个疏水跨膜结构域。细胞质C-末端具有两亲性α-螺旋，其作用为钙调蛋白结合结构域，这对于MLO蛋白质的完全活性是必需的。在体外和体内都显示了与这一肽结构域的钙-依赖性钙调蛋白结合，所述结合贡献了大约一半的mlo的易感性-赋予的活性(Kim M.C.Nature.2002 Mar 28；416(6879)：447-51)。
当被突变时会阻抑mlo-介导的抗性的基因ror2(mlo抗性2所需的)被发现编码质膜-停留的突触融合蛋白，所述突触融合蛋白是属于SNARE蛋白质超家族的蛋白质。缺乏野生型ROR2部分损害了mlo基因型中的穿入抗性，表明突触融合蛋白活性是有效的mlo抗性所需的(Freialdenhoven A.Plant Cell.1996 Jan；8(1)：5-14)。MLO和ROR2似乎都在尝试的真菌细胞壁侵入位点处主要聚集。因此，看起来MLO和ROR2在生物胁迫的位点处形成新的病原体触发的微域(Bhat R.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.20052月22；102(8)：3135-40)。在这些亚细胞区域中，在成功的真菌宿主细胞侵袭过程中，MLO和细胞质钙传感器钙调蛋白之间的相互作用瞬时增加(Bhat R.A.，见上)。此外，显示了MLO和ROR2之间的直接的物理相互作用。在单氨基酸取代mlo突变蛋白质的子集和野生型ROR2之间，以及在野生型MLO和由大麦ror2突变体所编码的大麦变体之间这一相互作用的强度被强烈降低。MLO可以在质膜处调节SNARE蛋白质依赖性和小泡转运相关的过程。因此，白粉病菌似乎特异性地破坏MLO来调节植物细胞外围的小泡相关的过程用于成功发病。
MLO的这一机制在植物中似乎是保守的。双子叶植物鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)包含大麦MLO的15个同源物，被称作AtMlo1-AtMlo15。AtMlo2的敲除赋予了针对白粉病菌二孢白粉菌(Erysiphe chichoracearum)和Golvinomyces orontii的抗性。这些数据表明白粉菌感染机制在单子叶植物和双子叶植物中是保守的。
认为可能是每种病原体物种进化其自己的特异性方式来阻抑和克服一般化或特化的宿主防御机制。由mlo介导的抗性表型似乎对于白粉病菌(子囊菌门-盘菌亚门(Pezizomycotina)-锤舌菌纲(Leotiomycetes)-白粉菌目(Erysiphales))是高度特异性的。迄今为止，从文献中已知mlo突变并不赋予针对除白粉病菌外的任何其他病原体的抗性。
例如，mlo突变并不赋予任何对子囊菌门的其它真菌(与白粉病菌相近)的抗性。在用小麦全蚀病真菌(禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)：子囊菌门-盘菌亚门-粪壳菌纲(Sordariomycetes)-不确定的粪壳菌纲(Sordariomycetes incertae sedis)-巨座壳科(Magnaporthaceae)；Jorgensen J.H.Induced Mutations Against Plant Diseases，Proc.Symp.Wien，1977.Wien：Int.Atomic Energy Agency，第533-547页)接种大麦后没有观察到mlo的作用。与mlo野生型植物相比，大麦mlo突变体在对一定范围的其他植物病原体的感染表型上并没有不同，所述其他植物病原体例如大麦叶锈病菌(条形柄锈菌(Puccinia striiformis)；担子菌门(Basidomycota)-锈菌纲(Urediniomycetes)-锈菌亚纲(Urediniomycetidae)-锈菌目(Uredinales)-柄锈科(Pucciniaceae))或条锈病菌(大麦柄锈菌(Puccinia hordei)；担子菌门-锈菌纲-锈菌亚纲-锈菌目-柄锈科)
此外，mlo突变体对于大麦对半活体营养的稻瘟病真菌稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(子囊菌门-盘菌亚门-粪壳菌纲-不确定的粪壳菌纲-巨座壳科；Jarosch B.Mol.Plant-Microbe Interact.12(6)：508-514，1999)和对于坏死营养型真菌小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)(子囊菌门-盘菌亚门-座囊菌纲(Dothideomycetes)-格孢腔菌目(Pleosporales)-格孢腔菌科(Pleosporaceae))的增强的易感性有作用。总之，除了白粉病菌外，已知没有病原体受到mlo突变的负面影响。
大豆锈病(SR)也已知为亚洲大豆锈病(担子菌门(Basidiomycota)-锈菌纲-锈菌亚纲-锈菌目-层锈菌科(Phakopsoraceae))，是影响大豆和其他豆科植物的疾病。其由两种类型的真菌豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)引起，后者是两者中较弱的病原体。
当夏孢子萌发产生单芽管、形成附着器并且总是通过直接的角质层穿透感染时，大豆锈菌的感染过程开始。穿透随着附着器锥体(cone)的形成开始，所述形成随着穿透菌丝的细胞壁持续。穿透菌丝进入表皮细胞、横断其并且达到叶肉的胞间隙，在该处形成第一隔膜(spetum)，将穿透菌丝与初级菌丝分开。在接种后24和48小时之间可见第一吸器。吸器在叶肉和表皮细胞中形成。
在最优条件下，孢子经过6-7天成熟。然后，在感染健康大豆植物后，新的孢子产生大约10天。这些新的孢子可以再次感染同一植物，或者被携带到其他易感植物。大豆锈病引起大豆和其他宿主植物的子叶、茎、叶柄、叶和荚果的损伤。对大豆植物的主要影响是对光合组织的破坏，这随后引起过早的脱叶、早熟和严重的产量减少(通过荚果和种子的数量减少以及减少的种子重量)。
目前，在任何美国商业大豆栽培种中都没有对大豆锈病的抗性。已知对豆薯层锈菌(P.Pachyrhizi)的特异性抗性，并且已经鉴定了4个单显性基因，为Rpp1、Rpp2、Rpp3和Rpp4。这些四基因条件抗性是对有限的锈菌分离群组。单基因抗性不是持久的，在鉴定了来源后很快就丢失了单基因的有效性。
本发明的目标是提供在转基因植物和/或植物细胞中增加对大豆锈病抗性的方法。该目标是通过主要权利要求的主题来实现的。其他独立权利要求的特征用来解决说明书中表明的这一和其他目标。本发明的优选的实施方案由从属权利要求的特征来限定。
发明详述
令人惊讶地，发明人发现了mlo突变在针对大豆锈病的抗性反应中的影响。这一相互作用表型是完全出乎意料的，这是由于下述一些原因：
l.除了白粉病抗性外，迄今为止没有描述任何其他的基于MLO影响(即MLO过量表达或MLO表达不足(underexpression))的抗性表型。对于真菌稻瘟病菌和小麦根腐病菌，甚至在mlo突变体中观察到增强的易感性。
2.在用其他锈菌感染后，mlo-大麦的表型与野生型植物没有区别，所述其它锈菌锈病与大豆锈菌紧密相关，所述锈菌即条锈病菌(大麦柄锈菌，担子菌门；锈菌纲；锈菌亚纲；锈菌目；柄锈科)和大麦叶锈病菌(条形柄锈菌，担子菌门；锈菌纲；锈菌亚纲；锈菌目；柄锈科)。
3.此外，MLO不影响使用与大豆锈菌类似的感染过程(例如表皮细胞的直接穿透和/或叶肉中的胞间生长)的其他致病真菌。例如，稻瘟病真菌稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)也直接穿透表皮以在叶中生长。
4.最后，白粉病真菌来自子囊菌门，而亚洲大豆锈菌来自担子菌门。
因此，在第一个方面中，本发明涉及在转基因植物和/或植物细胞中增加对大豆锈病的抗性的方法，其特征在于与野生型植物或植物细胞相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性分别被改变。
在本发明的范围内，“转基因”植物细胞(或植物)是待被引入核酸分子的细胞。该分子可以是DNA/cDNA分子或RNA分子，其可以是双链或单链，此类分子的实例是双链RNA分子或载体，例如质粒、黏粒、重组病毒或小染色体。核酸分子可以包含来自宿主细胞物种或来自其他生物/物种的序列。此外，这些序列可以是天然的或经修饰的或合成的。
根据本发明，“植物”可以是任何单子叶植物或双子叶植物。优选是单子叶或双子叶的农业、食物或饲料植物。优选地，单子叶植物选自大麦属(Hordeum)(大麦)、燕麦属(Avena)(燕麦)、小麦属(Triticum)(小麦)、黑麦属(Secale)(黑麦)、稻属(Oryza)(稻)、高粱属(Sorghum)(黍)、玉蜀黍属(Zea)(玉米)、稷属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、狗尾草属(Setaria)等。优选地，双子叶植物选自大豆、棉花、油菜、番茄、糖萝卜、马铃薯、向日葵、豌豆、观赏植物、烟草、三叶草(车轴草属物种(Trifolium spec.))、野葛(Pueraria lobata)、树和豆科植物如苜蓿。其他农业植物可以包括水果(特别是苹果、梨、樱桃、葡萄、柑橘水果、凤梨和香蕉)、油棕类、茶、可可和咖啡树、烟草、剑麻，以及医用植物如萝芙木属和digitales。特别偏好的是谷类小麦、黑麦、燕麦、大麦、稻、玉米和黍、糖萝卜、欧洲油菜、大豆、番茄、马铃薯和烟草。其他农业植物可以取自美国专利US 6,137,030。最优选的植物是大豆。
根据本发明的植物细胞包括经分化的和未经分化的植物细胞(包括原生质体)，所述细胞是通过本发明的方法产生的，已经向植物基因组中被整合了下文描述的核酸分子，或已经接受它们作为自主复制的分子。
在本发明的范围内，大豆锈病病原体是豆薯层锈菌或山马蝗层锈菌。优选地，病原体是豆薯层锈菌。
病原体“抗性”意思是在病原体攻击后减少或削弱植物致病症状。该症状可以是多种类型的，但是优选包含直接或间接导致植物的质量、收成的大小、用作动物饲料或用于人消耗的食物的适合性损伤的那些，或者妨碍作物的播种、栽种、收获或加工的那些。
根据本发明，术语“增加的抗性”(针对大豆锈病)被理解为意思是根据本发明的转基因植物或植物细胞，与另外被以相同方式(例如气候和栽培条件、病原体类型等)进行处理的未经转化的野生型植物或植物细胞相比，更弱、和/或更不频繁地被大豆锈菌感染。根据本发明，术语“野生型”被理解为各自的未经遗传修饰的亲本生物。穿透效率以及乳突形成率提供了定量植物对病原体侵染的反应的可能性(见实施例)。术语“增加的抗性”也包括已知的瞬时病原体抗性，即与各自的野生型相比，根据本发明的转基因植物或植物细胞仅在有限的时期内具有增加的病原体抗性。
瞬时沉默或瞬时抗性可以是有利的，因为其是其它允许产生具有增加的大豆锈病抗性，但是影响表型的方法的有价值的添加。通过本发明的方法产生并且在感染发展期间显示出瞬时抗性的植物没有表现出表型的任何显著的改变，因此引起瞬时抗性的根据本发明的方法与其他方法一起有助于产生特征在于更持久和更稳定的抗性的植物，而没有由该方法引起的对于表型限制的任何不利影响。
大豆锈病的侵染优选减少了至少10％或20％，更优选至少30％或40％，尤其优选至少50％或60％，特别优选至少70％或80％，以及最优选至少90％、95％或100％，这表现为致病症状发展的减少。
根据本发明，“MLO蛋白质”是具有如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的氨基酸序列的蛋白质，或者具有与所述序列基本同源的序列的蛋白质，或者与所述MLO蛋白质功能等价的蛋白质。
上述序列所指定的MLO蛋白质来源于下列植物物种：大麦(Hordeumvulgare)、大豆(Glycine max)、稻(Oryza sativa)、亚麻(Linumusitatissimum)、普通小麦(Triticum aestivum)和鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)。但是许多其它物种例如玉蜀黍(Zea mays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、金鱼草(Antirrhinum majus)、马铃薯(Solanum tuberosum)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、火炬松(Pinus taeda)、台湾耧斗菜(Aquilegia Formosa)、Aquilegia pubescens、中果咖啡(Coffeacanephora)、野莴苣(Lactuca serriola)、莴苣(Lactuca sativa)、姜(Zingiber officinale)、野草莓(Fragaria vesca)、Helianthus petiolaris、芜青(Brassica rapa)、日本百脉根(Lotus japonicus)、展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)、辣椒(Capsicum annuum)、番茄(Lycopersiconesculentum)和烟草(Nicotiana tabacum)包含MLO蛋白质，所述MLO蛋白质也包含在本发明的范围内。下列表1将给出对于MLO蛋白质的数据库研究结果的概述。
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| REFSEQ_NUCLEOTIDE|NM_129974 | 鼠耳芥 | NM_129974 | 18406453 |
| REFSEQ_NUCLEOTIDE|NM_190204 | 稻(日本栽培种组) | NM_190204 | 34907491 |
| REFSEQ_NUCLEOTIDE|NM_197580 | 稻(日本栽培种组) | NM_197580 | 37536519 |
| REFSEQ_NUCLEOTIDE|NM201957 | 鼠耳芥 | NM201957 | 42571224 |
| REFSEQ_NUCLEOTIDE|XM_464475 | 稻(日本栽培种组) | XM_464475 | 50905972 |
| REFSEQ_NUCLEOTIDE|XM_472638 | 稻(日本栽培种组) | XM_472638 | 50924555 |
| REFSEQ_NUCLEOTIDE|XM_474381 | 稻(日本栽培种组) | XM_474381 | 50929706 |
| REFSEQ_NUCLEOTIDE|XM_493809 | 稻(日本栽培种组) | XM_493809 | 50948902 |
| Triticum_aestivum_WheatApr03|c55126395 |
在本发明的范围中，术语“同源”用于氨基酸序列或核酸序列，意思是它们分别与另一氨基酸序列或核酸序列共享某一程度的“同源性”，即“同一性”或“相似性”。
存在许多算法确定同源性或相似性这一程度。优选地，可以通过DNAstar有限公司，Madison，Wisconsin(USA)的Lasergene软件，使用CLUSTAL方法(Higgins等人，1989，Comput.Appl.Biosci.，5(2)，151)来确定。本领域技术人员可用于比较序列并且基于算法的其它程序是例如Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法。其它有用的程序是PileAupa程序(J.Mol.Evolution.(1987)，25，351-360；Higgins等人，(1989)，Cabgos，5,151-153)或者空位和最佳适配程序(the Gap and Best Fitprogram)(Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.，48,443-453，以及Smith和Waterman(1981)，Adv.，Appl.Math.，2,482-489)或遗传计算机公司(the Genetics Computer Group)的GCG软件包的程序(575 ScieuceDrive，Madison，Wisconsin，USA 53711)。序列比对也可以用Clustal W程序从网页http://www.ebi.ac.uk/clustalw或者用NCBI Blast序列比对程序从网页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi进行。
本领域的技术人员可以在网络(例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez或http://www.tigr.org)可用的数据库中发现足够的核酸或氨基酸序列。除了已知的在本发明中公开的MLO序列外，以后在这些数据库中可以发现其它序列，这些序列可以用于本发明的上下文中。另外，本领域的技术人员已知允许其从其它生物中分离同源序列的技术。其可以进行同源性比较(通过CLUSTAL、BLAST、NCBI)，然后通过标准实验室方法分离经鉴定的同源核苷酸序列，所述标准实验室方法例如引物设计、PCR、杂交或用足够的探针筛选cDNA文库(参见例如Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY)。然后可以确定经鉴定的蛋白质的功能。
与MLO氨基酸序列“基本同源”(＝基本相似)的氨基酸序列意思是，在本发明的范围内，该序列与在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中描述的任何MLO蛋白质的氨基酸序列或者其功能等价的部分或片段有至少40％或50％，优选至少55％或60％，更优选至少65％或70％，尤其优选至少75％或80％，特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似。优选地，在那些蛋白质的整条序列长度上确定同源性。相同的定义类似地应用于核酸序列。
如果一些上述氨基酸序列仅仅是全长MLO蛋白质的部分序列(例如SEQ ID NO：7)，那么术语“基本同源的氨基酸序列”也是针对全长序列或者可以在将来被鉴定的全长序列的新的部分。
根据本发明，与MLO蛋白质“功能等价”的蛋白质是这样的蛋白质，其与具有在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所描述的氨基酸序列的任何MLO蛋白质具有相同的细胞功能、相同的结合性质和/或相同的结构性质。细胞功能尤其是指蛋白质与其病原或生理性结合伙伴蛋白(partner)的相互作用，即在MLO蛋白质的情形中，是它们与钙调蛋白和/或ROR2的相互作用。另一可能的MLO蛋白质的生理性结合伙伴蛋白是腺苷三磷酸酶蛋白质家族。将来将公开的任何其它可能的相互作用伙伴蛋白也意味着包括在本发明的范围内。功能等价的蛋白质也可以是所述MLO蛋白质的部分(片段)，例如在N-末端和/或C-末端具有氨基酸缺失或添加的蛋白质。其还可以是具有一个或多个氨基酸改变、插入或缺失(不导致改变的细胞功能、结合性质和/或结构性质)的蛋白质。
功能性点突变是例如通过保守性氨基酸改变来实现的，所述保守性氨基酸改变即将氨基酸改变为另一个氨基酸，所述另一个氨基酸具有相当的物理化学性质，例如疏水、亲水、带正电荷、带负电荷的氨基酸等。保守性氨基酸改变的一个实例是缬氨酸替换成丙氨酸(或者反过来)。技术人员需要记住要实现改变的区域，即如果其是对于MLO蛋白质与其结合伙伴蛋白的相互作用关键的区域。例如，MLO C-末端包含钙调蛋白结合位点。与已知MLO序列的序列比对给出了这样的指示：即一个区域是否对于蛋白质的结合性质来说是关键的。与保守性氨基酸改变相反，本领域的技术人员假设改变(例如带正电荷的氨基酸改为带负电荷的氨基酸(例如赖氨酸-谷氨酸))将导致MLO蛋白质的功能或结构的变化。相同的考虑应用于产生mlo的功能性插入或缺失突变体。技术人员将注意到这样的问题：即插入的或缺失的氨基酸或氨基酸范围是位于对于Mlo的结合性质来说关键还是不关键的区域中。
在本发明的上下文中，MLO的“片段”是MLO蛋白质的一部分，其中原始MLO蛋白质具有例如如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的氨基酸序列。通常，该片段缺乏N-末端或C-末端的氨基酸。
在MLO片段需要有功能的情形中，该片段具有“完整”MLO蛋白质长度的优选至少40％或50％、优选至少55％或60％、更优选至少65％或70％、尤其优选至少75％或80％、特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
但是，下文描述的一些方法并不需要编码MLO蛋白质“片段”的核酸序列必须编码功能性蛋白质。在那些情形中，核酸的“片段”或“部分”可以是短至20个核苷酸，在一些情形中甚至更短。(氨基酸或核酸)片段的长度的细节将于下文描述。
优选地，用于本发明的MLO是植物MLO，更优选的是选自以下的植物MLO：大麦MLO、稻MLO、鼠耳芥MLO，尤其优选AtMlo1、AtMlo2、AtMlo3、AtMlo4、AtMlo5、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo8、AtMlo9、AtMlo10、AtMlo11、AtMlo12、AtMlo13、AtMlo14或AtMlo15，亚麻MLO、普通小麦(小麦)MLO、大豆Mlo，尤其优选GmMlo1、GmMlo2、GmMlo3.1或GmMlo3.2，或与任一所述MLO蛋白质基本功能等价的MLO。
特别优选地，用于本发明的MLO是选自以下的MLO：具有如SEQ IDNO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的氨基酸序列的MLO，或者具有与在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等价的氨基酸序列的MLO。
在本发明的范围内，MLO蛋白质的“含量”被认为是MLO蛋白质的量，可以就被病原体接种和/或未被病原体接种的植物或植物细胞的野生型对其进行测定。适合于在植物细胞中确定MLO的量的一些方法将在下面描述。所有那些技术是对于技术人员来说熟知的常规实验室方法。确切的方案可以从任何标准的实验室教科书中习得。
MLORNA的量(是蛋白质的量的直接指示)可以通过反转录酶PCR(RT-PCR)来确定：1.分离总RNA，2.使用聚-T-引物或随机六聚体引物反转录为cDNA，3.使用cDNA作为模板，用Mlo特异性引物进行PCR。(或使用Quiagen试剂盒的一步RT-PCR)。
定量MLO RNA的量的另一种可能性是Northern印迹技术。这一方法是基于电泳分离的RNA分子从凝胶向吸收层(absorbent sheet)的转移，所述吸收层随后被浸入到将与目的RNA杂交的经标记的探针中来显现其存在。
可以通过Western印迹(免疫印迹)技术来确定蛋白质的量：这是在组织匀浆或提取物的给定样品中检测蛋白质的方法。其使用电泳来通过质量分离变性的蛋白质。然后将蛋白质转移出凝胶并且转移到膜(通常为硝化纤维素)上，在所述膜上其被使用对该蛋白质特异性的抗体“探测到”。
免疫组织化学染色也是在组织中检测特异性抗原的有价值的工具。为了进行标准的染色步骤，首先将组织切片脱蜡，然后在应用一抗之前将其再水合。然后应用酶缀合的二抗并且在添加酶特异性底物后可以观察到特异性染色。有时候，当观察到弱染色或无染色时，可能需要通过酶消化进行抗原“解掩蔽”。
MLO蛋白质的“活性”意思是其进行其细胞功能，尤其是与其生理或病原性结合伙伴蛋白(最尤其是与ROR2和/或钙调蛋白)相互作用的能力。可以使用标准的蛋白质-蛋白质相互作用的方法来检测MLO与钙调蛋白和/或Ror2的相互作用。在酵母双杂交(分裂-泛素(split-ubiquitin))系统中显示了钙调蛋白与MLO的相互作用(见Kim M.C.Journal of BiologicalChemistry.277(22)：19304-19314，20025月31日；和Kim M.C.Nature.416(6879)：447-450，20023月28日)。另外，在GST-下拉实验中也显示相互作用(见Kim M.C.Nature.416(6879)：447-450，2002 Mar 28)。ROR2突出融合蛋白与MLO的相互作用通过FRET显示(见Bhat R.A.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America.102(8)：3135-3140，2005-2-22)。
也可以将检测蛋白质-蛋白质相互作用的其它方法应用于MLO和其结合伙伴蛋白。分裂-泛素系统是发现新的相互作用伙伴蛋白的适当的系统(如Kim等人，2002，见上所述)，但是也可以使用基于瞬时转化(高通量)FRET或双-荧光互补(BiFc)筛选。在两种情形中，MLO诱饵都与荧光蛋白质(对于FRET为YFP f.l.，对于BiFC为YFP的N或C末端)融合。对于捕获物，cDNA文库与CFP(FRET)或YFP的互补半部分(BiFC)融合。诱饵和捕获物在表皮细胞或原生质体中共-表达。通过CLSM或荧光光度计测量荧光。
当在植物或植物细胞中改变MLO蛋白质的含量和/或活性时，可以比野生型减少或增加。增加MLO的含量可以通过增加内源MLO的量(即MOL)或者通过将额外的MLO的量引入植物或植物细胞来实现。根据本发明在植物或植物细胞中的MLO含量的减少通常通过减少内源MLO的量来实现。因此，MLO活性的增加可以通过增加内源MLO活性和/或引入额外量的功能性MLO来实现。MLO活性的减少可以通过减少内源MLO的活性来实现。类似地，MLO活性的减少也表示内源MLO活性未被修饰，但是其与生理或病原性结合伙伴蛋白的相互作用被抑制，例如通过非功能性MLO或抗MLO抗体或MLO抑制剂的表达。换句话说，MLO蛋白质与其结合伙伴蛋白的相互作用被基本上阻抑和/或被充分阻止。
因此，本发明优选的实施方案涉及在转基因植物和/或植物细胞中增加针对大豆锈病的抗性的方法，其特征在于与野生型相比，至少一种内源MLO蛋白质的含量和/或活性减少。
根据本发明的转基因植物或植物细胞中Mlo含量和/或活性的减少优选为至少10％、15％、20％或25％，更优选为至少30％、35％、40％或45％，尤其优选是至少50％、55％、60％或65％，特别优选是至少70％、75％、80％或85％，并且最优选是至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
MLO蛋白质的含量和/或活性的减少可以通过不同的方式来实现。一种优选的方法是向植物细胞转移至少一种核酸分子，所述核酸分子包含至少一种序列，所述序列与编码内源MLO或其片段的序列同一、同源或互补。
根据本发明，“核酸分子”可以是DNA分子，例如包含基因组序列或cDNA序列；或者是RNA分子。分子可以是双链或单链。此类分子的实例是双链RNA分子或载体，例如质粒、黏粒、重组病毒或微型染色体。核酸分子可以包含来自宿主细胞物种或来自其它生物/物种的序列。此外，所述序列可以是天然的或经修饰的或合成的。
核酸分子向植物或植物细胞的“转移”可以通过不同的方法进行。优选地，转移通过转化、转染(稳定或瞬时)、注射、生物射弹方法和/或电穿孔来发生，尤其是当核酸分子是DNA时。DNA可以以例如载体或无常规载体主链的线性“启动子-基因-终止子构建体”的形式存在。当分子是双链RNA时，转移可以通过生物射弹方法进行。技术人员熟悉那些方法并且能容易地鉴定对于其实际需要所最佳的转移方法。将详细描述一些转移方法(见下)。
与编码MLO蛋白质(或其片段)的序列“同一”的核酸序列意思是在序列之一的某一区域，优选在序列之一的完整区域上同一。
与编码MLO蛋白质(或其片段)的序列“同源”的核酸序列意思是，在本发明的范围内，该序列与编码在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中描述的任何MLO蛋白质或者其功能等价的部分或片段的核苷酸序列有至少40％或50％，优选至少55％或60％，更优选至少65％或70％，尤其优选至少75％或80％，特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相似。优选地，在核酸分子的整条序列长度上确定同源性。编码核酸序列的MLO可以由任何技术人员容易地自所述氨基酸序列推论出。一些各自的编码核酸序列示于SEQ ID NO：1、3、5、6、8、10、12、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47。当然所述序列是非限制性的。技术人员将使得核酸序列适用于宿主细胞的优选的密码子选择。
下述表2给出了上述氨基酸和核酸序列的概述。
根据本发明的一个优选的实施方案，经转移的核酸分子的一部分与编码内源MLO或其片段的序列至少50％、优选至少60％、尤其优选至少70％、特别优选至少80％、还特别优选至少90％、以及最优选至少95％同源。
与编码MLO蛋白质(或其片段)的序列“互补”的核酸序列意思是，在本发明的范围内，该序列可以与编码MLO蛋白质(或其片段)的核酸序列在严格条件下杂交，所述杂交是由于互补碱基之间的氢键。这一杂交必须是特异性的。本领域的技术人员已知为了彼此杂交，两个序列不需要具有100％互补性。在本文中，“互补”核酸序列与编码在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO蛋白质或其功能等价的部分或片段的核酸序列有至少40％或50％，优选至少55％或60％、更优选至少65％或70％、尤其优选至少75％或80％、特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％互补。
在本发明的上下文中，术语“在严格条件下杂交”意思是在严格到足以确保特异性杂交的条件下在体外进行杂交。严格体外杂交条件是本领域技术人员已知的，并且可以在文献中找到(例如Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，NY)。术语“特异性杂交”是指这样的事实，即分子优选与某一核酸序列(靶序列)在严格条件下结合(如果该靶序列是例如DNA或RNA分子的复杂混合物的一部分)，但是不与其它序列结合或者至少以相当更低的程度与其它序列结合。
严格条件取决于条件。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。通常，选择严格条件使得杂交温度低于特异序列在给定的离子强度和给定的pH值下的解链温度(Tm)大约5℃。Tm是在平衡状态中50％的与靶序列互补的分子杂交靶序列时的温度(在给定的pH值、给定的离子强度和给定的核酸浓度)。通常，严格条件是那样的，其中盐浓度在pH为7.0至8.3之间至少是大约0.01至1.0M的钠离子浓度(或另一种盐的浓度)，且对于短分子(即例如10至50个核苷酸)而言温度至少是30℃。此外，严格条件可以包括添加去稳定杂化物的物质例如甲酰胺。严格杂交条件的优选的非限制性实例是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在大约45℃杂交，接着是一步或多步在0.2×SSC、0.1％ SDS在50至65℃的洗涤步骤。温度，例如，在依据核酸类型的标准杂交条件下，在浓度为0.1至5×SSC(pH7.2)的含水缓冲液中范围在42℃和58℃之间。
如果有机溶剂例如50％的甲酰胺存在于上述缓冲液中，则标准条件下的温度为大约42℃。优选地，DNA：DNA杂化物的杂交条件是例如0.1×SSC，以及20℃至45℃，优选30℃至45℃。优选地，DNA：RNA杂化物的杂交条件是例如0.1×SSC和30℃至55℃，优选在45℃至55℃之间。例如对于具有大约100个碱基对的长度且G/C含量为50％的的核酸来说，在甲酰胺不存在时确定上述杂交温度。本领域的技术人员已知如何使用上述或下列教科书来确定所需的杂交条件：Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，Hames和Higgins(出版者)1985，Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach，IRL OxfordUniversity Press印刷，Oxford；Brown(出版者)1991，Essential MolecularBiology：A Practical Approach，Oxford University Press进行IRL印刷，Oxford.
典型的杂交和洗涤缓冲液具有例如下列组成(这一实例是非限制性的)：
预杂交溶液： 0.5％ SDS
5×SSC
50mM NaPO4，pH6.8
0.1％焦磷酸钠
5×Denhardt’s溶液
100μg/ml鲑精
杂交溶液： 预杂交溶液
1×106cpm/ml探针(5-10分钟95℃)
20×SSC： 3M NaCl
0.3M柠檬酸钠
用HCI加至pH7
50×Denhardt’s试剂：5g菲可
5g聚乙烯吡咯烷酮
5g牛血清白蛋白
添加500ml蒸馏水(A.dest)
用于杂交的典型方法如下(该实例是非限制性的)：
任选地： 在65℃在1×SSC/0.1％ SDS中洗涤印迹30分钟
预杂交： 在50-55℃至少2小时
杂交： 在55-60℃过夜
洗涤： 05分钟 2×SSC/0.1％ SDS 杂交温度。
30分钟 2×SSC/0.1％ SDS 杂交温度。
30分钟 1×SSC/0.1％ SDS 杂交温度。
45分钟 0.2×SSC/0.1％ SDS 65℃
5分钟 0.1×SSC 室温。
本领域的技术人员已知所示的专用溶液和方案可以或必需根据应用而被修改。
根据本发明的一个优选的实施方案，经转移的核酸分子的一部分与编码内源MLO或其片段的序列有至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、尤其优选至少80％、特别优选至少90％，以及最优选至少95％互补。
根据本发明的另一优选的实施方案，与编码内源MLO或其片段的序列同一、同源或互补的经转移的核酸分子的部分包含20至1000个核苷酸，优选20至750个核苷酸、更优选20至500个核苷酸、尤其优选20至250个核苷酸、特别优选20至150个核苷酸，也特别优选20至100个核苷酸，以及最优选大约20至50个核苷酸。
可以通过不同方法实现至少一种内源MLO含量和/或活性的减少，例如通过RNA干扰(RNAi)、反义构建体、共-阻抑构建体、转录后基因沉默(PTGS)、核糖核酸酶P构建体、同源重组、核酶构建体或病毒诱导性基因沉默(VIGS)。将在下文中解释方法。
在具有减少的MLO含量/活性的转基因植物或植物细胞中抗大豆锈病的抗性增加可以例如通过“沉默”方法来实现。在该方法中，将编码至少一种MLO或其片段的核酸和/或与其互补的核酸转移至植物细胞中。为了确保该植物细胞对于经转移的核酸是转基因的，通常待转移的核酸是载体的部分，所述载体例如质粒能够在细胞中稳定复制或者确保经转移的核酸整合到植物基因组中。
优选地，通过RNAi方法实现mlo的沉默。在该方法中，将载体转移到植物细胞中，所述载体以5’-3’的方向包含下列元件：在植物中有功能性活性的启动子序列；与其有效连接的与编码至少一种MLO或其片段的序列互补的反义序列(或这一反义序列的同源物)，其中所述序列在其3’端具有可为剪接体所识别的3’外显子序列；与其有效连接的内含子；与其有效连接的与编码至少一种MLO或其片段的序列同一或同源的正义序列，其中所述序列在其5’端具有可为剪接体所识别的5’外显子序列，以及任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列。当然，正义和反义序列的位置可以互换。在这一情形中，本领域技术人员显而易见，各自的3’剪接位点和5’剪接位点需要适合。
当那些载体被稳定转移到植物细胞中时，转录导致前-mRNA的产生，所述前-mRNA包含含有反义序列的第一外显子、内含子，以及包含正义序列的第二外显子。然后通过剪接过程将内含子移除，产生了具有彼此互补的区域的连续RNA分子。这一分子将发展出双链结构(Smith等人，2000，Nature，407：319-320)。
那些双链RNS分子能够通过诱导PTGS(转录后基因沉默)系统特异性沉默mlo mRNA。因此，MLO蛋白质不能再表达。反义和正义序列的选择使得能够确定应当阻抑哪种类型的mlo。技术人员能够鉴定作为蛋白质特征的序列。他还知道当使用许多对应的特征性序列时可以沉默多种MLO蛋白质。
这一RNAi方法可以包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的与编码至少一种MLO或其片段的序列互补的反义序列，或这一反义序列的同源物，其中所述序列在其3’端具有可为剪接体所识别的3’外显子序列，
-与其有效连接的内含子，
-与其有效连接的正义序列，所述正义序列与编码至少一种MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列在其5’端具有可为剪接体所识别的5’外显子序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的所述载体转移到植物细胞中，以及任选地整合进植物基因组。
技术人员已知选择何种载体用于RNAi方法或PTGS方法的执行。所述载体可以例如以下述方式构建，所述方式允许正义和反义序列被从任何适当的启动子转录，在细胞中杂交以及诱导PTGS系统(Tuschl，2002，Nat.Biotechnol.20,446-448；Miyagishi等人，2002，Nat.Biotechnol.，20，497-500；Lee等人，2002，Nat.Biotechnol.，20,500-505)。其它载体通过“环”序列组合了正义和反义序列，并且被从任何适当的启动子转录。环的反-折叠(back-folding)与允许正义和反义序列杂交，形成双链RNA以及诱导PTGS系统(Tuschl，2002，见上；Paul等人，2002，Nat.Biotechnol.，20，505-508；Paddison P.J.Genes Dev.20024月15日；16(8)：948-58；Brummelkamp等人，2002，Science，296,550-553)。
在另一RNAi方法中，包含上述正义和反义序列的预合成的双链RNA分子被直接转移到植物细胞中，例如通过生物射弹方法。因此，这一RNAi方法可以包括下列步骤：
a)构建双链RNA分子，其具有15至100个核苷酸，优选20至75个核苷酸，更优选20至50个核苷酸，尤其优选20至40个核苷酸，特别优选20至30个核苷酸以及最优选20至25个或者21、22或23个核苷酸的长度，包含具有正义链的核酸序列，所述正义链与编码至少一种内源MLO的序列的片段同一或同源，
b)将来自步骤a)的分子转移到植物细胞中。
在另一个优选的实施方案中，用于核酸转移的载体以5’-3’方向包含：启动子序列；与编码至少一种内源MLO或其片段的序列同一或同源的正义序列，其中所述序列具有自身-互补区域；以及任选地终止序列。植物细胞中那些载体的转录导致产生了RNA分子，所述RNA分子包含能够与其自身杂交的序列区域。这可以导致细胞内部双链RNA分子的形成，其可以诱导PTGS系统并且导致mlo mRNA的特异性降解。沉默植物蛋白质的这一方法也被称为共-阻抑，需要待被阻抑的MLO的mRNA包含彼此互补的区域。此类区域可以由技术人员通过目测各自的编码DNA序列或者通过序列程序(例如来自DNAStar有限公司，Madison，USA)来鉴定。
这一共-阻抑方法可以包含下列步骤：
a)构建载体，所述载体以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的正义序列，所述正义序列与编码至少一种内源MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列具有自身-互补的区域，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞中并且任选地整合进植物基因组中。
在本发明的另一个优选的实施方案中，用于转移核酸的载体以5’-3’方向包含：启动子序列，任选地与其有效连接的与编码至少一种内源MLO或其片段的序列互补的反义序列(或这一反义序列的同源物)，以及任选地终止序列。植物细胞中那些载体的转录导致产生了RNA分子，其序列与编码MLO或其部分的mRNA互补。反义序列与mlo的内源mRNA序列的在体内的杂交随后导致植物细胞中mlo表达的阻抑。
这一反义方法可以包括下列步骤：
a)构建载体，所述载体以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的与编码至少一种内源MLO或其片段的序列互补的反义序列，或这一反义序列的同源物，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的所述载体转移到植物细胞中，以及任选地整合进植物基因组。
在本发明的另一优选的实施方案中，用于核酸转移的载体以5’-3’方向包含：启动子序列，与其有效连接的编码特异性识别至少一种mlo的mRNA的核酶的DNA序列，以及任选地终止序列。本领域技术人员已知如何产生具有直接针对特异性mRNA的内切核酸酶活性的核酶。详细地，这一方法例如描述在Steinecke P等人(EMBO J.19924月；11(4)：1525-30)中。在本发明的上下文中，术语“核酶”还包含那些RNA序列，其除了核酶自身外还包括前导序列，所述前导序列与mlo的mRNA或其片段互补并且因此能够将mRNA特异性核酶更加有效地导向mRNA底物。
这一核酶方法可以包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码特异性识别至少一种内源mlo的mRNA的核酶的DNA序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
在转基因植物或植物细胞中增加抗大豆锈病抗性的另一备选是通过载体的核酸转移，所述载体以5’-3’方向包含：启动子序列，与其有效连接的与编码至少一种mlo或其片段的mRNA的序列互补的DNA反义序列，与其有效连接的编码核糖核酸酶P(RNAse P)的序列，以及任选地，与其有效连接的终止序列。这些载体在细胞中的转录产生RNA分子，所述RNA分子包括前导序列(反义序列)，所述前导序列将RNAse P导向mlo mRNA，然后发生通过RNAse P的mRNA降解(见美国专利5,168,053)。优选地，前导序列包含与mlo的DNA序列互补的10至15个核苷酸，一条3’-NCCA核苷酸序列，其中N优选为嘌呤。外部前导序列的转录物通过形成碱基对结合靶mRNA，这允许通过RNAse P在成对区域的5’核苷酸处进行mRNA的降解。这一被降解的mRNA不能被翻译成功能性蛋白质。
这一RNAse P方法可以包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的与编码至少一种MLO或其片段的mRNA的序列互补的DNA序列，
-与其有效连接的编码核糖核酸酶P的序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
此外，下述载体可以用于本发明的方法，所述载体以5’-3’方向包含下列序列：与编码至少一种内源MLO的5’端的序列同一或同源的DNA序列，启动子序列，与其有效连接的编码抗性基因或报道基因的DNA序列，任选地终止序列，以及与编码至少一种内源MLO的3’端的序列同一或同源的DNA序列。可以使用那些载体来通过同源重组诱导目的mlo的特异性敲除。抗性基因或报道基因的序列被插入到同源重组已经发生的那些植物细胞中，从而在该细胞中不能产生功能性mlo mRNA。通过选择抗性或报道基因鉴定其中已经发生重组的植物细胞。技术人员已知如何产生用于通过同源重组进行遗传敲除的那些载体，它们需要包含哪些元件(启动子、增强子、侧翼序列)，以及如何鉴定分别的植物细胞。通常，抗生素抗性基因用作为抗性基因(Amp、Kan等)。当然，可以使用允许选择其中已经发生了重组的细胞的所有其它可能的抗性基因。除了经典的抗性基因外，可以使用其它报道基因用于检测和/或选择其中已经发生了同源重组的植物和植物细胞，例如GUS、GFP等。
这一同源重组方法可以包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-与编码至少一种内源MLO的5’端的序列同一或同源的DNA序列，
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码抗性基因或报道基因的DNA序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
-与编码至少一种内源MLO的3’端的序列同一或同源的DNA序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
根据本发明，编码MLO或其片段的核酸序列可以是MLO的完整编码DNA序列，或完整mRNA序列，或其片段。由于用于产生转基因植物的上述方法(涉及mlo表达的显著减少)中的一些是基于内源mlo mRNA与在上述载体转录过程中产生的序列的特异性杂交(例如反义策略)，技术人员已知经转移的核酸不必需包含编码MLO的完整序列，而不问其是正义还是反义序列。事实上，编码MLO的序列的相对短的区域足以用于特异性杂交和有效沉默。
对应于mlo mRNA的序列区域并且被转录以产生双链RNA分子的载体的那些序列可以具有大约25个核苷酸，优选21、22或23个核苷酸的长度。被转移用于反义策略的序列通常包含20至1000个之间的核苷酸，优选20至800个之间的核苷酸、更优选400至800个之间的核苷酸、尤其优选500至750个之间的核苷酸。但是也可能使用包含20至500之间、20至300之间、20至150之间、20至100之间或20至50个之间的核苷酸的序列。技术人员已知对于RNAi或PTGS方法，用于产生双链RNA分子的正义和反义RNA也可以包含大约21、22或23个核苷酸，其具有特征性3’突出端(Tuschl，2002，Nat.Biotechnol.20，446-448)。
当将核酸转移到植物细胞并且细胞中那些序列的转录产生了与mlomRNA互补的序列(例如使用反义策略)时，那些经转移的序列不需要与mRNA 100％互补。如果序列至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、尤其优选至少80％、特别至少90％以及最优选至少95％互补即足以。差异可以是由于插入、缺失和/或取代，优选取代。但是技术人员已知随着互补性减少，沉默若干mlo mRNA的可能性将增加。
通常，仅那些能够与mlo mRNA的区域特异性杂交的互补序列可以用于本发明。在体内与除MLO之外的其它蛋白质的RNA区域杂交并且引起它们沉默的序列不适用于本发明。根据所选择的序列和互补性的程度，可以沉默多种MLO蛋白质或仅一些MLO蛋白质。还可能是仅一种特异性mlo的表达被抑制。互补序列的长度优选在20和1000个核苷酸之间，更优选在20和750个核苷酸之间，尤其在20和500个核苷酸之间，特别优选在20和300个核苷酸之间，以及最优选在20和150、20和75或20和50个核苷酸之间。还可能是序列仅包含大约20或25个核苷酸。
也可以使用下述序列进行上述方法中的一些，所述序列并非mlomRNA的编码区域的一部分，或者不与其互补。例如，如果那些调节序列是各个MLO的mRNA的特征，那么那些序列来自于5’或3’未翻译区就足够了。尤其是当沉默经由双链RNA构建体被诱导时或者当mRNA的翻译受到反义构建体抑制时，可以使用那些序列。因此，在本发明的上下文中，术语“mRNA”不仅包含编码区域，而且还包含在前-mRNA或在成熟mRNA中存在的并且是mlo mRNA的特征的调节区域。对于DNA序列，例如未经转录的序列、启动子序列、上游激活序列、内含子等，情况也是如此。
如果使用下述载体，其中所述载体的转录导致产生具有前导序列和RNAse P的RNA分子，那么前导序列需要充分互补以特异性识别mlomRNA。条件允许技术人员选择mlo mRNA的哪一部分被前导序列识别。优选地，前导序列包含大约20个核苷酸，但是它们应当不短于大约15个核苷酸。在具有100％互补性的前导序列时，12个核苷酸就足够了。当然，前导序列可以包含高达大约100个核苷酸，或者甚至更多，因为这将增加对于各个mRNA的特异性。
在本发明的上下文中，“正义序列”(或正义链)是对应于mlo基因编码链或其片段的那些序列。所述序列不必须与编码目的Mlo的序列100％相同。所述序列与编码MLO的序列足够相似(同源)从而它们在植物细胞中的表达导致mlo的有效和特异性的沉默(例如通过RNA干扰或共-阻抑)即可。如果那些序列至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、尤其优选至少80％、特别是至少90％以及最优选至少95％同源即足够。差异可以是由于插入、缺失、添加和/或取代。当序列具有那些程度的同一性时，它们通常被称为同源(见上)。但是技术人员已知随着同一性或同源性的减少，沉默若干mlo mRNA的可能性将增加。具有非常低的程度的相似性或同源性的序列(即也将沉默除MLO外的其它蛋白质的序列)并非是充分特异性的，因此不适合于本发明。
因此，“反义序列”(或反义链)是对应于目的MLO基因的非编码DNA链的那些序列。所述序列不必需与目的基因的非编码DNA链的序列100％相同，而是可以具有上述程度的同源性。例如，反义序列可以是至少40％或50％，优选至少55％或60％，更优选至少65％或70％，尤其优选至少75％或80％，特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的与非编码mlo链同源(或与编码链互补)。如上所述，所述反义序列能够与各自的mlo mRNA特异性杂交即足以。杂交可以在体内在细胞条件下发生，或者在体外发生。反义序列与内源mRNA序列的杂交通常在体内在细胞条件下发生。
术语“正义”和“反义”是本领域技术人员熟知的。在植物中沉默基因的领域中的技术人员从文献中已知用于沉默的核酸分子需要多长，以及它们需要与目的序列表现出何种程度的同源性或互补性。在本发明的上下文中，不能使用不与mlo编码正义序列特异性杂交(即也与其它蛋白质的编码正义序列杂交)的反义序列。
反义策略可以与核酶方法组合。核酶是有催化活性的RNA序列，其与反义序列组合，催化性切割其靶序列(Tanner等人，(1999)FEMSMicrobiol Rev.23(3)，257-75)。这可以增加反义策略的效率。
特别在植物中减少mlo表达的其它方法包含过量表达mlo核酸序列或其同源物以导致共-阻抑(Jorgensen等人，(1996)Plant Mol.Biol.31(5)，957-973)或者通过病毒表达系统(扩增子)诱导特异性RNA降解(Angell等人，(1999)Plant J.20(3)，357-362)。那些方法也被称为PTGS(见上)。
其它方法为通过将RNA/DNA寡核苷酸转移到植物中来在内源基因中引入无义突变(Zhu等人，(2000)Nat.Biotechnol.18(5)，555-558)，或者通过T-DNA诱变(Koncz等人，(1992)Plant Mol.Biol.20(5)963-976)或同源重组(Hohn等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96，8321-8323)产生敲除突变体。
此外，基因阻遏(但也有基因过量表达)也可以通过特异性DNA结合因子(例如锌指转录因子类型的因子)来进行。同样，可以将抑制靶蛋白质的因子引入细胞。蛋白质结合因子可以是例如适配体(Famulok等人，(1999)Curr Top Microbiol Immunol.243，123-36)。它们通过基于载体的过量表达来表达，并且它们的设计和选择可以由技术人员容易地实施。
上述方法的综述可以在例如Waterhouse等人，(2001)，Nature411，834-842；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol.20，446-448；Paddison等人，(2002)，Genes Dev.，16,948-958；Brummelkamp等人，(2002)，Science 296，550-553中找到。
本发明的另一方面是在转基因植物和/或植物细胞中增加抗大豆锈病抗性的方法，其中通过表达至少一种非功能性MLO或其片段来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述非功能性MLO或其片段具有至少一处点突变、缺失和/或插入。非功能性MLO蛋白质已经完全丧失或者以非常重要的程度丧失了它们与常规的生理或病原性结合伙伴蛋白相互作用的能力。所述非功能性突变体可以包含一个或多个氨基酸插入、缺失或点突变。它们可以用于产生转基因植物或植物细胞，在所述转基因植物或植物细胞中内源MLO蛋白质的含量未被改变，但是内源MLO的活性被通过所述非功能性MLO突变体的过量表达所阻断。此外，这些抗性植物具有表现出基本上正常的表型的优点。
非功能性MLO蛋白质或突变体具有与其功能性相似物基本相同的核酸和氨基酸序列。但是，它们包含一处或多处核苷酸或氨基酸的插入、缺失或点突变，这使得经突变的MLO蛋白质与其结合伙伴蛋白相互作用的能力显著减少。技术人员在手边具有一系列方法使得他能够将点突变、缺失或插入插入到编码功能性或非功能性MLO蛋白质的核酸序列中(Sambrook(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Coldspring Harbour Laboratory Press；“PCR technology：Principle和Applications for DNA Amplification”，H.Ehrlich，id，Stockton Press)。
与野生型(未经突变的)MLO蛋白质相比，那些MLO突变体与生理和/或病原性结合伙伴蛋白的减少的结合效率优选在超过1％至90％的范围内，更优选超过1％至70％，尤其优选超过1％至50％，特别优选超过1％至30％，以及最优选超过1％至10％的范围内。
尽管非功能性MLO突变体显示了一个或多个点突变、缺失和/或插入，术语“非功能性”MLO(也称为失活MLO)不包含这样的蛋白质，所述蛋白质与如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的功能性MLO蛋白质没有关键的序列同源性。
优选地，非功能性MLO的至少一处点突变、缺失和/或插入阻止了MLO的细胞功能，尤其抑制了MLO与其病原或生理性结合伙伴蛋白(尤其是与ROR2和/或钙调蛋白)的相互作用。
根据本发明在转基因植物中表达或过量表达的非功能性MLO突变体不必需是与宿主细胞内源MLO相同的MLO，还可以来自其它生物/物种。非功能性MLO突变体的重要特征是它们与内源MLO的活性竞争。当然，这两种蛋白质之间的高度序列同源性将有利于非功能性MLO的高竞争性活性。
根据本发明优选的实施方案，非功能性MLO是显性失活MLO。“显性失活方法”可以包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码至少一种内源Mlo的显性失活突变体的DNA序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
本领域的技术人员可以通过常规方法鉴定显性失活突变体。他可以例如向野生型MLO序列中引入突变，以及实施所获得的突变体与结合伙伴蛋白例如ROR2或钙调蛋白的体外结合测定。以相同的方式，技术人员可以测试MLO非功能性突变体是否与其野生型相似物在与已知结合伙伴蛋白的相互作用的方面竞争。
在本发明的范围内，“显性失活突变体”是能够抑制MLO与其病原或生理性结合伙伴蛋白如ROR2和/或钙调蛋白的相互作用的每种突变体(插入、缺失、点突变)。
可以通过下述方法产生具有增加的抗大豆锈病抗性的转基因植物或植物细胞，所述方法的特征在于通过表达至少一种重组抗体来减少至少一种内源Mlo的含量和/或活性，所述重组抗体对于至少一种内源Mlo来说是特异性的，并且其阻止Mlo的细胞功能，并且尤其抑制Mlo与其病原或生理性结合伙伴蛋白，尤其是与Ror2和/或钙调蛋白的相互作用。
技术人员从文献中已知如何产生、分离和鉴定那些抗体，所述抗体例如对于某一MLO结构域来说是特异性的。根据本发明，术语“重组抗体”包含抗体的全部不同的形式和类型，例如在Skerra A.(Curr OpinImmunol.1993 4月；5(2)：256-62)中所描述的。实例是Fab片段、Fv片段、scFv抗体、scFv同型二聚体、VH链等。Conrad U.和Fiedler U.提供了综述(Plant Mol Biol.1998 9月；38(1-2)：101-9)。用于产生单克隆、多克隆或重组抗体的标准方案可以在下列中找到：“Guide to Protein Purification”，Meth.Enzymol.182，第663-679页(1990)，M.P.Deutscher，编辑。抗体的表达也描述在Fiedler等人，(1997)Immunotechnology 3,205-216和Maynard和Georgiou(2000)Annu.Rev.Biomed.Eng.2,339-76中。
本发明中优选的是scFv抗体，其由轻链的可变区和重链的可变区组成，通过柔性接头肽彼此融合(见，例如Breitling等人(1999)RecombinantAntibodies，John Wiley & Sons，New York)。ScFv抗体与“正常”抗体具有相同的抗原特异性和活性，但是不需要从单链装配。
通常，重组抗体的产生用表达单克隆抗体的杂交瘤细胞系起始。分离编码轻链和重链的cDNA，并且在下一步中，轻链和重链的可变区的编码区域被融合为一个分子。获得重组抗体的另一方法是基于重组抗体文库(被称为噬菌体展示文库)的筛选(见Hoogenboom等人(2000)ImmunologyToday 21,371-378；Winter等人(1994)Annu.Rev.Immunol.12,433-455；De Wildt等人(2000)Nat.Biotechnol.18,989-994)。这一方法允许富集、选择和分离所需的抗MLO蛋白质的抗体。
表达抗-MLO抗体的一种方法可以包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码重组抗体的DNA序列，所述重组抗体对于至少一种内源Mlo来说是特异性的并且其阻止Mlo的细胞功能，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
也可以通过下述方法产生具有增加的抗大豆锈病抗性的转基因植物或植物细胞，所述方法的特征在于通过表达至少一种MLO抑制剂来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述MLO抑制剂阻止了至少一种MLO的细胞功能，并且其尤其抑制了MLO与其病原或生理性结合伙伴蛋白(尤其是与ROR2和/或钙调蛋白)的相互作用。这些抑制剂可以是例如这样的肽，所述肽在用于与生理性结合成分或因子相互作用的MLO蛋白质的各个结合袋中结合。这一方法类似于抗体策略，因为在植物中表达或过量表达的MLO蛋白质的抑制剂将通过与MLO结合而阻断MLO的活性(例如空间的)。表达MLO抑制剂的一种方法可以包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码MLO抑制剂的DNA序列，所述MLO抑制剂阻止了MLO的细胞功能，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
除了核酸分子的转移外，还有其它方法可以用于在转基因植物或植物细胞中增加抗大豆锈病的抗性，所述植物或植物细胞具有至少一种内源MLO的减少的含量和/或活性。例如，MLO含量和/或活性可以通过诱变减少，优选通过化学诱变或者辐射诱导诱变。诱变可以例如是通过乙基甲磺酸(EMS)、γ照射和/或快中子照射来实施的。
经诱导的突变也可以通过其它化学物来引起，所述化学物例如亚硝基胍(NTG)，碱基类似物(例如BrdU)，简单的化学物(例如酸)、烷化剂(例如N-乙基-N-亚硝基脲，ENU)，甲基化剂(EMS)，多环烃类(例如苯丙芘)，DNA嵌入剂(例如溴化乙锭)，DNA交联剂(例如铂)，氧自由基，或者通过UV照射(非电离)或电离辐射。烷化剂可以突变复制的和非复制的DNA。相反，碱基类似物仅在该类似物被掺入复制DNA中时突变DNA。每种这些类型的化学诱变剂具有某些效果，其然后导致转换、颠换或缺失。UV照射将电子激发到更高的能量水平。DNA吸收一种形式，紫外光。在DNA中的两种核苷酸碱基——胞嘧啶和胸腺嘧啶是最易受到激发的，所述激发能够改变碱基配对性质。UV光可以诱导DNA链中邻近的胸腺嘧啶碱基彼此配对，例如大量的二聚体。
发明人发现大麦中的mlo敲除赋予了增加的抗大豆锈病抗性。但是，可以理解通过MLO也发生了正的抗性效果。这意味着MLO过量表达(MLO来自例如大麦或拟南芥)也可以导致增加的抗性，尤其是大豆的增加的抗性。存在这样的蛋白质实例，其在非宿主相互作用(如在存在的情形中：大麦-大豆锈菌)中赋予抗性，而在宿主相互作用的情形中(大豆-大豆锈菌)，这些蛋白质赋予易感性。例如，在易感性相互作用中，大多数真菌Avr蛋白质是致病性因子，而在宿主抗性植物中，Avr蛋白质为植物R-蛋白质所识别。这意味着Avr蛋白质在抗性和相容的相互作用中具有不同的“功能”。
因此，MLO过量表达也可以在大豆中赋予抗性。因此，本发明的另一方面涉及在转基因植物和/或植物细胞中增加抗大豆锈病抗性的方法，其特征在于与野生型相比，至少一种MLO的含量和/或活性被增加。
增加优选是至少10％或20％，也优选至少30％或40％，更优选至少50％或60％，还更优选至少70％或80％，尤其优选至少90％、95％或100％，特别优选至少2倍或5倍，还特别优选至少10倍或50倍，以及最优选至少100或1000倍。
在本发明优选的实施方案中，与野生型相比至少一种MLO含量和/或活性的增加是通过向植物或植物细胞转移至少一种核酸分子来实施的，所述核酸分子编码至少一种MLO和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物。
原则上，核酸分子可以编码来自任何生物的任何已知的MLO(以及其功能等价的片段和/或衍生物)。在mlo序列是真核细胞的基因组来源的并且包含内含子的情形中，以及在宿主植物或植物细胞不能剪接那些内含子或者不能被赋予剪接那些内含子的能力的情形中，优选使用相应的cDNA序列。
术语“功能等价的片段”和“功能等价的衍生物”的下列定义涉及与野生型相比，增加至少一种MLO含量和/或活性的方法。因此，片段和突变体必需是功能性的，这与减少至少一种MLO含量和/或活性的方法(其中MLO片段或突变体也可以是非功能性的)相反。
在本发明的上下文中，编码MLO的“功能等价的片段”的核酸分子是这样的核酸分子的片段或部分，所述核酸编码具有例如如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的氨基酸序列的MLO蛋白质。由这一核酸编码的MLO片段与任何下述MLO蛋白质具有相同的细胞功能、相同的结合性质和/或相同的结构性质(见上“功能等价”的定义)，所述MLO蛋白质具有如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的氨基酸序列。通常，该片段缺乏N-末端和/或C-末端的氨基酸。
优选地，片段具有“完整”MLO蛋白质的至少40％或50％，优选至少55％或60％，更优选至少65％或70％，尤其优选至少75％或80％、特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的长度。
在本发明的上下文中，编码MLO蛋白质的“功能等价的衍生物”的核酸分子是下述核酸的衍生物或“同源物”或“突变体”，所述核酸编码MLO蛋白质，其中所述MLO蛋白质具有例如如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的氨基酸序列。由这一核酸编码的MLO衍生物具有与下述任意MLO蛋白质相同的细胞功能、相同的结合性质和/或相同的结构性质，所述MLO蛋白质具有如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48所示的氨基酸序列。通常，衍生物具有一处或多处氨基酸改变、插入或缺失，其不导致改变的细胞功能、结合性质和/或结构性质。
优选地，衍生物与“完整”MLO蛋白质具有至少40％或50％，优选至少55％或60％，更优选至少65％或70％，尤其优选至少75％或80％、特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似。
在本发明优选的实施方案中，编码至少一种MLO蛋白质和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物的核酸序列被转移到植物或植物细胞中。该转移导致与野生型相比MLO的表达或活性的增加，以及因此导致转基因细胞中抗大豆锈病抗性的增加。本领域技术人员熟知包含这些核酸序列以及启动子和任选地终止序列的载体的应用。此类方法通常包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码至少一种MLO和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物的DNA序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
技术人员已知如何将来自步骤a)的载体转移到植物细胞中以及载体需要哪些特征来被整合到植物基因组中。如果转基因植物或植物细胞中MLO的含量通过转移编码来自不同生物的Mlo的核酸分子而被增加，那么优选的将氨基酸序列根据遗传密码再翻译成这样的核酸序列，所述核酸序列主要包含由于宿主生物的“密码子选择”而被其优选使用的密码子。密码子选择可以通过基于计算机的对已知的来自各个宿主生物的其它基因的分析来确定。
至少一种内源Mlo的含量和/或活性的增加也可以通过影响内源Mlo的转录、翻译和/或翻译后修饰来实施。这意味着例如增加内源Mlo的基因表达或者关闭转录、翻译或蛋白质(例如翻译后修饰)水平上的抑制型调节机制。
根据本发明，基因表达的增加可以例如通过影响内源Mlo基因的启动子序列来实现。此类修饰优选导致内源Mlo表达的增强，可以通过缺失或插入DNA序列来实现。启动子序列的修饰通常导致表达的Mlo的量的改变，以及因此导致MLO活性的改变，所述活性可以在植物细胞中被确定。
此外，当在经转化的细胞或植物中不存在的调节蛋白质与内源Mlo基因的启动子相互作用时，实现了至少一种内源Mlo基因的被改变或被增加的表达。此类调节子可以是嵌合蛋白质，其包含DNA结合结构域和转录激活域，例如WO 96/06166所述。
增加内源Mlo的含量和/或活性的另一种可能性是基于转录因子的上调，所述转录因子参与内源Mlo基因的转录，所述上调例如是通过过量表达所述转录因子。上调转录因子的方法是技术人员已知的。
内源MLO的增加也可以在影响Mlo的转录后修饰时实现。例如，可以通过例如过量表达或“基因沉默”的方法来调节参与该过程的酶例如激酶或磷酸酶的活性。
最后，可以通过表达与Mlo的启动子序列特异性结合的适配体来调节内源Mlo的表达。根据适配体结合来刺激还是阻遏启动子区域，增加内源Mlo的含量以及因此也增加其活性。
在本发明优选的实施方案中，被转移到植物或植物细胞中的载体除了启动子序列和任选的终止序列外，还包含其它的调节和/或功能序列。更优选地，那些调节和/或功能序列是允许载体在细菌中增殖，和/或允许在植物细胞中瞬时和/或持久复制，和/或选自增强子、复制信号和选择标记的序列。
根据本发明的载体还可以包括其它例如增强子元件作为调节元件。此外，它们可以包含抗性基因、复制信号和其它允许载体在细菌例如大肠杆菌(E.coli)中增殖的DNA区域。调节元件还可以包括在宿主细胞中引起载体稳定的序列。特别地，这些调节元件包括允许载体稳定整合到植物宿主基因组或者允许载体在植物细胞中自主复制的序列。本领域的技术人员熟知这一类型的调节元件。
所谓的终止序列意思是这样的序列，其确保适当终止转录或翻译。如果转移的核酸是要被翻译，那么它们通常是终止密码子和相应的调节序列；如果转移的核酸仅是要被转录，那么它们通常是聚-A序列。
优选地，载体选自质粒、黏粒、(重组)病毒以及其它基因技术领域已知的现有载体，使用所述载体可以将核酸分子转移到植物或植物细胞中。术语“载体”还包含所谓的微型染色体，其是线性或环状DNA片段，所述片段除了转基因外还包含各个植物的着丝粒序列。微型染色体在核中是稳定的并且在细胞分裂过程中被传递到子细胞中。它们是通过转化的标准方法被转移的。更优选地，载体选自pBR322、pUC载体、M13mp载体或来源于农杆菌的Ti质粒或Ri质粒的载体。
为了准备将外来基因引入高等植物或其细胞，大量的克隆载体是可用的，所述载体包含用于大肠杆菌的复制信号和用于选择转化的细菌细胞的标记基因。此类载体的实例是pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。可以在适当的限制性位点将所需序列引入载体。获得的质粒用于转化大肠杆菌细胞。将经转化的大肠杆菌细胞培养在适当的培养基上，并且最终收获和裂解。回收质粒。作为表征获得的质粒DNA的分析方法，通常使用的方法例如限制性分析、凝胶电泳和其它生物化学/分子生物学方法。在每个操作后，切割质粒DNA，并且将获得的DNA片段与其它DNA序列组合。可以将每种质粒DNA序列克隆到相同或另外的质粒中。标准克隆方法见Sambrook等人，2001(Molecular cloning：A laboratory manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)
待转移的核酸序列优选受到在植物中有功能的启动子的控制。在本发明优选的实施方案中，启动子序列选自组成型启动子，优选35S启动子、肌动蛋白启动子或泛素启动子；组织特异性启动子，优选磷酸烯醇丙酮酸启动子或果糖-1，6-二磷酸酶启动子、叶特异性启动子、表皮特异性启动子、发育特异性启动子、光特异性启动子、损伤特异性启动子或病原体诱导的启动子，尤其是真菌诱导的启动子。
启动子可以是组成型的、可诱导的、组织或发育特异性的启动子。此外，它们还可以是病原体特异性启动子。这样，例如可以产生转基因植物，所述转基因植物在正常环境下，表达MLO蛋白质，但是如果受到病原体攻击，将由首先受到影响的细胞中的病原体特异性启动子沉默MLO蛋白质的基因。
通常，组成型35S启动子用作为载体的启动子。此外，当然可以使用其它启动子，所述启动子获得自不同的来源(例如植物或植物病毒或真菌)并且适合于在植物中表达基因。启动子和其它调节序列的选择决定了局部和时间表达图式，以及还有转基因植物中MLO蛋白质的沉默。
除了其它组成型启动子例如肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell，2：163)和泛素启动子(Binet等人，1991，Plant Science，79：87)外，也可以考虑决定叶特异性表达的，来自玉米的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的组织特异性启动子(Hudspeth等人，1989，Plant Mol.Biol.，12：579)或者来自马铃薯的果糖1，6-二磷酸酶的组织特异性启动子(WO 98/18940)。也可以使用损伤诱导的、光诱导的或病原体诱导的(尤其是真菌诱导的)启动子、叶特异性、表皮特异性和发育依赖性启动子或控制序列(Xu等人，1993，Plant Mol.Biol.22：573；Logemann等人，1989，Plant Cell，1：151；Stockhaus等人，1989，Plant Cell，1：805；Puente等人，1996，EMBO J.，15：3732；Gough等人，1995，Mol.Gen.Genet.，247：323)。可用的控制序列的概括也可以在Zuo等人，2000，Curr.Opin.Biotech.，11：146中找到。
适当的启动子也可以包括确保仅在光合有效组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7943-7947；Stockhaus等人(1989)EMBO J.8：2445-2451)。也可以使用这样的启动子，其在植物转化、植物再生或这些过程的特定阶段有活性，例如细胞分裂-特异性启动子如Histon H3启动子(Kapros等人(1993)In VitroCell Cev.Biol.Plant 29：27-32)或者可化学诱导的Tet-阻遏物系统(Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237)。其它适当的启动子可以从文献例如Ward(1993，Plant Mol.Biol.22：361-366)中获得。对于可诱导和细胞或组织特异性启动子，情况也是如此，所述启动子例如分生组织特异性启动子，所述启动子已经在文献中描述并且在本发明的构架中合适。
其它可诱导启动子包括病原体诱导型启动子例如ACMV病毒粒体正义启动子(Hong等人，1996，Virology，220：119-227)，其是由基因产物AC2所诱导的。真菌诱导型启动子也尤其适用于本发明。此外，在病原体侵染的组织中被诱导的此类蛋白质(例如苯丙氨酸铵裂合酶、查耳酮合酶、富羟脯氨酸糖蛋白、伸展蛋白、致病相关蛋白(例如PR-1a)和创伤可诱导的蛋白酶抑制剂(US 6,013,864))的所有启动子也是适合的。此外，叶特异性启动子例如来自光合组织的启动子(例如CAP启动子、RBCS启动子、GAPA启动子、GAPB启动子、ST-LS1启动子等)尤其适用于本发明。
此外，本领域的普通技术人员能够通过常规方法分离另外的适当的启动子。本领域的技术人员借助于所建立的分子生物学方法(例如杂交实验或DNA-蛋白质结合研究)可以由此鉴定叶特异性调节核酸元件。这样做，例如在第一步中，将整个的聚(A)+-RNA从所需生物的叶组织中分离出来(其中从所述生物中分离出调节序列)，并且产生cDNA文库。在第二步中，借助于基于来自非叶组织的聚(A)+-RNA分子的cDNA克隆，通过杂交从第一文库中鉴定出这样的克隆，其相应的聚(A)+-RNA分子仅在叶组织中聚集。最终，借助于以这种方式鉴定的这些cDNA，分离了用叶特异性调节元件装备的启动子。本领域技术人员可用基于PCR的其它方法来分离适当的叶特异性启动子。
另一实施方案使用来自马铃薯的I类patatin基因B33的启动子。其它有利的启动子是在果实中特别有活性的那些。这些包括例如多聚半乳糖醛酸酶基因的启动子(例如来自番茄，其介导番茄果实成熟过程中的表达)(Nicholass等人，(1995)Plant Mol.Biol.28：423-435，本领域描述了启动子/GUS融合构建体的分析)；ACC氧化酶的启动子(例如来自苹果，其介导了转基因马铃薯的成熟和果实特异性)(Atkinson等人(1998)Plant Mol.Biol.38：449-460；本领域也公开了启动子/GUS表达分析)，或者来自番茄的2A11启动子(van Haaren等人(1991)Plant Mol.Biol.17：615-630，也描述了启动子/GUS融合)
同样在果实特异性启动子的情形中，本领域的技术人员可以采用来自文献的其它适当的启动子，或者类似于如上所述的叶特异性启动子，通过常规方法分离它们。
本领域的技术人员已知诱导型启动子的使用允许产生这样的植物和植物细胞，其仅瞬时表达以及因此仅瞬时沉默根据本发明的序列。此类瞬时表达允许产生仅表现出瞬时病原体抗性的植物。例如如果有病原体污染的风险并且该植物因此需要仅在特定长度的时间内对病原体有抗性，那么则需要此类瞬时抗性。本领域技术人员已知需要瞬时抗性的其它情况。本领域技术人员还已知通过使用在植物细胞中不稳定复制并且携带用于沉默MLO蛋白质的分别的序列的载体，其可以实现瞬时表达以及因此也实现瞬时沉默和瞬时抗性。
对于将DNA引入植物宿主细胞，有许多已知的技术可用，借此本领域的技术人员可以毫无问题地确定在每种情形中适当的方法。这些技术包括通过使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA进行的植物细胞的转化、原生质体的融合、经分离的DNA直接基因转移进原生质体、DNA的电穿孔、通过生物射弹方法引入DNA，以及其它可能。这样做，可以产生稳定和瞬时的转化体。
关于DNA向植物细胞中的注射和电穿孔，实质上对于所用的质粒没有特定的要求。对于直接的基因转移，情况亦是如此。可以使用简单的质粒例如pUC衍生物。但是，如果要从此类经转化的细胞中再生出完整的植物，则需要存在可选择的标记基因。本领域的技术人员熟知现有的选择标记，他将毫无问题地选择适当的标记。标准选择标记是介导经转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素(卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、氨甲蝶呤、草甘膦、链霉素、磺酰脲、庆大霉素或膦丝菌素等)有抗性的那些。
根据将所需基因引入植物细胞的方法，需要其它DNA序列。例如，如果Ti或Ri质粒用于转化植物细胞，则至少包含在Ti或Ti质粒中的T-DNA的右侧翼区域(但是通常T-DNA的右和左侧翼区域)必需作为侧翼区域与待引入的基因相连。
如果农杆菌用于转化，则必需将待引入的DNA克隆到特定的质粒中(中间载体或二元载体中)。基于与T-DNA中的序列同源的序列，可以通过同源重组将中间载体整合进农杆菌的Ti或Ri质粒中。这一质粒还包含用于转移T-DNA所需的vir区域。中间载体不能在农杆菌中复制。通过辅助质粒，可以将中间载体转移到根癌农杆菌中(缀合)。可以在大肠杆菌以及农杆菌中复制二元载体。它们包含由右和左T-DNA边界区域加框的选择标记基因和接头或多聚接头。它们可以被直接转化到农杆菌中(Holsters等人(1978)，Molecular and General Genetics 163，181-187)。作用为宿主细胞的农杆菌应当包含携带vir区域的质粒。Vir区域对于将T-DNA转移到植物细胞中是必需的。也可以存在T-DNA。这一类型的经转化的农杆菌被用于转化植物细胞。
已经深入研究并且在EP 120 515中充分描述了T-DNA用于转化植物细胞的用途。
为了将DNA转移到植物细胞中，可以特别为此目的栽培具有根癌农杆菌或发根农杆菌的植物外植体。从经感染的植物材料(例如、叶片、茎细裂片(segment)、根、但是还有原生质体或悬浮培养的植物细胞)中，可以在适当的培养基中再生完整植物，所述培养基可以包含用于选择经转化的细胞的抗生素或杀生物剂。根据标准再生方法，使用常规的营养液发生植物的再生。可以就被引入的DNA的存在检查以这种方式获得的植物和植物细胞。
本领域的技术人员熟知其它可能性，用于使用生物射弹方法或通过原生质体转化引入外来DNA(见L.Willmitzer(1993)Transgenic Plants在：Biotechnology，A Multi-Volume Comprehensive Treatise中(出版商：H.J.Rehm等人)，第2卷，627-659，VCH Weinheim，德国)。
尽管借助于根癌农杆菌通过Ti质粒载体系统转化双子叶植物或其细胞已经良好建立，新的工作表明这样的事实，即单子叶植物或其细胞也非常容易用基于农杆菌的载体转化(见，例如Chan等人(1993)，Plant Mol.Biol.22，491-506)。
用于转化单子叶植物或其细胞的备选系统是通过生物射弹方法转化(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.104，37-48；Vasil等人(1993)Bio/Technology 11，1553-1558；Ritala等人(1994)Plant Mol.Bio.24，317-325；Spencer等人(1990)，Theor.Appl.Genet.79,625-631)、原生质体转化、部分可透化细胞的电穿孔、以及通过玻璃样组织(glass tissue)引入DNA。
经转化的细胞在植物中以正常方式生长(也见McCormick等人(1986)，Plant Cell Reports 5，81-84)。可以以正常方式培养获得的植物，并将其与具有相同的转化的遗传素质(disposition)或其他遗传素质的植物杂交。获得的杂种个体具有各自的表型性质。
可以培养两代或多代以确保表型特征保持稳定并且被遗传。应当收获种子并且确保保留各自的表型或其它特征。
类似地，通过使用标准方法，可以确定对于新的核酸分子纯合的转基因品系，并且研究了它们在存在的或不存在的病原体应答性方面的表型特征，以及将所述表型特征与来自半合子品系的那些进行了比较。
当然，可以另外培养包含根据本发明的核酸分子的植物细胞以及植物细胞(包括原生质体、愈伤组织、悬浮培养物等)。
可以以多种方式将上述载体转移到植物细胞中。载体是线性还是环状形式取决于想要的应用。本领域的技术人员已知他可以使用各自的线性化的载体还是不可以，以及何时使用各个线性化载体。例如，本领域的技术人员已知为了通过同源重组产生MLO蛋白质的基因的特异性敲除，线性化相应的载体并且将它们注射到植物或植物细胞中就足够了。
此外，本发明还涉及转基因植物或植物细胞，其具有增加的抗大豆锈病的抗性，特征在于与野生型植物或植物细胞相比，分别改变了至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性。这一植物可以例如通过上述任一方法产生。“转基因植物”和转基因植物细胞可以表示任何单子叶或双子叶植物或植物细胞，优选农业植物或来自农业植物的细胞。本发明还涉及该植物的转基因部分例如叶和花，转基因繁殖材料例如原生质体、愈伤组织、果实、种子、块茎、根状茎、胚原基、花粉、插条，以及植物的转基因后代。
根据一个优选的实施方案，与野生型植物或植物细胞相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性减少。根据另一优选的实施方案，与野生型植物或植物细胞相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性增加。
本发明的另一主题涉及植物细胞和植物，在所述植物细胞和植物中，MLO蛋白质的内源基因具有突变，即取代、插入和/或缺失，所述突变导致这样的事实，即表达的内源MLO蛋白质不再能够，或者仅在某些环境下能够，与其内源细胞或病原性结合伙伴蛋白相互作用。包含显示出突变的MLO蛋白质的这些内源基因拷贝的植物或植物细胞可以由增加的瞬时或持久的抗大豆锈病的抗性来区分开。此类植物和植物细胞，不同于上述指出的植物和植物细胞，是非转基因的，可以通过常规诱变来产生。
内源植物MLO蛋白质的表达的调节可以例如意思是，通过在MLO蛋白质基因的调节DNA元件(例如启动子、增强子或通常所称的“上游激活序列”)中的突变，下调内源MLO蛋白质的表达。
在本发明的构架中，MLO蛋白质的结合特征的调节意思是上述指定的突变类型导致内源MLO蛋白质与其内源细胞或病原性结合伙伴蛋白的结合特征的改变。MLO蛋白质的表达和结合特征的调节的组合也有可能。
例如，植物或植物细胞可以在MLO蛋白质的基因序列中具有突变，所述突变导致这些蛋白质表达的减少。其它植物或植物细胞具有导致上述显性失活突变体的突变。在两种情形中，获得了具有增加的抗大豆锈病抗性的植物。
本领域的技术人员已知例如也可以通过诱变产生植物和植物细胞，所述植物和植物细胞由于在植物MLO蛋白质基因的增强子和/或启动子序列中的突变，显示出这些蛋白质表达的减少，并且同时显示出编码MLO蛋白质的基因的编码区中的突变，所述突变引起这样的事实，即剩下的表达的MLO蛋白质将不再，或者仅以有限的程度，与真菌和/或其它细胞结合伙伴蛋白相互作用。另一方面，在增强子和/或启动子序列以及在编码序列中的各个突变可以具有这样的效果，即如上所述的植物MLO蛋白质的显性失活突变体过量表达，从而发生了上述竞争性反应，所述显性失活突变体不再能够，或者仅以非常有限的程度来与真菌和/或正常细胞相互作用伙伴蛋白相互作用。
优选地，通过所谓的“TILLING”方法(Targeting Induced Local Lesionin Genomes)产生根据本发明的非转基因植物和植物细胞，其是通过内源MLO蛋白质的表达和/或结合特征的调节来区别的，并且具有持久或瞬时的抗大豆锈病的抗性。这一方法已经详细描述在Colbert等人(2001，PlantPhysiology，126,480-484)、McCallum等人(2000，Nat.Biotechnol.，18，455-457)和McCallum等人(2000，Plant Physiology，123,439-442)中。上述指明的参考文献作为“TILLING”方法的明确公开内容被引入本文。
TILLING方法是所谓的反求遗传学策略，其将在诱变的植物标本收藏中产生高频率点突变(例如通过用乙基甲磺酸(EMS)的化学诱变)与靶序列中突变的快速系统辨别组合起来。首先，通过PCR，在诱变的M2群体的DNA库中扩增靶序列。异等位PCR产物的变性和退火反应允许形成异源双链体，其中一条DNA链来源于突变的并且另一条来源于“野生型”PCR产物。然后在点突变的位点发生所谓的错配，这可以通过变性HPLC(DHPLC，McCallum等人，2000，Plant Physiol.，123,439-442)或用CelI错配检测系统(Oleykowsky等人，1998，Nucl.Acids Res.26，4597-4602)来鉴定。CelI是内切核酸酶，其识别异源双链体DNA中的错配并且特异性地在这些位点处切割DNA。然后可以将切割产物分离并且通过自动测序凝胶电泳来检测(Colbert等人，2001，见上)。在库中鉴定了靶基因特异性突变后，于是分析了单个的DNA样品，以分离具有突变的植物。这样，可以在通过使用靶向MLO蛋白质的引物序列产生诱变的植物群体后，用根据本发明的植物和植物细胞鉴定诱变的植物细胞或植物。TILLING方法通常适用于全部植物，并且因此上述指明的栽培的和农业植物适合于根据本发明的方法。
因此，本发明还涉及大豆锈病抗性植物或植物细胞，其特征在于其是通过TILLING方法产生的并且其在至少一种编码MLO蛋白质的基因的编码和/或调节序列中包含突变，所述突变使得与野生型植物或植物细胞相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性改变。
本发明还涉及至少一种核酸分子用于在转基因植物和/或植物细胞中增加抗大豆锈病的抗性的用途，所述核酸分子包含：
a)至少一种与编码内源Mlo或其片段的序列同一、同源或互补的序列，
b)至少一种编码非功能性Mlo或其片段的序列，所述非功能性Mlo或其片段具有至少一种点突变、缺失和/或插入，
c)至少一种编码重组抗体的序列，所述重组抗体对于内源Mlo是特异性的并且其阻止Mlo的细胞功能，
d)至少一种编码Mlo抑制剂的序列，所述Mlo抑制剂阻止Mlo的细胞功能，和/或
e)至少一种编码Mlo和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物的序列。
本发明还涉及表达载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列：
a)在植物中有功能性活性的启动子序列，
b)与其有效连接的下述序列
-所述序列与编码内源Mlo或其片段的序列同一、同源或互补，
-所述序列编码非功能性Mlo或其片段，所述非功能性Mlo或其片段具有至少一种点突变、缺失和/或插入，
-所述序列编码重组抗体，所述重组抗体对于内源Mlo是特异性的并且其阻止Mlo的细胞功能，
-所述序列编码Mlo抑制剂，所述Mlo抑制剂阻止Mlo的细胞功能，和/或
-所述序列编码Mlo和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物，
c)任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列。
最后，本发明还涉及分离的核酸分子，其包含至少一种核酸序列，所述核酸序列选自：
a)根据SEQ ID NO：3、5、6、8或10的核苷酸序列或其片段，
b)编码具有根据SEQ ID NO：4、7、9或11任一项的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其片段，
c)与a)或b)的任一核苷酸序列基本同源的核苷酸序列，
d)在严格条件下与a)、b)或c)的任一核苷酸序列杂交的核苷酸序列，
其中所述核酸序列编码MLO蛋白质。
本领域的技术人员已知这样的事实，即条目a)的术语“核苷酸序列”优选是指SEQ ID NO：3、5、6、8或10的编码部分，即编码MLO蛋白质的部分，而不是通常位于编码区上游和下游的调节部分。但是，SEQ IDNO：3、5、6、8或10的5’和3’未翻译区也可以包括在核酸分子中。
“分离的核酸分子”意思是与存在于核酸的天然来源的其它核酸分子分开的分子。优选地，经分离的核酸分子不包含这样的序列，所述序列天然位于该分子所来源的生物的基因组DNA的侧翼。在一些实施方案中，经分离的核酸分子可以包括例如少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列，所述核酸序列天然位于该分子所来源的细胞的基因组DNA的侧翼。
“MLO蛋白质”具有生物学活性，植物或植物细胞中其含量和/或活性的改变导致植物或植物细胞抗大豆锈病的增加的抗性。生物学活性(或“细胞功能”)尤其意思是MLO蛋白质与其病原或生理性结合伙伴蛋白的相互作用，即优选其与钙调蛋白和/或ROR2的相互作用。因此，作为上述经分离的核酸分子的部分的核苷酸序列的“片段”限于编码具有这一生物学活性的MLO蛋白质的那些片段。通常，所述片段缺乏5’端或3’端的核苷酸。优选地，片段具有至少40％或50％，优选至少55％或60％，更优选至少65％或70％，尤其优选至少75％或80％、特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的“完整”MLO编码序列的长度。
与另一核苷酸序列“基本同源”的核苷酸序列在本发明的范围内意思是该序列与另一序列或片段有至少40％或50％，优选至少55％或60％，更优选至少65％或70％，尤其优选至少75％或80％、特别优选至少85％或90％，以及最优选至少92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似。优选地，这一同源性是在核苷酸序列的完整序列长度上确定的。
当然，“基本同源”或者可以“在严格条件下杂交”的核苷酸序列(见条目c)和d))也需要编码根据本发明的功能性MLO蛋白质，即，具有上述生物学活性的MLO蛋白质。
实施例
在本发明中使用大麦mlo突变mlo5。Mlo5是完全的无效突变体，是通过将Met-1(ATG)改变为Ile来得到的。野生型MLO蛋白质的序列描述在SEQ ID NO：2中。
使用大麦栽培种“Ingrid”野生型和mlo5突变体。通过BASF AG的APR/HS部门(Agrarzentrum，Limburgerhof)提供种子。在气候暴露测试箱中在受控的条件下(即22℃的温度和12小时的昼/夜节律)进行培育7天。在播种后7天用豆薯层锈菌接种植物。
大豆锈菌是来自巴西的野生分离群。
为了获得用于接种的适当的孢子材料，在接种前2-3天取15-20天以前被大豆锈菌感染的大豆叶，并将其转入琼脂平板中(H2O中1％琼脂)。将叶放置在琼脂上(上侧向上(with their upper side))，这使得真菌能够通过生长通过组织并且产生非常年轻的孢子。对于接种溶液，将孢子从叶上敲除并且添加到Tween-H2O溶液中。在光学显微镜下通过托马计数室进行孢子的计数。为了接种植物，将孢子悬浮液添加到空气压缩的可操作喷雾瓶中并且均匀应用到植物或叶上，直到叶表面被良好润湿。为进行显微镜术，使用10×105个孢子/ml的密度。将接种的植物在温室中放置24小时，所述温室为平均22℃且>90％的空气湿度。将接种的叶在相同条件下在封闭的培养皿中在0.5％植物琼脂上孵育。在平均25℃和70％空气湿度的室中进行下列培养。
为了评估病原体发育，将大麦“Ingrid”野生型和大麦“Ingrid”mlo5的接种的叶用苯胺蓝染色。同样的方案也用于大豆。
苯胺蓝染色用于检测荧光物质。在宿主相互作用和非宿主相互作用的防御反应中，物质例如酚、愈创葡聚糖、或木素聚集或者产生，并且在细胞壁被局部掺入乳突中或者掺入在整个细胞中(过敏反应，HR)。形成与苯胺蓝联合的复合物，这例如在愈创葡萄糖的情形中，导致黄色荧光。将叶材料转移到包含脱色液II(乙醇/乙酸6/1)的falcon管或平皿中，并且在水浴中在90℃温育10-15分钟。然后将脱色液II立即移除，用水将叶子洗涤2次。为了染色，将叶子在染色液II(0.05％苯胺蓝＝甲基蓝、0.067M磷酸氢二钾)中温育1.5-2小时，并且在之后立即通过显微术对其加以分析。
通过显微术评估(计数)了不同的相互作用类型。使用Olympus UV显微镜BX61(入射光)和UV Longpath滤器(激发：375/15，电子(射)束分裂器：405LP)。在苯胺蓝染色后，孢子在UV光下显现出蓝色。通过绿/黄染色，可以在真菌附着器下识别乳突。过敏反应(HR)的特征在于整个细胞荧光。
结果显示在表3和图1中。
可以区别出抗真菌生长的植物抗性的两个主要阶段。1.在附着器下细胞壁内侧上作为机械屏障的乳突的形成防止了细胞感染和真菌的进一步生长。2.受感染的细胞死亡(被称作过敏反应(HR))是抗真菌抗性的另一种方式。
图1显示了与野生型相比，在大麦“Ingrid”mlo5中乳突形成率的显著增加。
表3：用大豆锈菌感染的大麦品系
乳突形成百分比的标准误差在wt大麦中是0.02592647，在mlo5大麦中是0.04322237。T检验的值是0.001735842。
附图描述：
图1：在用大豆锈菌感染后大麦“Ingrid”野生型和大麦“Ingrid”mlo5突变体的乳突形成率(％)。
图2a GmMlo1-大豆(全长)核酸序列(SEQ ID NO：3)
GmMlol-大豆(全长)氨基酸序列(SEQ ID NO：4)
图2b GmMlo2(基因组)-大豆部分核酸序列(SEQ ID NO：5)
GmMlo2(EST)-大豆部分核酸序列(SEQ ID NO：6)
GmMlo2(EST)-大豆部分氨基酸序列(SEQ ID NO：7)
图2c GmMlo3.1-大豆(全长)核酸序列(SEQ ID NO：8)
GmMlo3.1-大豆(全长)氨基酸序列(SEQ ID NO：9)
图2d GmMlo3.2(EST)-大豆核酸序列(SEQ ID NO：10)
GmMlo3.2-大豆理论氨基酸序列(SEQ ID NO：11)
序列表
<110>巴斯福植物科学有限公司(BASF Plant Science GmbH)
<120>在转基因植物中增加抗大豆锈病抗性的方法
<130>B8373/RN
<150>EP 06 118 753.0
<151>2006-08-10
<160>48
<170>PatentIn版本3.3
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<213>大麦(Hordeum vulgare)
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<213>大麦
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<213>大豆(G1ycine max)
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<213>大豆
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<213>亚麻(Linum usitatissimum)
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<213>普通小麦(Triticum aestivum)
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<213>鼠耳芥(Arabidopsis tha1iana)
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<213>鼠耳芥
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Claims (53)
1.在转基因植物和/或植物细胞中增加抗大豆锈病抗性的方法，其特征在于与野生型植物或植物细胞相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性分别被改变。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于与野生型相比，至少一种内源MLO的含量和/或活性减少。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于通过向植物细胞转移至少一种核酸分子来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述核酸分子包含至少一种序列，所述序列与编码内源MLO或其片段的序列同一、同源或互补。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于与编码内源MLO或其片段的序列同一、同源或互补的经转移的核酸分子的部分包含20至1000个核苷酸，优选20至750个核苷酸、更优选20至500个核苷酸、尤其优选20至250个核苷酸、特别优选20至150个核苷酸，也特别优选20至100个核苷酸，以及最优选大约20至50个核苷酸。
5.根据权利要求3或4的方法，其特征在于经转移的核酸分子的一部分与编码内源MLO或其片段的序列至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、尤其优选至少80％、特别优选至少90％、以及最优选至少95％同源。
6.根据权利要求3或4的方法，其特征在于经转移的核酸分子的一部分与编码内源MLO或其片段的序列有至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、尤其优选至少80％、特别优选至少90％，以及最优选至少95％互补。
7.根据权利要求3至6中任一项的方法，其特征在于至少一种内源MLO的含量和/或活性的减少是通过RNA干扰(RNAi)、反义构建体、共-阻抑构建体、转录后基因沉默(PTGS)、核糖核酸酶P构建体、同源重组、核酶构建体或病毒诱导性基因沉默(VIGS)实现的。
8.根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的与编码至少一种MLO或其片段的序列互补的反义序列，或这一反义序列的同源物，其中所述序列在其3’端具有可为剪接体所识别的3’外显子序列，
-与其有效连接的内含子，
-与其有效连接的正义序列，所述正义序列与编码至少一种MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列在其5’端具有可为剪接体所识别的5’外显子序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的所述载体转移到植物细胞中，以及任选地整合进植物基因组。
9.根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建双链RNA分子，其具有15至100个核苷酸，优选20至75个核苷酸，更优选20至50个核苷酸，尤其优选20至40个核苷酸，特别优选20至30个核苷酸以及最优选20至25个或者21、22或23个核苷酸的长度，包含具有正义链的核酸序列，所述正义链与编码至少一种内源MLO的序列的片段同一或同源，
b)将来自步骤a)的分子转移到植物细胞中。
10.根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，所述载体以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的与编码至少一种内源MLO或其片段的序列互补的反义序列，或这一反义序列的同源物，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的所述载体转移到植物细胞中，以及任选地整合进植物基因组。
11.根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，所述载体以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的正义序列，所述正义序列与编码至少一种内源MLO或其片段的序列同一或同源，其中所述序列具有自身-互补的区域，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞中并且任选地整合进植物基因组中。
12.根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的与编码至少一种MLO或其片段的mRNA的序列互补的DNA序列，
-与其有效连接的编码核糖核酸酶P的序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
13.根据权利要求3至7中任一项的方法，
其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-与编码至少一种内源MLO的5’端的序列同一或同源的DNA序列，
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码抗性基因或报道基因的DNA序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
-与编码至少一种内源MLO的3’端的序列同一或同源的DNA序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
14.根据权利要求3至7中任一项的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码特异性识别至少一种内源MLO的mRNA的核酶的DNA序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
15.根据权利要求2的方法，其特征在于通过表达至少一种非功能性MLO或其片段来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述非功能性MLO或其片段具有至少一处点突变、缺失和/或插入。
16.根据权利要求15的方法，其特征在于非功能性MLO的至少一处点突变、缺失和/或插入阻止了MLO的细胞功能，尤其抑制了MLO与其病原或生理性结合伙伴蛋白，尤其是与Ror2和/或钙调蛋白的相互作用。
17.根据权利要求15或16的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码至少一种内源MLO的显性失活突变体的DNA序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
18.根据权利要求2的方法，其特征在于通过表达至少一种重组抗体来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述重组抗体对于至少一种内源MLO来说是特异性的，并且其阻止MLO的细胞功能，并且其尤其抑制MLO与其病原或生理性结合伙伴蛋白，尤其是与Ror2和/或钙调蛋白的相互作用。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码重组抗体的DNA序列，所述重组抗体对于至少一种内源MLO来说是特异性的并且其阻止MLO的细胞功能，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
20.根据权利要求2的方法，其特征在于通过表达至少一种MLO抑制剂来减少至少一种内源MLO的含量和/或活性，所述MLO抑制剂阻止了至少一种MLO的细胞功能，并且其尤其抑制了MLO与其病原或生理性结合伙伴蛋白，尤其是与Ror2和/或钙调蛋白的相互作用。
21.根据权利要求20的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码MLO抑制剂的DNA序列，所述MLO抑制剂阻止了MLO的细胞功能，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
22.根据权利要求1的方法，其特征在于与野生型相比至少一种MLO的含量和/或活性被增加。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于通过向植物或植物细胞转移至少一种核酸分子来增加至少一种MLO的含量和/或活性，所述核酸分子编码至少一种MLO和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物。
24.根据权利要求22或23的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)构建载体，其以5’-3’方向包含下列核酸序列元件：
-在植物中有功能性活性的启动子序列，
-与其有效连接的编码至少一种MLO和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物的DNA序列，
-任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列，
b)将来自步骤a)的载体转移到植物细胞并且任选地整合进植物基因组。
25.根据权利要求22至24中任一项的方法，其特征在于通过影响内源MLO的转录、翻译和/或翻译后修饰来增加至少一种内源MLO的含量和/或活性。
26.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于MLO是植物MLO，优选选自下述的植物MLO：大麦(Hordeum vulgare)MLO、稻(Oryzasativa)MLO、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)MLO，优选AtMlo1、AtMlo2、AtMlo3、AtMlo4、AtMlo5、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo8、AtMlo9、AtMlo10、AtMlo11、AtMlo12、AtMlo13、AtMlo14或AtMlo15，亚麻(Linumusitatissimum)MLO、普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)MLO、大豆(Glycine max)Mlo，优选GmMlo1、GmMlo2、GmMlo3.1或GmMlo3.2，或与任一所述MLO蛋白质基本功能等价的MLO。
27.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于MLO选自：具有如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的氨基酸序列的MLO，或者具有与在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等价的氨基酸序列的MLO。
28.根据权利要求8、10至14、17、19、21以及24至27中任一项的方法，其特征在于所述载体除了启动子序列和任选的终止序列外，还包含其它的调节和/或功能序列。
29.根据权利要求28的方法，其特征在于所述调节和/或功能序列是允许载体在细菌中增殖，和/或允许在植物细胞中瞬时和/或持久复制，和/或选自增强子、复制信号和选择标记的序列。
30.根据权利要求8、10至14、17、19、21以及24至29中任一项的方法，其特征在于所述载体选自质粒、黏粒、重组病毒和微型染色体。
31.根据权利要求30的方法，其特征在于所述载体选自pBR322、pUC载体、M13mp载体或来源于农杆菌的Ti质粒或Ri质粒的载体。
32.根据权利要求8、10至14、17、19、21、24至31中任一项的方法，其特征在于启动子序列选自组成型启动子，优选35S启动子、肌动蛋白启动子或泛素启动子；组织特异性启动子，优选磷酸烯醇丙酮酸启动子或果糖-1，6-二磷酸酶启动子、叶特异性启动子、表皮特异性启动子、发育特异性启动子、光特异性启动子、损伤特异性启动子或病原体诱导的启动子，优选真菌诱导的启动子。
33.根据权利要求8、10至14、17、19、21以及24至32中任一项的方法，其特征在于通过转化、转染、注射、生物射弹方法和/或电穿孔将载体转移至植物或植物细胞。
34.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于植物是双子叶植物例如大豆、棉花、油菜、番茄、糖萝卜、马铃薯、向日葵、豌豆、观赏植物、烟草、三叶草(车轴草属物种(Trifolium spec.))、野葛(Pueraria lobata)、树和豆科植物如苜蓿，并且尤其是大豆。
35.根据权利要求1至33中任一项的方法，其特征在于植物是单子叶植物例如大麦属(Hordeum)(大麦)、燕麦属(Avena)(燕麦)、小麦属(Triticum)(小麦)、黑麦属(Secale)(黑麦)、稻属(Oryza)(稻)、高粱属(Sorghum)(黍)、玉蜀黍属(Zea)(玉米)、稷属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、狗尾草属(Setaria)等。
36.至少一种核酸分子用于在转基因植物和/或植物细胞中增加抗大豆锈病的抗性的用途，所述核酸分子包含：
a)至少一种与编码内源MLO或其片段的序列同一、同源或互补的序列，
b)至少一种编码非功能性MLO或其片段的序列，所述非功能性MLO或其片段具有至少一种点突变、缺失和/或插入，
c)至少一种编码重组抗体的序列，所述重组抗体对于内源MLO是特异性的并且其阻止MLO的细胞功能，
d)至少一种编码MLO抑制剂的序列，所述MLO抑制剂阻止MLO的细胞功能，和/或
e)至少一种编码MLO和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物的序列。
37.根据权利要求36的用途，其特征在于MLO蛋白质是植物MLO，优选选自下述的植物MLO：大麦MLO、稻MLO、鼠耳芥MLO，优选AtMlo1、AtMlo2、AtMlo3、AtMlo4、AtMlo5、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo8、AtMlo9、AtMlo10、AtMlo11、AtMlo12、AtMlo13、AtMlo14或AtMlo15，亚麻MLO、普通小麦(小麦)MLO、大豆Mlo，优选GmMlo1、GmMlo2、GmMlo3.1或GmMlo3.2，或与任一所述MLO蛋白质基本功能等价的MLO。
38.根据权利要求36或37的用途，其特征在于MLO选自：具有如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的氨基酸序列的MLO，或者具有与在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等价的氨基酸序列的MLO。
39.根据权利要求36至38中任一项的用途，其特征在于所述植物是双子叶植物例如大豆、棉花、油菜、番茄、糖萝卜、马铃薯、向日葵、豌豆、观赏植物、烟草、三叶草(车轴草属物种)、野葛(Pueraria lobata)、树和豆科植物如苜蓿，并且尤其是大豆。
40.根据权利要求36至38中任一项的用途，其特征在于所述植物是单子叶植物例如大麦属(大麦)、燕麦属(燕麦)、小麦属(小麦)、黑麦属(黑麦)、稻属(稻)、高粱属(黍)、玉蜀黍属(玉米)、稷属、狼尾草属、狗尾草属等。
41.具有增加的抗大豆锈病抗性的转基因植物或植物细胞，以及植物的转基因部分例如叶和花，转基因繁殖材料例如原生质体、愈伤组织、果实、种子、块茎、根状茎、胚原基、花粉、插条，以及植物的转基因后代，所述转基因植物或植物细胞的特征在于与野生型植物或植物细胞相比，分别改变了至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性。
42.根据权利要求41的转基因植物或植物细胞，其特征在于与野生型植物或植物细胞相比，分别减少了至少一种内源MLO蛋白质的含量和/或活性。
43.根据权利要求42的转基因植物或植物细胞，其特征在于与野生型植物或植物细胞相比，分别增加了至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性。
44.根据权利要求41至43中任一项的转基因植物或植物细胞，其特征在于所述MLO蛋白质为植物MLO，优选选自下述的植物MLO：大麦MLO、稻MLO、鼠耳芥MLO，优选AtMlo1、AtMlo2、AtMlo3、AtMlo4、AtMlo5、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo8、AtMlo9、AtMlo10、AtMlo11、AtMlo12、AtMlo13、AtMlo14或AtMlo15，亚麻MLO、普通小麦(小麦)MLO、大豆Mlo，优选GmMlo1、GmMlo2、GmMlo3.1或GmMlo3.2，或与任一所述MLO蛋白质基本功能等价的MLO。
45.根据权利要求41至44中任一项的转基因植物或植物细胞，其特征在于MLO选自：具有如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的氨基酸序列的MLO，或者具有与在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等价的氨基酸序列的MLO。
46.具有增加的抗大豆锈病抗性的转基因植物或植物细胞，以及植物的转基因部分例如叶和花，转基因繁殖材料例如原生质体、愈伤组织、果实、种子、块茎、根状茎、胚原基、花粉、插条，以及植物的转基因后代，所述转基因植物或植物细胞的特征在于其是通过根据权利要求1至35中任一项的方法所产生的。
47.根据权利要求41至46中任一项的转基因植物或植物细胞，其特征在于所述植物是双子叶植物例如大豆、棉花、油菜、番茄、糖萝卜、马铃薯、向日葵、豌豆、观赏植物、烟草、三叶草(车轴草属物种)、野葛(Pueraria lobata)、树和豆科植物如苜蓿，并且尤其是大豆。
48.根据权利要求41至46中任一项的转基因植物或植物细胞，其特征在于所述植物是单子叶植物例如大麦属(大麦)、燕麦属(燕麦)、小麦属(小麦)、黑麦属(黑麦)、稻属(稻)、高粱属(黍)、玉蜀黍属(玉米)、稷属、狼尾草属、狗尾草属等。
49.表达载体，其特征在于其包含：
a)在植物中有功能性活性的启动子序列，
b)与其有效连接的下述序列
-所述序列与编码内源MLO或其片段的序列同一、同源或互补，
-所述序列编码非功能性MLO或其片段，所述非功能性MLO或其片段具有至少一种点突变、缺失和/或插入，
-所述序列编码重组抗体，所述重组抗体对于内源MLO是特异性的并且其阻止MLO的细胞功能，
-所述序列编码MLO抑制剂，所述MLO抑制剂阻止MLO的细胞功能，和/或
-所述序列编码MLO和/或其功能等价的片段和/或其功能等价的衍生物，
c)任选地，与其有效连接的在植物中有功能性活性的终止序列。
50.根据权利要求50的表达载体，其特征在于MLO蛋白质是植物MLO，优选选自下述的植物MLO：大麦MLO、稻MLO、鼠耳芥MLO，优选AtMlo1、AtMlo2、AtMlo3、AtMlo4、AtMlo5、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo8、AtMlo9、AtMlo10、AtMlo11、AtMlo12、AtMlo13、AtMlo14或AtMlo15，亚麻MLO、普通小麦(小麦)MLO、大豆Mlo，优选GmMlo1、GmMlo2、GmMlo3.1或GmMlo3.2，或与任一所述MLO蛋白质基本功能等价的MLO。
51.根据权利要求50或51的表达载体，其特征在于MLO选自：具有如SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中任何所示的氨基酸序列的MLO，或者具有与在SEQ ID NO：2、4、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中所示的任何MLO序列基本功能等价的氨基酸序列的MLO。
52.大豆锈病抗性植物或植物细胞，其特征在于其是通过TILLING方法产生的并且其在至少一种编码MLO蛋白质的基因的编码和/或调节序列中包含突变，所述突变使得与野生型植物或植物细胞相比，至少一种MLO蛋白质的含量和/或活性改变。
53.分离的核酸分子，其包含至少一种核酸序列，所述核酸序列选自：
a)根据SEQ ID NO：3、5、6、8或10的核苷酸序列或其片段，
b)编码具有根据SEQ ID NO：4、7、9或11任一项的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列或其片段，
c)与a)或b)的任一核苷酸序列基本同源的核苷酸序列，
d)在严格条件下与a)、b)或c)的任一核苷酸序列杂交的核苷酸序列，
其中所述核酸序列编码MLO蛋白质。
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