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CN101506231A - 筛选具有抗淀粉样蛋白性质的化合物的方法 - Google Patents

筛选具有抗淀粉样蛋白性质的化合物的方法 Download PDF

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CN101506231A CNA2007800307501A CN200780030750A CN101506231A CN 101506231 A CN101506231 A CN 101506231A CN A2007800307501 A CNA2007800307501 A CN A2007800307501A CN 200780030750 A CN200780030750 A CN 200780030750A CN 101506231 A CN101506231 A CN 101506231A
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P·莫兰
C·蒂比耶日
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Abstract

本发明涉及筛选具有抗淀粉样蛋白性质的化合物的方法。所述方法筛选这样的化合物，其能够使人皮质组织中的β淀粉样蛋白肽和烟碱性乙酰胆碱受体之间的高亲和性复合物解离或防止该复合物形成，此筛选方法可以快速鉴定旨在用于治疗和/或预防神经变性病，特别是阿尔茨海默病的化合物。

Description

筛选具有抗淀粉样蛋白性质的化合物的方法
发明领域
本发明涉及医学领域，特别是药理学研究部分。本发明实际上涉及筛选具有抗淀粉样蛋白性质的化合物的方法。
为此，本发明使用生物化学技术对生物样品进行离体分析，从而允许快速鉴定旨在用于治疗和/或预防神经变性疾病，特别是阿尔茨海默病的化合物。因此本发明涉及筛选这样的化合物的方法，所述化合物能够解离人皮质组织中的β淀粉样蛋白肽和烟碱性乙酰胆碱受体之间的高亲和性复合物。
背景技术
阿尔茨海默病是进行性神经变性疾病，其影响一大部分的老年人群体。临床上，该疾病的特征在于记忆丧失和认知功能减退。神经病理学上，阿尔茨海默病表现为出现两种组织病理学脑损伤：淀粉样蛋白斑和神经原纤维变性(NFD)。阿尔茨海默病的第三个特征是与显著的神经元丢失相应的皮质萎缩。
β淀粉样蛋白(Aβ)肽以神经元内沉积物以及淀粉样蛋白斑或老年斑的形式在神经元周围的堆积被视为位于阿尔茨海默病病因的起点。连同相关的认知障碍和神经原纤维变性，淀粉样蛋白沉积物的堆积是所有形式(包括家族性)阿尔茨海默病的早期不变特征。
神经原纤维变性相应于由成对螺旋纤丝或PHF形成的原纤维的神经元内堆积。PHF由tau微管相关蛋白的集合组成。这些蛋白的生物化学特征显示存在异常磷酸化和聚集的tau蛋白的主要三联体(tau 60、64和69)。正常tau蛋白被2到3倍磷酸化，而在阿尔茨海默病中则为5到9倍，其对神经元细胞骨架中微管的聚合/解聚以及轴突运输有作用。
皮质萎缩在阿尔茨海默病患者中表现为每十年脑重量丧失8到10％，而在健康受试者中，此丧失仅为2％。皮质萎缩伴随着脑室和皮质沟回的扩大，海马体积的减小，还有特别影响胆碱能系统的神经元丧失。
淀粉样蛋白斑由淀粉样蛋白物质的球形沉积产生。淀粉样蛋白物质由称为Aβ(β淀粉状蛋白)的具有39到43个氨基酸的多肽的纤丝组成。β淀粉样蛋白肽具有β折叠结构，赋予其不溶的特性和毒性。β淀粉样蛋白肽是大的膜糖蛋白APP(淀粉样前体蛋白)的正常代谢产物。淀粉样蛋白斑被神经炎性突起和神经胶质细胞所包围。淀粉样蛋白斑浸润神经实质，弥散进入脑所有区域的皮层灰质中。枕叶皮质似乎更常被这些淀粉样蛋白沉积物所影响。β淀粉样蛋白肽的神经毒性构成了阿尔茨海默病的主要问题。
近期的研究显示，位于细胞外间隙的淀粉样蛋白斑是在溶酶体区室中堆积了非常大量淀粉样蛋白沉积物的神经元细胞裂解的结果。这样的神经元内堆积导致神经元细胞的变性，而后导致细胞死亡，将那些沉积物释放到细胞外间隙中，逐渐形成淀粉样蛋白斑(Nagele等人，2002)。淀粉样蛋白斑被神经炎性突起和神经胶质细胞所包围，包含细胞核碎片(证明斑块来自于死亡的神经元)。α7型烟碱受体对Aβ肽进入神经元起根本作用(D’Andrea和Nagele，2006)。
Wang等人已证实Aβ肽与存在于神经元细胞外表面的α7烟碱性乙酰胆碱受体(α7 nAChR)以高亲和力特异性结合(Wang等人，2000)。Aβ肽，特别是Aβ42肽，与α7 nAChR受体之间的相互作用似乎是在Aβ42-α7nAChR复合物于神经元内堆积之前的必要步骤，神经元表面上的所述复合物经历胞吞作用，导致其在溶酶体区室中的堆积(Nagele等人，2002)。
而且，那些Aβ-α7化合物的神经元内堆积导致tau的异常磷酸化(Wang等人，2003)和突触功能障碍，包括胆碱能神经传递失败(Roselli等人，2005；Almeida等人，2005；Shemer等人，2006)。
这些资料整体而言倾向于说明，在老年人和阿尔茨海默病的患者中，Aβ肽，特别是Aβ42肽对α7 nAChR受体的长期破坏，是Aβ肽造成神经功能障碍的核心机制，淀粉样蛋白斑的形成和tau蛋白的磷酸化位于神经原纤维变性的起点。
因而，能够抑制Aβ42-α7 nAChR相互作用的化合物可能被证实为对于减少形成淀粉样蛋白斑和神经元功能障碍特别有效的药剂。
因此，就能够对位于淀粉样蛋白斑形成起点的Aβ42-α7 nAChR复合物起作用的化合物而言，由于其在神经变性和与年龄相关的病理学中的重要性，鉴定它们是有价值的。
这些化合物可以用多种方法鉴定，这些方法的适合程度和有效程度根据情况有所不同。有时不足以单独使用，而仅在组合使用时有效，无论如何，这些方法都具有一定的优点和缺点，在下文中对此有所概述，并将基于两个动物模型有效性标准进行讨论：结构效度(construct validity)，基于病理学成因条件和潜在的神经生物学机制的相似性；和描述效度(descriptive validity)，基于所造成的行为状态的相似性。
第一个方法包含向小鼠脑中注入β淀粉样蛋白，用置于脑室内(i.c.v.)的插管进行注射。经过7天外源性引入β淀粉样蛋白肽后，此方法(Yamada等人，2005；Mazzola等人，2003)可以得到有记忆缺陷的小鼠。此鼠类模型可快速获得，可以用于检测有希望用于治疗神经变性病，特别是治疗阿尔茨海默病的新物质。此方法基于的模型并不能完全代表阿尔茨海默病的病理生理学。事实上，使用这个方法鉴定作用于Aβ42-α7 nAChR复合物的化合物似乎无效，因为脑衰老的tau病理不在此鼠类模型中产生。而且，鉴于一方面该β淀粉样蛋白肽为外源性来源而非由动物天然产生，且另一方面此模型是动物而不是人，此鼠类模型不满足结构效度。最后，在小鼠脑中注入外源性β淀粉样蛋白肽使得必须实施体内工作，这使得该方法无法常规地用于抗阿尔茨海默化合物的筛选和鉴定。
鉴定化合物的若干其它方法使用转基因小鼠作为阿尔茨海默病的模型，所述转基因小鼠在APP和/或PS1(早老素1)基因上携带存在于家族性阿尔茨海默病中的突变。因此，对于家族性阿尔茨海默病而言，这些模型的结构效度是不可否认的，但对于在病例中占多于97％比例的散发性阿尔茨海默病则存在高度争议。
第一类的转基因小鼠仅具有在APP上的单个突变(Hsiao等人，1996)或具有在APP和PS1上的双突变(Holcomb等人，1998)。上述转基因模型的描述效度并不完全，因为它们不能可靠地再现与阿尔茨海默病相关联的病理生理特点，在单或双转基因小鼠的皮质中发现，其一方面缺乏神经原纤维变性，另一方面，很少或没有神经元丧失，而且老年斑出现缓慢。因而，鉴于相对于阿尔茨海默病的生理学差异和出现与此病理相关的损伤所需要的时间，不建议使用该单或双转基因小鼠模型。
使用携带三个突变基因(APP、PS1和tau)(LaFerla等人，2003)的小鼠转基因模型同样有缺点。此模型的结构效度是有争议的，因为相对于前述模型，在tau基因中加入了阿尔茨海默病人类患者所不具有的额外突变。然而，此模型具有好的描述效度，因为它很好地模拟了阿尔茨海默病的生理学损伤，包括淀粉样蛋白斑、神经原纤维变性和神经元丧失。然而，此方法需要6个月到12个月的时间才能得到具有阿尔茨海默病典型损伤的小鼠。因而，此转基因小鼠模型可以有效地在用于证实受试化合物的抗淀粉样蛋白性质的方法中，但鉴于所述模型花费的时间和实施的难度，其不适合用于最初筛选化合物。
第三种方法(Wang等人，2000)包括检测化合物防止外源引入的Aβ肽和大鼠组织(大鼠海马和皮质突触小体)中的α7之间形成复合物的能力。此体外方法比上述方法快，但确实有不能代表存在于人类中的复合物的缺点，因为使用的是大鼠的脑提取物，且Aβ肽是外源引入的。因而，对于筛选能够作用于Aβ42-α7 nAChR复合物的化合物的方法(所述复合物位于淀粉样蛋白斑形成的起点)，此模型既不满足在该方法中使用所需的结构效度条件，也不满足描述效度条件。
发明内容
因此本发明的目的在于提出鉴定如下化合物的备选方法方案，所述化合物能够作用于β淀粉样蛋白-α7 nAChR复合物，以至少部分地克服选择所述化合物的已知方法的缺点。为此，本发明提出离体筛选方法，所述方法再现阿尔茨海默病患者中存在的生理学状况。通过使用人脑，特别是从阿尔茨海默病患者中得到的额皮质来获得这些最佳状况。依照定义，因为该模型涉及直接使用患病的人体组织，其满足结构效度和描述效度的标准。
本发明筛选方法的离体条件使得可以避免那些与实施和操作动物模型相关的限制。
而且，使用人体生物材料可以避免所有与动物物种和人之间存在的生理学差异相关的假象和误差。鉴于阿尔茨海默病和神经变性病一般而言不在人以外的物种中天然存在，在根据本发明的筛选方法中使用人体生物材料特别重要。
因此本发明涉及筛选这样的化合物的方法，所述化合物能够使来自人脑的β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物解离，或者防止该复合物形成。
本发明优选涉及筛选这样的化合物的方法，所述化合物能够使来自人脑的β淀粉样蛋白肽与α7烟碱性乙酰胆碱受体的复合物解离，或者防止该复合物形成。
因此根据本发明的筛选方法可以鉴定具有治疗或预防性质的化合物，这取决于所述化合物是能够解离还是能够防止生成Aβ42-α7 nAChR复合物。
“抗淀粉样蛋白”或“抗β淀粉样蛋白”性质应理解为指化合物通过解离由Aβ肽与烟碱性乙酰胆碱受体形成的复合物，或通过抑制该复合物形成，从而使细胞内或细胞外β淀粉样蛋白肽沉积物解离或抵抗该沉积物形成的能力。
在本发明上下文中，α-7烟碱性乙酰胆碱受体(α7 nAChR)表示具有五聚体表面的细胞受体，其主要在皮质和海马中表达，对学习和记忆起重要作用。
在本发明上下文中，用语“β淀粉样蛋白”、“Aβ”和“β淀粉样蛋白肽”涉及全部β淀粉样蛋白肽，包括肽Aβ1-39或Aβ39、Aβ1-40或Aβ40、Aβ1-41或Aβ41、Aβ1-42或Aβ42、Aβ1-43或Aβ43，及其片段(Glenner等人，1984)。上述β淀粉样蛋白肽片段具有生物活性，可以用于根据本发明的筛选方法。所述片段为例如片段Aβ1-28和Aβ25-35。
在本发明上下文中使用的β淀粉样蛋白肽特别为肽Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和/或Aβ43。肽Aβ42对α7烟碱性乙酰胆碱受体的亲和力最高，在阿尔茨海默病的病因中起最重要的作用。
本筛选方法用来自人脑，优选人皮质和海马的样品进行。这些样品取自死后的阿尔茨海默病患者。
本发明优选涉及筛选方法，特征在于用免疫组织化学显示β淀粉样蛋白肽和α7烟碱性乙酰胆碱受体的复合物的解离。
在本发明上下文中，术语“免疫组织化学”涉及使用抗体检测或分离确定分子的所有抗原揭示技术(antigen-revealing techniques)。
筛选方法优选包括以下步骤：在受试化合物存在或不存在的情况下孵育β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物，然后在受试化合物存在或不存在的情况下测定未解离的复合物的量，评估未解离的复合物的量的差异，该差异表明受试化合物介导β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物的解离。
根据本发明的筛选方法优选还包括用抗β淀粉样蛋白肽抗体分离未解离的β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物的步骤。
用于筛选方法的抗β淀粉样蛋白肽抗体优选针对β淀粉样蛋白肽Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和/或Aβ43。这些抗体可以是小鼠或山羊单克隆抗体。
甚至更优选地，本筛选方法的特征在于，用抗烟碱性乙酰胆碱受体抗体，特别是抗α7烟碱性乙酰胆碱受体抗体来揭示未解离的复合物，特别是用蛋白质印迹方法进行揭示。
有利地，根据本发明的筛选方法已显示化合物S 24795，即1-(4-溴苯基)-2-(1-甲基-2-吡啶鎓基)-1-乙酮氯化物或碘化物为这样的化合物，其能够：一方面，抑制β淀粉样蛋白-α7 nAChR复合物的形成，另一方面，解离已经堆积在神经元周围的淀粉样蛋白斑中并已沉积到神经元内的所述β淀粉样蛋白-α7 nAChR复合物。因此用本发明的筛选方法鉴定的化合物S24795为这样的化合物，其能够使存在于阿尔茨海默病患者脑中的β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物解离，还能够抑制所述复合物的形成。
本发明还涉及用根据本发明的筛选方法鉴定的各化合物。
本发明还涉及药物组合物，其包含用根据本发明的筛选方法得到的化合物作为活性成分，以及一种或多种可药用赋形剂。
“活性成分”应理解为指负责药物组合物的药效性质或治疗性质的任何物质。在本发明上下文中，“赋形剂”应理解为指与药物活性成分混合以便于药物的制备、给药和改变其稠度、形式和体积的任何物质。
作为举例而非限制，无毒的可药用的赋形剂中可提及稀释剂、溶剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、粘合剂、溶胀剂、崩解剂、延缓剂、润滑剂、吸收剂、悬浮剂、着色剂和调味剂。
此外，旨在预防和/或治疗神经变性病，特别是阿尔茨海默病的该药物组合物，可以为适于口服、肠胃外、经鼻、经皮或透皮、直肠、经舌、经眼或呼吸道给药的形式，特别是片剂或糖锭剂、舌下片、囊剂、paquet、胶囊、glossettes、锭剂、栓剂、霜剂、软膏、皮肤凝胶和可注射或可饮用的安瓿剂。
本发明还涉及使用本发明筛选方法鉴定的化合物在获得旨在预防和/或治疗神经变性病的药物组合物中的用途。
使用本发明筛选方法鉴定的化合物可以用于治疗“神经变性病”，例如阿尔茨海默病、Pick病、路易氏体痴呆、Steele-Richardson综合征、唐氏综合症、Shy-Drager综合征、肌萎缩侧索硬化、神经变性共济失调、亨廷顿病、帕金森氏病、原发进行性失语、马查多-约瑟夫病、图雷特综合征、麻痹性构语障碍(paralytic dysarthria)、肯尼迪病、家族性痉挛性麻痹、韦德尼希-霍夫曼病、库格尔贝格-韦兰德病、泰伊-萨克斯二氏病、桑德霍夫病、Wohlfart-Kugelberg-Welander病、痉挛性轻截瘫、进行性多灶性脑白质炎以及和朊病毒相关的疾病，包括克雅病和格-施-沙病。
根据本发明，术语“预防”对应于预防性的治疗，目的在于通过抑制β淀粉样蛋白肽与α7烟碱性乙酰胆碱受体的结合来降低罹患阿尔茨海默病的风险。此抑制作用限制了β淀粉样蛋白-α7 nAChR复合物的形成，所述复合物位于淀粉样蛋白斑的起点，而淀粉样蛋白斑是阿尔茨海默病中存在的损伤。而且，术语“预防”可以理解为二级预防，旨在通过减缓疾病的进程和减少其持续时间来减少流行率。
“治疗”应理解为出于治疗阿尔茨海默病患者的目的予以处方的治疗，所述治疗通过解离存在于人脑中并构成老年斑的β淀粉样蛋白-α7 nAChR复合物来进行。
根据本发明的筛选方法得到的化合物在获得药物组合物中的用途，其目的更是尤其是旨在对阿尔茨海默病患者进行预防和/或治疗。
“阿尔茨海默病”应理解为指一种致死性神经变性病，其影响记忆和精神功能，伴有特别是语言退化、复杂活动障碍、时间和空间定向障碍。这些认知障碍与两种特征性的神经病理学损伤相关：老年斑和神经原纤维变性，这些损失使其能够在死后得到确诊。
附图说明
本发明通过下列附图进行举例说明，但不受其限制：
图1：蛋白质印迹表明S 24795对Aβ42-α7 nAChR复合物的抑制，所述复合物来自死后的阿尔茨海默病患者或对照受试者的额皮质突触小体。Aβ42-α7 nAChR复合物在培养基(Krebs-Ringer)中单独孵育或在S 24795(30μM)存在下孵育10分钟，而后在Aβ42肽存在下孵育30分钟。
图2：量化对人额皮质突触小体中Aβ42-α7 nAChR复合物的形成的抑制，该人额皮质突触小体获自死后的阿尔茨海默病患者和对照受试者，在与或不与S 24795(30μM)一起孵育后，与Aβ42肽(100nM)孵育。＊：对于对照和阿尔茨海默病患者p<0.01，用纽曼-科伊尔斯检验(Newman-Keuls test)进行多重比较。
图3：蛋白质印迹图示表明由S 24795造成的Aβ42-α7 nAChR复合物的解离，所述复合物来自死后的阿尔茨海默病患者或对照受试者的额皮质突触小体。Aβ42-α7 nAChR复合物在培养基(Krebs-Ringer)中单独孵育或在S 24795(1、10、30或100μM)存在下孵育10分钟，而后在存在或不存在Aβ42(100nM)的情况下进行孵育。
图4：量化对人额皮质突触小体中α7 nAChR受体与Aβ42之间的相互作用的解离，该人额皮质突触小体来自死后的阿尔茨海默病患者和对照受试者，与S 24795(1到100μM)孵育后，在存在或不存在Aβ42(100nM)的情况下孵育。＊：对于对照和阿尔茨海默病患者p<0.01，用纽曼-科伊尔斯检验进行多重比较。
图5：量化进入人额皮质突触小体的45Ca2+，该人额皮质突触小体来自死后的阿尔茨海默病患者和对照受试者，经S 24795处理。在用S 24795(10μM)处理之前，对照脑切片在存在或不存在Aβ42(1μM)的情况下进行孵育。由α7激动剂(PNU282987)或由NMDA加甘氨酸引起钙进入。
实施例
I.材料和方法
I.1)患者
死后阿尔茨海默病患者和健康对照受试者的人额皮质来自脑库(Harvard Brain Tissue Resource Center和Analytical BiologicalServices)。
此研究中包括的患者和对照受试者年龄在50到90岁之间。
对照受试者为在活着的时候没有显示出认知障碍或记忆丧失迹象的人。
而且，阿尔茨海默病患者分为有或没有相关血管疾病的两个亚组。本研究中仅使用没有相关疾病的患者的脑。
应注意，在显示临床症状的患者中，阿尔茨海默病的诊断经免疫组织化学方法进行确认，所述方法为美国衰老研究所(National Institute onAging)和里根研究所诊断标准工作组(Reagan Institute Working Groupon Diagnostic Criteria)进行阿尔茨海默病神经学评估的方法。
I.2)皮质的制备
为避免任何死后的伪象，本研究中取得的皮质是在死者死亡之后15小时之内取出的。
直至用于根据本发明的筛选方法之前，将取出的皮质储存于-80℃。
I.3)皮质的储存
取出之后，皮质在含20％(w/v)蔗糖的0.2M磷酸钠缓冲液(NaH2PO4.2H2O/NaH2PO4·.12H2O，pH 7.4)中冷冻保存2周。然后在于干冰中保持-30℃的异戊烷中冷冻1分钟。最后，在恒温控制于-30℃的冷冻切片机(Super Frost Plus Fisher)中制成5-μm厚的切片，置于0.02M PBS缓冲液中，4℃储存。
I.4)突触小体的制备
将100mg冰上研磨的死后额皮质在保持于冰上的10倍体积10mMHEPES pH 7.4中匀浆，在0.32mM蔗糖和0.1mM EDTA存在下充氧，然后在特氟隆/玻璃组织研磨器中于4℃在匀浆溶液中混和，所述匀浆溶液含25mM HEPES pH 7.5、1mM EDTA、50μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml抑肽酶、2μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、0.04mM PMSF、蛋白磷酸酶抑制剂混合物和0.2％ 2-巯基乙醇。
首先以1000g，4℃离心匀浆物10分钟。从第一次离心中得到的上清以15000g进行第二次离心30分钟，以得到突触小体沉淀。
在保存于冰上的10ml Krebs-Ringer溶液中悬浮，洗涤突触小体沉淀两次，所述Krebs-Ringer溶液包含25mM HEPES pH 7.4、118mM NaCl、4.8mM KCl、25mM NaHCO3、1.3mM CaCl2、1.2mM MgSO4、1.2mMKH2PO4、10mM葡萄糖、100μM抗坏血酸、50μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml抑肽酶、2μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、0.04mM PMSF和蛋白磷酸酶抑制剂混合物，之后用95％ O2/5％ CO2充气10分钟，而后在15000g，4℃再次离心10分钟。而后洗涤过的突触小体在1ml充氧的Krebs-Ringer溶液中悬浮，用Bradford法测定所述突触小体悬液的蛋白质浓度。
I.5)免疫沉淀
人皮质突触小体在充氧的Krebs-Ringer溶液中，于化合物S 24795存在下37℃孵育30分钟，总孵育体积500μl。化合物S 24795在反应混合物中的浓度为1μM、10μM、30μM或100μM。根据实施的实验，突触小体还在100nM Aβ42存在下或在载体(vehicle)存在下孵育。通过用1.5ml保存于冰上的1mM EDTA溶液-无钙离子Ca2+的Krebs-Ringer溶液稀释，终止反应，而后在15000g，4℃离心10分钟。移去上清后，得到的突触小体沉淀在250μl含有0.5％毛地黄皂苷、0.2％螯合钠和0.5％ NP-40的免疫沉淀缓冲液(25mM HEPES pH 7.5、200mM NaCl、1mM EDTA、50μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml抑肽酶、2μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、0.04mMPMSF和蛋白磷酸酶抑制剂混合物)中重悬。将突触小体用750μl保存于冰上的免疫沉淀缓冲液稀释，4℃离心以除去不溶性残渣后，用抗Aβ42抗体免疫沉淀以分离Aβ42-α7 nAChR复合物，在抗体存在下4℃孵育16小时，通过在25μl A/G-缀合的琼脂糖珠子存在下孵育2小时进行浓缩(Cai等人，1999，Wang等人，2000，Jin等人，2001)。
I.6)电泳和蛋白质印迹
用1ml磷酸缓冲盐水溶液pH 7.2洗涤三次并离心后，将分离的Aβ42-α7 nAChR复合物于热的100μl SDS-PAGE缓冲液(62.5mMTris-HCl pH 6.8、10％甘油、2％ SDS、5％ 2-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝)中溶解5分钟。然后将复合物上样至8-16％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在蛋白质印迹分析中使用抗α7 nAChR单克隆抗体，然后通过化学发光显示。用光密度测定法分析得到的条带的亮度，从而将化合物对存在的Aβ42-α7 nAChR复合物的量的影响作为化合物剂量的函数进行量化。
I.7)抗淀粉样蛋白化合物
化合物S 24795在根据本发明的离体筛选方法方案中用作抗淀粉样蛋白剂。
化合物S 24795为吡啶化合物，用作记忆认知(mnemocognitive)促进剂，能够改善认知过程和/或对抗与衰老相关的认知障碍。不同于直接作用于中枢胆碱能系统的记忆认知促进剂，化合物S 24795缺乏低温活性，而该活性在治疗神经变性病患者时可能成为问题。
I.8)功能恢复方法
用从根据I.1的患者得到的根据I.2的脑来进行功能恢复实验。
参照经过α7和NMDA受体的钙内流来评估通过S 24795(10μM)处理引起的功能恢复。用S 24795处理暴露于Aβ42(30分钟)的对照脑和阿尔茨海默病患者的脑1小时后进行测试。在从这些脑获得的皮质切片上用Aβ42(1μM)和S 24795(10μM)进行处理。然后按I.4中所述制备突触小体。为了评估经α7和NMDA受体的Ca2+内流，突触小体在45Ca2+(5μM)存在下在Krebs-Ringer培养基中37℃孵育5分钟。Ca2+流动由加入α7选择性α7nAChR受体激动剂PNU282987(0.1、1和10μM)引起，对于NMDAR受体，由加入NMDA(0.1、1、10μM)和甘氨酸(1μM)引起。通过加入含EGTA但不含钙的Krebs-Ringer培养基(4℃)停止反应。两次洗涤后，在乙醇(95％)中超声处理裂解突触小体，用液闪光谱法进行放射性计数。通过加入α7受体的选择性抑制剂(α-银环蛇毒素)和NMDA受体的选择性抑制剂(AP-5)检验钙内流的特异性。
II.结果
结果证实化合物S 24795的两种效果。
首先，此筛选方法可以鉴定，当在脑提取物中加入Aβ肽时，S 24795(在Aβ肽之前加入)防止Aβ42-α7 nAChR复合物形成的预防性质。确实，如图1中可见，在未患病的人皮质突触小体中加入Aβ肽造成Aβ42-α7nAChR复合物的量显著增加。
当S 24795在Aβ肽之前加入突触小体时，形成的Aβ42-α7 nAChR复合物的量减少92％，表明S 24795(30μM)防止由Aβ肽导致的该复合物的形成。
在由阿尔茨海默病患者皮质得到的突触小体中，所存在的复合物的量比未患病的对照高20倍。加入Aβ肽不引起患病组织中复合物的量增加，全部烟碱受体已被内源Aβ肽饱和了。在此情况下，筛选方法可以鉴定S24795的治疗性质，因为其使患者死亡之前形成的复合物解离。S 24795导致患病的脑中Aβ42-α7 nAChR复合物的量实质性减少。
图3中显示的结果证实了筛选方法鉴定具有治疗性质的化合物的能力，因为在没有Aβ肽加入的情况下，该化合物能够造成患病的人组织中已存在的复合物解离。确实，在外源性Aβ肽不存在的情况下，化合物S24795即使以1μM的浓度便可以导致患病的脑提取物中先前存在的Aβ42-α7 nAChR复合物减少约22％。S 24795浓度为10、30和100μM时该减少是实质性的，未解离的复合物以剂量依赖方式减少，在最高浓度时约63％(p<0.01双因素方差分析，而后用纽曼-科伊尔斯检验进行多重比较)。
因此，本筛选方法可以特异性选择这样的化合物，所述化合物：一方面能够防止复合物形成，适用于疾病早期，此时化合物起预防作用；另一方面能够解离已存在的复合物，适用于疾病晚期或事实上严重的疾病阶段，此时化合物起治疗作用。
Aβ42-α7 nAChR复合物的解离可以防止Aβ42-α7 nAChR复合物在神经元内过度堆积，从而对抗由于那些沉积引起的神经元死亡。
用人脑突触小体实施根据本发明的筛选方法避免了与动物物种和人之间的差异相关的假象和假阳性结果。而且，此筛选方法的离体操作使得可以快速且可重复地鉴定这样的化合物，所述化合物能够解离β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物。最后，由于此筛选方法使用的生物材料代表阿尔茨海默病的严重的固定阶段，因此可以选择和鉴定能对疾病的最终阶段起作用的化合物。根据本发明的筛选方法可以鉴定能够用于神经变性病，特别是阿尔茨海默病的治疗的化合物。
此外，实施了特定实验以评估Aβ42-α7 nAChR复合物解离之后可能的功能恢复。此实验显示由S 24795引起的Aβ42-α7 nAChR复合物的解离能够恢复α7 nAChR受体和NMDAR型谷氨酸受体的某些功能性。事实上，与对照受试者的突触小体相比，经α7 nAChR和NMDAR进入阿尔茨海默病患者突触小体的钙大大减少(对照值的35％)(图5)。钙进入的此减少显然是由Aβ42-α7 nAChR复合物的形成造成的，因为向对照受试者脑切片加入Aβ造成钙进入的减少，水平与患者中的相当。用S 24795处理，通过对抗Aβ在对照脑中的作用，显示了Ca2+进入的实质性重建。
更引人注目的是，用S 24795处理阿尔茨海默病患者中已形成的复合物，与未处理的阿尔茨海默病患者的脑相比，导致Ca2+进入的大约75％的实质性增加。图5显示，用S24795处理阿尔茨海默病患者的脑和用Aβ预处理的对照脑后，Ca2+进入达到相当的水平，相应于没有Aβ的对照值的约65％。
因此，此实验表明，在来自阿尔茨海默病患者的患病组织中，由S 24795引起的Aβ42-α7 nAChR复合物的解离，可以在死后恢复某些细胞功能性——在此具体情况中为钙进入。
因此，此实验突显了本筛选方法的治疗价值。

Claims (16)

1.筛选化合物的方法，所述化合物能够使来自人脑的β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物解离或防止所述复合物生成。
2.权利要求1所述的筛选方法，特征在于鉴定的化合物具有治疗或预防性质。
3.权利要求1所述的筛选方法，特征在于所述烟碱性乙酰胆碱受体为α7型。
4.权利要求1所述的筛选方法，特征在于所述β淀粉样蛋白肽为Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和/或Aβ43。
5.权利要求1所述的筛选方法，特征在于所述β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物来自人皮质或海马。
6.权利要求1所述的筛选方法，特征在于用免疫组织化学显示β淀粉样蛋白肽和烟碱性乙酰胆碱受体的复合物的解离。
7.权利要求1所述的筛选方法，特征在于其包括以下步骤：
-在受试化合物存在或不存在的情况下孵育β淀粉样蛋白肽与烟碱性乙酰胆碱受体的复合物；
-在受试化合物存在或不存在的情况下测定未解离的复合物的量，评估未解离的复合物的量的差异。
8.权利要求7所述的筛选方法，特征在于用抗β淀粉样蛋白肽抗体分离未解离的复合物。
9.权利要求8所述的筛选方法，特征在于所述抗体抗β淀粉样蛋白肽Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和/或Aβ43。
10.权利要求7所述的筛选方法，特征在于用抗烟碱性乙酰胆碱受体的抗体显示未解离的复合物。
11.权利要求10所述的筛选方法，特征在于用抗α7烟碱性乙酰胆碱受体的抗体显示未解离的复合物。
12.用权利要求1所述的筛选方法鉴定的化合物。
13.权利要求12所述的化合物，特征在于此化合物为1-(4-溴苯基)-2-(1-甲基-2-吡啶鎓基)-1-乙酮。
14.药物组合物，特征在于其包含一种或多种可药用的赋形剂和一种或多种权利要求12所述的化合物。
15.权利要求12所述的化合物在获得药物组合物中的用途，所述药物组合物旨在预防和/或治疗神经变性病。
16.权利要求12所述的化合物在获得药物组合物中的用途，所述药物组合物旨在预防和/或治疗阿尔茨海默病。
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