CN101506226A - 改良的色素上皮衍生因子变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)的抗血管生成变体及其用途，其中所述变体包含多个被改变的磷酸化位点、编码所述位点的多核苷酸。尤其，本发明的PEDF变体提供优良的抗血管生成活性和高神经营养活性，可用于治疗与新血管形成和神经变性病状关联的疾病。

Description

改良的色素上皮衍生因子变体及其用途

发明领域

本发明涉及色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)的抗血管生成变体及其用途，其中所述变体包含多个被改变的磷酸化位点、编码所述位点的多核苷酸。尤其，包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体提供优良的抗血管生成活性和高神经营养活性，可用于治疗与新血管形成和神经变性病状关联的疾病。

发明背景

色素上皮衍生因子(PEDF)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员，但是到目前为止，没有发现其呈现出对任何蛋白酶的抑制活性。最初，基于它把分裂的眼癌细胞转化成分化型神经元的能力而把它离析出来，因此将它鉴定为神经营养因子。后来发现，除了其神经营养功能之外，PEDF还是眼睛中血管生成的有效天然抑制剂，在眼睛中它抑制几种强的促血管生成因子的刺激活性。这一抗血管生成的潜能也已经在一些动物模型中表现出来，其中例证了PEDF为负责减少眼睛中血管生长的因子。尽管最初在从胎儿的人类视网膜获得的色素上皮细胞的培养基中发现PEDF，但目前清楚，PEDF不只在视网膜中也在成人眼睛的多个位点以及成年人类的脑、脊髓和人类血浆中被表达。因此，PEDF可能具有抑制全身血管生成的潜能。

已经确定，蛋白质磷酸化在大部分细胞内过程的调节中扮演主要角色。然而，越来越明显，蛋白质激酶也可调节细胞外过程，因为它们在细胞外作为外部蛋白质(ecto-protein)激酶或外蛋白质(exo-protein)激酶存在。外部蛋白质激酶是膜结合酶，其催化活性位于多种细胞的胞外细胞表面。外蛋白质激酶是分泌的可溶酶，其催化活性存在于胞外环境中，与细胞无直接关联。这些蛋白质激酶被示出为磷酸化细胞外可溶底物和细胞表面蛋白质，因此在包括细胞-细胞的相互作用、分化、增殖和离子流在内的许多生理学过程中起调节作用。

本发明的诸发明人在他们的最近研究中已经显示，从人类血浆(plPEDF)提纯而来的PEDF是一种磷蛋白质，该磷蛋白质在循环中被酪蛋白激酶CK2(CK2)和蛋白质激酶A(PKA)磷酸化(Maik-Rachline G.，等.Blood.105：670-678，2005)。还显示，CK2在两个主要残基Ser24和Ser114上磷酸化PEDF，而PKA在Ser227上磷酸化PEDF。使用几种模拟磷酸(Ser到Glu)或非磷酸(Ser到Ala)形式的PEDF的磷酸化位点突变体，发现PEDF的CK2和PKA磷酸化各自显著地影响它的生理机能。CK2磷酸化的PEDF具有降低了的神经营养活性，而其抗血管生成活性显著地增加。另一方面，PKA磷酸化降低了PEDF抗血管生成活性，但对它的神经营养活性几乎没有影响(Maik-Rachline G.，等.Blood.2005，105：670-678)。

在本发明申请人的国际申请公布第WO 2006/054278号中，揭示了一种PEDF变体以及另一种PEDF变体，其中第一种PEDF变体把在PEDF的CK2磷酸化位点上的两个丝氨酸残基即丝氨酸24和丝氨酸114置换成带负电荷的氨基酸，它与重组野生型PEDF相比较具有更高的抗血管生成活性而具有更低的神经营养活性，第二种PEDF变体把在PKA磷酸化位点上的丝氨酸残基即丝氨酸227置换成带负电荷的氨基酸，它与重组野生型PEDF的相比较表现出更低的抗血管生成活性而表现出相似的神经营养活性。WO 2006/054278要求保护包含至少一个被改变的磷酸化位点的抗血管生成PEDF变体。WO 2006/054278进一步要求保护编码抗血管生成PEDF变体的离析多核苷酸及其使用方法。

美国专利第5,840,686号揭示了：编码PEDF、被截断的PEDF及等效蛋白质的核酸，用于产生重组PEDF、被截断的PEDF和等效蛋白质的重组方法，以及这些蛋白质在神经元分化、神经元生存和神经胶质抑制中的用途。美国专利第6,319,687号要求保护重组PEDF蛋白质和具有PEDF生物活性的PEDF截断形式。

国际申请公布第WO 03/059248号揭示了呈现有效的抗血管生成和神经营养活性的人类血浆PEDF。

国际申请公布第WO 2004/028559号揭示了基本由PEDF的5到50个邻接氨基酸组成的PEDF片段、包含所述PEDF片段的药物组合物及其用于治疗癌症或眼科疾病的用途。

美国专利申请第2005/0222031号揭示了用于预防或治疗恶性黑色素瘤的方法，该方法包括为有相应需要的患者施用PEDF或具有功能上与PEDF等效特性的PEDF变体。根据美国专利申请第2005/0222031号，PEDF变体包含改变人类PEDF的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，并具有功能上与人类PEDF等效特性的氨基酸序列。然而，在美国专利申请第2005/0222031号中，既没有揭示被改变的氨基酸残基的位点和数量，也没有揭示氨基酸改变对PEDF生物活性的影响。

美国专利第6,821,775号揭示了一种复制缺陷型腺病毒载体，它含有编码PEDF或其治疗性片段的核酸序列。尽管包含置换、缺失或添加并编码功能性PEDF肽或其治疗性片段的核酸序列适宜插入病毒载体中，但是美国专利第6,821,775号并没有揭示能够发挥出比PEDF更优活性的具体PEDF变体。

美国专利申请公开第2003/0158112号揭示了一种治疗脉络膜新血管形成的方法，包含直接对眼睛施用治疗性因子或编码治疗性因子的核酸序列，以选择性地诱导与脉络膜新血管形成相关联的内皮细胞的凋亡，从而治疗脉络膜新血管形成。所列出的治疗性因子包括PEDF或其片段。在美国专利申请公开第2003/0158112号中，对于在特定位点有氨基酸置换的PEDF变体，没有指出这些变体可用于治疗脉络膜新血管形成。

国际申请公布第WO 05/041887号揭示了用于治疗涉及增加的血管通透性的病状的方法，该方法包括施用PEDF或PEDF44氨基酸肽或其同系物，其中分别在位点101、103、112和115的氨基酸残基谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸和丝氨酸不被改变。在国际公布申请第WO 05/041887号中没有揭示：包含在位点24、114和227被置换的丝氨酸残基的PEDF变体可用于治疗涉及增加的血管通透性或增加的血管生成的病状。

仍然存在对表现出神经营养活性的PEDF的有效抗血管生成变体的、没有得到满足的需求。

发明概述

本发明提供了新颖的抗血管生成PEDF变体，它包含相对于人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO：1被改变的氨基酸序列，其中该被改变的氨基酸序列包含多个被改变的磷酸化位点。尤其，本发明提供了新颖的抗血管生成PEDF变体，它包含相对于人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO：1被改变的氨基酸序列，其中该被改变的氨基酸序列包含在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点。本发明进一步提供编码该新颖PEDF变体的离析多核苷酸、含有所述变体的药物组合物及其使用方法。本发明进一步提供针对所述PEDF变体的离析抗体。

出乎意料的是，现在揭示，在位点24、114和227包含三个带负电荷的氨基酸残基、替换在这些位置自然存在的丝氨酸残基并因此模仿CK2和PKA磷酸化的PEDF变体表现出优良的抗血管生成活性。相对于仅在位置24和114包含两个带负电荷的氨基酸残基的PEDF变体(它仅模仿由CK2进行的磷酸化)，在下文被称为EEE变体的该三重变体显示为更有效的抗血管生成因子，并且远比重组野生型PEDF更有效。令人惊讶的是，EEE变体表现出高的神经营养活性。由EEE变体获得的神经营养活性类似于重组野生型PEDF的神经营养活性，但显著高于在丝氨酸24和丝氨酸114处具有两个带负电荷的氨基酸残基的PEDF变体的神经营养活性，后者表现出可以忽略不计的神经营养活性。因此，出乎意料的是，该新颖PEDF EEE变体表现出较高的抗血管生成活性，同时保留了重组野生型PEDF的神经营养活性。

进一步揭示，包括丝氨酸24、114和227的三个氨基酸置换的PEDF变体表现出有效的抗血管生成活性，所述氨基酸置换中仅丝氨酸24和114被带负电荷的氨基酸残基置换。这一抗血管生成活性低于包含模仿CK2和PKA磷酸化的三个带负电荷的氨基酸残基的EEE变体所表现出的抗血管生成活性，但类似于包含仅模仿CK2磷酸化的两个带负电荷的氨基酸残基的PEDF变体所表现出的抗血管生成活性。包含在丝氨酸24、114和227的三个氨基酸置换的PEDF变体具有可以忽略不计的神经营养活性，所述氨基酸置换中仅丝氨酸24和114被带负电荷的氨基酸残基置换。

根据第一方面，本发明提供一种抗血管生成的色素上皮衍生因子(PEDF)变体或其类似物或融合蛋白，它包含源自人类PEDF(SEQ IDNO：1)或其片段的改性氨基酸序列，其中该改性氨基酸序列包含多个被改变的磷酸化位点，它不同于一种包含仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点组成的PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白。

应该明白，本发明包含其他哺乳动物如小鼠、牛、猪等等的PEDF变体。

根据一些实施方案，本发明提供一种抗血管生成的PEDF变体，它包含源自人类PEDF(SEQ ID NO：1)的改性氨基酸序列，其中该改性氨基酸序列包含多个被改变的磷酸化位点，它不同于一种仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点组成的PEDF变体或类似物、其片段或融合蛋白。应该理解，PEDF变体的类似物、片段和融合蛋白在本发明的范围之内。

根据另外的实施方案，本发明提供一种抗血管生成的PEDF变体，它包含人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO：1的变体，其中该变体包含多个被改变的磷酸化位点，条件是：该变体不同于仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点组成的PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白。

根据一些实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段包含两个被改变的磷酸化位点，该磷酸化位点从由丝氨酸24和丝氨酸227；以及丝氨酸114和丝氨酸227组成的组中选择。

根据一些优选实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段包含在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点。

根据进一步的实施方案，包含三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段具有神经营养活性。根据另外的实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段的三个被改变的磷酸化位点被带负电荷的氨基酸残基置换。根据一个示例性实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋白包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其片段。根据一个特定的示例性的实施方案，PEDF变体包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

根据另外的实施方案，具有神经营养活性的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段包含三个被改变的磷酸化位点，其中丝氨酸24和丝氨酸114被非极性的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被选自带负电荷的氨基酸和非极性氨基酸残基的氨基酸残基置换。根据一些示例性实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋白包含选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4或其片段的氨基酸序列。根据特定的示例性实施方案，PEDF变体包含选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

根据进一步的实施方案，包含三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段基本上缺乏神经营养活性。根据一些实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段的丝氨酸24和丝氨酸114被带负电荷的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被非极性的氨基酸残基置换。根据一个示例性的实施方案，抗血管生成PEDF变体、其类似物或融合蛋白包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或其片段。根据一个特定的示例性实施方案，PEDF变体包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

应该理解，本发明进一步包含人类PEDF的变体、其类似物、片段和融合蛋白，其中三个被改变的磷酸化位点从由以下各项所组成的组中选择：带负电荷的氨基酸残基置换丝氨酸24和丝氨酸227，且非极性的氨基酸残基置换丝氨酸114；带负电荷的氨基酸残基置换丝氨酸114和丝氨酸227，且非极性的氨基酸残基置换丝氨酸24。

根据另外的实施方案，所述被改变的磷酸化位点通过化学改性获得。根据一些实施方案，化学改性选自：糖基化、氧化、永久磷酸化、还原、十四烷基化、硫酸盐化、酰化、乙酰化、ADP核糖基化、酰胺化、羟基化、碘化、甲基化和封闭基团衍生化。

根据另一方面，本发明提供一种编码抗血管生成的PEDF变体或其类似物或融合蛋白的离析多核苷酸序列，它包含具有人类PEDF核苷酸序列SEQ ID NO：6的变体或其片段，该变体或其片断编码包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白，条件是：所述PEDF变体不同于仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点组成的变体。

根据一些实施方案，本发明提供一种编码抗血管生成PEDF变体的离析多核苷酸序列，它包含具有人类PEDF核苷酸序列SEQ ID NO：6的变体，该变体编码包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体，条件是所述PEDF变体不同于仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点组成的变体。

根据一些实施方案，所述离析多核苷酸序列编码抗血管生成的PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白，其中所述PEDF包含选自下述组的两个被改变的磷酸化位点：丝氨酸24和丝氨酸227；以及丝氨酸114和丝氨酸227。

根据一些优选实施方案，该离析多核苷酸序列编码抗血管生成的PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白，其中所述PEDF包含在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227的三个被改变的磷酸化位点。

根据一些实施方案，由离析多核苷酸序列编码的包含三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白具有神经营养活性。根据另外的实施方案，由离析多核苷酸序列编码的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的三个被改变的磷酸化位点被带负电荷的氨基酸残基置换。根据一个示例性实施方案，编码包含被带负电荷的氨基酸残基置换的三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成的PEDF变体或其类似物或融合蛋白的离析多核苷酸序列包含SEQ ID NO：7或其片段。根据一个特定的示例性实施方案，编码PEDF变体的离析多核苷酸序列包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

根据另外的实施方案，离析多核苷酸序列编码包含三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成的PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白，其中抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的丝氨酸24和丝氨酸114被非极性的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被选自下述组的氨基酸残基置换：带负电荷的氨基酸残基和非极性的氨基酸残基。根据一些示例性实施方案，编码抗血管生成的PEDF变体或其类似物或融合蛋白的离析多核苷酸序列包含从由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9或其片段所组成的组中选择的核苷酸序列。根据特定的示例性实施方案，编码PEDF变体的离析多核苷酸序列包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

根据进一步的实施方案，由离析多核苷酸序列编码的包含三个被改变的磷酸化位点的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白基本上缺乏神经营养活性。根据一些实施方案，离析多核苷酸序列编码抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白，其中该抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的丝氨酸24和丝氨酸114被带负电荷的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被非极性的氨基酸残基置换。根据一个示例性实施方案，编码抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋白的离析多核苷酸序列包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或其片段。根据特定的示例性实施方案，编码PEDF变体的离析多核苷酸序列包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

根据进一步的方面，本发明提供一种表达载体，该表达载体包含编码根据本发明原理的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的离析多核苷酸序列。

根据更进一步的方面，本发明提供一种包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码根据本发明原理的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的离析多核苷酸序列。

根据另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含：作为活性成分的根据本发明原理的抗血管生成的PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段；以及药学上可接受的载体。

根据进一步的方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含：作为活性成分的根据本发明原理的编码抗血管生成的PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段的离析多核苷酸序列；以及药学上可接受的载体。

根据更进一步的方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含：作为活性成分包含离析多核苷酸序列的表达载体，其中所述离析多核苷酸序列编码根据本发明原理的抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段；以及药学上可接受的载体。

根据更进一步方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含：作为活性成分的包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码根据本发明原理的抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段的离析多核苷酸序列；以及药学上可接受的载体。

根据另一方面，本发明提供一种用于治疗患者与新血管形成相关的疾病或病症的方法，该方法包括为有相应需要的患者施用治疗有效量的根据本发明原理的药物组合物。

根据一些实施方案，与新血管形成相关的疾病或病症从由癌症、眼疾和用抗血管生成因子治疗的病症所组成的组中选择。

根据另外的实施方案，与新血管形成相关的疾病或病症是选自下述组的癌症：肉瘤、癌瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤导管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、维尔姆斯氏瘤子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑色素瘤和神经母细胞瘤。

根据另外的实施方案，用本发明的方法治疗的眼疾从由以下所组成的组中选择：新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜母细胞瘤、晶体后纤维组织增生、葡萄膜炎、早熟性视网膜病、黄斑变性、角膜移植片新血管形成、视网膜肿瘤和脉络膜肿瘤。根据进一步的实施方案，用抗血管生成因子治疗的病症从由以下所组成的组中选择：血管瘤、关节炎、牛皮癣、血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑、血友病性关节病和肥厚性瘢痕。

根据进一步的方面，本发明提供一种用于治疗患者神经变性病状的方法，该方法包括为有相应需要的患者施用治疗有效量的根据本发明原理的药物组合物。

根据一些实施方案，神经变性病状从由以下所组成的组中选择：多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、重症肌无力、运动原神经病、格-巴二氏综合症、自身免疫神经病、Lambert-Eaton类重症肌无力综合征、肾上腺炎神经疾病、肾上腺炎小脑萎缩、非肾上腺炎僵人综合症、渐进性小脑萎缩、Rasmussen氏脑炎、肌萎缩侧索硬化、Sydeham舞蹈病、Tourette综合症、自身免疫性多内分泌病、免疫异常性神经病、获得性神经性肌强直、多关节弯曲症、视神经炎和全身肌强直综合症。

根据另外的方面，本发明提供与选自下述组的多肽特异性结合的离析抗体或其片段：(a)包含源自人类PEDF(SEQ ID NO：1)的改性氨基酸序列的抗血管生成PEDF变体，该变体包含至少一个带负电荷的被改变的磷酸化位点；(b)(a)的片段；(c)(a)或(b)的类似物，其中所述离析抗体不结合具有非磷酸化丝氨酸或不带负电荷的被改变的磷酸化位点的相应人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO：1。

根据一些实施方案，本发明提供了特异性结合人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO：1的变体的离析抗体或其片段，该变体或其片段包含至少一个带负电荷的被改变的磷酸化位点，其中所述离析抗体不结合具有一个非磷酸化丝氨酸或一个不带负电荷的被改变的磷酸化位点的相应的人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO：1。

根据另外的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到包含一个在丝氨酸24处的被改变的磷酸化位点的PEDF变体或其片段或类似物。根据示例性的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含选自SEQ IDNO：2、5、11和12的氨基酸序列的PEDF变体。

根据进一步的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含一个在丝氨酸227处的被改变的磷酸化位点的PEDF变体或其片段或类似物。根据示例性的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到包含选自SEQID NO：2、3和13的氨基酸序列的PEDF变体。

根据另外的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含一个在丝氨酸114处的被改变的磷酸化位点的PEDF变体或其片段或类似物。根据示例性的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到包含选自SEQID NO：2、5、12和14的氨基酸序列的PEDF变体。

根据进一步的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点的PEDF变体或片段或其类似物。根据示例性的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到包含选自SEQ ID NO：2、5和12的氨基酸序列的PEDF变体。

根据更进一步的实施方案，所述离析抗体或其片段特异性结合到包含在丝氨酸24和丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点的PEDF变体或片段或其类似物。根据示例性的实施方案，该离析抗体或其片段特异性结合到包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PEDF变体。

根据另外的实施方案，所述离析抗体或其片段选自多克隆抗体、单克隆抗体、Fab、F(ab)2、嵌合抗体和单链抗体。

根据进一步的方面，本发明提供一种产生本发明的PEDF变体的方法，该方法包括：在促进PEDF变体或其片段或类似物的表达的条件下，培养含有编码本发明的PEDF变体、其片段或类似物的多核苷酸的原核和/或真核宿主细胞，以及随后回收该变体或其片段或类似物。

结合附图、说明书、实施例和所附权利要求，可以更好地理解本发明的这些和其他实施方案。

附图简述

图1A-D示出PEDF的CK2和PKA磷酸化之间的相互影响。图1A，在不同pH的缓冲液(已指出)中预透析的重组PEDF(rPEDF)和S24、114E变体(EE)被PKA磷酸化。SDS凝胶用考马斯蓝染色(下图)，并经过放射自显影(上图)。图1B，用在磷酸化之前经过热处理的rPEDF和S24、114E变体(EE)进行图1A的实验。图1C，在不同pH的缓冲液(已指出)中预透析的rPEDF和S24、114A变体(AA)由PKA磷酸化，在磷酸化之前经过或没有经过热处理。磷酸化的产物通过SDS-PAGE和放射自显影(上图)或通过用抗PEDF抗体进行免疫印迹(下图)来分析。图1D，血浆PEDF(plPEDF)、rPEDF、S227A和S227E变体由CK2磷酸化，在磷酸化之前经过或没有经过热处理。如在图1A的图中所描述的来分析磷酸化的产物。

图2A-C示出体外PEDF的CK2和PKA磷酸化。图2A示出PEDF变体的图示，其中Ser24、Ser114和/或Ser227被置换为Ala或Glu。图2B和2C，rPEDF和rPEDF变体由CK2(图2B)或由PKA(图2C)磷酸化，且磷酸化的产物通过SDS-PAGE后放射自显影(上图)并用抗PEDF抗体进行免疫印迹(下图)来分析。

图3A-C示出在人类脐带血管内皮细胞(human umbilical vascularendothelial cell，HUVEC)中rPEDF变体对ERK活化和增殖的影响。图3A，用指示的rPEDF变体刺激HUVEC。胞浆提取物用抗磷酸ERK抗体(αpERK，上图)或抗普通ERK抗体(αgERK，下图)进行免疫印迹。指示ERK2和ERK1的位置。图3B，图1A中的结果的定量分析，表示为ERK1和ERK2两者的ERK活化。图3C，用血浆(pl)PEDF、rPEDF或PEDF变体培养HUVEC。在48个小时后，用亚甲蓝法测定细胞数量。

图4A-B示出rPEDF及其变体对PEDF诱导的神经营养活性的影响。图4A，用rPEDF或rPEDF变体培养视网膜母细胞瘤Y-79细胞。在细胞附着到聚-D-赖氨酸涂布的平板上7天之后，通过倒置显微镜观察细胞形态。图4B，在图4A图中呈现结果的定量分析。^*P<0.01；^**P<0.05表示用rPEDF处理的细胞与用各种PEDF变体处理的细胞之间的比较。

图5A-B示出PEDF变体对中等的bFGF诱导的新血管形成的抗血管生成活性。图5A，在存在或没有bFGF(300ng/ml)的情况下，给CD-1裸鼠皮下注射0.5ml包含rPEDF、plPEDF和PEDF变体的基质胶(Matrigel)。对照塞(plug)仅用PBS或bFGF处理。7天之后，宰杀小鼠，塞经过H&E染色并且在光学显微镜(×40放大)下拍照。图5B，通过计数3个不同横截面面积的血管的数目/视野(field)来量化血管生成。^*P<0.01表示在用bFGF处理的塞和用bFGF和PEDF变体处理的塞之间的差异的统计显著性。

图6A-B示出PEDF变体对大范围的bFGF诱导的新血管形成的抗血管生成活性。图6A，在存在或没有bFGF(500ng/ml)的情况下，给CD-1裸鼠皮下注射0.5ml包含PEDF变体的基质胶。对照塞仅用PBS或bFGF处理。7天之后，宰杀小鼠，塞经过H&E染色并且在光学显微镜(×40放大)下拍照。图6B，通过计数3个不同截面面积的血管的数目/视野来量化血管生成。^**P<0.05表示在用bFGF和EEE变体处理的塞和用bFGF和EEA或S24、114E变体处理的塞之间的差异的统计显著性。

图7示出PEDF的差别磷酸化状态和它们对PEDF功能的影响的图示。

图8A-B示出EEE三重变体对无胸腺小鼠中DU145异种移植物生长的影响。图8A，用EEE变体处理植入DU145细胞的CD-1裸鼠。用PBS处理对照组。肿瘤体积相比较于其初始大小呈现倍增。图8B，第36天的肿瘤照片。左边，从PBS处理的组切离的肿瘤。右边，从EEE变体处理的组切离的肿瘤。

图9A-C示出通过抗CK2或抗PKA磷酸化PEDF多克隆抗体识别PEDF变体。图9A，重组PEDF(r)或血浆PEDF(pl)经过αpSer24、αpSer227或αPEDF抗体免疫印迹。图9B，rPEDF或plPEDF用马铃薯酸性磷酸酶(PAP)处理，然后用αpSer24、αpSer227或αPEDF抗体进行免疫印迹。对照试样不进行处理。图9C，rPEDF、EEA、AAE、EEE或AAA变体用αpSer24、αpSer227或αPEDF抗体进行免疫印迹。

发明详述

本发明提供包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体、其片段、类似物和融合蛋白。本发明也提供了编码PEDF变体、其片段、类似物和融合蛋白的离析核酸，该PEDF变体、其片段、类似物和融合蛋白包含多个被改变的磷酸化位点并具有抗血管生成活性。

根据本发明，自然存在的人类PEDF(SEQ ID NO：1)包含两个CK2磷酸化位点和一个PKA磷酸化位点。CK2磷酸化位点位于丝氨酸残基24和114，而PKA磷酸化位点位于位点227的丝氨酸残基。

根据一个方面，本发明提供一种离析的抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋白，它包含SEQ ID NO：1或其片段的氨基酸序列，该SEQID NO：1或其片段包含多个被改变的磷酸化位点。

术语“PEDF变体”在这里是指相对于自然存在的PEDF而包含改性的或被改变的氨基酸序列的PEDF蛋白质，其中至少两个、优选至少三个磷酸化位点被改变，该变体保留抗血管生成活性。应该理解，本发明尤其涉及人类PEDF(SEQ ID NO：1)，但是由于人类PEDF和源自其他哺乳动物的PEDF之间具有高度同源性，所以本发明涵盖其他哺乳动物如小鼠、牛、猪等等的PEDF。

通常以离析形式提供PEDF变体。术语“离析”指变体从自然地伴随天然序列的其他生物组分中分离出来，所述其他生物组分例如蛋白质、多核苷酸等。优选地，PEDF变体被提纯至同质性的。

术语“多个”被改变的磷酸化位点指至少两个被改变的磷酸化位点、优选地至少三个被改变的磷酸化位点。

根据一些实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物或融合蛋白包含两个选自下述组的磷酸化位点：丝氨酸24和丝氨酸227；以及丝氨酸114和丝氨酸227。在丝氨酸24和丝氨酸114处均包含被改变的磷酸化位点的PEDF变体被排除在本发明之外。

根据一些优选的实施方案，抗血管生成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白包含在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点。

根据一些实施方案，本发明提供一种与野生型重组PEDF相比较具有减少的神经营养活性的PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白。优选地，PEDF变体、其片段或类似物具有神经营养活性。

在这里使用的术语“片段”指PEDF的全长氨基酸序列的任何一部分，该部分具有比PEDF的全长氨基酸序列少的氨基酸，例如少于人类PEDF(SEQ ID NO：1)的418个氨基酸，该部分仍然包含多个被改变的磷酸化位点并且仍然保有抗血管生成活性。通常，全长蛋白质的一部分是肽、多肽或蛋白质。“肽”表示由不超过50个氨基酸组成的氨基酸序列。“多肽”表示通常由超过50个氨基酸残基组成的氨基酸序列。“蛋白质”表示一个或多个共价键合的多肽链。术语肽、多肽和蛋白质在本说明书中可互换使用。

在这里使用的术语“抗血管生成的”活性被用来定义PEDF变体减少或抑制内皮细胞增殖和/或减少或抑制内皮细胞迁移和/或诱导内皮细胞凋亡和/或减少或抑制新血管形成的能力。抗血管生成活性可以用本领域中已知的各种方法检测。用于测定血管生成的或抗血管生成的活性的体外试验或体内试验的例子包括小鼠角膜新血管形成、鸡绒毛尿胶囊膜试验、兔角膜囊袋试验、主动脉环试验和基质胶塞中新血管形成的试验(还参见下文实施例)。

在这里使用的术语“类似物”指相比较于自然存在的PEDF(优选地是SEQ ID NO：1的人类PEDF)具有改性氨基酸序列的PEDF肽、多肽或蛋白质，它包含多个被改变的磷酸化位点和至少一种氨基酸置换、添加、缺失和/或化学改性。对于使用“氨基酸置换”，意思就是功能上等效的氨基酸残基置换该序列中的残基，导致静态改变(Silent change)。例如，在序列里的一个或多个氨基酸残基可被另一相似极性的氨基酸置换，该相似极性的氨基酸充当功能等效物，这就获得静态改变。在序列内氨基酸的置换物可以从该氨基酸所属类别的其他成员中选择。例如，非极性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性的)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此类置换被认为是保守置换。另外，本发明包含非保守置换。可以进行非保守置换以使得PEDF变体、其类似物或片段的生物活性(例如，抗血管生成活性)被保留或者被提高。应该明白，本发明包含PEDF类似物，其中至少两个氨基酸残基被其他氨基酸置换以产生PEDF变体的抗血管生成类似物，相比较于自然存在的PEDF或野生型重组PEDF，该类似物具有增加的稳定性或更长的半衰期。

本发明的类似物包括与人类PEDF(SEQ ID NO：1)或其片段至少具有70％相似性的肽、多肽或蛋白质，优选地与人类PEDF(SEQ ID NO：1)或其片段至少具有80％同源性，更优选地与人类PEDF(SEQ ID NO：1)或其片段至少具有90％同源性，最优选地与人类PEDF(SEQ ID NO：1)或其片段至少具有95％同源性。通过比较一种多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸置换物和另一种多肽的序列，确定两种多肽之间的术语“相似性”。

在这里使用的术语“被改变的磷酸化位点”指通过氨基酸置换和/或化学改性而改变磷酸化位点。应该明白，在一个磷酸化位点中丝氨酸或苏氨酸残基的置换意思是指保守的、但优选地是指非保守的置换。因此，位于CK2或PKA的磷酸化位点的丝氨酸残基置换包括置换成非极性的氨基酸、置换成带负电荷的氨基酸或置换成带正电荷的氨基酸、优选地置换成带负电荷的氨基酸。在这里使用的术语“改性氨基酸”指通过氨基酸置换和/或化学改性的氨基酸改变。术语改变和改性在说明书和权利要求中可互换地使用。

由于在蛋白质中的一个丝氨酸残基的磷酸化与一个带负电荷的磷酸基团添加到该丝氨酸相关联，所以，带负电荷的氨基酸对丝氨酸的置换模仿磷酸化的丝氨酸并因此用于表征该磷酸化的生物学意义。重要的是，尽管磷酸化的蛋白质通过体内磷酸酶活性而被去磷酸化，但是带负电荷的氨基酸对丝氨酸的置换产生了在那个位点有永久带负电荷的氨基酸的蛋白质。

如下文所示，由谷氨酸残基对在重组人类PEDF的24、114和227位点的丝氨酸残基进行置换，得到具有高抗血管生成和神经营养活性的PEDF变体。把在位点24和114的丝氨酸残基置换成谷氨酸，同时把在位点227的丝氨酸残基置换成丙氨酸，得到具有抗血管生成活性但几乎无神经营养活性的PEDF变体。把在位点24和114的丝氨酸残基置换成丙氨酸而把在位点227的丝氨酸残基置换成谷氨酸，得到的PEDF变体具有低于重组野生型PEDF的神经营养活性但类似于重组野生型PEDF的抗血管生成活性。把所有三个丝氨酸残基置换成丙氨酸，得到具有类似于重组野生型PEDF的神经营养活性和抗血管生成活性的PEDF变体。

术语“神经营养”活性在此定义为诱导神经细胞表型分化的能力。例如，PEDF诱导所培养的视网膜母细胞瘤细胞分化的能力被认为是神经营养活性。PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白可以基本上缺乏神经营养活性。谈及基本上缺乏神经营养活性，意思是指PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白具有不超过20％的重组野生型PEDF神经营养活性，优选地不超过重组野生型PEDF神经营养活性的10％，更优选地不超过5％。

本发明包含含有化学改性氨基酸残基的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白。氨基酸残基的改性包括但不限于糖基化、氧化、永久磷酸化、还原、十四烷基化、硫酸化、酰化、乙酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、环化、二硫键形成、羟基化、碘化、甲基化、保护/封闭基团衍生化或在本领域中已知的任何其他衍生化方法。这样的改性可以在PEDF变体、其类似物或片段的序列的任何位置发生，包括肽主链、氨基酸支链、氨基或羧基末端。

包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体、片段及其类似物可通过在本领域中已知的各种方法产生，包括重组产生或合成产生。重组产生可通过使用编码PEDF变体、其片段或类似物的离析多核苷酸实现，该离析多核苷酸可操作连接到用于多核苷酸表达的启动子。任选地，增加该启动子的调节子、核糖体结合位点、翻译起始和转录终止子。包含编码PEDF变体、其片段或类似物的多核苷酸、启动子和任选地调节子、核糖体结合位点、翻译起始和转录终止子的构建体可置于载体中，如质粒、病毒或噬菌体载体。载体可用于转染或转化宿主细胞，例如细菌、酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞。

本发明也包含通过使所述PEDF变体或其类似物经过至少一种裂解剂处理而产生的PEDF片段。裂解剂可以是化学裂解剂如溴化氰，或者可以是酶，优选地可以是内切蛋白酶。可用于切割PEDF变体或其类似物的内切蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或在本领域中已知的产生蛋白水解片段的任何其他酶。

合成的肽、多肽或蛋白质是本领域公知的，且可以商业途径获自多个公司。包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体、片段或其类似物可使用标准直接肽合成法合成(参见Bodanszky，1984，Principles of PeptideSynthesis(肽合成原理)，Springer-Verlag，Heidelberg)，例如通过固相合成法(例如，参见Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。固相肽合成方法的例子包括把叔丁基氧化羰基用作α氨基保护基团的BOC方法以及利用9-亚芴基甲基氧化羰基保护氨基酸残基的α-氨基的FMOC方法，这两种方法在本领域中广为人知。此外，如果需要，非经典的氨基酸或化学氨基酸类似物可作为置换物或添加物引入PEDF变体、其片段或类似物中。非经典的氨基酸包括但不限于：oc-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸等等。

本发明进一步包含PEDF变体、其片段或类似物，它们可以包含PEDF的氨基酸的一种或多种D-异构体形式。一旦使用本发明，产生逆反D-氨基酸的PEDF肽就是简单的事情，其中该肽用所公布的相同氨基酸制备，但至少一种氨基酸或也许所有的氨基酸是D-氨基酸。当在肽中的所有氨基酸都是D-氨基酸且分子的N-和C-末端逆转时，得到这样一种分子：该分子与其L-氨基酸形式在相同的位点具有相同的结构基团。但是，在对抗蛋白水解降解方面，这种分子更稳定，因此可用于在此叙述的许多应用中。

本发明的范围包括含有PEDF变体、其片段或类似物的嵌合蛋白或融合蛋白，该PEDF变体、片段或其类似物在其氨基或羰基末端或者在一个支链处经由肽键与不同蛋白质的氨基酸序列连接。这样的嵌合蛋白可用蛋白质合成法制备，例如，通过使用肽合成器，或通过使用在本领域中已知的方法使编码所需要的氨基酸序列的适当核酸序列以适当的编码框架互相连接，以及通过在本领域中众所周知的方法表达嵌合蛋白。

根据另一方面，本发明提供一种离析多核苷酸序列，它包含源于人类PEDF核苷酸序列SEQ ID NO：6的改性核苷酸序列，该人类PEDF核苷酸序列SEQ ID NO：6编码包含源于包含多个被改变的磷酸化位点的SEQ IDNO：1的改性氨基酸序列的抗血管生成的PEDF变体或片段、其类似物或融合蛋白，条件是：相比于仅由两个在丝氨酸24和丝氨酸114被改变的磷酸化位点所组成的SEQ ID NO：1，该离析多核苷酸序列不编码包含一种改性氨基酸序列的PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白。简单起见，在下文说明中使用的术语“PEDF变体”应该被解释成包括PEDF变体的所有形式，包括含有多个被改变的磷酸化位点的其类似物、片段及融合蛋白，并具有抗血管生成活性。

应该理解，这里使用的术语“改性核苷酸序列”和“核苷酸序列变体”指相对于人类PEDF的核苷酸序列SEQ ID NO：6而改变的核苷酸序列，所述改变优选地通过导致在磷酸化位点的不同氨基酸的核苷酸置换。

术语“多核苷酸”意指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的聚合体，该聚合体可源自于任何源，可以是单链或双链，并且可以任选包含能够掺入DNA或RNA聚合体的合成的、非天然的、或被改变的核苷酸。

“离析多核苷酸”指与自然存在状态下在其侧面的序列分离的多核苷酸区段或片段，例如，从通常毗邻该片段的序列中移出的DNA片段，所述序列例如在基因组中自然存在的与基因组片段毗邻的序列。该术语也适用于完全从天然伴随核酸(例如RNA或DNA)的其他成分或在细胞中天然与之伴随的蛋白质提纯而来的多核苷酸。因此该术语包括例如：掺入载体、自主复制的质粒或病毒或者原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其他序列的单独分子(例如，作为通过PCR或限制酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)而存在的重组DNA。也包括重组DNA和RNA如mRNA，其中该重组DNA是编码另外的多肽序列的杂合基因的部分。

术语“编码”指在离析多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的固有性质，用作生物过程中其他聚合体和大分子的合成模板，其中所述聚合体和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA，tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果对应于所述一种基因的转录和mRNA的翻译在细胞或其他生物系统内产生一种多肽或蛋白质，则该基因就编码该多肽或蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并通常在序列表中提供的编码链以及被用作基因或cDNA的转录模板的非编码链，可以说是编码该基因或cDNA的多肽或蛋白质或其他产物。

本领域的技术人员应明白，正如所谓的“Wobble规则”所给出的那样，考虑到遗传密码的简并以及允许把在密码子的第三个位点上的经典碱基配对排除在外，多种核酸可以编码任何给定的多肽或蛋白质。此外，包括或多或少的核苷酸的多核苷酸可产生相同的或等价的多肽或蛋白质。因此，本发明预期包含编码SEQ ID NO：2到SEQ ID NO：5的氨基酸序列及其类似物、片段或融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸也具有在框架中被融合到标记序列的编码序列，这允许本发明多肽的提纯。对于细菌宿主的情况，标记序列可以是六联组氨酸标签(six histidine tag)，对于哺乳动物宿主的情况，标记序列可以是血凝素(HA)标签。

编码野生型或自然PEDF蛋白质的多核苷酸序列是已知的(例如，参见公布的国际专利申请第WO 95/33480和WO 93/24529号)，可从在此讨论的多肽序列推断出其他多核苷酸序列。根据特定的实施方案，本发明提供一种多核苷酸序列，它编码从SEQ ID NO：7到SEQ ID NO：10中选择的PEDF变体。

PEDF多核苷酸可以被表达成被转运的蛋白质，其中PEDF变体从包含多核苷酸的宿主细胞在其中生长的培养基中离析出来，或可以通过缺失前导或其他肽而被表达成胞内蛋白质，此种情况下PEDF从宿主细胞离析出来。然后，这样离析出来的PEDF用在本领域中已知的蛋白质提纯方法提纯。

通过把包含编码PEDF变体、其片段或类似物的离析多核苷酸的表达载体传递至与感兴趣的组织相关的细胞，PEDF变体、类似物或其片段可被提供给该感兴趣的组织。所述细胞产生并分泌该PEDF多肽变体，以使得其被合适地提供给该组织里面的细胞以在感兴趣的组织内发挥生物活性，例如抗血管生成活性或神经营养活性。因此，包含PEDF变体的表达载体通常包括与已知PEDF序列同源的离析多核苷酸序列，例如，它们将会在至少低严紧条件下、更优选地在中严紧条件下、最优选地在高严紧条件下与已知序列的至少一个片段杂交(采用在Sambrook等.，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor出版社中所提出的低、中、高严紧性的定义)。

除了编码PEDF变体多肽的离析多核苷酸序列之外，表达载体包含启动子。在本发明上下文中，启动子必须能够驱动PEDF多核苷酸在细胞内的表达。许多病毒启动子适合用于这样的表达盒，例如逆转录病毒ITR、LTR、即时早期病毒启动子(IEp)如疱疹病毒IEp(例如ICP4-IEp和ICP0-IEp)和巨细胞病毒(CMV)IEp、以及其他病毒启动子(例如，晚期病毒启动子、潜伏活性启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子以及鼠白血病病毒(MLV)启动子)。其他合适的启动子是真核启动子，包含增强子序列(例如兔β-球蛋白调节元件)、组成活性启动子(例如β-肌动蛋白启动子等)、信号和/或组织特异性启动子(例如可诱导的和/或可抑制的启动子，如响应于TNF或RU486的启动子、金属硫蛋白启动子等)、以及肿瘤特异性启动子。

在表达载体内，编码PEDF变体或其类似物或片段的多核苷酸和启动子可操作地连接，以使得启动子能够驱动编码PEDF变体、其类似物或片段的多核苷酸表达。只要维持这一可操作的连接，则表达载体可包括超过一个的基因，如通过内部核糖体进入位点(IRES)分隔的多个基因。此外，表达载体任选包括其他元件，如剪切位点、多腺苷酸化序列、转录调节元件(例如增强子、沉默子等)或其他序列。

表达载体必须以使得它们能够表达其中含有的编码PEDF变体、其片段或类似物的离析多核苷酸的方式被引入到细胞内。可以这样使用任何合适的载体，这些载体中有许多在本领域中都是已知的。此类载体的例子包括裸DNA载体(如寡核苷酸或质粒)、病毒载体如腺相关病毒载体(Berns等.，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.772：95-104)、腺病毒载体、疱疹病毒载体(Fink等.，1996，Ann.Rev.Neurosci.19：265-287)、包装扩增子(Federoff等.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1636-1640)、乳头状瘤病毒载体、小核糖核酸病毒载体、多瘤病毒载体、逆转录病毒载体、SV40病毒载体、牛痘病毒载体和其他载体。除了感兴趣的表达载体之外，载体也可包括其他遗传元件，例如编码选择性标记物的基因(例如，β-gal或赋予毒素抗性的标记物)、药理活性蛋白质、转录因子或其他生物活性物质。

用于操纵包含离析多核苷酸的载体的方法在本领域中广为人知(例如参见上文Sambrook等)，包括直接克隆、使用重组酶的位点特异性重组、同源重组和其他合适的构建重组载体的方法。以此方式，可以将表达载体构建为它可在任何需要的细胞中复制、在任何需要的细胞中被表达、甚至可被整合入任何需要的细胞的基因组中。

通过任何适于将DNA转移到细胞之内的方法，把PEDF变体表达载体引入到细胞之内。许多这样的方法在本领域中广为人知(上文Sambrook等.；同样参见Watson等.，1992，Recombinant DNA(重组DNA)，第12章，第2版，Scientific American Books)。因此，对于原核细胞的情况，可以例如通过电穿孔、转化、转导、接合或转移来实现载体导入。对于真核细胞，导入载体可以通过使用例如电穿孔、转染、感染、DNA涂敷微轰击粒子或原生质体融合。

如果有必要，在可诱导启动子的控制下PEDF变体多核苷酸已经被转移到其中的细胞，可用作瞬时转化体。然后，这样的细胞自身可以被转移到哺乳动物中以获得其中的治疗益处。通常，细胞被转移到哺乳动物的一个部位，以使得在其中表达并从其中分泌的PEDF变体接触预期的细胞如内皮细胞，以便发挥PEDF活性，例如抑制血管生成。或者，特别地，对于在体外已经把载体加入到其中的细胞的情况，细胞可以首先经过几轮克隆选择(通常通过在载体中使用选择性标记序列来帮助)以选择稳定的转化体。然后，此类稳定转化体被转移到哺乳动物中以获得其中的治疗益处。

通过把包含编码本发明PEDF变体的离析多核苷酸的载体转染到其他细胞群中，PEDF变体也可以被提供给细胞例如内皮细胞，由此PEDF变体在所述其他细胞中表达并从中分泌。之后，这样转染的其他细胞群被转移到哺乳动物的一个部位，其中这样分泌的PEDF变体接触这些细胞例如内皮细胞并抑制血管生成。PEDF变体从所述其他细胞的表达和分泌有益于感兴趣的细胞。没有必要把编码PEDF变体的多核苷酸稳定整合入细胞。在细胞里，可以从非整合或整合的多核苷酸表达和分泌PEDF变体。

在细胞里面，PEDF变体多核苷酸被表达成使得细胞表达和分泌PEDF变体多肽。可使用标准的分子生物学技术(例如Northern杂交、Western印迹、免疫沉淀反应、酶免疫测定等等)评估多核苷酸的成功表达。在本领域中已知用于检测来自转染细胞的PEDF基因的表达和PEDF变体的分泌的试剂(也参见下文中的实施例)。

通过重组技术产生的PEDF变体可以被提纯，以使得当它被施用患者时是大致纯的。术语“大致纯”指一种化合物(例如蛋白质或多肽)被从自然伴随它的成分中分离出来。通常，当试样中至少50％、更优选地至少60％、更优选地至少75％、更优选地至少90％、最优选地至少99％的总材料(按体积，按湿重或干重，或按摩尔百分比或摩尔分数)是感兴趣的化合物时，该化合物就是大致纯的。可用任何适当的方法测量纯度，例如对于多肽或蛋白质的情况用柱色谱、凝胶电泳或HPLC分析。当基本不受自然结合成分影响或当从以天然状态伴随的自然杂质分离时，化合物如多肽或蛋白质也是大致纯的。

抗体

多种免疫原可用来产生可与包含多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体特异性反应的抗体。重组全长PEDF变体或其片段可用于产生抗体。由在此描述的PEDF变体蛋白质序列获得的合成肽也可作为免疫原用于产生抗体(见下文的实施例8)。在真核细胞或原核细胞中，重组蛋白质可被表达、提纯并用作免疫原。如果合适，自然地倍增或变性的蛋白可用于产生抗体。可以生成单克隆抗体或多克隆抗体。

应该明白，当术语“抗体”被使用时，其意思是包括完整抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体(mAb))及其蛋白水解的片段(例如Fab或F(ab′)2片段)。本发明的范围进一步包含嵌合抗体、人类抗体和人源化抗体、重组和工程抗体及其片段。此外，编码抗体可变区的DNA可被插入编码其他抗体的DNA中，以产生嵌合抗体(例如，见美国专利第4,816,567号)。单链抗体落在本发明范围内。

产生多克隆抗体的方法为本领域中的技术人员所知道。通常，免疫原，优选为提纯的蛋白质，与辅助剂混合，用该混合物免疫动物。通过进行试验采血并测定对目标PEDF变体或片段的反应滴度，来监测动物对免疫原制剂的免疫反应。当获得适当高的针对免疫原的抗体滴度时，通常在重复免疫之后，从该动物采血并制备抗血清。如果需要，可进行抗血清的进一步分级分离以富集对蛋白质有反应的抗体(例如，见Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册，CSH出版社，其内容通过引用合并于此，如同在此完整描述)。

可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术获得单克隆抗体。通常，一般通过和骨髓瘤细胞进行融合，使来自用所希望的抗原免疫的动物的脾细胞无限增殖(见Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6：511519，通过引用结合入本文)。无限增殖化的替代方法包括用Epstein Barr病毒、致癌基因或逆转录病毒的转化，或在本领域中已知的其他方法。筛选单个无限增殖细胞产生的菌落，以产生具有所需要的抗原特异性和亲合力的抗体，并且可通过包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔在内的各种技术提高由这种细胞产生的单克隆抗体的产量。或者，例如，依照(Huse，等.(1989)Science，246：1275-1281)中概述的一般方法，通过筛选来自人类B细胞的DNA库，可以把编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列离析出来。

其它合适的技术包括在噬菌体或类似载体中选择抗体库。例如，见Huse，等.(1989)Science，246：12751281，和Ward，等.(1989)Nature，341：544546。可以在存在或没有改性的情况下使用本发明的抗体。然而，可以通过共价地或非共价地连接提供可检测信号的物质来标记抗体。多种标记物和轭合技术广为人知，并且在科学文献和专利文献中都被广泛地报导。合适的标记物包括放射性试剂、酶类、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性粒子等等。

药物组合物和给药途径

本发明提供了药物组合物，其包含：治疗有效量的具有抗血管生成活性的PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白以及药学上可接受的载体，该PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白包含多个被改变的磷酸化位点。

本发明药物组合物可配制为本发明的蛋白质、多肽或肽的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指从药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐，该无毒碱或酸包括无机碱或有机碱以及无机酸或有机酸。由无机碱获得的盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰盐、锰、钾、钠、锌等等。由药学上可接受的有机无毒碱获得的盐包括下述的盐：伯胺、仲胺和叔胺的盐；取代胺，包含天然取代胺；环胺；和阳离子交换树脂，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N′N-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、海葱次苷(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇等等。

当本发明的蛋白质、多肽或肽是碱性时，可以从药学上可接受的、包括无机酸和有机酸在内的无毒酸制备盐。这样的酸包括乙酸、苯磺酸、安息香酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、黏酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和邻甲苯磺酸等等。尤其优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。

术语“药学上可接受的”指美国联邦政府或州政府的管理机构批准的，或在美国药典或其他通常公认的药典中列出用于动物的、特别是用于人类的。术语“载体”指通过它们施用治疗化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。上述药物载体可以是无菌液体，例如水和油，其中油包括：石油、动物油、植物油或合成来源的油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。当静脉施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体，尤其是用作可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、乙醇等等。如果需要，所述组合物也可包含较少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。也包括诸如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯的抗菌剂、诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂、诸如乙二胺四乙酸的螯合剂、以及诸如氯化钠或葡萄糖的张力调节剂。

所述组合物可采取如下形式：溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等等。所述组合物可与传统的粘合剂和载体如甘油三酸酯、微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述了合适的药物载体的例子。所述组合物将包含治疗有效量的抗血管生成PEDF变体或其片段、类似物或融合蛋白(优选地以大致纯的形式)，以及适量的载体以便提供适合施用至患者的形式。

有效治疗特定病症或病状的抗血管生成PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白的量，取决于所述病症或病状的性质，并可用标准临床技术来测定。另外，可任选地使用体外检验以帮助确定最佳剂量范围。在制剂中应用的精确剂量还将取决于给药途径以及疾病或病症的严重性，并且应该依照医师的判断和每个患者的情况来决定。可以从由体外或动物模型试验生物测定或系统获得的剂量响应曲线外推出有效剂量。

根据感兴趣组织的位置，能够以适于把PEDF变体供给感兴趣组织里的内皮细胞的任何方式提供PEDF变体、其类似物或片段。因此，例如，可以把包含PEDF变体源(即上述的PEDF变体多肽、或编码PEDF变体的离析多核苷酸、或PEDF变体表达载体、或表达PEDF变体的细胞)的组合物引入体循环，体循环把PEDF源分配到感兴趣组织。或者，包含PEDF变体源的组合物可被局部地应用到感兴趣的组织(例如，注射，或者作为连续输液或肿瘤里的弹丸泵入，被应用到全部或部分皮肤表面，被滴在眼睛表面上，等等)。

包含PEDF变体源的药物组合物的引入方法包括但不限于：局部的、皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、硬膜外的、眼的以及口服的途径。以任何方便的途径施用所述化合物，例如通过输注或弹丸注射、经由上皮层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等等)的吸收，并且可以和其他治疗活性剂一起给药。给药最好是局部性的，但也可以是全身性的。另外，希望以包括脑内注射和鞘内注射在内的任何适当途径把本发明的药物组合物引入中枢神经系统；可以通过例如连接至贮器的脑内导管来帮助脑内注射。也可使用肺部给药，例如，通过使用吸入器或雾化器，并与雾化剂一起配制。

可能希望把本发明的药物组合物局部施用至需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于下述方式实现：在手术时局部输注、局部应用，例如，与手术后创伤敷料结合，通过注射、借助于导管、借助于栓剂、借助于药物贴片或借助植入物，其中所述植入物是多孔的、无孔的、或胶状的材料。根据一些优选的实施方案，可通过例如经由注射器在肿瘤或肿瘤组织或肿瘤前期组织的位置直接注射给药。

对于局部应用，基于需要的活性，抗血管生成PEDF变体、其类似物或片段可与药学上可接受的载体结合，以便递送有效剂量(即，例如从1.0pM到1.0mM的有效剂量范围，以缓解或预防局部血管生成)。载体可以是如下形式(作为例子而非限制)：软膏、乳油、凝胶、糊剂、泡沫、气溶胶、栓剂、衬垫(pad)或胶棒。

用于治疗一些眼疾的局部组合物包含在如下眼科可接受的赋形剂中的有效量的抗血管生成PEDF变体：缓冲盐水、矿物油、诸如玉米油或花生油的植物油、石蜡油、以及Miglyol 182、醇溶液或脂质体或类脂质体产品。这些组合物也可以包括防腐剂、抗氧化剂、抗生素、免疫抑制剂和其他治疗有效物质，它们对抗血管生成PEDF变体不产生有害作用。

对于定向的内部局部应用，药物组合物可以是片剂或胶囊的形式，它可以包含任何下列成分或相似性质化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；或助流剂，如胶体二氧化硅。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，还可包含诸如脂肪油的液体载体。此外，剂量单位形式可包含改变所述剂量单位的物理形式的各种其他原料，例如糖衣、虫胶或其他肠内吸收剂。

可以控制释放系统递送抗血管生成PEDF变体、其片段或类似物。在一个实施方案中，输液泵可用于施用抗血管生成PEDF变体、其片段或类似物，例如，用于把胰岛素或化学疗法递送到特定器官或肿瘤的输液泵。在一种优选的形式中，抗血管生成PEDF变体、其类似物或片段与生物可降解的、生物相容的聚合移植物结合给药，该聚合移植物在所选择的位置在控制时段内释放抗血管生成PEDF变体。优选的聚合材料的例子包括聚酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯醋酸乙烯酯、共聚物及其混合物(见，控制释放的医学应用，Langer和Wise(编辑)，1974，CRC出版社，Boca Raton，Fla.)。然而，在另一个实施方案中，可以把控制释放系统置于治疗靶附近，这样仅需要全身性剂量的一部分。

PEDF变体的用途

本发明提供一种用于治疗疾病或病症特别是与新血管形成有关的疾病或病症的方法。该治疗方法包括为有相应需要的患者施用药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的作为活性成分的PEDF源和药学上可接受的载体。按照本发明，PEDF源包括：PEDF变体多肽，即，抗血管生成PEDF变体、其片段、类似物或融合蛋白；编码本发明的PEDF多肽变体的离析多核苷酸序列；包含离析多核苷酸序列的表达载体，该离析多核苷酸序列编码本发明的PEDF多肽变体；以及用表达载体转染的宿主细胞，该表达载体包含离析多核苷酸序列，该离析多核苷酸序列编码本发明的PEDF多肽变体。

血管生成的抑制通常被认为是阻止新血管形成，不管它们是通过抽芽(sprouting)还是通过到达(arrival)而产生并随后分化成循环干细胞的内皮细胞。然而，由于已经表明PEDF诱导活化的内皮细胞的凋亡，因此在本发明上下文中血管生成的抑制也应被解释为包括PEDF变体杀伤细胞，尤其是靠近肿瘤或在肿瘤里的现有血管中的细胞。因此，在本发明上下文中，血管生成的抑制包括抑制新血管形成，该抑制作用可能伴随着或不伴随着附近现有血管的破坏。术语“新血管形成”和血管生成在本说明书和权利要求书中可互换地使用。

“治疗性”治疗是对呈现病理学病征的患者给药以减少或消除那些病征的治疗。

PEDF源的“治疗有效量”是足以为被施用PEDF源的患者提供有益作用的PEDF源的量。

有相应需要的患者可能患有与新血管形成有关的一种或多种的疾病或病症，或者可能已被判定更容易患有与新血管形成有关的疾病或病症。因此，根据本发明的治疗方法包括治疗和预防两种效用。

可用抗血管生成PEDF源治疗的新生血管性疾病是包括但不限于以下实体瘤的癌症：肉瘤、癌瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤导管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、维尔姆斯氏瘤子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

可用抗血管生成PEDF源治疗的、与新血管形成有关的眼疾包括但不限于：新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜母细胞瘤、晶体后纤维组织增生、葡萄膜炎、早熟性视网膜病、黄斑变性、角膜移植片新血管形成、眼炎性疾病、诸如视网膜肿瘤和脉络膜肿瘤的眼瘤、以及与视网膜、脉络膜或虹膜新血管形成有关的疾病。

可用抗血管生成PEDF源治疗的其他病症包括但不限于：血管瘤、关节炎、牛皮癣、血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑块、血友病性关节病和肥厚性瘢痕。

为了希望的治疗或预防活性并确定治疗有效剂量，可以在体内测定抗血管生成PEDF变体。例如，在人体试验之前，在适当的动物模型系统中测试PEDF源，该动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等等。对于体内试验，在对人类给药之前，可使用在本领域中已知的任何动物模型系统(见下文的实施例)。

根据另一方面，本发明提供一种用于治疗患者的神经变性疾病或病症的方法，该方法包含为有相应需要的患者施用治疗有效量的根据本发明原理的药物组合物和药学上可接受的载体。

“神经营养”活性在此被解释为具有诱导神经元细胞群分化的能力。例如，PEDF诱导培养的视网膜母细胞瘤细胞分化的能力被认为是神经营养活性。神经营养活性也包括神经细胞诱向活性和胶质抑制活性(Gliastaticactivity)。“神经细胞诱向”活性在此解释为提高神经元细胞群的成活率的能力。“胶质抑制”活性在此解释为抑制神经胶质细胞生长和增殖的能力。

神经元死亡和由神经胶质(神经胶质增生)引起的群体过剩代表了许多神经变性疾病以及对CNS(脑和视网膜)的其他损伤。PEDF可有效地被用于这些病状以延长初级神经元的寿命和功能作用，避免神经胶质的增加。例如，在阻断响应于CNS损伤的小神经胶质细胞活化以及在延长/保护神经元的寿命方面，PEDF源是有效的。在视网膜中，可以预测PEDF抑制马勒神经胶质细胞。由于马勒细胞与星形神经胶质相似，在阻断诸如视网膜脱离、糖尿病、视网膜色素变性等等的神经胶质增生病状以及保护视网膜神经元的寿命方面，PEDF源同样是有效的。

一般认为，移植神经元可治愈某些病变。例如，在帕金森氏症中，把特定胎儿脑细胞移植到病人体内可以减轻或治愈与该疾病有关的问题。尽管要解决的主要问题之一是延长移植细胞的寿命并使它们保持分化，例如，分泌适当的物质。用PEDF变体对细胞进行预处理可以在这两个区域中给予帮助。同样地，在植入前用包含编码PEDF变体的离析多核苷酸的载体转染神经元或星形神经胶质，这可以是在移植位置的PEDF变体的长期来源。

在尝试移植神经视网膜和光感受器细胞以帮助治愈失明方面有更多的活动。由于非分化和移植物死亡，到目前为止，还没有富有成效的尝试。PEDF源可在两方面提供帮助。具体地，在手术前，待移植的光感受器神经元可用PEDF源进行预处理。或者，能够以高水平把包含编码PEDF变体的离析多核苷酸的载体转染到相邻的视网膜色素上皮(RPE)细胞，其中它们可用作蛋白质的超常来源。现在，一些研究人员已经表明，培养的RPE细胞在被移植入试验动物的光感受器间空间中之后存活得很好。在体外，用编码PEDF基因的离析多核苷酸转染人类RPE细胞，使得这些细胞能够在视网膜移植上使用。

对于自然产生的PEDF，它可存在为高达约250nM的浓度。因为PEDF变体是无毒的，它们能够以高度浓缩的剂量供给组织。然而，由于PEDF变体的潜能，它可以被用在非常低的浓度中，如大约10nM或更低的浓度(例如，低至0.01nM)。根据包含PEDF源的组合物的剂型，它在足以延缓血管生成和/或诱导神经营养活性的时程内被供给到所希望的组织中。

在一些方案中，重复应用可以提高PEDF变体的抗血管生成活性和/或神经营养活性，在一些应用中可能需要重复应用。对于PEDF源是PEDF表达载体的情况，表达PEDF变体的细胞可以产生有效量的PEDF变体(也就是说，足以发挥PEDF的一种或多种生物活性)。

可单独或与其他治疗模式联合施用PEDF变体。把PEDF变体作为包括诸如手术、药物疗法、光动力学疗法和/或放射疗法的其他疗法的治疗方案的一部分进行给药是适当的。

实施例

材料及方法

试剂和抗体

重组人类CK2(在大肠杆菌(E.coli)中表达)从Calbiochem(达姆施塔特，德国)购买。采用如(Beavo J.A.，等，酶学方法，38C：299-308，1974)描述的方法提纯PKA的催化亚基。内皮促细胞分裂剂(ECGS)从生物医学技术公司(Biomedical Technologies Inc.)(斯托顿，马萨诸塞州，美国)购买。重组人类bFGF(在大肠杆菌中表达)、聚-L-赖氨酸(70-150kDa)和猪肠肝素从西格玛(Sigma)(圣路易斯，密歇根州)购买。基质胶从碧迪生物科技(BD Biosciences)(马萨诸塞州，美国)购买。限制酶从罗氏制药公司(Roche)(Manhemin，德国)购买。PfuDNA聚合酶从普洛麦格(Promega)(威斯康星州，美国)购买。对抗PEDF的多克隆抗体由魏兹曼科学院(Weizmann Institute of Science)的抗体部门制备。全长人类PEDFcDNA由N.Bouck博士(西北大学，芝加哥，伊利诺伊州，美国)提供。

细胞培养

人类Y-79视网膜母细胞瘤细胞在添加了2mM L-谷氨酰胺和15％胎牛血清的MEM中生长。HEK-293T细胞在添加了10％ FCS的DMEMF-12中培养。HUVEC在添加了20％ FCS、25μg/ml ECGS促细胞分裂剂和5U/ml肝素的M-199中生长。

重组PEDF(rPEDF)变体的构建

将包含Ser24和Ser114及其突变的区域的HindIII和KpnI消化片段(1-362bp)，(Maik-Rachline，G.，等等，Blood：299-308，2005和WO2006/054278，其内容通过参考合并于此)用含有各种突变的Ser227的质粒中的相同片段替换，产生三重变体。所得到的三重变体如下：

EEE变体，S24、114E插入片段与经消化的DcDNA3-S227E载体连接。

AAE变体，S24、114A插入片段与经消化的DcDNA3-S227E载体连接。

AAA变体，S24、114A插入片段与经消化的DcDNA3-S227A载体连接。

EEA变体，S24、114E插入片段与经消化的pcDNA3-S227A载体连接。

rPEDF的产生

如(Maik-Rachline，G.，等，Blood：299-308，2005)中所述，使用LipofectAMINE试剂把携带rPEDF或变体的各种质粒引入HEK-293T细胞中，并在Ni⁺²柱上提纯所分泌的蛋白质。

在此揭示的各种PEDF的氨基酸和核苷酸序列的名称和序列号(SEQID NO)如下所示：

 

氨基酸置换

名称

氨基酸SEQ ID NO：

核苷酸SEQ ID NO：

 

无	rPEDF或plPEDF	1	6
				S24,114,227E	EEE	2	7
S24,114A，227E	AAE	3	8
				S24,114,227A	AAA	4	9
S24,114E，227A	EEA	5	10
				S24E	S24E	11
S24,114E	S24,114E	12
				S227E	S227E	13
S114E	S114E	14

从人类血浆提纯PEDF

如先前所描述(Maik-Rachline，G.，等，Blood：299-308，2005)，先通过9-20％PEG切片，然后通过DEAE-Sephacel柱(2.9×40cm)和肝素琼脂糖柱，从人类柠檬酸盐血浆(IL)中提纯plPEDF。

PEDF的体外磷酸化

磷酸化试验(40μl)包含rPEDF、plPEDF或rPEDF变体(50μg/ml)。对于CK2：构成成分是CK2(4μg/ml)、甘油(2％)、NaCl(20mM)、β-巯基乙醇(0.1mM)、MgCl₂(20mM)、[γ³²P]-ATP(10μM)、聚-L-赖氨酸(200nM)和Tris-HCl(50mM pH7.4)。对于PKA：纯的PKA催化亚基(2.5μg/ml)、MgCl₂(10mM)、肝素(50μg/ml)、[γ³²P]-ATP(10μM)和Tris-HCl(50mM，pH6.5)。反应在30℃持续45分钟。然后，加入煮沸的样品缓冲剂，使所述样品经过10％ SDS-PAGE处理。

ERK磷酸化的测定

血清饥饿的HUVEC用各种rPEDF变体(10nM)处理15分钟。在刺激之后，收集细胞，用SDS-PAGE离析蛋白质，并通过蛋白质印迹法使用如(Aebersold，D.M.，等.MoI.Cell.Biol.24：10,000-10,015，2004)中所描述的适当抗体检测磷酸ERK和普通ERK。

内皮细胞增殖试验

如先前所描述(Oliver，M.H.，等.，J.Cell Sci.92：513-518，1989)，通过亚甲蓝试验确定增殖。简而言之，HUVEC被接种在明胶涂布的24孔组织培养皿中的2.5％ FCS的M-199(0.5ml/孔)中(20×10³个细胞/孔)。在一式四份(均为10nM)接种之后立即添加各种PEDF，并将培养皿在加湿培养箱中培养48小时。然后，细胞在4％的缓冲甲醛溶液中固定2小时，用pH8.5的0.1M硼酸钠缓冲液洗涤两次，并用溶解在0.1M硼酸盐缓冲溶液中的1％亚甲蓝染色20分钟。多余染料被洗掉，细胞结合的染料用200μl/孔的0.1M HCl洗脱。在Wallac 1420多标记计数器中读取595nm处的光密度值。在Microsoft Excel中分析数据，使用2.5％ FCS介质中的细胞增殖作为对照。

突起生长(neurite outgrowth)试验

如先前所描述(Becerra，S.P.，等等，J.Biol.Chem.268：23148-23156，1993)，试验人类Y-79视网膜母细胞瘤细胞(从ATCC获得)的突起生长。1ml的Y-79细胞混悬液(2.5×10⁵个细胞/ml)在添加了2mM的L-谷氨酰胺、抗生素和0.1％ ITS的MEM中与rPEDF或者各种rPEDF变体(20nM)一起培养。7天之后，培养物中的细胞被转移到聚D-赖氨酸涂布的平板，在不同时间段用光学显微镜监测它们的突起生长。

体内基质胶塞血管生成试验

有或没有PEDF(20nM)，在冰上保持的基质胶(0.5毫升/鼠)与指定浓度的bFGF混合，而且如(Passaniti，A.，等.，Lab.Invest.67：519-528，1992)所描述，皮下注射入8个星期大的裸鼠的腹侧。在注射之后基质胶快速形成一个塞。在第7天，宰杀小鼠，而且它们的皮肤被小心地后拉以暴露完整的塞。塞被移出、固定(4％甲醛)、石蜡包埋并切片。切片用苏木素和曙红(H&E)染色。通过Masson三色染色法确认浸润基质胶的内皮细胞/微血管。

实施例1

PEDF的CK2磷酸化突变体不是PKA底物

已经研究CK2和PKA磷酸化之间的互相作用。作为第一个步骤，检查每种磷酸化作用是否改变PEDF充当另一蛋白质激酶的底物的性能。为达到这一目的，通过用带负电荷的谷氨酸残基替代，来模仿磷酸化丝氨酸的负电荷，而丝氨酸的非磷酸化状态通过丙氨酸来模仿，它不能够充当磷受体。因此，通过用PKA的纯催化亚基和[γ³²P]-ATP来培养，CK2磷酸化变体S24、114E(EE)经过PKA磷酸化。由于PKA磷酸化通常依赖于pH值，在不同的pH值进行本实验。

如图1A所示，尽管rPEDF充当PKA的良好底物，但在所使用的条件下，磷酸化变体S24、114E并不被PKA磷酸化(图1A)。然而，用以温和消除S24、114E变体的天然结构的简单热处理，恢复了其由PKA进行的磷酸化(图1B)。这一结果表明，缺乏磷酸化是由于磷酸化CK2位点对PKA磷酸化位点的构象依赖性掩蔽，而且这与这两个位点位于PEDF分子的分离区域的这一事实无关。此外，在所试验的不同反应条件下，根本不能被CK2磷酸化的变体S24、114A(AA)被PKA轻易地磷酸化(图1C)，这表明缺乏磷酸化确实是由在Ser24和Ser114上的负电荷引起的。与在CK2位点的负电荷对PKA磷酸化的妨碍相反，在PKA位点(Ser227)的负电荷对CK2磷酸化没有显著影响。对PKA可磷酸化和不可磷酸化位点变体(分别为S227E和S227A)来说都是这样，两者都被CK2轻易地磷酸化(图1D)。由CK2对变性PEDF的高度磷酸化先前已被报导(Maik-Rachline，G.，等.，同上)，并指出PEDF变性暴露了其他CK2位点。而且，如先前所示出，由CK2对plPEDF的磷酸化显著低于rPEDF的CK2磷酸化(图1D)，这可能是由于在这些位点上的循环蛋白质预磷酸化而发生的。因此，Ser24和Ser114的CK2磷酸化诱导PEDF的构象改变，这使得Ser227难以进行PKA磷酸化。然而，Ser227的PKA磷酸化不影响PEDF被CK2磷酸化的性能。

实施例2

PEDF三重变体的表征

本发明的发明人先前已经示出，从循环血液提纯的PEDF(plPEDF)在其CK2位点上并且在较小的程度上也在其PKA位点上包含磷酸(Maik-Rachline，G.等，同上；以及上文的图1)。另外，上文结果示出，三个PEDF位点可以同时(首先由PKA，然后由CK2(图1))磷酸化。考虑到这些发现，表征这些激酶对PEDF的同时磷酸化的效果变得重要了。因此，通过用以下Ala或Glu替代CK2和PKA磷酸化位点Ser24、114和227，构建一组三重位点变体：S24E114E227E(EEE)模仿在CK2和PKA位点上的磷酸化，S24E114E227A(EEA)模仿在CK2而非PKA位点上的磷酸化，S24A114A227E(AAE)模仿在PKA而非CK2位点上的磷酸化，以及S24A114A227A(AAA)模仿非CK2或PKA磷酸化PEDF(图2A)。使用Glu突变体而非部分磷酸化的plPEDF很重要，因为这提供了在相关位点中具有负电荷的同质分子群，并由此使得可以准确检出磷酸化效果。磷酸化Ser到Ala残基的突变也很重要，因为它们使得可以获得非磷酸化分子的同质群。这不同于在S24、114E或S24、114A中的PKA位点上以及在S227E和S227A变体中的CK2位点上发生的少量磷酸化(Maik-Rachline，G.，etal.，同上)，这些磷酸化可以部分影响这些分子的性质。通过用全长人类PEDFcDNA或变体来转染HEK293T细胞来表达这些变体，并在Ni⁺²柱上提纯。

为表征这些变体并确定它们的生物化学完整性，它们中的每一个经过由CK2或PKA进行的体外磷酸化。AAE和AAA变体几乎完全消除了CK2磷酸化(图2B)。另一方面，三重变体EEE和EEA轻易地被CK2磷酸化，表明这些变体表现出与先前所描述的S24、114E(EE)突变体的高度磷酸化(Maik-Rachline，G.，等，同上)一致的附加磷酸化位点。因此，与单独的S24、114E磷酸化相比较，S227A或S227E突变附加到CK2突变位点，并不显著影响其CK2的磷酸化水平(图2B)。另外，三重突变体没有被PKA磷酸化(图2C)，这表明三重突变体内CK2位点突变成Glu或Ala，并不影响PKA位点的构象结构。

实施例3

PEDF变体对ERK活化的影响

尽管PEDF的受体还没有被鉴定，但已表明这一因子能刺激各种细胞内信号传导过程，包括细胞外信号调控的激酶(extracellular signal-regulatedkinase，ERK)/促细胞分裂剂激活的蛋白质激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)级联。为进一步表征PEDF的各种三重变体，检验了它们对HUVEC中ERK活化的影响。因此，各种变体被添加到血清饥饿的HUVEC，并使用抗磷酸化ERK和抗普通ERK抗体来测定ERK的活性。

在本发明人前面的研究中，他们示出CK2对PEDF的磷酸化显著提高了rPEDF对ERK活化的影响，而单独的PKA磷酸化实质上没有影响(Maik-Rachline，G.，等.，同上)。这些发现表明S24、114E诱导显著的ERK磷酸化(图3A和3B)，这高于由rPEDF诱导的磷酸化。然而，由三重磷酸化变体EEE诱导的ERK磷酸化导致更强的磷酸化，是S24、114E的磷酸化的约1.5倍(图3A-B)。EEA和AAE变体诱导ERK磷酸化到稍微高于S24、114E变体的水平，而AAA变体显著降低了PEDF活化ERK的性能。这些结果表明，PKA或CK2对PEDF的磷酸化对PEDF诱导的ERK级联活化来说是必要的，并且这些激酶的三个位点的累积磷酸化显著提高了这一诱导。

实施例4

PEDF变体对细胞增殖的影响

PEDF先前被示出为抑制子宫内膜癌细胞的细胞增殖，并诱导内皮细胞的凋亡。这一实验的目的是确定PEDF及其磷酸化变体对HUVEC增殖的影响。为达到这一目的，在24孔组织培养皿中接种HUVEC，在用有或没有各种PEDF的添加了2.5％ FCS的培养基中保持48小时，然后通过亚甲蓝试验分析增殖速度(Oliver，M.H.，等.J.CellSci.92：513-518，1989)。在这些条件下，rPEDF把HUVEC增殖抑制在适当的范围内(22％，图3C)，而从血浆提纯的PEDF(plPEDF)的抑制影响更为显著(33％)。当用S24、114E处理细胞时，观察到对HUVEC增殖的抑制作用，变体非常类似于plPEDF的抑制作用，这再次表明循环血浆中的PEDF主要是在其CK2位点上被磷酸化的(见上文)。有趣的是，当用EEE变体处理细胞时，抑制作用的水平显著提高(57％)，然而用EEA变体处理的细胞表现非常类似于用S24、114E处理的细胞(分别为27％和33％抑制作用)。另一方面，PKA磷酸化变体S227E和AAE对HUVEC增殖几乎没有影响。另外，用非磷酸化变体S24、114A和S227A处理的细胞表现出与用rPEDF处理的细胞相似的增殖水平，然而AAA突变体对HUVEC增殖只有小的影响。因此，这些结果表示HUVEC增殖的抑制作用依赖于PEDF的磷酸化状态。尤其是，细胞增殖被在其CK2位点上磷酸化的PEDF抑制，而且这一抑制作用在把PKA位点中的一个负电荷附加到CK2位点的负电荷之后显著增加。

实施例5

三重突变对PEDF诱导的神经营养活性的影响

发明人先前示出，CK2磷酸化显著减少了PEDF的神经营养效果，而PEDF的PKA磷酸化对PEDF的神经营养效果则没有或有非常小的影响(Maik-Rachline，G.，等.，同上)。本研究目的是，检查同时发生的到PEDF的PKA和CK2位点的磷酸结合是否调节PEDF变体诱导培养物中人类视网膜母细胞瘤Y-79细胞分化的性能。令人惊讶的是，用EEE变体处理的细胞(图4)呈现了突起生长并形成了聚合体，而EEA变体诱导小冠状结构的形成，这些冠状结构非常紧密，没有任何幼芽以与用S24、114E变体处理的细胞类似的方式从这些细胞伸出。用PKA磷酸化位点变体处理Y-79细胞：S227E和AAE，得到不同的细胞表型，其中尽管清楚地观察到它们的过程，但菌落更小。这些发现表明，尽管CK2磷酸化显著减少了PEDF神经营养效果，除了CK2的磷酸化之外对PKA位点的磷酸附加，保持了PEDF的神经营养活性。尽管仅在其PKA位点被磷酸化的PEDF的影响最小，这仍然发生了。

实施例6

三重氨基酸置换对体内PEDF诱导的抗血管生成活性的影响

为了进一步探究CK2和PKA磷酸化两者对PEDF功能的影响，使用基质胶塞试验，确定三重变体对PEDF的抗血管生成活性的影响。

用已检验因子补充的液体基质胶被皮下注射到CD-1裸鼠中。基质胶聚合形成一个塞，该塞在一个星期之后被移出，并通过组织学染色法分析血管的生长和浸润。结合bFGF(300ng/ml)，用rPEDF、plPEDF或各种变体处理基质胶塞。正如所期望的那样，用PBS处理的对照塞显示了非常微小的血管生成响应，bFGF处理的塞显示了强的血管生成活性，rPEDF、plPEDF以及S24、114E和S24、114A突变体呈现系统中先前描述的抗血管生成活性(图5，也见Maik-Rachline，G.，等.，同上)。三重变体EEE或EEA把bFGF诱导的血管生成减少到大致类似于S24、114E的影响，而AAA和AAE变体只有比大致类似于S24、114A的影响更小的影响。有趣的是，EEE变体的抗血管生成影响稍微高于其他变体，但是在当前实验中所使用的情况下，这并非是统计学上显著的。值得注意，在所有结核的周边观察到一些没有形成血管的增殖细胞，与PEDF变体的类型无关，这表明抗血管生成活性部分地由不包括增殖抑制的机理介导。

考虑到EEE变体对血管抽芽的抑制稍微好些，于是考察了这一变体相比其他磷酸化变体确实是更好的抗血管生成因子的可能性。为达到这一目的，确定这些变体对用更高水平bFGF(500ng/ml)处理的基质胶塞的抑制作用。总的来说，用500ng/ml bFGF处理的塞比用300ng/ml处理的塞呈现更高的血管生成响应(图6)。这由浸润塞的细胞数量的显著上升(图6)以及这些塞中实际血管的清晰染色所证明，而这在用较低浓度bFGF处理的塞中并不明显。在这些较高的bFGF水平下，EEE变体显著增加了PEDF抗血管生成活性，这是因为在塞中没有观察到血管(图6)。与由S24、114E或EEA突变体(分别为p＝0.04和p＝0.01)观察到的抗血管生成活性相比较，这一抑制活性显然更为显著。因此，这些结果表明，当和CK2磷酸化结合时，PEDF的PKA磷酸化是强抗血管生成活性所必要的，但在由其本身给出时并非如此。这些结果进一步指出，CK2和PKA对PEDF的同时磷酸化得到具有最高水平抗血管生成活性的PEDF变体，超过单独由CK2进行磷酸化的PEDF变体所呈现的抗血管生成活性。

因此，PEDF的磷酸化在其生理学活性测定中扮演重要角色。在发明人(Maik-Rachline，G.，等.，同上)的以上研究中，示出CK2对PEDF的细胞外磷酸化消除了PEDF神经营养活性，但增强了其抗血管生成活性，PKA磷酸化减少PEDF抗血管生成活性而不影响其神经营养活性。在本发明中，在PKA和CK2磷酸化位点的丝氨酸对Glu的组合替换把PEDF转变成其最有效的抗血管生成形式，而仍保持其神经营养活性。考虑所有这些发现，可以得出结论：PKA、CK2或这两种激酶一起对PEDF的细胞外磷酸化，可以调节PEDF活性。因此，非磷酸化的蛋白质具有弱的抗血管生成和神经营养活性；PKA磷酸化的蛋白质呈现强的神经营养活性但不呈现抗血管生成活性；在这两个CK2位点上被磷酸化的PEDF呈现抗血管生成活性而不具有任何神经营养效果；最后，三重磷酸化的蛋白质恢复这两种活性。此外，三重磷酸化的蛋白质的抗血管生成活性要比非磷酸化或单一PKA磷酸化PEDF的抗血管生成活性高很多，而且也高于双重CK2磷酸化的蛋白质的抗血管生成活性(图7)。

实施例7

EEE三重变体抑制DU145移植瘤的生长

由于EEE变体在基质胶塞试验中呈现最高水平的抗血管生成活性，接下来检验其对活体内移植瘤模型的效果。为达到这一目的，DU145人类前列腺癌细胞混悬液(100μl盐水中的5×10⁶个细胞)被皮下注射到5星期大的雌性无胸腺裸鼠的腹侧(CD-1)。肿瘤被允许生长大约1星期，之后根据肿瘤体积把小鼠随机分成2组。其中一组用EEE变体静脉注射，每次注射8μg(n＝3)。另一组被用作对照组，用PBS(n＝2)静脉注射。使用测径器，通过对长×宽×深进行相乘，计算肿瘤体积。所有处理一个星期进行3次，肿瘤体积一个星期检测两次。结果给出为每一组肿瘤体积相对于其初始大小的倍增均值。使用学生t-检验来分析处理组和对照组之间肿瘤体积的倍增均值的统计显著性差异(^*P≤0.05)。如图8A-B所示，用EEE变体处理DU145异种移植物，显著减小了肿瘤体积。

实施例8

抗CK2和抗PKA磷酸化PEDF多克隆抗体的产生

针对对应于人类PEDF的氨基酸14-29的合成16mer肽，在兔中产生抗磷酸Ser24(α-pSer24；CK2位点)PEDF多克隆抗体，其中人类PEDF的氨基酸14-29的合成16mer肽具有以下氨基酸序列：SEQ ID NO：15中所示的LGHSSCQNPAS(磷酸)PPEEG。针对对应于人类PEDF的氨基酸219-233的合成15mer肽，产生抗磷酸Ser227(α-pSer227；PKA位点)PEDF多克隆抗体，其中人类PEDF的氨基酸219--233的合成15mer肽具有以下氨基酸序列：SEQ ID NO：16中所示的TKFDSRKTS(磷酸)LEDFYL。此外，针对对应于人类PEDF的氨基酸327-343的17mer肽，产生抗PEDF(α-PEDF)多克隆抗体，其中人类PEDF的氨基酸327-343的17mer肽具有以下氨基酸序列：在SEQ ID NO：17中所示的KSLQEMKLQSLFDSPDF。用于制备多克隆抗体的方法正如本领域中所公知的那样(见Harlow和Lane(1988)抗体：实验室手册，CSH出版社，其内容通过引用结合，如同完整描述于此)。

为确定多克隆抗体识别PEDF，用各种抗磷酸PEDF抗体对rPEDF和plPEDF进行免疫印迹。如图9A所示，两种蛋白质都被αpSer24和αpSer227识别，然而与rPEDF相比较，两种抗体都把plPEDF识别到更高的程度，且用αpSer24对plPEDF的识别更显著。这些结果证实本文以上所揭示的发现，即人类血浆中的PEDF在循环中作为磷酸化蛋白质存在，它主要在其CK2位点上被磷酸化。

为进一步验证抗体确实是磷酸化PEDF抗体，rPEDF和plPEDF用马铃薯酸性磷酸酶如下处理：rPEDF(1μg)或plPEDF(1μg)用马铃薯酸性磷酸酶(PAP，0.5U)在37℃培养30分钟。此后，试样用各种抗磷酸PEDF抗体进行免疫印迹。rPEDF的磷酸酶处理完全消除了αpSer24和αpSer227对其的识别，而plPEDF的相同处理显著减少磷酸化抗体对其的识别(图9B)。最后，各种PEDF变体(EEA、AAE、EEE和AAA)用抗磷酸PEDF抗体进行免疫印迹。如图9C所示，有趣的是，αpSer24抗体高度识别了CK2磷酸化突变体(EEA和EEE)，而αpSer227抗体高度识别了PKA磷酸化突变体(AAE和EEE)。

本领域内的技术人员应该明白，本发明不受上文具体示出并描述的内容的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定。

序列表

<110>维兹曼科学研究所耶达研究与发展有限公司

<120>改良的色素上皮衍生因子变体及其用途

<130>YEDA/061 PCT

<150>US 60/735,875

<151>2005-11-14

<160>17

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>418

<212>PRT

<213>人类

<400>1

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<213>人工的

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<223>合成肽

<400>17

Claims (47)

1.一种抗血管生成色素上皮衍生因子(PEDF)变体或其类似物或融合蛋白，其包括具有多个被改变的磷酸化位点的人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO：1的变体或其片段，条件是：所述变体不同于仅由两个在丝氨酸24和丝氨酸114处被改变的磷酸化位点组成的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白。

2.如权利要求2所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段，其包括选自丝氨酸24和丝氨酸227、丝氨酸114和丝氨酸227的两个被改变的磷酸化位点。

3.如权利要求1所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段，其包括在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点。

4.如权利要求3所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段，其具有神经营养活性。

5.如权利要求4所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段，其中所述三个被改变的磷酸化位点被带负电荷的氨基酸残基置换。

6.如权利要求5所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物或融合蛋白，其包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其片段。

7.如权利要求4所述的抗血管生成PEDF变体、类似物、融合蛋白或其片段，其中丝氨酸24和丝氨酸114被非极性的氨基酸残基置换，并且其中丝氨酸227被选自由带负电荷的氨基酸残基和非极性的氨基酸残基所组成的组的氨基酸残基置换。

8.如权利要求7所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物或融合蛋白，其包括选自由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4或其片段所组成的组的氨基酸序列。

9.如权利要求3所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段，其基本上缺乏神经营养活性。

10.如权利要求9所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段，其中丝氨酸24和丝氨酸114被带负电荷的氨基酸残基置换，并且其中丝氨酸227被非极性氨基酸残基置换。

11.如权利要求10所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物或融合蛋白，其包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或其片段。

12.如权利要求1所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段，其中磷酸化位点的改变通过化学改性来进行。

13.如权利要求12所述的抗血管生成PEDF变体、其类似物、融合蛋白或片段，其中所述化学改性选自：糖基化、氧化、永久磷酸化、还原、十四烷基化、硫酸化、酰化、乙酰化、腺苷二磷酸核糖基化、酰胺化、羟基化、碘化、甲基化以及封闭基团衍生化。

14.一种离析多核苷酸序列，其编码抗血管生成的色素上皮衍生因子(PEDF)变体或其类似物或融合蛋白，所述多核苷酸序列包括人类PEDF核苷酸序列SEQ ID NO：6的变体或其片段，该变体或其片段编码包括多个被改变的磷酸化位点的PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白，条件是：所述PEDF变体不同于仅由在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点所组成的变体。

15.如权利要求14所述的离析多核苷酸序列，其中所述PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白包括选自下述组的两个磷酸化位点：丝氨酸24和丝氨酸227；以及丝氨酸114和丝氨酸227。

16.如权利要求14所述的离析多核苷酸序列，其中所述PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白包括在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点。

17.如权利要求16所述的离析多核苷酸序列，其中所述抗血管生成PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白具有神经营养活性。

18.如权利要求17所述的离析多核苷酸序列，其中所述三个被改变的磷酸化位点被带负电荷的氨基酸残基置换。

19.如权利要求18所述的离析多核苷酸序列，其包括SEQ ID NO：7或其片段。

20.如权利要求17所述的离析多核苷酸序列，其中丝氨酸24和丝氨酸114被非极性的氨基酸残基置换，并且丝氨酸227被选自由带负电荷的氨基酸残基和非极性的氨基酸残基组成的组的氨基酸残基置换。

21.如权利要求20所述的离析多核苷酸序列，所述离析多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9或其片段所组成的组。

22.如权利要求16所述的离析多核苷酸序列，其中所述抗血管生成PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白基本上缺乏神经营养活性。

23.如权利要求22所述的离析多核苷酸序列，其中丝氨酸24和丝氨酸114被带负电荷的氨基酸残基置换，且丝氨酸227被非极性氨基酸残基置换。

24.如权利要求23所述的离析多核苷酸序列，其包括SEQ ID NO：10或其片段。

25.一种表达载体，其包括如权利要求14至24任一项所述的编码抗血管生成PEDF变体、其类似物、片段或融合蛋白的离析多核苷酸序列。

26.一种宿主细胞，其包括如权利要求25所述的包括编码抗血管生成PEDF变体或其类似物、片段或融合蛋白的离析多核苷酸序列的表达载体。

27.一种药物组合物，其包含：作为活性成分的、如权利要求1至13任一项所述的抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段；以及药学上可接受的载体。

28.一种药物组合物，其包含：作为活性成分的、如权利要求14至24任一项所述的编码抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段的离析多核苷酸序列；以及药学上可接受的载体。

29.一种药物组合物，其包含作为活性成分的、如权利要求25所述的表达载体以及药物上可接受的载体，所述表达载体包括编码抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段的离析多核苷酸序列。

30.一种药物组合物，其包含作为活性成分的、如权利要求26所述的包括表达载体的宿主细胞以及药学上可接受的载体，所述表达载体包括编码抗血管生成PEDF变体或其类似物、融合蛋白或片段的离析多核苷酸序列。

31.一种用于治疗患者中与新血管形成关联的疾病或病症的方法，其包括为有相应需要的患者施用治疗有效量的如权利要求27至30任一项所述的药物组合物。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述与新血管形成关联的疾病或病症选自：癌症、眼疾以及用抗血管生成因子治疗的病症。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述疾病或病症是选自下述组的癌症：肉瘤、癌瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤导管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、维尔姆斯氏瘤子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、卡波西肉瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤和神经母细胞瘤。

34.如权利要求32所述的方法，其中所述眼疾选自：新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、视网膜母细胞瘤、晶体后纤维组织增生、葡萄膜炎、早熟性视网膜病、黄斑变性、角膜移植片新血管形成、视网膜肿瘤和脉络膜肿瘤。

35.如权利要求32所述的方法，其中所述用抗血管生成因子治疗的病症选自：血管瘤、关节炎、牛皮癣、血管纤维瘤、动脉粥样硬化斑、血友病性关节病和肥厚性瘢痕。

36.一种用于治疗患者神经变性病状的方法，其包括为有相应需要的患者施用治疗有效量的如权利要求27至30任一项所述的药物组合物。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述神经变性病状选自：多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、重症肌无力、运动原神经病、格-巴二氏综合症、自身免疫神经病、Lambert-Eaton类重症肌无力综合征、肾上腺炎神经疾病、肾上腺炎小脑萎缩、非肾上腺炎僵人综合症、渐进性小脑萎缩、Rasmussen氏脑炎、肌萎缩侧索硬化、Sydeham舞蹈病、Tourette综合症、自身免疫多内分泌腺病、异常免疫神经病、获得性神经性肌强直、多关节弯曲、视神经炎和全身肌强直综合症。

38.一种离析抗体或其片段，其特异性结合选自下述组的多肽：(a)人类PEDF氨基酸序列SEQ ID NO：1的变体，其包括至少一个带负电荷的被改变的磷酸化位点；

(b)(a)的PEDF变体的类似物；

(c)(a)的PEDF变体或(b)的类似物的片段，

其中所述离析抗体不结合相应的具有非磷酸化丝氨酸或不带负电荷的被改变的磷酸化位点的人类PEDF序列SEQ ID NO：1。

39.如权利要求38所述的离析抗体或片段，其中所述至少一个被改变的磷酸化位点位于丝氨酸24，并且其中所述PEDF变体包括选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

40.如权利要求38所述的离析抗体或片段，其中所述至少一个被改变的磷酸化位点位于丝氨酸227，并且其中所述PEDF变体包括选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：13的氨基酸序列。

41.如权利要求38所述的离析抗体或片段，其中所述PEDF变体包括在丝氨酸24和丝氨酸114处的两个被改变的磷酸化位点，并且所述PEDF变体包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

42.如权利要求38所述的离析抗体或片段，其中所述PEDF变体包括在丝氨酸24、丝氨酸114和丝氨酸227处的三个被改变的磷酸化位点，并且所述PEDF变体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

43.如权利要求38至42任一项所述的离析抗体或其片段，其是多克隆抗体。

44.如权利要求38至42任一项所述的离析抗体或其片段，其是单克隆抗体。

45.如权利要求38至42任一项所述的离析抗体或其片段，其选自：

(a)Fab；

(b)F(ab)2；

(c)嵌合抗体；以及

(d)单链抗体。

46.一种用于产生抗血管生成PEDF变体的方法，其包括：在促进如权利要求1至13任一项所述的抗血管生成PEDF变体或其片段或类似物的表达的条件下，培养包括编码所述变体、片段或类似物的离析多核苷酸的宿主细胞，以及回收所述变体、片段或类似物。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。

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