CN101498703B - 茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法，解决了筛选技术中茶树愈伤组织或细胞系中儿茶素含量及组分检测所需时间较长，操作复杂的问题。本发明包括茶愈伤组织诱导与继代、含不同儿茶素含量的愈伤组织筛选、含不同儿茶素含量的细胞系筛选、含不同儿茶素组分的细胞系筛选4道操作步骤。本发明实现了含不同儿茶素含量或组分的细胞系的筛选；能在5-10分钟的短时间内显示愈伤组织的儿茶素含量的差异，因此其最大优点是可以在转接继代的操作过程中同时进行儿茶素检测；茶树细胞系儿茶素组分的薄层层析鉴定，可一次分析多个样品，另外，薄层层析鉴定还可以发现新的成分，从而加快了含不同儿茶素含量和含不同儿茶素组分的细胞系的筛选速度。

Description

茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法

技术领域

本发明涉及植物细胞系的筛选方法，茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法。

背景技术

植物类黄酮的合成受到外界环境因素的影响，光照、温度、营养等因素均会影响到茶树中的酚类物质的合成。由于利用完整的茶树个体研究酚类物质的生物合成代谢有许多限制因素，无疑茶愈伤组织和细胞悬浮培养体系已成为研究茶树次生代谢的良好平台。筛选出含不同儿茶素含量及组分的茶细胞系是这种良好平台最终建立的前提。

常见的含特殊物质细胞系的筛选手段有多种，而寻找一种有效易行的特殊物检测手段是筛选体系建立的基础。对于有颜色的特殊物，通常采用直接目视法筛选高产细胞系^[1]，如含花青素、萘醌、类胡萝卜素、叶绿素等物质的愈伤组织或细胞系，其颜色的深浅表明了内含物含量的变化。山本等在筛选具有高产和稳产花青素细胞系过程中，利用目视法挑选颜色较深的愈伤组织继代培养，这样反复筛选了近30代，在第23代之后细胞块的色素含量的平均值保持稳定，并比原细胞株含量高7倍^[2]。吴蕴祺等利用二分法结合高效液相色谱分析(HPLC)，对红豆杉愈伤组织中的紫杉醇高产细胞系进行筛选，获得了一个紫杉醇高产细胞系Ts-19，其紫杉醇含量达细胞干重的4.0％^[3]。

但茶树儿茶素是无色的，无法通过肉眼直接进行茶细胞系的识别筛选，只能采取间接的方法。儿茶素的含量可以通过1％香草醛盐酸试剂显色的分光光度法测定，儿茶素的组分可以通过高效液相色谱(HPLC)法来检测，但其测定过程复杂、所需时间较长，如从样品的儿茶素提取分光光度法测定至少需要30分钟，而从样品的儿茶素提取到高效液相色谱分析完毕需要至少1小时，无法达到快速检测的目的，从而限制了含不同儿茶素含量及组分的茶细胞系的筛选。

发明内容

为了解决茶树愈伤组织或细胞系中儿茶素含量及组分的检测所需时间较长，操作复杂，无法达到快速检测的问题，本发明提供一种操作简便、可实现快速筛选的茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法。

具体技术方案如下：

茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法包括茶愈伤组织诱导与继代、含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选、含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选、含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选4道操作步骤，具体操作方法如下：

(1)茶愈伤组织诱导与继代

A、诱导

选取茶树幼嫩茎为外植体，将外植体消毒，并接种于固体培养基上诱导，诱导条件：温度25±1℃，暗培养；每21天转接继代一次，转接1-3次，茎段两端即可长出浅黄色的茶愈伤组织；

B、继代

将浅黄色茶愈伤组织切成0.5cm*0.5cm大小，继续在固体培养基上继代培养，每21天转接继代一次，至少转接5次，继代培养条件：温度25±1℃，暗培养；继代过程中不断弃去褐化和长势不好的茶愈伤组织，保留生长速度快的茶愈伤组织；

(2)含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选

取茶愈伤组织在固体培养基上继代培养，21天转接继代一次；继代培养条件：温度25±1℃，暗培养；在第21天转接继代时，采取目视法对茶愈伤组织进行筛选，即在超净工作台上挑选不同颜色、不同质地的茶愈伤组织分别进行继代培养；转接继代半年至一年，获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织；

所述高儿茶素含量的茶愈伤组织，颜色为黄色、生长速度快、质地疏松；

所述低儿茶素含量的茶愈伤组织，颜色为白色、生长速度快、质地松散；

(3)含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织分别接种到液体培养基上培养21天，接着再分别接种到固体培养基上培养21天；固体培养条件：温度25±1℃，暗培养；液体培养条件：摇床转速100rpm/min、培养瓶为150ml的三角锥形瓶、装液量30ml、接种量1g，温度25±1℃、暗培养；在液体与固体培养的交替继代接种时，在超净工作台上将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织逐一编号后用手术刀一分为二，取其中的一半放入事先装有5ml1％香草醛盐酸试剂的试管中，显色10分钟，将对应的另一半分别进行继代培养；如此反复循环，至少4个循环，获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶细胞系；

所述高儿茶素含量的茶细胞系，1％香草醛盐酸试剂活体快速显色后呈现深红色；茶细胞系的儿茶素含量达到每克干重7.7689毫克以上；

所述低儿茶素含量的茶细胞系，1％香草醛盐酸试剂活体快速显色后呈现浅红色；茶细胞系的儿茶素含量达到每克干重0.1272毫克以下；

(4)含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织分别接种到液体培养基上培养21天，接着再分别接种到固体培养基上培养21天；固体培养条件：温度25±1℃，暗培养；液体培养条件：摇床转速100rpm/min、培养瓶为150ml的三角锥形瓶、装液量30ml、接种量1g，温度25±1℃、暗培养；在液体与固体培养的交替继代接种时，将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织的一半分别进行儿茶素组分的薄层层析检测，将对应的另一半分别进行继代培养；如此反复循环，至少4个循环；获得两种以上含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系；

薄层层析检测操作步骤如下：

A.制备茶细胞系儿茶素提取液

对两种以上含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系分别制备茶细胞系儿茶素提取液；

取含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系3g，加少许石英砂，液氮研磨至粉碎，加3ml 95％乙醇研磨，4000g离心，吸取上清液，沉淀加3ml 95％乙醇，再次离心，此法重复三次，最后95％乙醇定容至10ml；将上述得到的10ml乙醇溶液，蒸干去除乙醇，再用热水溶解，再用等量乙酸乙酯萃取3次，取有机相浓缩干燥，用1ml甲醇定容；甲醇定容溶液用孔径为0.45μm有机膜过滤，得两种以上儿茶素提取液；

B.薄层层析检测

分别对两种以上儿茶素提取液进行薄层层析检测；

将儿茶素提取液点样于2.5*10硅胶GF-254板上，25℃下展层2～3h，展开剂接近硅胶板上端后取出硅胶板晾干，硅胶板经过1％(g/v)香兰素盐酸溶液喷雾显色，吹风机吹干后，立刻观察拍照；

所述含六种儿茶素组分的茶细胞系，其儿茶素提取液，在展层后的硅胶板上，经过1％(g/v)香兰素盐酸溶液喷雾显色，呈现四个红色条带；高效液相色谱检测(公识方法)含有表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)、表儿茶素没食子酸酯((-)-epicatechin-3-gallate，ECG)、表没食子儿茶素((-)-epigallocatechin，EGC)、没食子儿茶素((+)-gallocatechin，GC)、儿茶素((+)-catechin，C)和表儿茶素((-)-epicatechin，EC)六种儿茶素；

所述含六种以下儿茶素组分的茶细胞系，其儿茶素提取液，在展层后的硅胶板上，经过1％(g/v)香兰素盐酸溶液喷雾显色，呈现四个以下红色条带；高效液相色谱检测(公识方法)含有表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)、表儿茶素没食子酸酯((-)-epicatechin-3-gallate，ECG)、表没食子儿茶素((-)-epigallocatechin，EGC)、没食子儿茶素(㈩-gallocatechin，GC)、儿茶素((+)-catechin，C)和表儿茶素((-)-epicatechin，EC)六种儿茶素中的五种以下；

所述固体培养基为：在1L B₅培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激动素0.1mg、琼脂8g和蔗糖30g；pH为5.5；

所述液体培养基为：在1L B₅培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激动素0.1mg和蔗糖30g；pH为5.5。

发明技术特点说明：

1.培养基的选择

不同培养基会影响到茶愈伤组织的生长特性和儿茶素合成能力，表2、图7结果发现，在pH5.5的H培养基(H培养基为：1L MS培养基含10mg吲哚丁酸(IBA)、2mg激动素(KT)、8g克琼脂和30g蔗糖的固体培养基)生长的茶愈伤组织，不仅儿茶素合成能力有限，儿茶素含量低，而且组织紧结、生长速度慢；在pH5.5的S固体培养基(S固体培养基为：1L MS培养基含2mg2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.5mg激动素(KT)、8g琼脂和30g蔗糖)上生长的茶愈伤组织，虽然儿茶素含量高，但组织紧结、生长速度慢，这两种培养基均不适合进行均一茶细胞系的诱导和筛选；只有在pH5.5的B固体培养(B固体培养为：1L B₅培养基含0.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.1mg激动素(KT)、8g克琼脂和30g蔗糖)上诱导的茶愈伤组织，生长速度快，组织疏松，适合诱导筛选均一的茶细胞系。

另外，在B固体培养基中，激素浓度也会影响茶细胞系的生长和儿茶素积累。由表3可见，在激动素(KT)保持不变的情况下，适当增加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的浓度能够促进茶细胞系的生长，但是对儿茶素的积累没有太大的影响；在激动素(KT)保持不变的情况下，增加萘乙酸(NAA)浓度，不仅有利于茶细胞系生长，也有利于儿茶素合成；在2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)保持不变的情况下，增加激动素(KT)浓度，不利于茶细胞系生长，也不明显提高茶细胞系儿茶素的积累；当同时提高2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)与激动素(KT)的浓度，保持其比例不变时，均不利于茶细胞系的生长和儿茶素的积累。

2.含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选

早期茶愈伤组织是不均匀的，从外观上看，有黄色、白色，浅绿色，从质地上看，有坚硬、疏松的区别。图8-图13所示，经过1％(w/v)香兰素盐酸溶液显色后，黄色茶愈伤组织的颜色较深，而白色和浅绿色茶愈伤组织则显色较浅，说明从茶愈伤组织的外观上可以初步区分茶愈伤组织体内的儿茶素含量，即黄色茶愈伤组织的儿茶素含量大于白色、浅绿色的。但在试验中要区分由于衰老引起的茶愈伤组织色泽变黄，变黄衰老的茶愈伤组织中的儿茶素含量很低。

3.含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选

由于培养条件的差异，在液体培养条件下的茶细胞团呈圆形，细胞较均匀，而固体培养的茶细胞团呈不规则性，茶细胞系均匀性较差，因此液体培养有利于获得均一的茶细胞系(图14、图15，图16、图17)。

但液体培养方式并不适合茶细胞系的筛选的操作，因此在茶细胞系筛选中选择液体与固体交替培养方式，再结合二分法、1％香草醛浓盐酸试剂活体显色法，筛选具有明显儿茶素含量差异的茶细胞系，例如，本发明实施例中采用这种方式，从云茎63愈伤组织中，筛选得到两种儿茶素含量差异较大的茶细胞系，“云茎63XA”和“云茎63YA”；从外形上看，“云茎63XA”茶细胞颜色发白、松散、悬浮性较好，而“云茎63YA”茶细胞颜色发黄、略紧、悬浮性较差(图2)；高效液相色谱(HPLC)分析表明(表1，图3)，云茎63Y茶细胞的儿茶素含量远高于云茎63X茶细胞。

4.含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选

与高效液相色谱(HPLC)相比，利用薄层层析可以在短时间快速检测出茶细胞系的儿茶素组分，具有快速、方法简单、不需要昂贵的仪器的特点。例如，本发明实施例中采用这种方式，从云茎63茶愈伤组织中，筛选得到一种儿茶素组分较少的细胞系云茎63H，从外形上看，“云茎63H”与“云茎63Y”相似，但“云茎63H”细胞只含有简单儿茶素GC、EGC、C、EC，不含有酯型儿茶素ECG、EGCG(图5，图6)。

本发明与现有技术相比具有以下有益技术效果：

1.目前，获得含不同儿茶素含量或组分的茶愈伤组织的方法主要是通过改变培养条件而达到的，如增加光照，改变培养基成分等。但光照和培养基都可能较大地改变细胞特性，无法得到有价值的、均匀的茶细胞系。

目前尚没有建立含不同儿茶素含量或组分的茶细胞系的筛选技术。

2.虽然茶树儿茶素是无色的。但本发明的研究发现，茶愈伤组织的外观颜色与儿茶素含量有相关性，因此直接目视法是可以用来筛选含不同儿茶素含量的茶细胞系的。

3.与1％香草醛盐酸试剂显色的分光光度法相比，茶树愈伤组织的香草醛盐酸试剂活体显色技术，虽然不能精确测定愈伤组织中的儿茶素含量，但却具有操作简单、显色迅速的特点。由于能在5-10分钟的短时间内显示愈伤组织的儿茶素含量的差异，因此其最大优点是可以在转接继代的操作过程中同时进行儿茶素检测，从而加快了含不同儿茶素含量的茶细胞系的筛选速度。

5.与高效液相色谱技术相比，茶树细胞系儿茶素组分的薄层层析鉴定，可以一次分析多个样品，因此具有快速鉴定的特点。另外，薄层层析鉴定还可以发现新的成分，从而加快了含不同儿茶素组分的茶细胞系的筛选速度。

附图说明

图1为二分法结合1％香草醛盐酸试剂活体快速显色法筛选茶细胞系示意图，

图2为云茎63YB(上左，下左)和云茎63XB(上右，下右)茶细胞系示意图，

图3为“云茎63XB”和“云茎63YB”茶细胞系的儿茶素组分的比较图，

图4为含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选程序示意图，

图5为不同茶细胞系儿茶素组分的薄层层析图，

图6为不同茶细胞系儿茶素组分的高效液相色谱图，

图7为不同培养基培养的茶愈伤组织儿茶素组分的高效液相色谱图，

图8为绿色茶愈伤组织染色前状态图，

图9为绿色茶愈伤组织染色后状态图，

图10为白色茶愈伤组织染色前状态图，

图11为白色茶愈伤组织染色后状态图，

图12为黄色茶愈伤组织染色前状态图，

图13为黄色茶愈伤组织染色后状态图，

图14为液体培养筛选系染色前状态图，

图15为液体培养筛选系染色后状态图，

图16为固体培养筛选系染色前状态图，

图17为固体培养筛选系染色后状态图，

图18为“云茎63XB”和“云茎63YB”儿茶素含量，见表1，

图19为不同培养基诱导的愈伤组织的特性，见表2，

图20为激素对茶树细胞生长和儿茶素合成的影响，见表3。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地说明。

实施例：

主要设备

1.手术刀；2.高压蒸汽灭菌锅；3.2.5*10硅胶GF-254板；4.9cm培养皿；5.离心机；6.pH计；7.超净工作台；8.高效液相色谱(HPLC)

材料与试剂

1.材料：

茶树云南大叶种(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze.var.sinensis cultivar Yun Nan Da YeZhong)幼嫩茎段。

2.主要试剂：

(1)70％的乙醇：按体积比无水乙醇∶水＝750∶282配制，

(2)0.1％氯化汞(HgCl₂)：取0.1g氯化汞(HgCl₂)溶于100ml纯水中，

(3)固体培养基为：在1L B₅培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激动素0.1mg、琼脂8g和蔗糖30g；pH为5.5，

(4)液体培养基为：在1L B₅培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激动素0.1mg和蔗糖30g；pH为5.5，

(5)1％香草醛浓盐酸溶液：称取1.0g香草醛，溶于100ml浓盐酸溶液，

(6)薄层层析展开剂：正丁醇∶冰乙酸∶水＝4∶1∶5，配制后的展开剂经过多次振摇后，放置24小时后，弃去下层后待用。

操作方法

茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法包括茶愈伤组织诱导与继代、含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选、含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选、含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选4道操作步骤，具体操作方法如下：

1.茶愈伤组织诱导与继代

A：茶愈伤组织诱导

选取茶树幼嫩茎为外植体。采来的外植体用清水冲洗干净，在超净工作台上，先用70％的乙醇浸泡30秒，经无菌水冲洗3～5遍，然后放入0.1％HgCl₂中浸泡5～7分钟，再用无菌水冲洗3～5遍，得无菌外植体。立即将无菌外植体接种于固体培养基上诱导茶愈伤组织。茶愈伤组织诱导条件为温度25±1℃；暗培养。外植体每21天转接继代一次，转接1-3次后，茎段两端即可长出浅黄色的茶愈伤组织。

B：茶愈伤组织继代

将浅黄色茶愈伤组织切成0.5cm*0.5cm大小，接种在固体培养基上继代培养。在第21天转接继代过程中，在超净工作台上，弃去褐化和长势不好的茶愈伤组织，保留生长速度快的茶愈伤组织继续培养。继代培养条件为温度25±1℃；暗培养。以后每21天转接继代一次。继代4次，得到较为均匀的茶愈伤组织，命名为云茎63愈伤组织。

2.含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选

将云茎63茶愈伤组织接种在固体培养基上，在第21天转接继代过程中，在超净工作台上，采取目视法对愈伤组织进行筛选，即挑选不同颜色、不同质地的愈伤组织分别进行继代培养。继代培养条件为温度25±1℃；暗培养。以后每21天转接1次，同时采用目视法对愈伤组织继续进行筛选。继代培养至少半年，可以初步获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织，分别命名为云茎63YA和云茎63XA愈伤组织。

高儿茶素含量的茶愈伤组织(云茎63YA)：颜色黄色、生长速度快、质地疏松。

低儿茶素含量的茶愈伤组织(云茎63XA)：颜色白色、生长速度快、质地松散。

3.含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织进行液体与固体交替培养，即将茶愈伤组织接种在液体培养基中进行液体悬浮培养，在第21天将茶愈伤组织再接种到固体培养基上进行固体培养；固体培养条件：温度25±1℃；暗培养；液体培养条件：培养瓶为150ml的三角锥形瓶；装液量30ml；接种量1g；摇床转速100rpm/min；培养周期21天；(25±1)℃；暗培养；在液体与固体培养的交替过程中，在超净工作台上，利用二分法，结合1％香草醛盐酸试剂活体快速显色法(图1)，分别筛选高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶细胞系，即在超净工作台上将细胞团逐一编号后用手术刀一分为二，取其中的一半细胞团放入事先装有5ml 1％香草醛盐酸试剂的试管中，显色10分钟。将显色不同深浅的茶愈伤组织对应的另一半茶细胞团分别接种，继续培养。以后每21天液体与固体培养的交替培养1次，同时进行二分法，结合1％香草醛盐酸试剂活体快速显色法分别筛选。至少交替培养4个周期，获得了高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶细胞系，分别命名为云茎63YB细胞系和云茎63XB细胞系(图2，图3，表1)。

高儿茶素含量的茶细胞系(云茎63YB)(图2)：颜色黄色、生长速度快、质地疏松、细胞颗粒大、悬浮性差；1％香草醛盐酸试剂活体快速显色后呈现深红色。

低儿茶素含量的茶细胞系(云茎63XB)(图2)：颜色白色、生长速度快、质地松散、细胞颗粒小、悬浮性好；1％香草醛盐酸试剂活体快速显色后呈现浅红色。

4.含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织进行液体与固体交替培养，即将茶愈伤组织接种在液体培养基中进行液体悬浮培养，在第21天将茶愈伤组织再接种到固体培养基上进行固体培养。在液体与固体培养的交替过程中，在超净工作台上，利用二分法，结合薄层层析和1％香草醛浓盐酸溶液喷雾显色法，分别筛选含儿茶素组分多和含儿茶素组分少的茶细胞系(图4)。以后每21天液体与固体培养的交替培养1次，同时进行二分法，结合1％香草醛盐酸试剂活体快速显色法分别筛选。至少交替培养4个周期，获得了含儿茶素组分多和含儿茶素组分少的茶细胞系，分别命名为云茎63YC，云茎63H细胞系(图5，图6)。

细胞系儿茶素薄层层析检测方法如下：

A.筛选细胞系儿茶素提取液的制备取筛选细胞系3g，加少许石英砂，液氮研磨至粉碎，加3ml 95％乙醇研磨，4000g离心，吸取上清液，沉淀加3ml 95％乙醇，再次离心。此法重复三次，最后95％乙醇定容至10ml。将上述得到的10ml乙醇溶液，蒸干去除乙醇，再用热水溶解，再用等量乙酸乙酯萃取3次，取有机相浓缩干燥，用1ml甲醇定容。得到的样品用孔径为0.45μm有机膜过滤，得儿茶素提取液。

B.薄层层析检测

儿茶素提取液点样于2.5*10硅胶GF-254板上，25℃下展层2～3h，展开剂接近硅胶板上端后取出硅胶板晾干，1％(g/v)香兰素盐酸溶液喷雾显色，吹风机吹干后，立刻观察拍照。

薄层层析检测(图5)显示，茶树中的六种儿茶素可以在硅胶板呈现四条红色条带，每一个条带的迁移率并不相同。含不同儿茶素组分的细胞系的条带数有差异，云茎63YC含有四条红色条带，而云茎63H只有儿茶素((+)-catechin，C)和表儿茶素((-)-epicatechin，EC)和表没食子儿茶素((-)-epigallocatechin，EGC)的红色条带，但云茎63H有未知条带。

高效液相色谱(HPLC)进一步证实(图6)，含儿茶素组分多的细胞系(云茎63YC)含有表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)、表儿茶素没食子酸酯((-)-epicatechin-3-gallate，ECG)、表没食子儿茶素((-)-epigallocatechin，EGC)、没食子儿茶素((+)-gallocatechin，GC)、儿茶素((+)-catechin，C)和表儿茶素((-)-epicatechin，EC)，而含儿茶素组分少的细胞系(云茎63H)只有表没食子儿茶素((-)-epigallocatechin，EGC)、没食子儿茶素((+)-gallocatechin，GC)、儿茶素((+)-catechin，C)和表儿茶素((-)-epicatechin，EC)。

5.筛选茶细胞系稳定性检测

利用高效液相色谱(HPLC)方法，定期检测培养的茶细胞系的儿茶素含量和组分，以确定茶细胞系儿茶素合成能力的稳定性。

茶细胞系儿茶素高效液相色谱(HPLC)检测方法如下：

A.筛选茶细胞系儿茶素提取液的制备(同薄层层析检测方法)，

B.高效液相色谱(HPLC)检测方法

儿茶素提取液用色谱甲醇稀释到合适的浓度，HPLC检测。

HPLC色谱条件：色谱泵：沃特斯600(Waters 600)；控制仪：沃特斯600(Waters 600)；色谱柱：菲罗门圣洁兰4u辐深250*4.6mm(Phenomenex Synergi 4u Fusion 250*4.6mm)；检测器：UV沃特斯(Waters)2487；灵敏度：0.01；检测波长：280nm；流速：1.2ml/分钟；进样量：5μl；每一试样进样之前，以流动相平衡15分钟。采用梯度洗脱条件A相：1％乙酸，B相：色谱纯乙腈，洗脱梯度为前20分钟内A相由90％到87％，B相由10％到13％；20分钟到40分钟A相由87％到70％，B相由13％到30％。外标法定量。

目的在于检测已经筛选到的茶细胞系的儿茶素合成的能力是否保持不变，如果有变化，茶细胞系必须被液氮超低温保存。

参考文献：

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Claims (1)

1.茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法，其特征在于：包括茶愈伤组织诱导与继代、含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选、含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选、含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选4道操作步骤，具体操作方法如下：

(1)茶愈伤组织诱导与继代

A、诱导

选取茶树幼嫩茎为外植体，将外植体消毒，并接种于固体培养基上诱导，诱导条件：温度25±1℃，暗培养；每21天转接继代一次，转接1-3次，茎段两端即可长出浅黄色的茶愈伤组织；

B、继代

将浅黄色茶愈伤组织切成0.5cm*0.5cm大小，继续在固体培养基上继代培养，每21天转接继代一次，至少转接5次，继代培养条件：温度25±1℃，暗培养；继代过程中不断弃去褐化和长势不好的茶愈伤组织，保留生长速度快的茶愈伤组织；

(2)含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选

取茶愈伤组织在固体培养基上继代培养，21天转接继代一次；继代培养条件：温度25±1℃，暗培养；在第21天转接继代时，采取目视法对茶愈伤组织进行筛选，即在超净工作台上挑选不同颜色、不同质地的茶愈伤组织分别进行继代培养；转接继代半年至一年，获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织；

所述高儿茶素含量的茶愈伤组织，颜色为黄色、生长速度快、质地疏松；

所述低儿茶素含量的茶愈伤组织，颜色为白色、生长速度快、质地松散；

(3)含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织分别接种到液体培养基上培养21天，接着再分别接种到固体培养基上培养21天；固体培养条件：温度25±1℃，暗培养；液体培养条件：摇床转速100rpm、培养瓶为150ml的三角锥形瓶、装液量30ml、接种量1g，温度25±1℃、暗培养；在液体与固体培养的交替继代接种时，在超净工作台上将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织逐一编号后用手术刀一分为二，取其中的一半放入事先装有5ml1％g/v香草醛盐酸试剂的试管中，显色10分钟，将对应的另一半分别进行继代培养；如此反复循环，至少4个循环，获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶细胞系；

所述高儿茶素含量的茶细胞系，1％g/v香草醛盐酸试剂活体快速显色后呈现深红色；茶细胞系的儿茶素含量达到每克干重7.7689毫克以上；

所述低儿茶素含量的茶细胞系，1％g/v香草醛盐酸试剂活体快速显色后呈现浅红色；茶细胞系的儿茶素含量达到每克干重0.1272毫克以下；

(4)含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织分别接种到液体培养基上培养21天，接着再分别接种到固体培养基上培养21天；固体培养条件：温度25±1℃，暗培养；液体培养条件：摇床转速100rpm/min、培养瓶为150ml的三角锥形瓶、装液量30ml、接种量1g，温度25±1℃、暗培养；在液体与固体培养的交替继代接种时，将高儿茶素含量的茶愈伤组织的一半和低儿茶素含量的茶愈伤组织的一半分别进行儿茶素组分的薄层层析检测，将对应的另一半分别进行继代培养；如此反复循环，至少4个循环；获得两种以上含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系；

薄层层析检测操作步骤如下：

A.制备茶细胞系儿茶素提取液

对两种以上含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系分别制备茶细胞系儿茶素提取液；

取含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系3g，加少许石英砂，液氮研磨至粉碎，加3ml 95％乙醇研磨，4000g离心，吸取上清液，沉淀加3ml 95％乙醇，再次离心，重复离心三次，最后95％乙醇定容至10ml；将上述得到的10ml乙醇溶液，蒸干去除乙醇，再用热水溶解，再用与热水等量的乙酸乙酯萃取3次，取有机相浓缩干燥，用1ml甲醇定容；甲醇定容溶液用孔径为0.45μm有机膜过滤，得两种以上儿茶素提取液；

B.薄层层析检测

分别对两种以上儿茶素提取液进行薄层层析检测；

薄层层析展开剂∶正丁醇∶冰乙酸∶水＝4∶1∶5，配制后的展开剂经过多次振摇后，放置24小时后，弃去下层后待用；

将儿茶素提取液点样于2.5*10硅胶GF-254板上，25℃下展层2～3h，展开剂接近硅胶板上端后取出硅胶板晾干，硅胶板经过1％g/v香兰素盐酸溶液喷雾显色，吹风机吹干后，立刻观察拍照；

所述含六种儿茶素组分的茶细胞系，其儿茶素提取液，在展层后的硅胶板上，经过1％g/v香兰素盐酸溶液喷雾显色，呈现四个红色条带；高效液相色谱检测含有表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素六种儿茶素；

所述含六种以下儿茶素组分的茶细胞系，其儿茶素提取液，在展层后的硅胶板上，经过1％g/v香兰素盐酸溶液喷雾显色，呈现四个以下红色条带；高效液相色谱检测含有表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素和表儿茶素六种儿茶素中的五种以下；

所述固体培养基为：在1L B₅培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激动素0.1mg、琼脂8g和蔗糖30g；pH为5.5；

所述液体培养基为：在1L B₅培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激动素0.1mg和蔗糖30g；pH为5.5。

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