CN101451106A - 基于农用复合肥的用于微藻培养的工业培养基的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及采用以农用复合肥的可循环使用的用于微藻培养的工业培养基的配制。本发明采用技术方案是：采用N、P、K含量不同的农用复合肥作为培养基的组成成分，在添加柠檬酸铁、工业盐、农用尿素、碳酸氢钠、混合的农用复合肥后，配制出适用于微藻工业化培养的初始液体培养基，同时，将回收培养基残液，经与新配制的初始液体培养基参合，制成可循环使用的再生培养基。使用本发明所述的培养基，所收获的微藻生物量和代谢产物产量有不同程度的提高，所采用的农用复合肥替代微藻培养配方中的化学纯或分析纯成分，具有方法易行、操作安全，可大幅度降低生产成本30％－60％。
Description
技术领域
本发明涉及采用以农用复合肥的可循环使用的用于微藻培养的工业培养基的制备。
背景技术
海藻养殖受地域影响较为显著，一般局限于沿海等地。在培养过程中如果不考虑所用培养基的复杂程度和有效性，生产费用通常是限制海藻培养商业化的主要制约因素。海水和无机盐是培养基的基本组成。为了实现商业化海藻培养，使海藻培养引入到最需要的地域，就必须寻找到廉价而又可行的培养基替代海水进行规模化养殖。目前，世界各国正在研究海藻的廉价培养。利用好氧消化后的奶牛粪便和硝酸铵、硫酸铵等农业肥料两种培养基替代分析纯氮源养殖Chondracanthus canaliculatus，实验结果与传统培养基结果均没有显著差异，表明处理后的粪便或者农业肥料均可作为该藻的良好营养来源，具备有效、廉价等优点(Pacheco-Ruíz et al.，Cienc.1987；Pacheco-Ruíz et al.，Aquaculture.2004)。采用养鱼废水以及化肥培养食用型红藻Gracilaria parvispora(Rhodophyta)，通过每天添加一定量铵盐促进红藻的生长，可以获得最高产率达细胞干重40g/m2·d(Nagler et al.，Aquaculture.2003)。利用曝气啤酒废水进行螺旋藻生长研究，相比分析纯组成的CFTRI培养基，螺旋藻相对生长率相同，而蛋白质含量相对低于后者，但这也说明啤酒废水养殖螺旋藻的可行性(郑爱榕等，海洋科学.2004)。选用N:P:K[20:20:20]等农业肥料养殖雨生红球藻能够获得最大的细胞密度，而且细胞密度比分析纯组成的BG11改良培养基高9.8％(Dalay et al.，Journal of Microbiology and Biotechnology.2007)。在对照培养基中添加一定量猪粪发酵液培养绿藻Scenedesmus spp.，添加发酵液使Scenedesmus细胞生长速率增加到三倍，且细胞叶绿素a、虾青素、叶黄素等次生代谢产物都有成倍的提高，表明添加的物质能够提高绿藻细胞的生理和生化活性；通过充分利用动物废水养殖的方法不仅可以获得更多的营养物质，而且能够减少废水排放所造成的环境污染(Kim et al.，Bioresource Technology.2007)。利用氮源丰富的肥料取代f/2培养基中的氮源培养三角褐指藻以获得胞外多糖、可溶性蛋白和SOD等产物，结果表明在富含尿素的化肥培养基中三角褐指藻的SOD活性是对照组的三倍(Guzmán-Murillo et al.，J Appl Phycol.2007)。上述实验研究体现了利用廉价肥料培养基实现微藻生物量和生物活性物质显著提高已成为可能。
紫球藻(Porphyridium cruentum)属红藻门的单细胞藻，富含多种生物活性物质，其蛋白质含量为32.1％，氨基酸含量为29.54％；碳水化合物39.4％，总膳食纤维21.7％；灰份17.6％，水分7.8％，每千克干藻粉钙、镁、钾和锌含量分别为20000mg、4100mg、9500mg和92mg；每千克干藻粉β-胡萝卜素240mg、维生素B6 18mg；有毒重金属铅、砷和汞含量符合有关规定(黄键等，食品与发酵工业，2005)。近年来的研究表明紫球藻及其胞外多糖具有(1)抗病毒作用；(2)调血脂作用(陈必链等，应用与环境生物学报，2004)；(3)抗炎作用或抗肿瘤细胞作用；(5)抗辐射作用；(6)降血糖作用(刘丽平等，中国海洋药物，2005；黄键等，福建师范大学学报，2006)。开展不同类型的封闭式光生物反应器培养紫球藻，如平板式光生物反应器(游文朗等，植物资源与环境学报，2006)、搅拌式光生物反应器(陈必链等，应用与环境生物学报，2004)等。研究了超声波辐射对紫球藻细胞抗氧化防御体系的影响(Bilian Chen et al.，Colloids andSurfaces B：Biointerfaces.2008)。由于紫球藻及其胞外多糖药效学的研究已取得明显进展，因此开展紫球藻的工业化培养，降低生产成本成为当今研究开发的热点和难点。
蔷薇藻(Rhodella reticulata)是与紫球藻同属红藻门的单细胞藻，细胞外包被着一层粘质鞘，由细胞生长进入稳定期后产生胞外水溶性粘多糖形成。蔷薇藻含丰富的藻胆蛋白、胞外多糖和不饱和脂肪酸等天然产物。尤其胞外多糖的物化性质与紫球藻极为相似(Geresh et al.，J Biochem Biophys Methods.2002)，因此，可能具有类似紫球藻及其胞外多糖的抗病毒、降血糖以及降血脂等功能，国外许多学者围绕蔷薇藻的胞外多糖、藻胆蛋白、光合系统等方面进行了研究，用X射线衍射的方法分析发现蔷薇藻R.viollacea的葡聚糖为B型(Shimonagaet al.，Plant Celll Physiol.2008)，纯化了蔷薇藻的藻胆蛋白，得到B—藻红蛋白，C—藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白(Mihova et al.，J Biotechnol.1996)；国内张艳燕等研究氮源对蔷薇藻生长代谢的影响(张艳燕等，武汉植物学研究.2008)。
发明内容
本发明的目的就是提供一种基于农用复合肥的可循环使用的用于紫球藻、蔷薇藻培养的工业培养基的制备方法。
为实现本发明的目的而采用的技术方案是：采用N、P、K含量不同的农用复合肥作为培养基的组成成分，制备出适用于微藻工业化初始培养的初始液体培养基，同时，回收经过初始培养后的培养基残液，经与新配制的初始液体培养基参合，制成可循环使用的再生液体培养基，上述培养基在保证微藻生物量和代谢产物产量有所提高的前提下，实现利用农用复合肥取代传统培养基配方中的大量化学纯或分析纯原料，达到既降低生产成本又提高目标产物的目的。
以液体培养基的总体积(L)计，初始液体培养基的配方为：柠檬酸铁0.025g/L、工业盐12.5g/L、农用尿素0.2g/L、碳酸氢钠0.5g/L、混合的农用复合肥0.1-1.5g/L。
本发明所述的农用复合肥指N、P、K比分别是N:P:K[27:6:6]的农用复合肥、N:P:K[16:0:9]的农用复合肥、N:P:K[16:16:16]的农用复合肥或N:P:K[20:20:20]的农用复合肥。所述的混合的农用复合肥是指上述农用复合肥一种或多种以任意比例的混合。
以液体培养基的总体积(L)计，可循环使用的再生液体培养基的配方为：培养基残液与初始液体培养基比为10％-50％：50％-90％。
本发明所述的微藻是指红藻门的单细胞类群的紫球藻、蔷薇藻。
根据配方制备微藻培养液，将配好的培养液分装于250mL三角瓶中，每个三角瓶装100mL培养液，接入对数期藻种，置往复式摇床培养，往复频率为90r/min，光照强度4500lux，温度25℃。于培养周期结束收集并测定藻细胞干重、藻红蛋白含量和胞外多糖含量。
本发明采用农用复合肥替代微藻培养配方中的化学纯或分析纯成分，具有方法易行、操作安全，可大幅度降低生产成本，与采用化学纯或分析纯培养基配方相比，采用农用化肥培养基配方可降低培养基成本30％-70％，同时微藻的生物量、胞外多糖、藻胆蛋白等生理活性产物产量有不同程度的提高，有较大的推广应用价值。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
按照以下配方制备紫球藻培养基：在塑料桶中预先加入970L的清水，在搅拌的同时，逐步加入28g的柠檬酸铁、12500g的工业盐、200g的农用尿素、500g的碳酸氢钠、按300g的N:P:K[16:0:9]的农用复合肥，500g的N:P:K[16:16:16]的农用复合肥和400g的N:P:K[27:6:6]的农用复合肥混合而成的混合农用复合肥并使其完全溶解，即配制成初始液体培养基998L。
取初始液体培养基250mL于三角瓶中，接入对数期紫球藻藻种，置往复式摇床培养，光照强度4500lux，温度25℃。培养周期结束后，以收获时的生物量与采用KOCH配方相比，提高了12.5％。同时，胞外多糖、藻胆蛋白的含量也相应有所提高。经测算培养基配方成本降低40％。
实施例2
按照以下配方制备紫球藻培养基：在塑料桶中预先加入975L的清水，在搅拌的同时，逐步加入43g的柠檬酸铁、10500g的工业盐、200g的农用尿素、500g的碳酸氢钠、按300g的N:P:K[16:0:9]的农用复合肥，600g的N:P:K[27:6:6]的农用复合肥，即配制成初始液体培养基996L。
取初始液体培养基500mL于三角瓶中，接入对数期紫球藻藻种，置往复式摇床培养，光照强度4500lux，温度24℃。培养周期结束后，以收获时的生物量与采用KOCH配方相比，提高了11.8％。同时，胞外多糖、藻胆蛋白的含量也相应有所提高。经测算培养基配方成本降低38％。
实施例3
按照以下配方制备紫球藻培养基：在塑料桶中预先加入980L的清水，在搅拌的同时，逐步加入35g的柠檬酸铁、11450g的工业盐、450g的农用尿素、600g的碳酸氢钠、700g的N:P:K[27:6:6]的农用复合肥，即配制成初始液体培养基。
取初始液体培养基500L分装于大烧瓶中，接入对数期紫球藻藻种，置往复式摇床培养，光照强度4500lux，温度25℃。培养周期结束后，以收获时的生物量与采用KOCH配方相比，提高了10.5％。同时，胞外多糖、藻胆蛋白的含量也相应有所提高。经测算培养基配方成本降低43％。
紫球藻收获后，对培养基残液进行粗虑，取其清液200L，加入300L初始液体培养基，混匀，分装于大烧瓶中，接入对数期紫球藻藻种，置往复式摇床培养，光照强度4500lux，温度25℃。培养周期结束后，以收获时的生物量与采用KOCH配方相比，提高了9.5％。同时，胞外多糖、藻胆蛋白的含量也相应有所提高。经测算培养基配方成本降低56％。
实施例4
按照以下配方制备蔷薇藻培养基：在塑料桶中预先加入983L的清水，在搅拌的同时，逐步加入40g的柠檬酸铁、10000g的工业盐、150g的农用尿素、400g的碳酸氢钠、1300g的N:P:K[16:0:9]的农用复合肥，并使其完全溶解，即配制成初始液体培养基。
取初始液体培养基500L分装于大烧瓶中，接入对数期蔷薇藻藻种，置往复式摇床培养，光照强度4500lux，温度25℃。培养周期结束后，以收获时的生物量与采用KOCH配方相比，提高了11.5％。同时，胞外多糖、藻胆蛋白的含量也相应有所提高。经测算培养基配方成本降低46％。
蔷薇藻收获后，对培养基残液进行粗虑，取清液450L，加入450L初始液体培养基，混匀，分装于大烧瓶中，接入对数期蔷薇藻藻种，置往复式摇床培养，光照强度4500lux，温度25℃。培养周期结束后，以收获时的生物量与采用KOCH配方相比，提高了8.5％。同时，胞外多糖、藻胆蛋白的含量也相应有所提高。经测算培养基配方成本降低45％。
Claims (4)
1、一种基于农用复合肥的可循环使用的用于微藻培养的工业培养基的配制，其特征是：
以液体培养基的总体积L计，初始液体培养基的配方为：柠檬酸铁0.025g～0.045g/L、工业盐10.5g～12.45g/L、农用尿素0.1g～0.45g/L、碳酸氢钠0.5g/L、混合的农用复合肥0.1-1.5g/L；
以液体培养基的总体积L计，可循环使用的再生培养基的配方为：培养基残液与初始液体培养基比为10％-50％∶50％-90％。
2、根据权利要求1所述的基于农用复合肥的可循环使用的用于微藻培养的工业培养基的配制，其特征是所述的农用复合肥是指N、P、K比分别是N∶P∶K[27∶6∶6]的农用复合肥、N∶P∶K[16∶0∶9]的农用复合肥、N∶P∶K[16∶16∶16]的农用复合肥或N∶P∶K[20∶20∶20]的农用复合肥。
3、根据权利要求2所述的基于农用复合肥的可循环使用的用于微藻培养的工业培养基的配制，其特征是所述的混合的农用复合肥是指上述农用复合肥一种或多种任意比例的混合。
4、根据权利要求1所述的基于农用复合肥的可循环使用的用于微藻培养的工业培养基的配制，其特征是所述的微藻是指红藻门的单细胞类群的紫球藻、蔷薇藻。
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| CN102701801B (zh) * | 2012-05-16 | 2014-02-19 | 上海交通大学 | 由无机肥制备有机肥或复合肥同时生产沼气能源的方法 |
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