CN101411306A

CN101411306A - 一种橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生方法

Info

Publication number: CN101411306A
Application number: CNA2008102260012A
Authority: CN
Inventors: 周权男; 李哲; 孙爱花; 黄天带; 于波; 黄华孙; 林位夫; 汪秀华
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2008-11-03
Publication date: 2009-04-22
Anticipated expiration: 2028-11-03
Also published as: CN101411306B

Abstract

本发明提供了一种橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生方法，主要包括：选择橡胶树试管苗无菌幼根，直径为0.8～1.2mm，切成长度为1.0～1.5cm的根段，在胚性愈伤组织诱导培养基暗培养25～40天；再转入继代培养基，暗培养15～30天；然后转移到体细胞胚诱导培养基暗培养20～50天；最后转移到出苗培养基，光照培养，培养20～50天，培养温度为25～28℃，长成完整植株。本发明所提供的橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生方法，工艺流程简单，可以取用优良橡胶树品种的树根为外植体，经体细胞胚发生途径诱导再生植株，建立优良砧木离体培养无性繁殖体系。

Description

一种橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生方法

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养方法，具体地说，涉及一种以橡胶树试管苗无菌根作为外植体，通过体细胞胚发生途径获得再生植株的方法。

背景技术

橡胶树是多年生的异花授粉乔木，栽培于热带地区。橡胶树的主产品天然橡胶是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有重要地位。由于我国热带地区可种植橡胶树的土地资源有限，且天然橡胶属于不可替代的稀缺资源。因此，选育和推广高产橡胶树，是提高单位面积产量、确保我国天然橡胶总产量逐步提高的关键。

随着植物组织培养技术的发展，从上世纪七十年代以来，橡胶树组织培养技术也蓬勃开展，以期利用生物技术拓宽橡胶树育种途径，改良其性状，加速育种进程。目前橡胶树不同外植体来源的组织培养，如花药、未授粉胚珠、子房、内珠被、子叶培养均获得成功，获得了再生植株。但橡胶树根的组织培养还未见报道。

在其它植物中，从木本植物的根进行离体培养研究成功地诱导出再生植株的报道较少。1990年Son等用银白杨试管苗的根系切取外植体，经组织培养得到了再生植株。1991年法国的Pedrotti等进行了樱桃的根系离体培养，通过间接愈伤组织诱导和直接芽诱导，成功地培养出植株。1992年Bhat等切取酸柠檬的根在MS培养基中进行组织培养，有低频的植株再生。1996年Sankhla等把合欢种子在无菌条件下诱导萌发，取15～20天龄的幼苗的根作为外植体，经组织培养得到再生植株。

在橡胶树栽培实践中，最早使用的种植材料是实生树，实生树来自自然授粉的种子，具有生长快、经济寿命长、抗逆性强的优点，但存在株间差异大、平均产量低(仅为芽接树的1/3)、不能保持母本优良性状的缺点。

目前生产上普遍种植芽接树，使用的橡胶树繁殖的主要方法是嫁接，即橡胶树种植材料主要是用芽接苗；芽接树减少了株间产量的差异，大幅度提高了产量。但是砧木与接穗间存在相互作用，砧木对接穗的影响不仅表现在生长、产量、生理生化特性及组织结构上，而且还表现在内源植物激素方面，产量的变化与内源激素之间存在某种联系。

近年来，发现一些具有优良性状的砧木，对芽接树的产量、抗寒、速生等性状有重要影响。一般在我国大规模种植的高产橡胶树品种如热研7-33-97，单株年产干胶6～7公斤。但目前在云南发现有些品种有超高产的橡胶树，单株年产干胶100公斤以上，在西双版纳傣族自治州景洪市也有单株年产干胶98公斤的橡胶树。橡胶树育种工作者取一些超高产橡胶树的芽条与实生苗砧木进行嫁接后，并未发现嫁接苗长大后在产量上出现超高产的情况。

从同一母本植株取芽条进行嫁接的芽接树，其接穗的遗传性状是相同的；而作为砧木的实生苗，由种子萌发而来，在有性生殖过程中发生了基因分离，因而实生苗砧木的遗传背景差别很大。芽接树成年后，普通高产橡胶树之间产量差别小，但超高产橡胶树和普通高产橡胶树之间产量差别则很大，相差几倍到十几倍，这与砧木的遗传性状有关。

在科研和生产过程中，迫切需要对这些具有优良性质的砧木进行扩大繁殖。但由于确定砧木具有优良品性要等到开割以后，需要7年以上时间，此时在砧木上难以找到芽点或芽眼，优良砧木难以通过常规育种方法扩大繁殖。

发明内容

本发明的目的是利用橡胶树优良品种的试管苗无菌根为外植体，经体细胞胚发生途径获得再生植株，以建立优良砧木离体培养无性繁殖体系、获得在遗传上整齐一致的砧木。

为了实现本发明目的，本发明所述的橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生方法，包括如下步骤：

1)根的选择和处理：选取橡胶树花药培养经过胚状体发生途径得到的试管苗的无菌幼根，切成长度约1.0～1.5cm的根段；

2)愈伤组织的诱导和继代培养：把根段接种于胚性愈伤组织诱导培养基，暗培养25～40天；然后转入继代培养基，暗培养15～30天，培养温度为25～28℃；

3)体细胞胚的诱导：将继代培养后的胚性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基，进行暗培养20～50天，培养温度为25～28℃，以诱导出体细胞胚；

4)植株再生：再将成熟体细胞胚转移到出苗培养基，光照培养，培养温度在25～28℃之间，培养20～50天，长成完整植株。

本发明所述的根的选择和处理，是选取长势较好，且来源于性状优良的橡胶树品种，经过橡胶树花药培养胚状体发生途径得到的试管苗的无菌幼根，直径为0.8～1.2mm，切成长度为1.0～1.5cm的根段，作为根段外植体材料，用于诱导胚性愈伤组织。

本发明所述的愈伤组织的诱导和继代培养：是将根段外植体接种于胚性愈伤组织诱导培养基，进行暗培养，诱导出胚性愈伤组织。培养温度为25～28℃，暗培养25～40天，根段在胚性愈伤组织诱导培养基中膨大，部分愈伤化，出现白色非胚性愈伤组织和鲜黄色胚性愈伤组织。

然后将鲜黄色胚性愈伤组织转入继代培养基，进行暗培养，培养温度为25～28℃，暗培养15～30天。鲜黄色胚性愈伤组织进一步增殖。

本发明所述的愈伤组织诱导培养基为改良的MS培养基，将MS培养基中的无水氯化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙150～400mg/L、磷酸二氢钾350～500mg/L、四水硫酸锰15～40mg/L、七水硫酸镁400～600mg/L；并添加2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1～5mg/L、KT(6-糠氨基嘌呤，又名激动素)1～5mg/L、6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.5～5.0mg/L、Phytagel(植物凝胶)2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L。

所述的继代培养基为改良的MS培养基，并添加2，4-D1～3mg/L、KT1～3mg/L、NAA(萘乙酸)1～3mg/L、Phytagel2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L。

本发明所述的体细胞胚的诱导是将鲜黄色胚性愈伤组织经过继代培养后，转移到体细胞胚诱导培养基上进行暗培养，以诱导出体细胞胚，暗培养20～50天，培养温度为25～28℃。鲜黄色胚性愈伤组织表面出现了长势旺盛的乳白色的小体细胞胚，一块胚性愈伤组织可诱导出一至数十个体细胞胚。体细胞胚在此培养基上可进一步发育。

所述的体细胞胚诱导培养基是改良的MS培养基，并添加6-BA0.5～2.0mg/L、KT 0.5～3.0mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、GA₃0.1～1.0mg/L、Phytagel2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L。

本发明所述的植株再生方法，是将成熟子叶型体细胞胚转移到出苗培养基，光照培养，以促其萌发，长成完整植株，培养温度为25～28℃，培养20～50天。

所述的出苗培养基为改良的MS培养基，并添加KT0.5～4.0mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、GA₃(赤霉素)0.1～1.0mg/L、Phytagel2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L。

本发明以橡胶树根为外植体材料建立的植株再生体系，为橡胶树研究领域一直关心的砧穗关系开辟了新的研究途径。橡胶树的砧木一直采用实生苗，遗传背景差异大，用高产芽接树的根通过组织培养方法建立砧木自根无性系，可以为研究和生产提供优良砧木材料，为研究砧木和接穗相互作用提供实验系统，为选择最优的砧穗组合提供了可能，为研究橡胶树超高产的机理打下基础。

本发明设计的愈伤组织诱导、继代培养、体细胞胚诱导和分化出苗培养基和添加物及培养条件，适合于橡胶树品种用本发明方法培养出再生植株。

本发明工艺流程简单，成本低，体细胞胚诱导率高，再生植株健壮，具有很好的应用前景。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

预先按要求配制好各种培养基。选取长势较好，且来源于性状优良的橡胶树品种(如橡胶树无性系热研87-6-62)，经过橡胶树花药培养胚状体发生途径得到的试管苗的幼根，直径为1mm，在无菌条件下切成长度为1.2cm的根段。

把根段接种于愈伤组织诱导培养基，暗培养25天，培养温度为26±1℃，以诱导出愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基为改良的MS培养基，将MS培养基中的无水氯化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙250mg/L、磷酸二氢钾400mg/L、四水硫酸锰35mg/L、七水硫酸镁500mg/L，并添加2，4-D4mg/L、KT2.5mg/L、6-BA3mg/L、Phytagel2g/L、蔗糖70g/L、椰子水50ml/L。

把诱导出的鲜黄色愈伤组织转入继代培养基进行暗培养，培养温度为26±1℃，暗培养15～30天，鲜黄色胚性愈伤组织进一步增殖。所述继代培养基为改良的MS培养基，添加2，4-D2.5mg/L、KT2mg/L、NAA2mg/L、Phytagel2g/L、蔗糖70g/L、椰子水50ml/L。

再把经过继代培养诱导出的鲜黄色胚性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基上，进行暗培养30天，培养温度为26±1℃，以诱导出体细胞胚。体细胞胚在体细胞胚诱导培养基上可以进一步发育，生长为成熟的体细胞胚。体细胞胚诱导培养基为改良的MS培养基，添加6-BA 1mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L、GA₃ 0.5mg/L、Phytagel2g/L、蔗糖70g/L、活性碳1g/L、椰子水50ml/L。

最后将成熟子叶型体细胞胚转移到出苗培养基上，光照培养，培养温度为26±1℃，以促其萌发，长成完整植株。成熟的子叶型体细胞胚转入出苗培养基后，20天后开始陆续萌发，形成的再生小植株健壮、主根发达。出苗培养基为改良的MS培养基，添加KT 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L、GA₃ 0.5mg/L、Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、活性碳1g/L、椰子水50ml/L。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)根处理：选取橡胶树花药培养经过胚状体发生途径得到的试管苗的幼根，直径为0.8～1.2mm，切成长度为1.0～1.5cm的根段；

2)胚性愈伤组织的诱导和继代培养：把根段接种于胚性愈伤组织诱导培养基，暗培养25～40天，诱导出胚性愈伤组织；再转入继代培养基，暗培养15～30天，培养温度为25～28℃；

3)体细胞胚的诱导：将继代培养后的胚性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基，培养温度为25～28℃，暗培养20～50天，诱导出体细胞胚；

4)植株再生：再将成熟体细胞胚转移到出苗培养基，光照培养，培养温度为25～28℃，培养20～50天，长成完整植株。

2、根据权利要求1所述的橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导培养基为改良的MS培养基，将MS培养基中的无水氯化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙150～400mg/L、磷酸二氢钾350～500mg/L、四水硫酸锰15～40mg/L、七水硫酸镁400～600mg/L，并添加2，4-D 1～5mg/L、KT 1～5mg/L、6-BA 0.5～5.0mg/L、Phytagel2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L。

3.根据权利要求1所述的橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生的方法，其特征在于，所述继代培养基为改良的MS培养基，添加2，4-D 1～3mg/L、KT 1～3mg/L、NAA 1～3mg/L、Phytagel 2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L。

4.根据权利要求1所述的橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生再生植株的方法，其特征在于，所述体细胞胚诱导培养基为改良的MS培养基中添加6-BA 0.5～2.0mg/L、KT 0.5～3.0mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、GA₃ 0.1～1.0mg/L、Phytagel 2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L。

5.根据权利要求1所述的橡胶树试管苗无菌根体细胞胚发生植株再生方法，其特征在于，所述出苗培养基为改良的MS培养基中添加KT 0.5～4.0mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、GA₃ 0.1～1.0mg/L、Phytagel2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L。