CN101405389A

CN101405389A - 新型蛋白质表达系统

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Publication number: CN101405389A
Application number: CNA200780009437XA
Authority: CN
Inventors: 游军; 田畑寿晃; 井上诚; 朱亚峰; 长谷川护
Original assignee: Dnavec Corp
Current assignee: Dnavec Corp
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2009-04-08
Also published as: KR20080094910A; CA2636600A1; WO2007083644A1; US20100167341A1; JPWO2007083644A1; EP1983048A4; EP1983048A1

Abstract

本发明者们设计了MiniSeV－SeV粒子共存蛋白质表达系统，并研究了本表达系统将目的基因导入靶细胞的能力及在靶细胞中目的基因的表达水平。结果表明，本发明的表达系统不仅可以将目的基因高效率导入靶细胞，还可以使目的基因在靶细胞中获得高水平的表达。

Description

新型蛋白质表达系统

技术领域

本发明涉及在靶细胞内表达外源基因的方法。该方法包含将分别包装了辅助负链RNA病毒载体和携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子导入靶细胞的步骤。本发明还涉及辅助负链RNA病毒载体和负链RNA病毒微型基因组。进而本发明还涉及辅助负链RNA病毒载体和负链RNA病毒微型基因组各自包装的病毒粒子的制备方法和该病毒粒子。

技术背景

以往的蛋白质表达(蛋白质生产、机能解析等)系统大体分为非病毒蛋白表达系统和病毒蛋白质系统表达。非病毒蛋白质表达系统具有制作简单、成本低、短时间内可大量调制且生物安全性高等长处。但由于in vitro(体外)基因导入效率颇受导入试剂及细胞种类的影响，而in vivo(体内)的基因导入效率很低。反之，病毒蛋白表达系统在in vitro和in vivo中均有较高的基因导入效果，但与非病毒载体相比存在成本较高，调制时间长及生物安全问题等缺点。由于这2种蛋白表达系统各有利弊，因此期待能够开发出更具性能的新型蛋白表达系统。

仙台病毒载体(以下表述为SeV)是细胞质型的病毒载体，其优越性在于在in vitro和in vivo中均表现出高效率基因导入和高水平表达，且在in vitro中长期持续表达。但存在着制备成本高，短时间内很难大量调制等病毒载体共同的缺点。

已知存在干扰性缺损粒子(DI)，其中缺失了SeV基因组的一部分，且其增殖需要正常病毒的辅助，其还可抑制正常病毒增殖。有报告利用该(DI)粒子的特性，构建了携带外源基因的人工DI(SeV微型基因组)的cDNA质粒，并将该质粒与表达NP、P、L的辅助SeV或辅助质粒一起导入靶细胞，以研究目的外来蛋白的表达(非专利文献1)。这个报告与重组SeV载体相比，通过载体cDNA制做简单的微型基因组使表达蛋白成为可能，但由于in vivo及in vitro的基因导入和表达效率较低，尚需改进。

因此，更有待开发出一种将病毒载体和微型基因组表达系统的优势溶为一体的新型表达系统。

本发明的现有技术文献如下。

非专利文献1 Vullienoz et al，Journal of General Virology，86：171-180，2005

发明内容

本发明要解决的课题

鉴于上述，本发明提供一种在靶细胞内表达外源基因的方法。该方法包含将分别包装了辅助负链RNA病毒载体和携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子导入靶细胞的步骤。本发明以提供辅助负链RNA病毒载体和负链RNA病毒微型基因组为课题。本发明还以提供分别包装了辅助负链RNA病毒载体和负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的制备方法以及该病毒粒子为课题。

解决课题的方法

为解决这一课题，本发明者们为充分发挥SeV载体的优势，研究出一种制作简便、成本低、短时间可大量调制的新型蛋白表达系统，使用了SeV微型基因组(MiniSeV)系统。虽然SeV微型基因组系统具有制作简便、转录复制效率高等优越性，但由于在细胞内自我复制时需要将正常病毒或NP、P、L表达质粒作为辅助，故很难打造成高表达水平的载体。

于是，本发明者们设计出了MiniSeV-SeV粒子共存蛋白表达系统(图6)，并研究了本表达系统的目的基因对靶细胞的导入效率及在靶细胞中的表达水平。首先，将缺失SeV融合蛋白质(F蛋白质)的SeV/ΔF和携带目的基因(GOI：gene of interest)的SeV微型基因组cDNA质粒导入表达T7RNA聚合酶和SeV融合蛋白质(F蛋白质)的生产细胞中。然后，回收了MiniSeV/GOI粒子和SeV/ΔF粒子共存的培养上清。使用MiniSeV/GOI和SeV/ΔF共存粒子，在in vitro和in vivo中均实现了目的基因(GOI)对靶细胞的高效导入及在该细胞中的高水平表达。本发明使用了GFP作为目的基因(GOI)之一例。

进而可知：当上述共存粒子系统的SeV微型基因组中使用RNA聚合酶I启动子时，或目的基因附加了Tag(标签)序列(HA-Tag)时，也可获得目的基因对靶细胞的高效导入，并实现了在该细胞中的高水平表达。

即本发明者们成功地构建了目的基因高效率导入靶细胞并在靶细胞内保持高水平表达能力的MiniSeV-SeV粒子共存蛋白质表达系统，直至完成本发明。

本发明更具体地提供以下〔1〕～〔51〕的方法。

〔1〕外源基因在靶细胞内的表达方法，该方法包含以下(a)～(c)步骤。

(a)将辅助负链RNA病毒载体以及携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组导入生产细胞的步骤。

(b)回收在该生产细胞内生产的分别包装了辅助负链RNA病毒载体以及负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的步骤。

(c)将(b)步骤回收的病毒粒子导入到靶细胞的步骤。

〔2〕〔1〕中所述的方法，其包含(a)步骤中将表达NP、P及L蛋白质的载体也导入生产细胞的步骤。

〔3〕〔1〕中的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体是核糖核蛋白(RNP)复合体或病毒样粒子(VLP)。

〔4〕〔1〕中所述的方法，其特征为所述负链RNA病毒微型基因组具有一个或多个启动子。

〔5〕〔4〕中的方法，其特征为所述启动子中至少有一个是RNA聚合酶I启动子。

〔6〕〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中所述负链RNA病毒是副粘病毒。

〔7〕〔6〕中的方法，其特征为辅助负链RNA病毒载体或负链RNA病毒微型基因组表达副粘病毒的NP、P及L蛋白质。

〔8〕〔6〕中所述的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体是包含负链单链RNA的载体。该负链单链RNA的载体将5′端尾随区被替换成前导区，且该负链单链RNA载体不表达副粘病毒的F、M或HN蛋白质中任意一个或多个蛋白质。

〔9〕〔8〕中所述的方法，其特征为所述生产细胞表达在辅助负链RNA病毒载体中修饰为非表达的F、M或HN蛋白质中的任意一个或多个蛋白质。

〔10〕〔8〕或〔9〕中所述的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体的被修饰的蛋白质是F蛋白质。

〔11〕〔8〕-〔10〕中任一项所述的方法，其特征为所述辅助负链RNA病毒载体在P基因以及/或C基因中具有突变。

〔12〕〔11〕中所述的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体包含以下(a)或(b)的负链单链RNA。

(a)包含序列号10的碱基序列的单链负链RNA

(b)在严格条件下，与包含序列号10的碱基序列的负链RNA的互补链进行杂交的单链负链RNA

〔13〕〔6〕中所述的方法，其中所述副粘病毒是仙台病毒。

〔14〕〔6〕中所述的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体是野生型仙台病毒载体。

〔15〕〔1〕～〔14〕中任一项所述的方法，其中所述生产细胞是表达T7 RNA聚合酶的细胞。

〔16〕〔1〕～〔15〕中所述的任一方法，其特征为在in vitro(体外)的靶细胞中表达外源基因。

〔17〕〔16〕中所述的方法，其中所述靶细胞是293T细胞、A549细胞、BHK-21细胞、C2C12细胞、HeLa细胞、LLC-MK₂细胞、MDCK细胞、或NIH3T3细胞中的任一细胞。

〔18〕〔1〕～〔15〕中任一项所述的方法，其特征为在in vivo(体内)的靶细胞中表达外源基因。

〔19〕〔1〕～〔18〕中任一项所述的方法，其特征为外源基因中附加了Tag(标签)序列。

〔20〕〔19〕中所述的方法，其中所述Tag序列是HA-Tag。

〔21〕辅助负链RNA病毒载体，其包含修饰为不表达副粘病毒的F、M或HN蛋白质中的任意一种或多种蛋白质、且将5′端尾随区替换成前导区的负链单链RNA。

〔22〕〔21〕中所述的载体，其中所述被修饰的蛋白质是F蛋白质。

〔23〕〔21〕或〔22〕中所述的载体，其特征为P基因以及/或C基因中具有突变。

〔24〕〔23〕中所述的载体，其中所述辅助负链RNA病毒载体包含以下(a)或(b)的负链单链RNA。

(a)包含序列号10的碱基序列的单链负链RNA

〔25〕〔21〕～〔24〕中任一项所述的载体，其中所述辅助负链RNA病毒载体是核糖核蛋白(RNP)复合体或病毒样粒子(VLP)。

〔26〕〔21〕～〔25〕中任一项所述的载体，其中所述负链RNA病毒是副粘病毒。

〔27〕〔26〕中所述的载体，其中所述副粘病毒是仙台病毒。

〔28〕携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组。

〔29〕〔28〕中所述的负链RNA病毒微型基因组，其特征为具有一个或多个启动子。

〔30〕〔29〕中所述的负链RNA病毒微型基因组，其特征为启动子中至少一个是RNA聚合酶I启动子。

〔31〕〔28〕～〔30〕中任一项所述的负链RNA病毒微型基因组，其中所述负链RNA病毒是副粘病毒。

〔32〕〔31〕中所述的负链RNA病毒微型基因组，其中所述副粘病毒是仙台病毒。

〔33〕权利要求28～32中任一项所述的负链RNA病毒微型基因组，其特征为，在外源基因中附加Tag序列。

〔34〕权利要求33中所述的负链RNA病毒微型基因组，其中所述Tag序列是HA-Tag。

〔35〕在靶细胞内表达外源基因的方法，其包含将〔21〕～〔27〕中任一项所述的辅助负链RNA病毒载体以及〔28〕～〔34〕中任一项所述的负链RNA病毒微型基因组导入靶细胞的步骤。

〔36〕病毒粒子的制备方法，其包含以下(a)和(b)的步骤。

(a)将辅助负链RNA病毒载体以及携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组导入到生产细胞的步骤

(b)回收该生产细胞内生产的分别包装了辅助负链RNA病毒载体以及负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的步骤

〔37〕〔36〕中所述的方法，其进一步包含在步骤(a)中将表达NP、P及L蛋白质的载体导入到生产细胞的步骤。

〔38〕〔36〕中所述的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体是核糖核蛋白(RNP)复合体或病毒样粒子(VLP)。

〔39〕〔36〕中所述的方法，其特征为所述负链RNA病毒微型基因组具有一个或多个启动子。

〔40〕〔39〕中所述的方法，其特征为启动子的至少其中之一是RNA聚合酶I启动子。

〔41〕〔36〕～〔40〕中任一项所述的方法，其中所述负链RNA病毒是副粘病毒。

〔42〕〔41〕中所述的方法，其特征为辅助负链RNA病毒载体或负链RNA病毒微型基因组表达副粘病毒的NP、P及L蛋白质。

〔43〕〔41〕中所述的方法，辅助负链RNA病毒载体包含不表达副粘病毒的F、M或HN蛋白质中的任意一种或多种蛋白质、而将5′端尾随区替换成了前导区的负链单链RNA。

〔44〕〔43〕中所述的方法，其中所述生产细胞特征为表达在辅助负链RNA病毒载体中被修饰成非表达的F、M或HN蛋白质中的任一或多个蛋白质。

〔45〕〔43〕或〔44〕中所述的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体中被修饰的是F蛋白质。

〔46〕〔43〕～〔45〕中任一项所述的方法，其特征为辅助负链RNA病毒载体在P基因以及/或C基因中具有突变。

〔47〕〔46〕中所述的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体包含以下(a)或(b)中所述的负链单链RNA。

(a)含有序列号10中的碱基序列的负链单链RNA

(b)在严格条件下，与包含序列号10中的碱基序列的负链RNA的互补链进行杂交的单链负链RNA

〔48〕〔41〕中所述的方法，其中所述副粘病毒是仙台病毒。

〔49〕〔41〕中所述的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体是野生型仙台病毒载体。

〔50〕〔36〕～〔49〕中任一项所述的方法，其中所述生产细胞是表达T7 RNA聚合酶的细胞。

〔51〕通过〔36〕～〔50〕中任一项所述的方法回收的分别包装了辅助负链RNA病毒载体以及负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子。

附图说明

【图1】pSeVagp55/ΔF的构建图。

【图2】pSeVagp55/(P/C)m/ΔF的构建图。

【图3】SeV微型基因组(SeV minigenome)设计图。

(A)单启动子SeV微型基因组(Single-promoter SeV minigenome)；MiniSeV_SP/GOI(B)双启动子SeV微型基因组(Double-promoter SeVminigenome)；MiniSeV_DP/GOI(1)GP的第58碱基C突变为A，这一突变使S机能大幅度下降。(2)缺失GP的最初12个碱基使3’-启动子(3’-promoter)机能大幅度下降。

【图4】SeV单启动子微型基因组cDNA(SeV single-promoter minigenomecDNA)的构建图。

【图5】SeV双启动子微型基因组cDNA(SeV double-promoter minigenomecDNA)的构建图。

【图6】MiniSeV-SeV/ΔF粒子共存蛋白表达系统的结构图。

【图7】辅助SeV(Helper SeV)设计对共存粒子生产性的影响示意图。(A)包装细胞(Packaging Cell)中产生的共存粒子(B)共存粒子感染靶细胞(Target Cell)

【图8】微型SeV cDNA(MiniSeV cDNA)设计对共存粒子生产性影响的示意照片及图。(A)包装细胞中产生的共存粒子(B)生产出的共存粒子的滴度检测

【图9】使用SeVagp55/ΔF和SeVagp55/(P/C)m/ΔF的共存粒子生产性的对比照片及图。(A)包装细胞中产生的共存粒子(B)共存粒子感染靶细胞(C)生产的共存粒子的滴度。

【图10】改善共存粒子中MiniSeV和Helper SeV的量的比的示意照片和图。(A)包装细胞中的共存粒子的生产(B)生产的共存粒子的滴度及HelperSeV/MiniSeV的量之比

【图11】显示利用MiniSeV_DP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子的in vitro表达的照片。

【图12】显示利用共存粒子的in vivo表达(鼻腔内GFP表达)的照片。

【图13】显示利用MiniSeV_DP/GFP cDNA质粒以及SeVagp55/ΔF感染性粒子的蛋白质表达的照片。

【图14】使用RNA聚合酶I启动子的微型基因组cDNA的构建图。

【图15】携带带有HA-Tag的基因(GFP)的微型基因组cDNA的构建图。

【图16】显示利用使用RNA聚合酶I启动子的共存粒子系统的in vitro表达的照片。

【图17】显示利用携带了附带HA-Tag的基因的共存粒子系统的in vitro表达的照片。

本发明的具体实施方式

本发明者们将辅助负链RNA病毒载体以及携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组导入生产细胞，并将在生产细胞内分别包装的病毒粒子导入靶细胞，由此实现了目的基因的高效导入及高水平表达。本发明正是基于这一卓识产生。

本发明涉及在靶细胞中表达外源基因的方法。该方法包含以下(a)～(c)的步骤。

(a)将辅助负链RNA病毒载体及携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组导入到生产细胞的步骤

(b)回收该生产细胞内生产的分别包装有辅助负链RNA病毒载体以及负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的步骤

(c)将(b)回收的病毒粒子导入靶细胞的步骤

本发明中的负链RNA病毒是以负链(与编码病毒蛋白的有义链互补的反义链)RNA为基因组的病毒。负链RNA病毒又称[-]负链RNA病毒。本发明中所使用的负链RNA病毒尤其优选单链负链RNA病毒(也可称非分节段型(non-segmented)负链RNA病毒)。所谓单链负链RNA病毒即以一条负链(即[-]链)RNA为基因组的病毒。包括属于副粘病毒科(Paramyxoviridae；含副粘病毒属(Paramyxovirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)、及肺病毒属(Pneumovirus)等)、弹状病毒科(Rhabdoviridae；含水泡病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)、及短暂热病毒属(Ephemerovirus)等)，纤丝病毒科(Filoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae；含布尼亚病毒属(Bunyavirus)，汉坦病毒属(Hantavirus)，内罗病毒属(Nairovirus)，以及白蛉病毒属(Phlebovirus)等)、沙粒病毒科(Arenaviridae)等病毒科的病毒。本发明使用的负链RNA病毒载体，可以是具有传播性或非传播性的缺陷型载体。所谓“传播性”，是指病毒载体感染宿主细胞时，病毒可以在该细胞内进行复制，并产生感染性病毒粒子。所谓缺陷型载体，如至少缺失编码包膜蛋白的基因的其中一种。具体为，因病毒种类而异，如缺失编码F、H、HN、G、M、M1等包膜蛋白的基因中的至少一种(WO00/70055及WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。

本发明中尤其优选适用的负链RNA病毒，具体如副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙台病毒(Sendai virus)、新城疫病毒(Newcastledisease virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、RS病毒(respiratory syncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热城疫病毒(distemper virus)、猴猿类副流感病毒(SV5)、人类副流感病毒1，2，3，；属弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水泡性口内炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(rabies virus)等。本发明的副粘病毒优选副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)属(包括呼吸道病毒属、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)，更优选呼吸道病毒属(respirovirus)(也称副粘病毒属(Paramyxoviridae))的病毒或其衍生物。衍生物中包含在不破坏病毒基因的基因导入能力的前提下对病毒基因进行修饰所改变的病毒及化学修饰后的病毒。适用于本发明的呼吸道病毒属的病毒包括，人副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙台病毒(也称鼠副流感病毒1型)、猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。本发明的副粘病毒最优选仙台病毒。这些病毒可源自天然株、野生型株、突变株、实验室传代株、人工构建株等。

例如，仙台病毒(Sendai virus；SeV)中的天然病毒基因组长约15,000碱基，负链在3′短前导区后依次具有编码NP(核蛋白)、P(磷)、M(基质)、F(融合)、HN(血凝素-神经氨酸酶)、以及L(大)蛋白质的6种基因，在5’端具有短5′尾随区。

副粘病毒的“NP、P、M、F、HN、以及L基因”分别是指编码核蛋白、磷、基质、融合、血凝素-神经氨酸酶以及大蛋白的基因。磷(P)蛋白质是作为RNA聚合酶小亚单元的磷酸化蛋白质。基质(M)蛋白具有从内侧保持病毒粒子构造的机能。融合(F)蛋白是参与攻入宿主细胞的膜融合蛋白质。血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白是参与与宿主细胞结合的蛋白质。大蛋白是RNA聚合酶的大亚单元。上述基因都各具转录调控单元，可从各基因单独转录出mRNA并翻译成蛋白质。除P蛋白外，还由P基因利用不同ORF翻译产生非构造蛋白质(C)和因读取P蛋白质mRNA过程中的RNA编辑而形成的蛋白质(V)。副粘病毒亚科属的每一种病毒的基因通常从3′按顺序表示如下。通常NP基因也可表示为“N基因”。

呼吸道病毒属NP/C/V M F HN-L

腮腺炎病毒属NP/V M F HN(SH)L

麻疹病毒属NP/C/V M F H-L

仙台病毒的各基因的碱基序列的数据库登录号可参照如下：N基因为M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046，X17218；P基因为M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，X17008；M基因为D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056；F基因为D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，X02131；HN基因为D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131；L基因为D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，X58886。其它病毒编码的病毒基因有：N基因为CDV，AF014953；DMV，X75961；HPIV-1，D01070；HPIV-2，M55320；HPIV-3，D10025；Mapuera，X85128；Mumps，D86172；MV，K01711；NDV，AF064091；PDPR，X74443；PDV，X75717；RPV，X68311；SeV，X00087；SV5，M81442；以及Tupaia，AF079780、P基因为CDV，X51869；DMV，Z47758；HPIV-1，M74081；HPIV-3，X04721；HPIV-4a，M55975；HPIV-4b，M55976；Mumps，D86173；MV，M89920；NDV，M20302；PDV，X75960；RPV，X68311；SeV，M30202；SV5，AF052755；以及Tupaia，AF079780、C基因为CDV，AF014953；DMV，Z47758；HPIV-1.M74081；HPIV-3，D00047；MV，ABO16162；RPV，X68311；SeV，AB005796；以及Tupaia，AF079780、M基因为CDV，M12669；DMV Z30087；HPIV-1，S38067；HPIV-2，M62734；HPIV-3，D00130；HPIV-4a，D10241；HPIV-4b，D10242；Mumps，D86171；MV，AB012948；NDV，AF089819；PDPR，Z47977；PDV，X75717；RPV，M34018；SeV，U31956；以及SV5，M32248、F基因为CDV，M21849；DMV，AJ224704；HPN-1，M22347；HPIV-2，M60182；HPIV-3，X05303，HPIV-4a，D49821；HPIV-4b，D49822；Mumps，D86169；MV，AB003178；NDV，AF048763；PDPR，Z37017；PDV，AJ224706；RPV，M21514；SeV，D17334；以及SV5，AB021962、HN(H或G)基因为CDV，AF112189；DMV，AJ224705；HPIV-1，U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3，AB012132；HPIV-4A，M34033；HPIV-4B，AB006954；Mumps，X99040；MV，K01711；NDV，AF204872；PDPR，X74443；PDV，Z36979；RPV，AF132934；SeV，U06433；以及SV-5，S76876、L基因为CDV，AF014953；DMV，AJ608288；HPIV-1，AF117818；HPIV-2，X57559；HPIV-3，AB012132；Mumps，AB040874；MV，K01711；NDV，AY049766；PDPR，AJ849636；PDV，Y09630；RPV，Z30698；以及SV-5，D13868。已知每种病毒都有多种毒株，且毒株之间存在差异，所以除上述序列外还存在着包括其他序列的基因。

本发明中的负链RNA病毒微型基因组指的是下述干扰性缺失粒子，所述干扰性缺失粒子来源于负链RNA病毒，该干扰性缺失粒子由于缺失基因组的一部分，在增殖中需要对所缺失的基因起互补作用的辅助病毒，且该干扰性缺失粒子抑制辅助病毒的增殖。

负链RNA病毒微型基因组可以将所需外源基因导入到基因组RNA中。对外源基因没有特别限制，可以是编码天然的蛋白质全长，或其部分片段(7个氨基酸以上、优选8、10、或15个氨基酸以上)，也可以是编码它们和其它多肽的融合多肽等。导入了外源基因的重组病毒载体可以通过将与该基因互补的反义基因插入负链RNA病毒微型基因组的基因组而得。

搭载到微型基因组的基因数少(基因组短)则转录复制效率高。最优选缺失本发明的负链RNA病毒微型基因组中的构成负链单链RNA病毒的所有蛋白质，或有多个缺失。

基因插入位置可以选择如病毒基因组的蛋白质非编码领域的适当部位。例如基因组RNA的3′前导区和最靠近3′端的病毒蛋白ORF之间，各病毒蛋白ORF之间以及/或最靠近5′端的病毒蛋白ORF和5′尾随区之间。在缺失多个基因的负链RNA病毒微型基因组中可插到其缺陷区域。将外源基因导入副粘病毒微型基因组时，插入基因组的多核苷酸的片段链长优选为6的倍数(Kolakofski，D.et al.，J.Virol.1998：72；891-899；Calain，P.andRoux，L.J.Virol.1993：67；4822-4830)。在插入的外源基因和负链RNA病毒微型基因组ORF之间，构成E-I-S序列。可借助E-I-S序列随机串列插入2个或多个外源基因。

本发明的负链RNA病毒微型基因组可以有一个或多个基因组启动子。本发明中对基因组启动子没有特别限制，例如RNA聚合酶I启动子。将在细胞内表达RNA聚合酶I的细胞作为生产细胞时，不需要外源载体(辅助负链RNA病毒载体)提供RNA聚合酶I，这样在节省供给成本的同时可与T7系统同样地获得基因的高表达水平。

外源基因的表达量可通过附加在该基因上游(负链的3’侧)的转录起始序列的类型来调节(WO 01/18223)。也可通过基因组中的外源基因的插入位置调控。插入位置越靠近负链3’末端则表达水平越高；反之越靠近5’末端则表达水平越低。因此，为获得大量外源基因的表达，优选将编码外来多肽的基因连接到高效转录起始序列，插入负链基因组3’末端附近。具体为，将外源基因插入3’-前导区和最靠近3’末端的病毒蛋白ORF之间；或插入最靠近3’-前导区的病毒蛋白基因和第2靠近基因的ORF之间。或插入从3’末端数的第2和第3的病毒蛋白基因之间。

将编码外源基因的核酸插入基因组所使用的附加S序列，可以是如负链RNA病毒所需的S序列，如果是仙台病毒，可适当使用3′-UCCCWVUUWC-5′(W＝A或C；V＝A，C，或者G)(序列序号：22)共有序列。尤其优选3′-UCCCAGUUUC-5′(序列号：23)、3′-UCCCACUUAC-5′(序列号：24)、和3′-UCCCACUUUC-5′(序列号：25)。如果将这些序列用编码正链的DNA序列表示，则分别是5′-AGGGTCAAAG-3′(序列号：26)、5′-AGGGTGAATG-3′(序列号：27)、以及5′-AGGGTGAAAG-3′(序列号：28)。仙台病毒载体的E序列优选，例如3′-AUUCUUUUU-5′(序列号：29)(在编码正链的DNA中优选5′-TAAGAAAAA-3′(序列号：30))。I序列，例如，可以是任意的3种碱基，具体可使用3′-GAA-5′(正链DNA中为5′-CTT-3′)。

也可在本发明的外源基因中附加编码Tag序列的碱基序列，以便在外源基因的功能不明确时用附加Tag序列确认外源基因的表达。Tag序列的附加位置没有特别限定，可附加在外源基因的氨基末端侧，也可加在羧基末端侧。Tag序列种类没有特别限定，例如可使用HA-Tag序列。

本发明中的辅助负链RNA病毒载体指的是下述负链RNA病毒载体，所述负链RNA病毒载体起到与负链RNA病毒微型基因组所缺失的基因互补的作用，以使负链RNA病毒微型基因组增殖。

本发明的辅助负链RNA病毒载体可以是核糖核蛋白(RNP)复合体或病毒样粒子(VLP)。

副粘病毒通常包含包膜内部的由RNA和蛋白质构成复合体(核糖核蛋白；RNP)。RNP所包含的RNA是副粘病毒的基因组(-)链(负链)单链RNA，该单链RNA在NP、P、和L蛋白结合后形成RNP。该RNP中的RNA成为病毒基因组转录和复制的模板(Lamb，R.A.，and D.Kolakofsky，1996，Paramyxoviridae：The viruses and their replication.pp.1177-1204.In FieldsVirology，3rd edn.Fields，B.N.，D.M.Knipe，and P.M.Howley et al.(ed.)，Raven Press，New York，N.Y.)。

本发明的辅助负链病毒载体中的负链单链RNA(基因组RNA)典型优选表达NP、P和L蛋白质，但不限于此。只要本发明的辅助负链RNA病毒载体或负链RNA病毒微型基因组能够表达副粘病毒的NP、P及L蛋白质就可以。

此外，本发明的辅助负链病毒载体中的负链单链RNA(基因组RNA)也可以修饰为对F、M以及或HN蛋白质的全部或部分不进行表达。副粘病毒的F蛋白是参与宿主细胞膜的融合、HN蛋白质是粘付于细胞膜的蛋白质。M蛋白质是从内侧维持病毒粒子构造的蛋白质。由于本发明的病毒载体的基因组RNA不表达F、M和HN蛋白质，所以不具有粒子形成能力和传播性。即本发明的病毒载体感染宿主细胞时，只在该宿主细胞内产生感染性病毒粒子，其子代病毒不会感染到相邻细胞。此外，本发明的病毒载体也可以产生感染性粒子。如后所述，重建本发明的病毒载体时，如能使F、M以及/或HN蛋白质共同表达，则该重建的病毒载体对宿主具有感染性。

本发明通过设计缺失F、HN和M基因的基因组来进行修饰，以不表达包膜蛋白质。尤其优选缺失F基因。另外载体的基因组所编码的NP、P和L基因也可保持源于病毒的基因序列。只要这些基因编码的蛋白质结合到基因组RNA，在细胞内具有RNP复制的活性，也可导入突变。进而，只要下述RNA中的基因所编码的NP、P、以及L蛋白质结合到基因组RNA、并具有RNP复制活性，则它们也可成为本发明载体的基因组RNA，所述RNA包括：编码下述多肽的负链单链RNA，所述多肽是在包含前述基因组RNA的碱基序列的负链RNA所编码的多肽中一个或多个氨基酸发生缺失，取代，插入或增加而成多肽；与包含前述基因组RNA的碱基序列的负链RNA的互补链在严格条件下杂交的负链单链RNA。该突变可参照本领域技术人员公知的方法。例如，PCR及盒式突变法等导入部位特异性突变或通过化学试剂及随机核苷酸等导入随机突变。上述提及的所谓严格杂交条件可由具体操作人员进行适当选择。例如25％甲酰胺、较严格条件为在50％甲酰胺、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×Denhart’s液、含20μg/ml变性鲑鱼精DNA的杂交液中、42℃预杂交过夜后，再进行42℃杂交过夜。之后可在“1×SSC、0.1％SDS、37℃”中漂洗，较为严格的条件为“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”、更为严格的条件为在“0.2×SSC、0.1％SDS、65℃”的漂洗液及温度下进行。利用这个杂交技术分离的多核苷酸编码的多肽，一般在氨基酸序列中与上述(-)链RNA编码的多肽有较高的同源性。所谓较高的同源性为至少40％以上、优选60％以上、再优选80％以上、进而优选90％以上、更优选至少95％以上、更优选至少97％以上(例如98-99％)的序列同源性。氨基酸序列的同一性可通过例如，Karlin and Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993)确定。基于该算法发明的BLASTX(Altschul et al.J.Mol.Biol.215：403-410，1990)在解析氨基酸序列时，参数例如为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些解析方法的具体手段是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。

另外，本发明的辅助负链RNA病毒载体也可以是包含5′端尾随区被替换成了前导区的负链单链RNA的载体。5’端尾随区的反义基因组启动子的基因组转录复制效率比3’端前导区的基因组启动子高，因此，若将5’端尾随区替换成3’端前导区，会降低辅助病毒的基因组转录复制效率，抑制与微型基因组的竞争，获得较高水平的微型基因组的蛋白表达(Le Mercier P.etal.J Virol.2002 76(11)：5492-5502)。

另外，本发明的辅助负链RNA病毒载体在P基因以及/或C基因中也可有突变。该突变可以是降低负链RNA病毒的细胞障害功能的突变。对该突变部位没有特别限定，优选例如将SeV P蛋白质的第9位的Lys(K9)、第13位的Glu(E13)、第17位的Glu(E17)、第29位的Ile(I29)、第38位的Ser(S38)、第39位的Glu(E39)、第41位的Thr(T41)、第47位的Arg(R47)、第48位的Ser(S48)、第52位的Asn(N52)、第55位的Asn(N55)、第56位的Thr(T56)、第58位的Gln(Q58)，SeV C蛋白质的第16位的Leu(L16)、第17位的Lys(K17)、第18位的Lys(K18)、第21位的Lys(K21)、第22位的Leu(L22)、第25位的Arg(R25)、第27位的Gln(Q27)、第28位的Glu(E28)、第30位的Glu(E30)、第35位的Met(M35)、第36位的Leu(L36)、第38位的Asp(D38)、第41位的Met(M41)、第47位的Asn(N47)、第48位的Gln(Q48)、第52位的Glu(E52)、第55位的Glu(E55)、第63位的Thr(T63)、第66位的Lys(K66)、或第68位的Gln(Q68)替换成其它氨基酸。可以在一个或多个部位导入突变。氨基酸突变也可以是替换为其它所需氨基酸，优选替换为侧链化学性质不同的氨基酸。例如，氨基酸可分为碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天门冬氨酸、谷氨酸)、非带电性氨基酸(例如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱胺酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等。有的氨基酸可替换成本属以外的氨基酸。具体如将碱性氨基酸替换成酸性或中性氨基酸，将极性氨基酸替换成非极性氨基酸，将大于20种天然氨基酸的平均分子量的氨基酸替换成小于平均分子量的氨基酸，反之，将小于平均分子量的氨基酸替换成较大分子量的氨基酸，但并不限定于此。具体如，将SeV P蛋白质的K9替换成Gly(K9G)、将E13替换成Gly(E13G)、将E17替换成Gly(E17G)、将I29替换成Val(I29V)、将S38替换成Gly(S38G)、将E39替换成Gly(E39G)、将T41替换成Ala(T41A)、将R47替换成Gly(R47G)、将S48替换成Gly(S48G)、将N52替换成Ser(N52S)、将N55替换成Gly(N55G)、将T56替换成Ala(T56A)、将Q58替换成Arg(Q58R)；SeVC蛋白质的L16向Trp突变(L16W)、K17向Gly的突变(K17G)、K18向Arg的突变(K18R)、K21向Gly的突变(K21G)、L22向Trp的突变(L22W)、R25向Gly的突变(R25G)、Q27向Arg的突变(Q27R)、E28向Gly的突变(E28G)、E30向Gly的突变(E30G)、M35向Thr的突变(M35T)、L36向Trp的突变(L36W)、D38向Gly的突变(D38G)、M41向Thr的突变(M41T)、N47向Gly的突变(N47G)、Q48向Arg的突变(Q48R)、E52向Gly的突变(E53G)、E55向Gly的突变(E55G)、T63向Ala的突变(T63A)、K66向Gly的突变(K66G)、或Q68向Arg的突变(Q68R)等。

本发明也可以在L蛋白质中导入突变。突变部位如，将第1197位的Asn(N1197)以及/或第1795位的Lys(K1795)替换成其它氨基酸，或在与其它负链RNA病毒L蛋白质同源的部位的替换。尤其优选具有L蛋白质的这2个突变的L蛋白质基因。氨基酸突变仍然以替换成所需的其它氨基酸为宜，优选与上述相同，替换成侧链化学性质不同的氨基酸。例如，可如上述那样地替换成不同类别的氨基酸。具体可举例为将N1197替换成Ser(N1197S)、将K1795替换成Glu(K1795E)等。

本发明由于具备P基因和C基因的突变，所以可明显提高持续感染性、明显提高对2次粒子放出的抑制效果或抑制对细胞毒性的效果。为使其不表达上述F、HN及M蛋白质而经修饰的重组负链RNA病毒中装入上述突变，则更加提高这些效果。尤其优选P和C基因两者均突变的病毒。最优选P基因中有上述位点的突变、C基因中具有上述突变的病毒。

另外，本发明的辅助负链RNA病毒载体也可包含以下(a)或(b)的负链单链RNA。

(a)该负链单链RNA包含序列号10的碱基序列

(b)该负链单链RNA与(a)的负链RNA的互补链在严格条件下杂交

本发明中所谓严格的杂交条件是指6M尿素、0.4％SDS、0.5×SSC或与其同等的条件。在更严格的条件下，例如在6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC的条件下，可期待性同源性更高的DNA分离。由此分离的DNA在氨基酸水平与目的蛋白质的氨基酸序列具有高的同源性。所谓高的同源性是指全部的氨基酸序列至少有50％以上、更优选70％以上、进一步优选90％以上(例如95％，96％，97％，98％，99％以上)序列的同一性。氨基酸序列及碱基序列的同源性可根据Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990、Proc Natl Acad Sci USA 90：5873，1993)确定。基于BLAST算法研究开发出了BLASTN及2BLASTX程序(Altschul SF，et al：J Mol Biol 215：403，1990)。使用BLASTN解析碱基序列时，参数为score＝100、wordlength＝12。此外，用BLASTX解析氨基酸序列时参数为score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时使用各程序的默认参数。这些具体的解析方法为已知。

另外，本发明的辅助负链RNA病毒载体也可以是野生型仙台病毒载体。

以下就本发明表达系统的各步骤进行说明。

本发明的表达系统的第一步骤为将上述辅助负链RNA病毒载体及携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组导入生产细胞。

本发明上述步骤中，还可以也将表达NP、P以及L蛋白质的载体导入生产细胞。

本发明的“生产细胞”优选使用所需的哺乳动物细胞，具体如来源猴肾的LLC-MK₂细胞(ATCC CCL-7)以及CV-1细胞(例如ATCC CCL-70)、来源仓鼠肾的BHK-21细胞(如ATCC CCL-10)等培养细胞、来源于人的细胞等。本发明更优选BHK-21细胞，但并非特别限定。

负链RNA病毒微型基因组cDNA导入细胞的方法为(i)制备目的细胞可摄入的DNA沉淀物的方法、(ii)制备适于目的细胞摄入且较低细胞毒性的、带正电荷的、含DNA的复合体的方法、(iii)利用电脉冲在目的细胞的膜上瞬时开孔的方法，孔的大小仅足以让DNA分子通过。

方法(ii)可使用各种转染试剂，例如Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat.No.11668-019)、DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer#1811169)等。方法(i)可用磷酸钙进行转染，但已知这种方法导入细胞的DNA虽被吞噬体摄入，但仍有足量的DNA能被摄入细胞核中(Graham，F.L.and Van Der Eb，J.，1973，Virology 52：456；Wigler，M.and Silverstein，S.，1977，Cell 11：223)。Chen和Okayama研究了导入技术的最佳条件，他们报告说：(1)细胞和共沉淀物的温育条件为：2～4％CO₂，35℃，15～24hr，(2)环状DNA比线性DNA活性更高，(3)当沉淀混合液DNA浓度为20～30μg/ml时，可形成最佳沉淀(Chen，C.and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)。方法(ii)适于瞬时性转染。已知更早的方法是配制具有所需DNA浓度比的DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885 M.W.5×10⁵)混合液进行转染。由于大多数复合体在内体中降解，可以加入氯喹来提高转染效力(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。方法(iii)被称为电穿孔方法，由于没有细胞选择性，它比方法(i)和(ii)应用更广。可通过优化脉冲电流的持续时间、脉冲形式、电场强度(电极间空隙，电压)、缓冲液的导电率、DNA浓度和细胞密度使转染效力最大化。

在上述三种方法中，方法(ii)操作简单，并且能用大量的细胞检测大量样品，因此本发明适合使用转染试剂。适用的转染试剂有Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat.No.11668-019)、Superfect Transfection Ragent(QIAGEN，CatNo.301305)、或DOSPER Liposomal Transfection Reagent(BoehringerMannheim，Cat No.1811169)。

辅助负链RNA病毒载体的重构可采用已知方法。

回收的病毒滴度可通过测定CIU(Cell-Infected Unit，细胞感染单位)或血凝素活性(HA)来确定(WO00/70070；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Yonemitsu，Y.&Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine：Humana Press：pp.295-306，1999)。对于携带GFP(绿色荧光蛋白)等标记基因的载体，可以利用标记作为指标，直接计数受感染的细胞来定量(例如GFP-CIU)。如此检定的滴度可与CIU做同等处理(WO00/70070)。

对本发明表达系统的T7 RNA聚合酶和F蛋白质(也可以是突变型F5R)的表达方法没有特别限制。例如，使用质粒等瞬间表达的方法和在生产细胞内永久表达T7 RNA聚合酶和F蛋白质(F5R)的使用细胞的方法。本发明的生产细胞也可以表达F、M或HN蛋白质中的一个或多个蛋白质，而该F、M或HN蛋白质已被修饰为在辅助负链RNA病毒载体中不进行表达。病毒基因组以外所供给的这些蛋白质群，其氨基酸序列即使不是来源病毒序列，只要核酸导入活性相同或超过天然型的话也可导入突变或用其它病毒的相同基因代替。如水疱性口内炎病毒(VSV)的G蛋白质(VSV-G)。通常包膜蛋白质多显示细胞毒性，也可以只在诱导性启动子的调控下重构载体时进行表达。

细胞内重构载体时，如果在生产细胞内能表达包膜蛋白的话，该包膜蛋白被微型基因组病毒粒子摄入，便可制备有包膜蛋白感染性的病毒载体。该载体一旦感染到细胞，一次感染便可在细胞内增殖RNP，但由于其本身没有包膜基因，所以不能再次生产具有如初的包膜蛋白的病毒。该载体尤其适用于对安全性要求较高的基因治疗领域。

通过上述第一步，辅助负链RNA病毒载体和携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组重构病毒，并从生产细胞中释放出来。

具体如实施例(图6)所示，辅助SeV/ΔF(优选SeVagp55/ΔF)和携带目的外源基因(GOI)的SeV微型基因组cDNA质粒(pSeVmini/GOI)一旦导入表达T7 RNA聚合酶和SeV的融合蛋白质的F蛋白质(突变型F5R也可)的生产细胞，在T7 RNA聚合酶的作用下MiniSeV/GOI的RNA基因组从pSeVmini/GOI开始转录，并利用起Helper(辅助者)作用的SeV/ΔF所表达的NP，P，L蛋白质，形成MiniSeV/GOI的RNP、并复制。这个MiniSeV/GOI的RNP利用Helper SeV/ΔF表达的M，HN和生产细胞表达的F/F5R，被包装成感染性MiniSeV/GOI粒子，与感染性Helper SeV/ΔF粒子一起释放到培养上清中。

本发明表达系统的第二步骤为回收分别包装了该生产细胞内生产的辅助负链RNA病毒载体和负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子。

可以将回收的病毒粒子(病毒载体)纯化使其达到基本纯。纯化方法包括过滤、离心分离和柱纯化等公认的纯化分离方法或上述方法的组合。“基本纯”是指病毒载体在其样品中占主要成分。一般来说，在样品的全部蛋白(作为承载体和稳定剂加入的蛋白除外)中，来自病毒载体的蛋白比例占10％以上，优选20％以上，更优选50％以上，优选70％以上，更优选80％以上，进一步优选90％以上时，可以确定为基本纯的病毒载体。具体如果是副粘病毒的话，病毒的具体纯化方法有纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753)，以及吸附于含有硫酸岩藻糖的多糖和/或其分解产物上的方法(WO 97/32010)，但不限于此。

本发明涉及包含以上第一和第二步骤的分别包装了辅助负链RNA病毒载体和负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的制备方法。为实现负链RNA病毒微型基因组的高导入能力和目的基因的高表达水平，有必要加大包装了负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的放出量。如本发明使用SeVagp55ΔF等修饰体作为辅助负链RNA病毒载体，可加大包装了负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的放出量。

为减弱包装了辅助负链RNA病毒载体的病毒粒子的毒性(细胞毒性)，需将生产细胞释放出的病毒粒子的比率(辅助负链RNA病毒载体：负链RNA病毒微型基因组)均等(优选负链RNA病毒微型基因组的数量多于辅助负链RNA病毒载体)。如本发明使用SeVagp55/(P/C)m/ΔF等修饰体作为辅助负链RNA病毒载体，可以增加包装了负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的放出比例。

可灵活运用辅助负链RNA病毒载体，以达到不同的目的(提高导入·表达水平、减弱毒性)。

本发明表达系统的第三步骤为将上述第二步骤回收的病毒粒子导入靶细胞。

本发明的“靶细胞”是指希望通过导入本发明的病毒粒子来表达外源基因的所需细胞。

本发明导入病毒粒子的靶细胞可以是in vitro靶细胞，也可以是in vivo靶细胞(即直接在动物中表达外源基因)。in vitro的靶细胞如293T细胞、A549细胞、BHK-21细胞、C2C12细胞、HeLa细胞、LLC-MK₂细胞、MDCK细胞、或NIH3T3细胞的任一种，但没有特别限定。

in vitro病毒粒子导入靶细胞时，例如在培养液或生理盐水等所需生理液中，将病毒粒子感染到靶细胞。这时，MOI(多重感染度：即每个细胞的感染病毒数)优选1～1000的范围，更优选2～500、更优选3～300、更优选5～100。病毒粒子和细胞短时间接触即可，如1分钟以上、优选3分钟以上、5分钟以上、10分钟以上、或20分钟以上。例如1～60分钟左右，比较特定为5～30分钟左右也可以。当然也可以更长时间，如几天以上接触。

包含病毒基因组RNA在内的RNP或非感染性病毒粒子(病毒样粒子(VLP)导入细胞时可用已知的转染方法。具体如磷酸钙法(Chen，C.&Okayama，H.(1988)BioTechniques 6：632-638；Chen，C.and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)、DEAE-葡聚糖法(Rosenthal，N.(1987)Methods Enzymol.152：704-709)、各种核糖体转染剂(Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY)、以及电穿孔法(Ausubel，F.et al.(1994)In Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，NY)，Vol.1，Ch.5以及9)等本行业公认的多种技术转染细胞。转染剂中可添加氯喹以防止在内体中的降解(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015，1983)。转染剂中包含、DOTMA(Roche)、Superfect TransfectionRagent(QIAGEN，Cat No.301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)、TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)、CalPhos^TMMammalian Transfection Kit(Clontech#K2051-1)、CLONfectin^TM(Clontech#8020-1)等。已知包膜病毒在形成病毒粒子时，会吞含来源于宿主细胞的蛋白，考虑到这种蛋白导入细胞时，会产生某种抗原性或细胞毒性(J.Biol.Chem.(1997)272，16578-16584)，因此使用去除包膜的RNP为好(WO00/70055)。

同时，本发明的辅助负链RNA病毒载体以及负链RNA病毒微型基因组导入靶细胞后，可在细胞内直接形成病毒RNP，在靶细胞内表达外源基因。

将本发明的病毒粒子(或病毒载体)导入的细胞培养12小时～5天(优选1～3天)左右，使其表达外源基因。

in vivo病毒粒子导入靶细胞时，将本发明的病毒粒子直接给药到动物，使其表达外源基因。

还可将上述本发明的病毒粒子感染(导入)的细胞给药到动物(ex vivo(回体)给药)。细胞可以直接或溶解为裂解物(溶解物)接种给动物。可用表面活性剂溶解细胞膜的方法或反复冻结-融化等方法调制载体感染细胞的裂解物。表面活性剂中非离子性的Triton X-100、Nonidet P-40等的浓度为0.1～1％。例如将PBS清洗、离心回收的细胞块，在TNE缓冲液[25mMTris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Nonidet P-40]中悬浮后，置于冰中10-30分钟后可得。当作为抗原使用的蛋白可在细胞质内溶解时，将所得的细胞裂解物离心(10,000×g、10分钟)，以沉淀的形式除去不溶成分，所得上清可用于免疫。在不希望使用表面活性剂的部位，给药细胞裂解物时，将清洗后悬浮于PBS中的细胞，反复冻结-溶解5-6次，待细胞破坏后也可制备细胞裂解物。

接种途径没有特别限制。例如，适合肌肉(如腓腹肌)、皮下给药、鼻腔内给药(点鼻)、手掌或足背皮下、脾脏内直接给药、腹腔内给药等。接种部位可一到多处(如2-15处)。接种量可根据疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组成物的形态、给药方法、导入基因等具体情况适当调整。给药时还可适当调整接种动物对象、接种部位及接种次数等。例如一个部位的给药量换算成病毒滴度为1x10⁴ CIU-5x10.¹¹CIU(细胞感染单位)，优选1×10⁶CIU～1×10¹⁰CIU。用培养细胞接种(ex vivo给药)时，例如，本发明的病毒感染同种的培养细胞株(如肉瘤细胞株)时，可将时10⁴～10⁹细胞、优选10⁵～10⁸细胞或其提取液接种到动物。

例如，对人体的1次药量优选2×10⁵CIU～2×10¹⁰CIU。可1次给药或在临床副作用容许范围内多次给药。日给药次数也可依此调整。如果是本发明的载体调制的蛋白制剂，蛋白质的给药量，例如从10ng/kg到100μg/kg、优选从100ng/kg到50μg/kg、更优选从1μg/kg到5μg/kg的范围。人以外的动物可按目的动物和人的体重比或给药靶部位的容积比(如平均值)换算剂量。本发明载体的组成物的给药对象包含人、猴、小鼠、大鼠、兔、山羊、牛、狗等所有哺乳动物。

本发明的辅助负链RNA病毒载体和负链RNA病毒微型基因组所分别包装的病毒粒子、该病毒粒子导入的细胞或细胞提取液均可与可药用运载体或赋形剂混合使用。

可药用运载体或赋形剂如杀菌水及生理盐水、安定剂、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合物(EDTA等)、结合剂等。

本发明中的非离子表面活性剂可典型例举如：去水山梨糖醇单辛酸酯、去水山梨糖醇单月桂酸酯、去水山梨糖醇单棕榈酸酯等山梨醇脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油单硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、十甘油单硬脂酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯去水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇三硬脂酸酯等聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯等聚氧化乙烯甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷醚；聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷醚；聚氧乙烯壬基醚等聚氧化乙烯烷苯乙醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧化乙烯氢化蓖麻油)等聚氧化乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧化乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧化乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰胺等聚氧化乙烯脂肪酸酰胺等，具有HLB6～18的制品等。

此外，阴离子表面活性剂如十六烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、油醇硫酸钠等碳原子数10～18烷基的烷硫酸盐；聚氧乙烯月桂硫酸钠等乙烯氧化物的平均附加摩尔数为2～4，烷基的碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷醚硫酸盐；月桂硫琥珀酸酯钠等烷基碳原子数为8～18的烷硫琥珀酸酯盐；天然的表面活性剂如卵磷脂、甘油脂；鞘磷脂等鞘脂；碳原子数12～18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。

本发明可以将这些表面活性剂的1-2种以上混合使用。本发明试剂优选表面活性剂为山梨醇20，40，60或80等聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，尤其优选聚山梨醇20、80以及泊洛沙姆(ポロキサマ-)((

F-68等)为代表的聚氧乙烯聚氧丙烯甘醇。

表面活性剂的添加量可视其种类而定，聚山梨醇20或80的情况下一般为0.001～100mg/mL、优选0.003～50mg/mL、更优选0.005～2mg/mL。

本发明中的缓冲剂如，磷酸、柠檬酸缓冲液、醋酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、葡糖酸、辛酸、脱氧胆酸、水杨酸、三乙醇胺、富马酸等其它有机酸等、或者碳酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、组氨酸缓冲液、咪唑缓冲液等。

此外也可用溶液制剂业界公认的水性缓冲液调制溶液制剂。缓冲液的浓度一般为1～500mM，优选5～100mM、更优选10～20mM。

此外，本发明中其它低分子量的多肽、血清蛋白、动物胶及免疫球蛋白等蛋白质、氨基酸、多糖和单糖等糖类及炭水化物、也可含糖乙醇。

本发明的碱性氨基酸例如，精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等。此外还有如上这些氨基酸的无机盐(优选盐酸盐、磷酸盐型即磷酸氨基酸)。使用游离氨基酸时pH值优选添加适当的生理缓冲物质，如无机酸、尤其添加盐酸、磷酸、硫酸、醋酸、蚁酸或添加这些盐进行调整。使用磷酸盐尤其利于获得安定的冻结干燥物。调制物在实质上不含有机酸、如苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸或没有对应阴离子(苹果酸离子、酒石酸离子、柠檬酸离子、琥珀酸离子、富马酸离子等)时更为有利。优选的氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、或鸟氨酸。进而还可使用酸性氨基酸，例如谷氨酸及天门冬氨酸及它的盐形式(优选钠盐)或中性氨基酸、例如亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸磷、蛋氨酸、半胱胺酸、和丙氨酸、或芳香族氨基酸，如苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或衍生物N-乙酰色氨酸。

本发明中多糖和单糖等糖类及碳水化合物如，葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖，海藻糖、绵白糖等。

本发明中的糖醇如甘露醇、山梨糖醇、肌醇等。

注射液如生理食盐水、含葡萄糖或其它辅助剂的等渗液，例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、盐化钠；可以并用适当的溶解辅助剂如醇(乙醇)、聚醇(丙二醇、PEG等)、非离子表面活性剂(山梨醇80、HCO-50)等。

必要时也可包含稀释剂、溶解辅助剂、pH调整剂、无痛化剂、含硫还原元剂、氧化防止剂等。

本发明中的含硫还原剂如，N-乙酰半胱胺酸、N-乙酰高半胱胺酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫醇胺、硫代甘油、硫山梨糖醇、硫代甘醇酸及盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽以及碳原子数1～7硫链烷酸等具有巯基的化合物等。

此外，本发明中的氧化防止剂有例如异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。

还可根据需要，装入微型胶囊(羟纤维素甲醚、动物胶、聚[甲基丙烯酸]等的微型胶囊)，作成胶囊药品(脂质体、蛋白微型球体、微型乳化剂、毫微颗粒或毫微胶囊等)(″Remington′s Pharmaceutical Science 16^th edition″，OsloEd.，1980等参照)。进而，已知的渐溶性药剂也适于本发明(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.1981，15：167-277；Langer，Chem.Tech.1982，12：98-105；美国专利第3,773,919号；欧州专利申请公开(EP)第58,481号；Sidman et al.，Biopolymers 1983，22：547-556；EP第133,988号)。

所使用的可药用运载体或赋形剂根据使用方法可从上述中选择或适当混合，但不限于此。

作为外源基因，用治疗基因调制病毒粒子的话，可以给药该病毒粒子进行基因治疗。本发明的病毒粒子应用于基因治疗，可采取直接和间接(exvivo)给药表达基因的任一方法，使有疗效的外源基因或患者体内缺少的内在基因等得以表达。对外源基因没有特别制限，可以整合到编码蛋白质的核酸或反义物及核酶等不编码蛋白质的核酸中。

外源基因，如果使用感染症相关细菌或病毒的抗原的编码基因的话，可作为疫苗直接给药到动物，使该动物体内产生免疫。

作为疫苗使用时，本发明的病毒粒子适用于肿瘤、传染病、及其他一般的疾病。例如肿瘤治疗，使用本发明的载体可使有疗效的基因在癌细胞、DC细胞等抗原提示细胞(APC)内得以表达。该基因可例举如癌抗原Muc-1和Muc-1样粘蛋白串列重复肽(美国专利第5,744,144号)、黑素瘤gp100抗原等。该基因治疗可广泛应用于乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等。此外将提高佐剂效果的细胞因子类混合使用也有效果。例如i)IL-2和单链IL-12的混合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15)：8591-8596，1999)、ii)IL-2和干扰素-γ(米国专利第5,798,100号)混合、iii)单独使用的粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、iv)主治脑瘤的GM-CSF和IL-4混合(J.Neurosurgery 90(6)，1115-1124(1999))等。

作为传染病的治疗，可以列举出：流感如强毒株H5N1型包膜；日本脑炎如包膜嵌合体(Vaccine，vol.17，No.15-16，1869-1882(1999))；艾滋病如HIV gag和SIV gag蛋白质(J.Immunology(2000)vol.164，4968-4978)、HIV包膜蛋白质口服药物的疫苗治疗、用聚乳酸-甘醇包合给药(Kaneko，H.et al.，Virology 267：8-16(2000))；霍乱如霍乱毒素的B亚单元(CTB)(Arakawa T，et al.，Nature Biotechnology(1998)16(10)：934-8、Arakawa T，et al.，Nature Biotechnology(1998)16(3)：292-7)；狂犬病如狂犬病毒的糖蛋白(Lodmell DL et al.，1998，Nature Medicine 4(8)：949-52)；宫颈癌如人乳头瘤病毒6型的衣壳蛋白L1(J.Med.Virol，60，200-204(2000))等。

本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参考汇入本说明书。

实施例

本发明通过以下实施例进一步具体说明，但并不限于此。

〔实施例1〕辅助SeV的cDNA构建

1.1 pSeVagp55/ΔF的构建

图1所示，首先将pSeV(TDK)经限制酶Kas I和Fse I处理、纯化而得的含SeV尾随序列(基因组5’启动子)片段作为模板，通过使用了引物agp55-1F(5’-caggtttgaggatattatacatag，24 mer(序列号：1))和agp55-1R(5’-caggattttagtttttcttactattgtc，28mer(序列号：2))的PCR得到片段1，通过使用了引物agp 55-3F(5’-ctcttgtttggtgggtcggcatggcatctc，30mer(序列号：3))和agp55-3R(5’-ttagctcactcattaggcaccccag，25mer(序列号：4))的PCR得到了片段3。同时，将用限制酶Kas I和Not I处理pSeV(TDK)并纯化而得的SeV前导序列(基因组3’启动子)片段作为模板，用通过使用了引物agp55-2F(5’-gtaagaaaaactaaaatcctgtataacttc，30mer(序列号：5))和agp55-2R(5’-gccgacccaccaaacaagagaaaaaacatg，30mer(序列号：6))的PCR得片段2。然后以片段1，2，3为模板，通过使用了引物agp55-1F和agp55-3R的PCR获得含Sac II和Mlu I限制酶位点的片段。最后将该片段经Sac II和Mlu I处理、纯化后，作为插入片段插入同样经Sac II和Mlu I处理并去除SeV尾随序列片段的pSeV/ΔF载体中，由此得pSeVagp55/ΔF(序列号：7)。所述agp55表示前导(Leader)-前导型(将尾随(Trailer)替换成前导)，ΔF表示缺失F基因。

1.2构建pSeVagp55/(P/C)m/ΔF

如图2，将SeV/4C(-)/w用极限稀释法进行病毒克隆，从各克隆产物中抽出RNA基因组，进行RT-PCR，检测基因组序列得到了P/C基因中产生了许多突变的克隆4。以该克隆4的RNA基因组为模板，通过使用了引物SeVF619(5’-atgggtatcctgcatgcctaggag，24mer(序列号：8))和SeVR2111(5’-atcgattatcttgggtcgacg，21mer(序列号：9))的PCR获得了在两端具有SphI和Sal I限制酶切位点的片段(序列号：10)。将该片段经Sph I和Sal I处理、纯化，作为插入片段与pSeVagp55/ΔF载体对应的两端包含Sph I和Sal I限制酶切位点的序列交换，获得pSeVagp55/(P/C)m/ΔF。上述的(P/C)m指的是P基因以及/或C基因中导入突变。pSeVagp55/(P/C)m/ΔF的全长序列为序列号11。

〔实施例2〕调制Helper SeV(SeV/ΔF，SeVagp55/ΔF，SeVagp55/(P/C)m/ΔF)

2.1准备

1)细胞：前一天～8e5 BHK-21细胞/孔(6孔板)

2)20％FBS/opti-MEM[Cat No.31985-070，Lot No.1183337，Invitrogen公司](P&S无添加)

3)opti-MEM(原液)

2.2准备转染液

1)DNA液

1孔

opti-MEM(无添加原液) 250μL

pCAGGS-NP(Z)，1μg/μL 0.5μL

pCAGGS-P(Z)/4C(-)，1μg/μL 0.5μL

pCAGGS-L(TDK)，1μg/μL 2.0μL

pCAGGS-F5R，1μg/μL 0.5μL

pCAGGS-T7，1μg/μL 0.5μL

SeV cDNA，1μg/μL 5μL

2)LipofectAMINE 2000试剂[Cat No.11668-019，Lot No.1188609，Invitrogen公司]溶液

1孔

opti-MEM(无添加原液) 250μL

LipofectAMINE2000 18μL

3)2)溶液备好5分钟后与1)溶液混合，在RT下放置20-30分钟。

2.3用opti-MEM(原液)漂洗1次，添加0.5mL/孔的20％FBS/opti-MEM后，对细胞添加0.5mL/孔的上述转染液。

2.4 37℃下6小时后，添加1mL/孔的10％FBS/G-MEM。次日用VP-SFM漂洗1次后，加5μg/mL胰蛋白酶/VP-SFM进行培养。第3天回收上清(P0病毒溶液)，感染到新鲜的LLC-MK₂/F/Ad细胞中(从P0到P1病毒传代)。之后用LLC-MK₂/F/Ad细胞生产病毒。用CIU测定检测P1以后的上清的病毒滴度。

〔实施例3〕设计SeV微型基因组并构建cDNA

3.1 SeV微型基因组的设计

如图3，设计了具有普通单启动子(GP)的SeVminiSP/GOI和具有双启动子(GP58A-GPd12)的SeVminiDP/GOI的2种微型基因组。(参考文献：Natureof a paramyxovir us replication promoter influences a nearby transcriptionsignal，Diane Vullienoz et al，Journal of General Virology，p171-180，v86，2005)

3.2构建SeV单启动子(SP)微型基因组cDNA

如图4A，以市场出售的GFP质粒为模板，将使用了引物NotI-GFP-N(5’-agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg，50mer(序列号：12))和GFP-SacII-C(5’-caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacagctcgtccatg，65mer(序列号：13))进行PCR获得的NotI-GFP-SacII片段经Not I和Sac II处理、纯化后，作为GFP插入片段，插入同样经Not I和Sac II处理并去除了NP，P，L，M，F，HN序列片段的pSeV(TDK)载体(包含Not I和Sac II位点。437～670表示MiniSeV基因组序列。序列号：14、特开2002-272465)中，获得了pMiniSeV_SP/GFP。

MiniSeV_SP/GFP基因组序列示于序列号15。1～137以及858～996表示MiniSeV基因组序列、138～857表示携带的GFP的ORF序列。

如图4B，构建携带GFP以外的目的基因(GOI)的SeV微型基因组cDNA时，通过使用了引物Not I-GOI-N和GOI-Sac II-C的PCR，在GOI两侧安装Not I和Sac II限制酶切位点，只须与pMiniSeV_SP/GFP的NotI-GFP-Sac II序列交换便可简单制得。

引物Not I-GOI-N的序列设计成“5’-agttcacgcggccgcagatcttcacg(序列号：16)+GOI ORF的包含起始密码子在内的最初的18～24有意序列”，并将引物GOI-Sac II-C设计为「5’-caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaa(序列号：17)+接头+GOI-ORF的包含终止密码子在内的最后的18～24反义序列、调整接头为0～2碱基使得基因组总碱基数为6的倍数”。

3.3构建SeV双启动子(DP)微型基因组cDNA

如图5，将以ApMiniSeV_SP/GFP为模板，使用引物224N(5’-ataccgcatcaggcgccattcg，22mer(序列号：18))和(GP58A-GPd12)R(5’-gttttttagggtctggaacctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg，57mer(序列号：19))进行PCR所得片段，和使用引物(GP58A-GPd12)F(5’-ggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatg，34mer(序列号：20))和GFP-Sac II-C(参照上述序列)进行PCR所得片段纯化后，作为模板，使用引物224N和GFP-Sac II-C进行PCR，将所得片段经Kas I和Sal I处理、纯化后，作为插入片段插入同样经Kas I和Sal I处理并去除含有Single-启动子序列的pMiniSeV_SP/GFP载体中，获得了pMiniSeV_DP/GFP。该pMiniSeV_DP/GFP的序列示于序列号：21。437～1516表示MiniSeV基因组序列，其中的658～1377表示携带的GFP的ORF序列。

如图5B，构建携带GFP以外的目的基因(GOI)的SeV微型基因组cDNA时，通过使用引物Not I-GOI-N和GOI-Sac II-C(设计方法参照上述)的PCR，在GOI两侧安装Not I和Sac II限制酶切位点，只须与pMiniSeV_DP/GFP的Not I-GFP-Sac II序列交换便可简单制得。

〔实施例4〕MiniSeV-SeV/ΔF粒子共存蛋白质表达系统结构

如图6，表达T7 RNA聚合酶和作为SeV融合蛋白质的F蛋白质(突变型F5R也可)的生产细胞中一旦导入Helper SeV/ΔF(优选SeVagp55/ΔF)和携带目的基因(GOI)的SeV微型基因组cDNA质粒(pSeVmini/GOI)，在T7RNA聚合酶的作用下，由pSeVmini/GOI转录MiniSeV/GOI的RNA基因组，并利用辅助SeV/ΔF表达的NP，P，L蛋白质形成MiniSeV/GOI的RNP，并进行复制。生产细胞优选BHK-21细胞，但不限于此。T7 RNA聚合酶和F/F5R的表达方法没有特别限制，例如用质粒等进行暂时性表达的方法及使用永久性表达T7 RNA聚合酶和F/F5R的细胞的方法。优选T7 RNA聚合酶和F/F5R这两种蛋白可持续表达的细胞，也可以是单独表达其中任何一种的细胞。这个MiniSeV/GOI的RNP利用Helper SeV/ΔF表达的M，HN和生产细胞表达的F/F5R，被包装为感染性MiniSeV/GOI粒子，与感染性HelperSeV/ΔF粒子一起释放到培养上清。回收该感染性MiniSeV/GOI和HelperSeV/ΔF粒子共存的培养上清，一旦感染目的细胞，利用Helper SeV/ΔF的转录复制系统(NP，P，L蛋白质)使搭载到MiniSeV/GOI的目的基因GOI得以表达。

本发明仅以SeV/ΔF为例对Helper SeV进行了说明，但不限于此。也可缺失SeV的构成蛋白质NP，P，L，M，F，HN的任意之一或多数，其缺失的蛋白质需要由生产细胞另行表达。

〔实施例5〕Helper SeV/ΔF的设计对MiniSeV-SeV/ΔF共存粒子生产性的影响

将SeV/ΔF和SeVagp55/ΔF(将SeV基因组的5′侧55碱基序列换成3′侧55碱基的反义序列的前导/前导型)以moi 10感染前一天接种的3e5细胞/孔(12-well collagen-coated plate(12-孔胶原包覆板)，IWAKI)的BHK/T7/Ad(T7RNA聚合酶持续表达细胞)，1小时后，导入了pCAGGS/F5R(1μg/孔)和pMiniSeV_SP/GFP(2μg/孔)(导入试剂：Lipofectamine 2000，Invitrogen，Lipofectamine/DNA＝2μL/μg)。培养(10％FBS/G-MEM培养基)次日，用无血清培养液VP-SFM漂洗1次，再更换成加入了5μg/mL的胰蛋白酶的VP-SFM培养基，并回收了第4天的培养上清。(图7A)为4天之内每天拍照的GFP照片。将回收的培养上清以100μL/孔感染LLC-MK₂细胞(6孔板)，(图7B)为感染次日的GFP照片。

如图7A，将SeVagp55/ΔF作为Helper SeV时，微型基因组的蛋白质的表达水平高于(GFP表达细胞的比率)一般SeV/ΔF。图7B所示的GFP表达细胞数表示生产的共存粒子中的MiniSeV的量，使用SeVagp55/ΔF的共存粒子的生产性远比SeV/ΔF要高。

〔实施例6〕MiniSeV cDNA的设计对MiniSeV-SeV/ΔF共存粒子生产性的影响

将SeVagp55/ΔF以moi 10感染前一天接种的3e5细胞/孔(12-wellcollagen-coated plate，IWAKI)的BHK/T7/Ad(T7 RNA聚合酶持续表达细胞)，1小时后导入了pCAGGS/F5R(1μg/孔)和微型基因组cDNA(2μg/孔)(导入试剂：Lipofectamine 2000，Invitrogen，Lipofectamine/DNA＝2μL/μg)。这里作为MiniSeV cDNA，使用了2种即pMiniSeV_SP/GFP、pMiniSeV_DP/GFP。培养(10％FBS/G-MEM培养基)次日，用无血清培养液VP-SFM漂洗1次后，更换成加入了5μg/ml胰蛋白酶的VP-SFM培养基，并回收了第4天的培养上清。(图8A)为4天之内的GFP照片。用回收的上述培养上清进行了CIU测定(图8B)。具体为将样品以10倍的梯度稀释，以100μL/孔感染6孔板的LLC-MK₂细胞，1小时后在无血清培养液中培养，次日计数GFP表达细胞，将其作为MiniSeV滴度进行了测量。此外，用抗SeV抗体DN2进行抗体染色，计数DN2阳性细胞数，将其作为辅助SeV滴度进行了测量。

如图8，在SP和DP两个设计中均获得了GFP高表达水平，DP设计中获得了较高的MiniSeV生产性(GFP-CIU)及较低的辅助SeV/MiniSeV量之比。

〔实施例7〕使用SeVagp55/ΔF和SeVagp55/(P/C)m/ΔF的共存粒子生产性的比较

用SeVagp55/ΔF和SeVagp55/(P/C)m/ΔF以moi 1，3，10感染前一天接种的3e5细胞/孔(12-well collagen-coated plate，IWAKI)的BHK/T7/Ad(T7 RNA聚合酶持续表达细胞)，1小时后导入了pCAGGS/F5R(1μg/孔)和pMiniSeV_DP/GFP(2μg/孔)(导入试剂：Lipofectamine 2000，Invitrogen，Lipofectamine/DNA＝2μL/μg)。培养(10％FBS/G-MEM培养基)次日用无血清培养液VP-SFM漂洗1次后，更换成加入了5μg/mL胰蛋白酶的VP-SFM培养基，并回收了第4天的培养上清。(图9A)为4天之内每天的GFP照片。将回收的培养上清以100μL/孔感染LLC-MK₂细胞(6孔板)，(图9B)为次日的GFP照片。此外，用上述回收的培养上清进行了CIU测定(图9C)。

如图9，将SeVagp55/ΔF作为Helper SeV生产共存粒子时，获得了较高的MiniSeV生产性，其Helper SeV/MiniSeV的量之比(～10倍)也很高。反之，用SeVagp55/(P/C)m/ΔF生产的共存粒子，其MiniSeV生产性比较低，Helper SeV/MiniSeV的量之比(约1∶1)非常低。根据目的可区别选择使用这2种Helper SeV。

〔实施例8〕Helper SeV/MiniSeV的量之比的改善

以moi 0.5，1，2将SeVagp55/Δd转染到前一天接种的8e5细胞/孔(6-well collagen-coated plate，IWAKI)的BHK-21细胞中，1小时后导入了“pCAGGS/T7(1μg/孔)、pCAGGS/F5R(4μg/孔)以及pMiniSeV_DP/GFP(5μg/孔)”或“pCAGGS/NP，P，L(0.5，0.5，2μg/孔)、pCAGGS/T7(1μg/孔)、pCAGGS/F5R(4μg/孔)以及pMiniSeV_DP/GFP(5μg/孔)”(导入试剂：Lipofectamine 2000，Invitrogen，Lipofectamine/DNA＝2μl/μg)。此外，上述2种条件质粒导入6小时后的BHK-21细胞用SeVagp55/ΔF以moi 0.5，1，2感染。培养(10％FBS/G-MEM培养基)第1天用无血清培养液VP-SFM漂洗1次后，更换成加入了5μg/mL胰蛋白酶的VP-SFM培养基，第3天拍摄了GFP照片(图10A)，并回收了培养上清。用上述回收的培养上清进行了CIU测定(图10B)。

如图10，导入MiniSeV cDNA时，将表达NP，P，L的质粒一同导入的话，生产的共存粒子中的MiniSeV量没有太大变化，但出现了HelperSeV/MiniSeV的量之比下降的倾向。

〔实施例9〕共存粒子的in vitro表达

将MiniSeV_DP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子(2e6 GFP-CIU/mL，7.7e6DN2-CIU/mL)以MOI3转染到以铺满底～90％的状态培养在24-wellcollagen-coated plate上的293T，A549，BHK-21，C2C12，HeLa，LLC-MK₂，MDCK，NIH3T3细胞后，在32℃下培养。次日拍照了GFP照片(图11)。

如图11，通过MiniSeV_DP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子考察的8种细胞均获得了高效率的GFP导入和高水平的表达。

〔实施例10〕共存粒子的in vivo表达

将MiniSeV_DP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子给药(5e6 GFP-CIU/只)到小鼠(n＝3)鼻腔内。对照组同时同量给药SeV18+GFP/ΔF。次日解剖摘取鼻腔并拍摄了GFP照片(图12)。

如图12，MiniSeV_DP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子得到了较高的in vivo表达(鼻腔内GFP表达)。

〔实施例11〕

将moi20的作为Helper-SeV的SeVagp55/T7/ΔF感染性粒子转染到以铺满底～90％的状态培养在12-well collagen-coated plate上的BHK-21，HeLa细胞，1小时后用Lipofectamine 2000试剂[Lipofectamine 2000/DNA＝2.0(μL/μg)，2μg DNA/孔]导入了MiniSeV_DP/GFP cDNA质粒，并拍照了次日的GFP照片(图13)。

如图13，将MiniSeV_DP/GFP的cDNA质粒和SeVagp55/T7/ΔF感染性粒子导入靶细胞得到了微型基因组蛋白的高表达水平。

〔实施例12〕使用了RNA聚合酶I启动子的共存粒子系统

由于SeV载体使用了T7启动子，所以重构病毒时需要供给T7聚合酶。上述实施例在生产共存粒子时，都必须供给T7聚合酶，或者将微型基因组cDNA导入生产细胞的同时T7聚合酶表达质粒也随之导入，或者使用了携带T7聚合酶基因的Helper-SeV。前者的方法导入的质粒种类多，可能会对生产成本和生产效率带来负面影响。反之后者的方法，携带在MiniSeV上的目的基因(GOI)表达时，Helper-SeV常常一起表达T7聚合酶，所以可能会对蛋白机能的解析有负面影响。为了避免这些问题，研究了使用RNA聚合酶I启动子取代T7启动子的共存粒子系统。

12.1用RNA聚合酶I启动子构建微型基因组cDNA质粒

如图14，以pMpolBDV质粒为模板，通过使用了引物Apa I/polmPr-F(5’-gtacgggcccgtacgtctgaggccgagggaaag，33mer(序列号：31))和polmPr/GP-R(5’-ctcttgtttggtacctatctccaggtccaatagg，34mer(序列号：32))的PCR得到ApaI-polmPr片段。同时，以pMiniSeVDP/GFP为模板，通过使用了引物polmPr/GP-F(5’-gacctggagataggtaccaaacaagagaaaaaac，34mer(序列号：33))和MiniDP/Not I-R(5’gactagcggccgcgtgaactttggcag，27mer(序列号：34))的PCR得到DP-Not I片段。接着，将Apa I-polmPr片段和DP-Not I片段作为模板，通过使用了引物Apa I/polmPr-F和MiniDP/Not I-R的PCR得到Apa I-polmDP-Not I片段，将其用Apa I/Not I处理，并纯化。纯化后所得片段插入到同样经Apa I/Not I处理去除了Apa I到Not I的片段的pMiniSeVDP/GFP中，得到了pMiniSeVDPpolm/GFP。

GFP基因较短，其长度为0.7kb。为研究生产更长基因的共存粒子，构建了GFP和Luciferase(萤光素酶)的融合蛋白(GFP-Luci，2.3kb)作为模型。如图14，以pMiniSeVDP/GFP为模板通过使用了引物GFP-Not I-F(5’-atatgcggccgcaatggtgagcaagggcgaggag，34mer(序列号：35))和GFP-Luci3m-R(5’-tggcgtcttccttgtacagctcgtccatgccg，32mer(序列号：36))的PCR得到了NotI-GFP片段。同时以pSeV18+Luci3m/ΔF为模板，通过使用了引物GFP-Luci3m-F(5’-acgagctgtacaaggaagacgccaaaaacataaag，35mer(序列号：37))和Luci3m-Not I-R(5’-atatgcggccgcttacacggcgatctttccgc，32mer(序列号：38))的PCR，得到了Luci3m-Not I片段。接着，以Not I-GFP片段和Luci3m-Not I片段为模板，使用了引物GFP-Not I/Luci3m-Not I进行重叠PCR而得到Not I-GFP-Luci-Not I片段，将其用Not I处理，制备为插入片段。以pMiniSeVDPpolm/GFP为模板，用引物MiniDP/Not I-F(5’-tcacgcggccgctagtccctatcgtgcagaacg，33mer(序列号：39))和MiniDP/Not I-R(5’-gactagcggccgcgtgaactttggcag，27mer(序列号：40))进行PCR得到NotI-MiniSeVDPpolm-Not I片段，将其用Not I处理，制备为载体。进而将GFP-Luci插入片段(2384nt(序列号：41))插入MiniSeVDP载体，得到了pMiniSeVDPpolm/GFP-Luci。

12.2使用RNA聚合酶I启动子的共存粒子的生产

将SeVagp55/ΔF以moi 10感染前一天接种的1e6细胞/孔(6-wellcollagen-coated plate，IWAKI)的BHK-21细胞，1小时后导入了“pCAGGS/F5R(5μg/孔)以及pMiniSeV_DPpolm/GFP(5μg/孔)”(导入试剂：Lipofectamine 2000，Invitrogen，Lipofectamine/DNA＝2μl/μg)。另外，导入了“pCAGGS/NP，P，L(0.5，0.5，2μg/孔)、pCAGGS/F5R(4μg/孔)以及pMiniSeV_DPpolm/GFP-Luci(5μg/孔)”(导入试剂：Lipofectamine 2000，Invitrogen，Lipofectamine/DNA＝1.5μl/μg)，并在导入的次日以moi 10用SeVagp55/ΔF进行了感染。培养(10％FBS/G-MEM培养基)第1天，用无血清培养基VP-SFM漂洗1次后，更换成加入了3μg/ml胰蛋白酶的VP-SFM培养基，之后每天更换培养基，并拍照了GFP照片，用第4天的培养上清进行了CIU测定(图16)。

如图16，在短基因(GFP，0.7kb)和长基因(GFP-Luci，2.3kb)两方面，均生产了含有1e7GFP-CIU/ml以上的MiniSeV的共存粒子，并确认到了用RNA聚合酶I启动子也能获得较高的共存粒子的生产性。

〔实施例13〕携带了带有HA-Tag的基因的共存粒子系统

将GFP等标记基因以及编码可免疫染色的抗体的基因搭载到本发明的共存粒子系时，很容易检测出共存粒子中的MiniSeV的滴度。然而，如果在携带了性能不明基因的情况下，或者在未搭载编码可免疫染色抗体的基因的情况下，则很难检测出共存粒子中的MiniSeV的滴度。为解决这个问题研究了携带带有HA-Tag的基因(GFP)的共存粒子系统。

13.1构建携带带有HA-Tag的基因(GFP)的微型基因组cDNA

如图15，为在GFP的N末端安装HA-Tag，构建了微型基因组cDNA。首先，以携带GFP的质粒为模板，通过使用了引物HA-GFP-Not I-F(5’-atagcggccgcaatgtacccatacgacgtcccagactacgctgtgagcaagggcgaggagctg，63mer(序列号：42))和GFP-Not I-R2(5’-tatgcggccgcttacttgtacagctcgtccatg，33mer(序列号：43))的PCR得到了Not I-HA-GFP-Not I片段。用相同模板，通过使用了引物GFP-Not I-F(上述实施例12参照)和GFP-HA-Not I-R(5’-tatgcggccgcttaagcgtagtctgggacgtcgtatgggtacttgtacagctcgtccatgccg，63mer(序列号：44))的PCR得到了Not I-GFP-HA-Not I片段。将这2种片段(NotI-HA-GFP-Not I和Not I-GFP-HA-Not I)经Not I处理后，作为插入片段插入同样经Not I处理的上述实施例12所得的Not I-MiniSeVDPpolm-Not I片段中，得到了pMiniSeVDPpolm/HA-GFP和pMiniSeVDPpolm/GFP-HA。

13.2携带带有HA-Tag的基因(GFP)的共存粒子的生产

将SeVagp55/ΔF以moi 10感染前一天接种的1e6细胞/孔(6-wellcollagen-coated plate，IWAKI)的BHK-21细胞，1小时后导入了“pCAGGS/F5R(5μg/孔)+pMiniSeV_DPpolm/GFP(5μg/孔)或pMiniSeV_DPpolm/HA-GFP(5μg/孔)或pMiniSeV_DPpolm/GFP-HA(5μg/孔)”(导入试剂：Lipofectamine 2000，Invitrogen，Lipofectamine/DNA＝1.5μl/μg)。培养(10％FBS/G-MEM培养基)第1天用无血清培养基VP-SFM漂洗一次后，更换成加入了3μg/ml胰蛋白酶的VP-SFM培养基，之后每天更换培养基，并拍照了GFP照片，并用第4天的培养上清进行了CIU测定(图17)。同时，将家兔抗HA-Tag抗体作为第一抗体、将Alexa Fluor 594山羊抗家兔IgG抗体作为第二抗体，免疫染色了共存粒子感染的LLC-MK2细胞(图17)。

如图17-A，搭载了N末端或C末端带有HA-Tag的GFP基因时，生产了与对照(携带无HA-Tag的GFP)同等水平的共存粒子。同时，如图17-B所示，可知：使用HA-Tag抗体的荧光抗体染色能够将被携带带有HA-Tag的基因(GFP)的共存粒子感染的细胞进行特异染色。

工业实用性

本发明者们研究开发的MiniSeV-SeV粒子共存蛋白质表达系统同时兼备以往病毒载体的“基因导入效率·表达效率高”和非病毒载体的“制备简便、易于短时间内大量调制、成本低廉”等优越性。即本发明的表达系统结合了以往非病毒载体以及病毒载体双方的优点，可期待应用于所需蛋白质的生产、抗体制作、蛋白质机能解析、基因治疗、基因疫苗等广泛领域。

此外，当使用蛋白质缺失型的辅助病毒载体时，共存粒子感染到靶细胞后不会再次释放感染性粒子，所以在生物安全性方面更具优越性。

序列表

<110>生物载体株式会社(DNAVEC CORPORATION)

<120>新型蛋白质表达系统

<130>D4-A0511P

<150>JP 2006-008965

<151>2006-01-17

<160>44

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>1

caggtttgag gatattatac atag 24

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>2

caggatttta gtttttctta ctattgtc 28

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>3

ctcttgtttg gtgggtcggc atggcatctc 30

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>4

ttagctcact cattaggcac cccag 25

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>5

gtaagaaaaa ctaaaatcct gtataacttc 30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>6

gccgacccac caaacaagag aaaaaacatg 30

<210>7

<211>16362

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>7

accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt 60

caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccctttgc tttgctgcca aagttcacgc 120

ggccgcagat cttcacgatg gccgggttgt tgagcacctt cgatacattt agctctagga 180

ggagcgaaag tattaataag tcgggaggag gtgctgttat ccccggccag aggagcacag 240

tctcagtgtt cgtactaggc ccaagtgtga ctgatgatgc agacaagtta ttcattgcaa 300

ctaccttcct agctcactca ttggacacag ataagcagca ctctcagaga ggggggttcc 360

tcgtctctct gcttgccatg gcttacagta gtccagaatt gtacttgaca acaaacggag 420

taaacgccga tgtcaaatat gtgatctaca acatagagaa agaccctaag aggacgaaga 480

cagacggatt cattgtgaag acgagagata tggaatatga gaggaccaca gaatggctgt 540

ttggacctat ggtcaacaag agcccactct tccagggtca acgggatgct gcagaccctg 600

acacactcct tcaaatctat gggtatcctg catgcctagg agcaataatt gtccaagtct 660

ggattgtgct ggtgaaggcc atcacaagca gcgccggctt aaggaaaggg ttcttcaaca 720

ggttagaggc gttcagacaa gacggcaccg tgaaaggtgc cttagttttc actggggaga 780

cagttgaggg gataggctcg gttatgagat ctcagcaaag ccttgtatct ctcatggttg 840

agacccttgt gactatgaat actgcaagat ctgatctcac cacattagag aagaacatcc 900

agatcgttgg gaactacatc cgagatgcag ggctggcttc cttcatgaac actattaaat 960

atggggtgga aacaaagatg gcagctctaa cgttgtcaaa cctgaggccc gatattaata 1020

agcttagaag cctcatagac acctacctgt caaaaggccc cagagctccc tttatctgta 1080

tcctcaagga ccctgttcat ggtgaatttg ctccaggcaa ttatcctgca ctatggagtt 1140

acgccatggg agtcgccgtc gtacagaaca aggcaatgca gcagtacgtc acagggagga 1200

cataccttga tatggaaatg ttcttactag gacaagccgt ggcaaaggat gctgaatcga 1260

agatcagcag tgccttggaa gatgagttag gagtgacgga tacagccaag gggaggctca 1320

gacatcatct ggcaaacttg tccggtgggg atggtgctta ccacaaacca acaggcggtg 1380

gtgcaattga ggtagctcta gacaatgccg acatcgacct agaaacaaaa gcccatgcgg 1440

accaggacgc taggggttgg ggtggagata gtggtgaaag atgggcacgt caggtgagtg 1500

gtggccactt tgtcacacta catggggctg aacggttaga ggaggaaacc aatgatgagg 1560

atgtatcaga catagagaga agaatagcca tgagactcgc agagagacgg caagaggatt 1620

ctgcaaccca tggagatgaa ggccgcaata acggtgtcga tcatgacgaa gatgacgatg 1680

ccgcagcagt agctgggata ggaggaatct aggatcatac gaggcttcaa ggtacttgat 1740

ccgtagtaag aaaaacttag ggtgaaagtt catccaccga tcggctcagg caaggccaca 1800

cccaacccca ccgaccacac ccagcagtcg agacagccac ggcttcggct acacttaccg 1860

catggatcaa gatgccttca ttcttaaaga agattctgaa gttgagaggg aggcgccagg 1920

aggacgagag tcgctctcgg atgttatcgg attcctcgat gctgtcctgt cgagtgaacc 1980

aactgacatc ggaggggaca gaagctggct ccacaacacc atcaacactc cccaaggacc 2040

aggctctgct catagagcca aaagtgaggg cgaaggagaa gtctcaacac cgtcgaccca 2100

agataatcga tcaggtgagg agagtagagt ctctgggaga acaagcaagc cagaggcaga 2160

agcacatgct ggaaaccttg ataaacaaaa tatacaccgg gcctttgggg gaagaactgg 2220

tacaaactct gtatctcagg atctgggcga tggaggagac tccggaatcc ttgaaaatcc 2280

tccaaatgag agaggatatc cgagatcagg tattgaagat gaaaacagag agatggctgc 2340

gcaccctgat aagaggggag aagaccaagc tgaaggactt ccagaagagg tacgaggaag 2400

tacatcccta cctgatgaag gagaaggtgg agcaagtaat aatggaagaa gcatggagcc 2460

tggcagctca catagtgcaa gagtaactgg ggtcctggtg attcctagcc ccgaacttga 2520

agaggctgtg ctacggagga acaaaagaag acctaccaac agtgggtcca aacctcttac 2580

tccagcaacc gtgcctggca cccggtcccc accgctgaat cgttacaaca gcacagggtc 2640

accaccagga aaacccccat ctacacagga tgagcacatc aactctgggg acacccccgc 2700

cgtcagggtc aaagaccgga aaccaccaat agggacccgc tctgtctcag attgtccagc 2760

caacggccgc ccaatccacc cgggtctaga gaccgactca acaaaaaagg gcataggaga 2820

gaacacatca tctatgaaag agatggctac attgttgacg agtcttggtg taatccagtc 2880

tgctcaagaa ttcgaatcat cccgagacgc gagttatgtg tttgcaagac gtgccctaaa 2940

gtctgcaaac tatgcagaga tgacattcaa tgtatgcggc ctgatccttt ctgccgagaa 3000

atcttccgct cgtaaggtag atgagaacaa acaactgctc aaacagatcc aagagagcgt 3060

ggaatcattc cgggatattt acaagagatt ctctgagtat cagaaagaac agaactcatt 3120

gctgatgtcc aacctatcta cacttcatat catcacagat agaggtggca agactgacaa 3180

cacagactcc cttacaaggt ccccctccgt ttttgcaaaa tcaaaagaga acaagactaa 3240

ggctaccagg tttgacccat ctatggagac cctagaagat atgaagtaca aaccggacct 3300

aatccgagag gatgaattta gagatgagat ccgcaacccg gtgtaccaag agagggacac 3360

agaacccagg gcctcaaacg catcacgtct cctcccctcc aaagagaagc ccacaatgca 3420

ctctctcagg ctcgtcatag agagcagtcc cctaagcaga gctgagaaag tagcatatgt 3480

gaaatcatta tccaagtgca agacagacca agaggttaag gcagtcatgg aactcgtaga 3540

agaggacata gagtcactga ccaactagat cccgggtgag gcatcctacc atcctcagtc 3600

atagagagat ccaatctacc atcagcatca gccagtaaag attaagaaaa acttagggtg 3660

aaagaaattt cacctaacac ggcgcaatgg cagatatcta tagattccct aagttctcat 3720

atgaggataa cggtactgtg gagcccctgc ctctgagaac tggtccggat aagaaagcca 3780

tcccccacat caggattgtc aaggtaggag accctcctaa acatggagtg agatacctag 3840

atttattgct cttgggtttc tttgagacac cgaaacaaac aaccaatcta gggagcgtat 3900

ctgacttgac agagccgacc agctactcaa tatgcggctc cgggtcgtta cccataggtg 3960

tggccaaata ctacgggact gatcaggaac tcttaaaggc ctgcaccgat ctcagaatta 4020

cggtgaggag gactgttcga gcaggagaga tgatcgtata catggtggat tcgattggtg 4080

ctccactcct accatggtca ggcaggctga gacagggaat gatatttaat gcaaacaagg 4140

tcgcactagc tccccaatgc ctccctgtgg acaaggacat aagactcaga gtggtgtttg 4200

tcaatgggac atctctaggg gcaatcacca tagccaagat cccaaagacc cttgcagacc 4260

ttgcattgcc caactctata tctgttaatt tactggtgac actcaagacc gggatctcca 4320

cagaacaaaa gggggtactc ccagtacttg atgatcaagg ggagaaaaag ctcaatttta 4380

tggtgcacct cgggttgatc aggagaaagg tcgggaagat atactctgtt gagtactgca 4440

agagcaagat tgagagaatg cggctgattt tctcacttgg gttaatcggc ggtataagct 4500

tccatgttca ggttaatggg acactatcta agacattcat gagtcagctc gcatggaaga 4560

gggcagtctg cttcccatta atggatgtga atccccatat gaacatggtg atttgggcgg 4620

catctgtaga aatcacaggc gtcgatgcgg tgttccaacc ggccatccct cgtgatttcc 4680

gctactaccc taatgttgtg gctaagaaca tcggaaggat cagaaagctg taaatgtgca 4740

cccatcagag acctgcgaca atgccccaag cagacaccac ctggcagtcg gagccaccgg 4800

gtcactcctt gtcttaaata agaaaaactt agggataaag tcccttgtga gtgcttggtt 4860

gcaaaactct ccacctggta caagcacaga tcatggatgg tgataggggc aaacgtgact 4920

cgtactggtc tacttctcct agtggtagca ccacaaaacc agcatcaggt tgggagaggt 4980

caagtaaagc cgacacatgg ttgctgattc tctcattcac ccagtgggct ttgtcaattg 5040

ccacagtgat catctgtatc ataatttctg ctagacaagg gtatagtatg aaagagtact 5100

caatgactgt agaggcattg aacatgagca gcagggaggt gaaagagtca cttaccagtc 5160

taataaggca agaggttata gcaagggctg tcaacattca gagctctgtg caaaccggaa 5220

tcccagtctt gttgaacaaa aacagcaggg atgtcatcca gatgattgat aagtcgtgca 5280

gcagacaaga gctcactcag cactgtgaga gtacgatcgc agtccaccat gccgatggaa 5340

ttgccccact tgagccacat agtttctgga gatgccctgt cggagaaccg tatcttagct 5400

cagatcctga aatctcattg ctgcctggtc cgagcttgtt atctggttct acaacgatct 5460

ctggatgtgt taggctccct tcactctcaa ttggcgaggc aatctatgcc tattcatcaa 5520

atctcattac acaaggttgt gctgacatag ggaaatcata tcaggtcctg cagctagggt 5580

acatatcact caattcagat atgttccctg atcttaaccc cgtagtgtcc cacacttatg 5640

acatcaacga caatcggaaa tcatgctctg tggtggcaac cgggactagg ggttatcagc 5700

tttgctccat gccgactgta gacgaaagaa ccgactactc tagtgatggt attgaggatc 5760

tggtccttga tgtcctggat ctcaaaggga gaactaagtc tcaccggtat cgcaacagcg 5820

aggtagatct tgatcacccg ttctctgcac tataccccag tgtaggcaac ggcattgcaa 5880

cagaaggctc attgatattt cttgggtatg gtggactaac cacccctctg cagggtgata 5940

caaaatgtag gacccaagga tgccaacagg tgtcgcaaga cacatgcaat gaggctctga 6000

aaattacatg gctaggaggg aaacaggtgg tcagcgtgat catccaggtc aatgactatc 6060

tctcagagag gccaaagata agagtcacaa ccattccaat cactcaaaac tatctcgggg 6120

cggaaggtag attattaaaa ttgggtgatc gggtgtacat ctatacaaga tcatcaggct 6180

ggcactctca actgcagata ggagtacttg atgtcagcca ccctttgact atcaactgga 6240

cacctcatga agccttgtct agaccaggaa ataaagagtg caattggtac aataagtgtc 6300

cgaaggaatg catatcaggc gtatacactg atgcttatcc attgtcccct gatgcagcta 6360

acgtcgctac cgtcacgcta tatgccaata catcgcgtgt caacccaaca atcatgtatt 6420

ctaacactac taacattata aatatgttaa ggataaagga tgttcaatta gaggctgcat 6480

ataccacgac atcgtgtatc acgcattttg gtaaaggcta ctgctttcac atcatcgaga 6540

tcaatcagaa gagcctgaat accttacagc cgatgctctt taagactagc atccctaaat 6600

tatgcaaggc cgagtcttaa atttaactga ctagcaggct tgtcggcctt gctgacacta 6660

gagtcatctc cgaacatcca caatatctct cagtctctta cgtctctcac agtattaaga 6720

aaaacccagg gtgaatggga agcttgccat aggtcatgga tgggcaggag tcctcccaaa 6780

acccttctga catactctat ccagaatgcc acctgaactc tcccatagtc agggggaaga 6840

tagcacagtt gcacgtcttg ttagatgtga accagcccta cagactgaag gacgacagca 6900

taataaatat tacaaagcac aaaattagga acggaggatt gtccccccgt caaattaaga 6960

tcaggtctct gggtaaggct cttcaacgca caataaagga tttagaccga tacacgtttg 7020

aaccgtaccc aacctactct caggaattac ttaggcttga tataccagag atatgtgaca 7080

aaatccgatc cgtcttcgcg gtctcggatc ggctgaccag ggagttatct agtgggttcc 7140

aggatctttg gttgaatatc ttcaagcaac taggcaatat agaaggaaga gaggggtacg 7200

atccgttgca ggatatcggc accatcccgg agataactga taagtacagc aggaatagat 7260

ggtataggcc attcctaact tggttcagca tcaaatatga catgcggtgg atgcagaaga 7320

ccagaccggg gggacccctc gatacctcta attcacataa cctcctagaa tgcaaatcat 7380

acactctagt aacatacgga gatcttgtca tgatactgaa caagttgaca ttgacagggt 7440

atatcctaac ccctgagctg gtcttgatgt attgtgatgt tgtagaagga aggtggaata 7500

tgtctgctgc agggcatcta gataagaagt ccattgggat aacaagcaaa ggtgaggaat 7560

tatgggaact agtggattcc ctcttctcaa gtcttggaga ggaaatatac aatgtcatcg 7620

cactattgga gcccctatca cttgctctca tacaactaaa tgatcctgtt atacctctac 7680

gtggggcatt tatgaggcat gtgttgacag agctacagac tgttttaaca agtagagacg 7740

tgtacacaga tgctgaagca gacactattg tggagtcgtt actcgccatt ttccatggaa 7800

cctctattga tgagaaagca gagatctttt ccttctttag gacatttggc caccccagct 7860

tagaggctgt cactgccgcc gacaaggtaa gggcccatat gtatgcacaa aaggcaataa 7920

agcttaagac cctatacgag tgtcatgcag ttttttgcac tatcatcata aatgggtata 7980

gagagaggca tggcggacag tggcccccct gtgacttccc tgatcacgtg tgtctagaac 8040

taaggaacgc tcaagggtcc aatacggcaa tctcttatga atgtgctgta gacaactata 8100

caagtttcat aggcttcaag tttcggaagt ttatagaacc acaactagat gaagatctca 8160

caatatatat gaaagacaaa gcactatccc ccaggaagga ggcatgggac tctgtatacc 8220

cggatagtaa tctgtactat aaagccccag agtctgaaga gacccggcgg cttattgaag 8280

tgttcataaa tgatgagaat ttcaacccag aagaaattat caattatgtg gagtcaggag 8340

attggttgaa agacgaggag ttcaacatct cgtacagtct caaagagaaa gagatcaagc 8400

aagagggtcg tctattcgca aaaatgactt ataagatgcg agccgtacag gtgctggcag 8460

agacactact ggctaaagga ataggagagc tattcagcga aaatgggatg gttaaaggag 8520

agatagacct acttaaaaga ttgactactc tttctgtctc aggcgtcccc aggactgatt 8580

cagtgtacaa taactctaaa tcatcagaga agagaaacga aggcatggaa aataagaact 8640

ctggggggta ctgggacgaa aagaagaggt ccagacatga attcaaggca acagattcat 8700

caacagacgg ctatgaaacg ttaagttgct tcctcacaac agacctcaag aaatactgct 8760

taaactggag atttgagagt actgcattgt ttggtcagag atgcaacgag atatttggct 8820

tcaagacctt ctttaactgg atgcatccag tccttgaaag gtgtacaata tatgttggag 8880

atccttactg tccagtcgcc gaccggatgc atcgacaact ccaggatcat gcagactctg 8940

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gtcactcctt gtcttaaata agaaaaactt agggataaag tcccttgtga gtgcttggtt 4860

gcaaaactct ccacctggta caagcacaga tcatggatgg tgataggggc aaacgtgact 4920

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acccttctga catactctat ccagaatgcc acctgaactc tcccatagtc agggggaaga 6840

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taataaatat tacaaagcac aaaattagga acggaggatt gtccccccgt caaattaaga 6960

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aggatctttg gttgaatatc ttcaagcaac taggcaatat agaaggaaga gaggggtacg 7200

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acactctagt aacatacgga gatcttgtca tgatactgaa caagttgaca ttgacagggt 7440

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tatgggaact agtggattcc ctcttctcaa gtcttggaga ggaaatatac aatgtcatcg 7620

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tgtacacaga tgctgaagca gacactattg tggagtcgtt actcgccatt ttccatggaa 7800

cctctattga tgagaaagca gagatctttt ccttctttag gacatttggc caccccagct 7860

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caagtttcat aggcttcaag tttcggaagt ttatagaacc acaactagat gaagatctca 8160

caatatatat gaaagacaaa gcactatccc ccaggaagga ggcatgggac tctgtatacc 8220

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aagagggtcg tctattcgca aaaatgactt ataagatgcg agccgtacag gtgctggcag 8460

agacactact ggctaaagga ataggagagc tattcagcga aaatgggatg gttaaaggag 8520

agatagacct acttaaaaga ttgactactc tttctgtctc aggcgtcccc aggactgatt 8580

cagtgtacaa taactctaaa tcatcagaga agagaaacga aggcatggaa aataagaact 8640

ctggggggta ctgggacgaa aagaagaggt ccagacatga attcaaggca acagattcat 8700

caacagacgg ctatgaaacg ttaagttgct tcctcacaac agacctcaag aaatactgct 8760

taaactggag atttgagagt actgcattgt ttggtcagag atgcaacgag atatttggct 8820

tcaagacctt ctttaactgg atgcatccag tccttgaaag gtgtacaata tatgttggag 8880

atccttactg tccagtcgcc gaccggatgc atcgacaact ccaggatcat gcagactctg 8940

gcattttcat acataatcct agggggggca tagaaggtta ctgccagaag ctgtggacct 9000

taatctcaat cagtgcaatc cacctagcag ctgtgagagt gggtgtcagg gtctctgcaa 9060

tggttcaggg tgacaatcaa gctatagccg tgacatcaag agtacctgta gctcagactt 9120

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acgtcatgtt tgatgtaggg cacgagctaa aattgaacga gaccatcatt agtagcaaga 9240

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ccttgaccaa gtgtgtattc tggtccgaga cactggtaga tgaaaacaga tctgcttgtt 9360

cgaacatctc aacatccata gcaaaagcta tcgaaaatgg gtattctcct atactaggct 9420

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atccaactat cagcccgacc gtaagagatc aatactttaa gggtaagaat tggctgagat 9540

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gagcggatct gttagacaag caggtattat acagggtcat gaatcaagaa cccggtgact 9720

ctagttttct agattgggct tcagaccctt attcgtgtaa cctcccgcat tctcagagta 9780

taactacgat tataaagaat atcactgcta gatctgtgct gcaggaatcc ccgaatcctc 9840

tactgtctgg tctcttcacc gagactagtg gagaagagga tctcaacctg gcctcgttcc 9900

ttatggaccg gaaagtcatc ctgccgagag tggctcatga gatcctgggt aattccttaa 9960

ctggagttag ggaggcgatt gcagggatgc ttgatacgac caagtctcta gtgagagcca 10020

gcgttaggaa aggaggatta tcatatggga tattgaggag gcttgtcaat tatgatctat 10080

tgcagtacga gacactgact agaactctca ggaaaccggt gaaagacaac atcgaatatg 10140

agtatatgtg ttcagttgag ctagctgtcg gtctaaggca gaaaatgtgg atccacctga 10200

cttacgggag acccatacat gggctagaaa caccagaccc tttagagctc ttgaggggaa 10260

tatttatcga aggttcagag gtgtgcaagc tttgcaggtc tgaaggagca gaccccatct 10320

atacatggtt ctatcttcct gacaatatag acctggacac gcttacaaac ggatgtccgg 10380

ctataagaat cccctatttt ggatcagcca ctgatgaaag gtcggaagcc caactcgggt 10440

atgtaagaaa tctaagcaaa cccgcaaagg cggccatccg gatagctatg gtgtatacgt 10500

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ctaatctgag cttagagaat ctaaagctgc tgactcctgt ttcaacctcc actaatctat 10620

ctcataggtt gaaagatacg gcaacccaga tgaagttctc tagtgcaaca ctagtccgtg 10680

caagtcggtt cataacaata tcaaatgata acatggcact caaagaagca ggggagtcga 10740

aggatactaa tctcgtgtat cagcagatta tgctaactgg gctaagcttg ttcgagttca 10800

atatgagata taagaaaggt tccttaggga agccactgat attgcactta catcttaata 10860

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tggaccttga gctatttagc aaggtcagag atgttgtaca cacagttgac atgacttatt 11040

ggtcagatga tgaagttatc agagcaacca gtatctgtac tgcaatgacg atagctgata 11100

caatgtctca attagataga gacaacttaa aagagatgat cgcactagta aatgacgatg 11160

atgtcaacag cttgattact gagtttatgg tgattgatgt tcctttattt tgctcaacgt 11220

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aagtcttatc taatgctcta tctcatccca aaatcttcaa acgattctgg aatgcaggtg 11400

tcgtggaacc tgtgtatggg cctaacctct caaatcagga taagatactc ttggccctct 11460

ctgtctgtga atattctgtg gatctattca tgcacgattg gcaagggggt gtaccgcttg 11520

agatctttat ctgtgacaat gacccagatg tggccgacat gaggaggtcc tctttcttgg 11580

caagacatct tgcataccta tgcagcttgg cagagatatc tagggatggg ccaagattag 11640

aatcaatgaa ctctctagag aggctcgagt cactaaagag ttacctggaa ctcacatttc 11700

ttgatgaccc ggtactgagg tacagtcagt tgactggcct agtcatcaaa gtattcccat 11760

ctactttgac ctatatccgg aagtcatcta taaaagtgtt aaggacaaga ggtataggag 11820

tccctgaagt cttagaagat tgggatcccg aggcagataa tgcactgtta gatggtatcg 11880

cggcagaaat acaacagaat attcctttgg gacatcagac tagagcccct ttttgggggt 11940

tgagagtatc caagtcacag gtactgcgtc tccgggggta caaggagatc acaagaggtg 12000

agataggcag atcaggtgtt ggtctgacgt taccattcga tggaagatat ctatctcacc 12060

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tatactcttg tgatgtcaat gggcagagag agttaaatat atatcctgct gaggtggcac 12300

tagtgggaaa gaaattaaac aatgttacta gtctgggtca aagagttaaa gtgttattca 12360

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cacacaactg catgatagct ttcaacaggg ttttgaagga tacaatcttc gaatgggcta 13020

gaataactga gtcagataaa aggcttaaac taactggtaa gtatgacctg tatcctgtga 13080

gagattcagg caagttgaag acaatttcta gaagacttgt gctatcttgg atatctttat 13140

ctatgtccac aagattggta actgggtcat tccctgacca gaagtttgaa gcaagacttc 13200

aattgggaat agtttcatta tcatcccgtg aaatcaggaa cctgagggtt atcacaaaaa 13260

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aatacacgac cgtgattgat gatggatcac taggtgatat cgagccatat gacagctcgt 13440

aataattagt ccctatcgtg cagaacgatc gaagctccgc ggtacctgga agtcttggac 13500

ttgtccatat gacaatagta agaaaaacta aaatcctgta taacttcatt acatatccca 13560

tacatgtttt ttctcttgtt tggtgggtcg gcatggcatc tccacctcct cgcggtccga 13620

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cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 14460

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 14520

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agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 14640

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 14700

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 14760

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 14820

ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 14880

cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 14940

cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 15000

accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 15060

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ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 15180

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tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 15360

actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 15420

ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 15480

aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 15540

ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 15600

cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 15660

aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 15720

actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 15780

cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 15g40

ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa 15900

taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 15960

acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 16020

agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc 16080

atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 16140

aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 16200

gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 16260

gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 16320

tgccaagctc gcgtcgtacg ggccctaata cgactcacta ta 16362

<210>12

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>12

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<210>13

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>13

caggtaccgc ggagcttcga tcgttctgca cgatagggac taattacttg tacagctcgt 60

ccatg 65

<210>14

<211>3010

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>14

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gctcgcgtcg tacgggccct 420

aatacgactc actataacca aacaagagaa aaaacatgta tgggatatgt aatgaagtta 480

tacaggattt tagggtcaaa gtatccaccc tgaggagcag gttccagacc ctttgctttg 540

ctgccaaagt tcacgcggcc gcccgcggta cctggaagtc ttggacttgt ccatatgaca 600

atagtaagaa aaacttacaa gaagacaaga aaatttaaaa ggatacatat ctcttaaact 660

cttgtctggt gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa 720

ggaggacgca cgtccactcg gatggctaag ggagagctac gcgtggatcc ccgggaattc 780

gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 840

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 900

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 960

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 1020

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 1080

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 1140

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tctcaaagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1440

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1500

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tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1680

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agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1980

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 2040

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 2100

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 2160

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 2220

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 2280

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2340

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2400

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2460

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2520

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2580

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2640

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2700

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2760

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2820

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2880

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2940

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 3000

ccctttcgtc 3010

<210>15

<211>996

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>15

accaaacaag agaaaaaaca tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt 60

caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gaccctttgc tttgctgcca aagttcacgc 120

ggccgcagat cttcacgatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 180

tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 240

agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 300

ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 360

accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 420

aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 480

tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 540

gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaaa actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 600

ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 660

gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 720

tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 780

agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 840

acgagctgta caagtaatta gtccctatcg tgcagaacga tcgaagctcc gcggtacctg 900

gaagtcttgg acttgtccat atgacaatag taagaaaaac ttacaagaag acaagaaaat 960

ttaaaaggat acatatctct taaactcttg tctggt 996

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>16

agttcacgcg gccgcagatc ttcacg 26

<210>17

<211>43

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>17

caggtaccgc ggagcttcga tcgttctgca cgatagggac taa 43

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>18

ataccgcatc aggcgccatt cg 22

<210>19

<211>57

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>19

gttttttagg gtctggaacc tgctcctcag ggtggatact ttgacactaa aatcctg 57

<210>20

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<223>人工合成的引物序列

<400>20

ggttccagac cctaaaaaac atgtatggga tatg 34

<210>21

<211>3856

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>21

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gctcgcgtcg tacgggccct 420

aatacgactc actataacca aacaagagaa aaaacatgta tgggatatgt aatgaagtta 480

tacaggattt tagtgtcaaa gtatccaccc tgaggagcag gttccagacc ctaaaaaaca 540

tgtatgggat atgtaatgaa gttatacagg attttagggt caaagtatcc accctgagga 600

gcaggttcca gaccctttgc tttgctgcca aagttcacgc ggccgcagat cttcacgatg 660

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 720

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 780

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 840

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 900

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 960

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 1020

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 1080

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 1140

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 1200

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1260

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1320

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaatta 1380

gtccctatcg tgcagaacga tcgaagctcc gcggtacctg gaagtcttgg acttgtccat 1440

atgacaatag taagaaaaac ttacaagaag acaagaaaat ttaaaaggat acatatctct 1500

taaactcttg tctggtgggt cggcatggca tctccacctc ctcgcggtcc gacctgggca 1560

tccgaaggag gacgcacgtc cactcggatg gctaagggag agctacgcgt ggatccccgg 1620

gaattcgtaa tcatgtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 1680

cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 1740

ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 1800

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 1860

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1920

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1980

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 2040

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 2100

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 2160

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 2220

gcgctttctc aaagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 2280

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 2340

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2400

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2460

tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2520

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2580

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2640

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2700

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 2760

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 2820

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 2880

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 2940

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 3000

agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 3060

agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 3120

gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 3180

cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 3240

gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 3300

tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 3360

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 3420

aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 3480

cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 3540

cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 3600

aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 3660

ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 3720

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 3780

ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 3840

acgaggccct ttcgtc 3856

<210>22

<211>10

<212>RNA

<21 3>仙台病毒

<400>22

ucccwvuuwc 10

<210>23

<211>10

<212>RNA

<213>仙台病毒

<400>23

ucccaguuuc 10

<210>24

<211>10

<212>RNA

<213>仙台病毒

<400>24

ucccacuuac 10

<210>25

<211>10

<212>RNA

<213>仙台病毒

<400>25

ucccacuuuc 10

<210>26

<211>10

<212>DNA

<213>仙台病毒

<400>26

agggtcaaag 10

<210>27

<211>10

<212>DNA

<213>仙台病毒

<400>27

agggtgaatg 10

<210>28

<211>10

<212>DNA

<213>仙台病毒

<400>28

agggtgaaag 10

<210>29

<211>9

<212>RNA

<213>仙台病毒

<400>29

auucuuuuu 9

<210>30

<211>9

<212>DNA

<213>仙台病毒

<400>30

taagaaaaa 9

<210>31

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>31

gtacgggccc gtacgtctga ggccgaggga aag 33

<210>32

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>32

ctcttgtttg gtacctatct ccaggtccaa tagg 34

<210>33

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>33

gacctggaga taggtaccaa acaagagaaa aaac 34

<210>34

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>34

gactagcggc cgcgtgaact ttggcag 27

<210>35

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>35

atatgcggcc gcaatggtga gcaagggcga ggag 34

<210>36

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>36

tggcgtcttc cttgtacagc tcgtccatgc cg 32

<210>37

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>37

acgagctgta caaggaagac gccaaaaaca taaag 35

<210>38

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>38

atatgcggcc gcttacacgg cgatctttcc gc 32

<210>39

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>39

tcacgcggcc gctagtccct atcgtgcaga acg 33

<210>40

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>40

gactagcggc cgcgtgaact ttggcag 27

<210>41

<211>2384

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>41

gcggccgcaa tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 60

gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 120

gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 180

tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 240

cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 300

accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 360

gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 420

ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 480

cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 540

cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 600

gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 660

cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 720

tacaaggaag acgccaaaaa cataaagaaa ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat 780

ggaaccgctg gagagcaact gcataaggct atgaagagat acgccctggt tcctggaaca 840

attgctttta cagatgcaca tatcgaggtg gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg 900

tccgttcggt tggcagaagc tatgaaacga tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc 960

gtatgcagtg aaaactctct tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga 1020

gttgcagttg cgcccgcgaa cgacatttat aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc 1080

atttcgcagc ctaccgtggt gttcgtttcc aaaaaggggt tgcaaaagat tttgaacgtg 1140

caaaagaagc tcccaatcat ccaaaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag 1200

ggatttcagt cgatgtacac gttcgtcaca tctcatctac ctcccggttt taatgaatac 1260

gattttgtgc cagagtcctt cgatagggac aagacaattg cactgatcat gaactcctct 1320

ggatctactg gtctgcctaa aggtgtcgct ctgcctcata gaactgcctg cgtgagattc 1380

tcgcatgcca gagatcctat ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt 1440

gttgttccat tccatcacgg ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga 1500

tttcgagtcg tcttaatgta tagatttgaa gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat 1560

tacaagattc aaagtgcgct gctggtgcca accctattct ccttcttcgc caaaagcact 1620

ctgattgaca aatacgattt atctaattta cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc 1680

tctaaggaag tcggggaagc ggttgccaag aggttccatc tgccaggtat caggcaagga 1740

tatgggctca ctgagactac atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg 1800

ggcgcggtcg gtaaagttgt tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg 1860

aaaacgctgg gcgttaatca aagaggcgaa ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc 1920

ggttatgtaa acaatccgga agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat 1980

tctggagaca tagcttactg ggacgaagac gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag 2040

tctctgatta agtacaaagg ctatcaggtg gctcccgctg aattggaatc catcttgctc 2100

caacacccca acatcttcga cgcaggtgtc gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa 2160

cttcccgccg ccgttgttgt tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg 2220

gattacgtcg ccagtcaagt aacaaccgcg aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg 2280

gacgaagtac cgaaaggtct taccggaaaa ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc 2340

ataaaggcca agaagggcgg aaagatcgcc gtgtaagcgg ccgc 2384

<210>42

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>42

atagcggccg caatgtaccc atacgacgtc ccagactacg ctgtgagcaa gggcgaggag 60

ctg 63

<210>43

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>43

tatgcggccg cttacttgta cagctcgtcc atg 33

<210>44

<211>63

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>44

tatgcggccg cttaagcgta gtctgggacg tcgtatgggt acttgtacag ctcgtccatg 60

ccg 63

Claims

1.包含以下(a)～(c)步骤的在靶细胞中表达外源基因的方法：

(a)将辅助负链RNA病毒载体和携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组导入生产细胞的步骤，

(b)回收分别包装了在该生产细胞内生产的辅助负链RNA病毒载体以及负链RNA病毒微型基因组而成的病毒粒子的步骤，

(c)将(b)步骤所回收的病毒粒子导入靶细胞的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述(a)步骤还包含将表达NP蛋白质、P蛋白质、以及L蛋白质的载体导入生产细胞的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辅助负链RNA病毒载体是核糖核蛋白(RNP)复合体或病毒样粒子(VLP)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述负链RNA病毒微型基因组具有一个或多个启动子。

5.根据权利要求4的方法，其中，所述启动子中的至少一个是RNA聚合酶I启动子。

6.根据权利要求1～5任一项的方法，其中所述负链RNA病毒是副粘病毒。

7.根据权利要求6的方法，其特征为由辅助负链RNA病毒载体或负链RNA病毒微型基因组表达副粘病毒的NP蛋白质、P蛋白质及L蛋白质。

8.根据权利要求6的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体是包含下述负链单链RNA的载体，所述负链单链RNA经过修饰使得其不表达副粘病毒的F蛋白质、M蛋白质或HN蛋白质中的任意一个或多个蛋白质，且所述负链单链RNA的5′端尾随区被替换成前导区。

9.根据权利要求8的方法，其特征为所述生产细胞表达在辅助负链RNA病毒载体中经修饰而不表达的F蛋白质、M蛋白质或HN蛋白质中的任意一个或多个蛋白质。

10.根据权利要求8或9的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体经过修饰使其不表达F蛋白质。

11.根据权利要求8～10任一项的方法，其特征为所述辅助负链RNA病毒载体在P基因和/或C基因中具有突变。

12.根据权利要求11的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体包含以下(a)或(b)的负链单链RNA：

(a)包含序列号10的碱基序列的单链负链RNA；

(b)与含序列号10的碱基序列的负链RNA的互补链在严格条件下杂交的单链负链RNA。

13.根据权利要求6的方法，其中所述副粘病毒是仙台病毒。

14.根据权利要求6的方法，其中所述辅助负链RNA病毒载体是野生型仙台病毒载体。

15.根据权利要求1～14任一项的方法，其中所述生产细胞是表达T7RNA聚合酶的细胞。

16.根据权利要求1～15任一项的方法，其特征为在体外的靶细胞中表达外源基因。

17.根据权利要求16的方法，其中所述靶细胞是293T细胞、A549细胞、BHK-21细胞、C2C12细胞、HeLa细胞、LLC-MK₂细胞、MDCK细胞、或NIH3T3细胞中的任一种细胞。

18.根据权利要求1～15任一项的方法，其特征为在体内的靶细胞中表达外源基因。

19.包含下述负链单链RNA的辅助负链RNA病毒载体，其中，所述负链单链RNA经过修饰使得其不表达副粘病毒的F蛋白质、M蛋白质或HN蛋白质中的任意一种或多种蛋白质，且所述负链单链RNA的5′端尾随区被替换成前导区。

20.携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组。

21.在靶细胞内表达外源基因的方法，该方法包含将权利要求19的辅助负链RNA病毒载体和权利要求20的负链RNA病毒微型基因组导入靶细胞的步骤。

22.病毒粒子的制备方法，该方法包含以下(a)和(b)的步骤：

(a)将辅助负链RNA病毒载体以及携带外源基因的负链RNA病毒微型基因组导入生产细胞的步骤；

(b)回收分别包装了在该生产细胞内生产的辅助负链RNA病毒载体和负链RNA病毒微型基因组的病毒粒子的步骤。