CN101397332B

CN101397332B - 附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及利用该功能肽段构建的多重抗原肽

Info

Publication number: CN101397332B
Application number: CN2008102328941A
Authority: CN
Inventors: 何畏; 梁志清; 孙黎黎; 吴玉章; 李晋涛; 李彦锋
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Army Medical University
Priority date: 2008-10-20
Filing date: 2008-10-20
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2028-10-20
Also published as: CN101397332A

Abstract

本发明公开了附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及利用该功能肽段构建的多重抗原肽；本发明的附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示氨基酸序列，具有成分单一、结构简单、激发的免疫反应针对性强的特点，可用于制备免疫原；本发明的利用该功能肽段构建的多重抗原肽，在由一个或多个双官能单元构成的树状核心的分枝上共价连接该功能肽段而得到；该多重抗原肽可提高功能肽段的免疫原性同时不影响其抗原特异性，能够刺激机体产生高滴度的特异于功能肽段的抗体，降低血清附睾蛋白酶抑制剂水平，诱导高效、安全、可逆的抗生育作用，可用于制备男性避孕疫苗。

Description

附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及利用该功能肽段构建的多重抗原肽

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及利用该功能肽段构建的多重抗原肽。

背景技术

人口、资源和环境问题是严重影响本世纪人类生存和经济社会发展的关键问题，避孕节育研究受到极大重视。迄今为止，男性避孕方法还局限于传统的体外排精、绝育术和使用避孕套等，尚无高效、方便、安全、可逆的避孕新措施问世。

几十年来，研究者都试图以生殖相关激素和精子特异性蛋白为靶抗原，将免疫方法应用于男性生育控制，但仍存在诸多问题，如尚未找到最佳的特异性靶抗原，天然抗原的弱抗原性和免疫耐受，免疫避孕效果不理想等。这些问题已成为避孕疫苗发展和应用的巨大障碍。

2001年，人类附睾蛋白酶抑制剂(epididymal protease inhibitor，Eppin)首次被发现，其在睾丸和附睾中优势表达，主要分布于精子表面和精浆中。用保留羧基端的Eppin截短蛋白免疫的雄性猕猴出现可逆性的不育(避孕率7/9，可逆率5/7)，精液分析发现精子的前向运动能力减弱，而精子的数量及体内雄激素水平不受影响，亦未见自身免疫性疾病的发生，表明Eppin是一种极有发展前途的靶抗原，但其为自身抗原，故仍存在免疫原性弱和免疫耐受等问题，此外，未对Eppin中可能导致远期毒副反应的不良肽段做剔除或加工。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供Eppin的功能肽段，选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

本发明的目的之二在于提供利用所述Eppin的功能肽段构建的多重抗原肽，由下式表示：

B₂K或B₄K₂K或B₈K₄K₂K

其中：

B是附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段，选自与SEQ ID No.1具有至少80％序列相同性的多肽或/和与SEQ ID No.2具有至少80％序列相同性的多肽；

K是双官能单元。

进一步，所述附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段选自SEQ ID No.1或/和SEQ IDNo.2所示氨基酸序列；

进一步，所述附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段，选自SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且两种序列的摩尔比为1∶1；

进一步，所述双官能单元选自半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或鸟氨酸；

进一步，所述双官能单元为赖氨酸。

本发明的目的之三在于提供一种包含免疫学有效量的所述多重抗原肽的组合物。

进一步，还包含药学上可接受的载体。

本发明的目的之四在于提供所述Eppin的功能肽段在制备免疫原中的应用。

本发明的目的之五在于提供所述多重抗原肽在制备男性避孕疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)发明人在分析Eppin的氨基酸序列及蛋白质空间结构的基础上，结合免疫信息学相关理论和研究手段，对Eppin的功能肽段进行了筛选和鉴定，本发明公开了其中两个功能肽段：B1具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列，B2具有SEQ IDNo.2所示氨基酸序列；本发明的功能肽段具有成份单一，结构简单，激发的免疫反应针对性强的特点，可用于制备免疫原；

(2)本发明利用Eppin的功能肽段构建了多重抗原肽，研究证实，所得多重抗原肽可提高功能肽段的免疫原性同时不影响其抗原特异性，能够刺激机体产生高滴度的特异于功能肽段的抗体，诱导高效、安全、可逆的抗生育作用，可用于制备男性避孕疫苗，为男性避孕的临床主动免疫治疗提供新的手段，具有重要的开发价值和广阔的应用前景，能够产生重大的社会效益和经济效益。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

附图为本发明多重抗原肽的结构示意图。

具体实施方式

本发明采用错位重复套式方法，将Eppin分成32个多肽片段，再将各多肽片段与载体蛋白偶联制得32个免疫原，各免疫原作体外抗Eppin特异性抗体识别检测，再将各免疫原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂组成组合物，以此组合物免疫雄性小鼠，进行体内免疫原性检测和抗生育能力研究，由此筛选出数个免疫原性强、抗体产生稳定、具有高效抗生育能力的免疫原，从而获得Eppin的功能肽段。本发明公开了其中两个功能肽段：功能肽段B1，具有SEQ IDNo.1所示氨基酸序列；功能肽段B2，具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

多重抗原肽(Multiple antigenic peptide，MAP)是在一个树状核心的分枝上连接功能肽段而形成的放射状分子肽。该树状核心由一个或多个双官能单元如半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或鸟氨酸构成。树状核心分子量小，免疫原性弱，不足以诱发特异性免疫反应，将功能肽段与之连接后，机体能够产生针对功能肽段的特异性免疫应答，是替代传统交联载体蛋白，提高功能肽段的免疫原性同时不影响其抗原特异性的有效办法。

本发明利用Eppin的功能肽段B1或/和B2构建了两种类型的多重抗原肽。一种类型是在树状核心的所有分枝上共价连接Eppin的功能肽段B1或B2；另一种类型是在树状核心的不同分枝上分别连接Eppin的功能肽段B1和B2，连接在分枝上的B1和B2的摩尔比可为1∶1或其它比例。本领域公知，具有至少80％序列相同性的多肽基本上可以保持原功能肽段的生物学活性。这些多肽包括但不限于：(1)有一个或几个氨基酸残基被取代、缺失或/和插入的多肽，取代或插入的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽。因此，与Eppin的功能肽段B1或B2具有至少80％序列相同性的多肽都可以用于构建本发明所述的多重抗原肽，都能够实现本发明目的。根据本文的教导，这些多重抗原肽均属于本发明保护范围。

在上述两种类型的多重抗原肽中，由不同数量如一个、三个或七个双官能单元构成的树状核心可分别形成二分枝、四分枝或八分枝，因此，在本发明中，每种类型的多重抗原肽又可分别制成二分枝肽、四分枝肽或八分枝肽。

本发明的多重抗原肽，可以利用Fmoc策略以固相多肽合成法先分别合成Eppin的功能肽段和树状核心，再将二者按一定比例共价连接制成多种抗原肽；也可以利用Fmoc策略以固相多肽合成法直接合成多重抗原肽。

本发明还包括一种药物组合物，其包含免疫学有效量的所述多重抗原肽和药学上可接受的载体，可制成男性避孕疫苗等药物形式。本发明多重抗原肽的免疫学有效量可根据用药途径、患者的年龄、体重、健康状况和个体反应等变化，通常剂量为每千克体重1-5毫克，这一剂量可以一次或多次施用。药学上可接受的载体一般应与免疫原相容且对受体无害，包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、霍乱毒素B等。本领域普通技术人员可以很容易地确定药物剂型，包括速释或/和缓释制剂。各种剂型可以按照药学领域的常规方法进行制备。所得药物制剂可以通过任何一种便利的途径施用，包括皮下的、口服的、肌内的、腹膜内的，或其他肠胃外的或肠道的途径。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、多重抗原肽的设计

将Eppin的功能肽段B1或/和B2的羧基端与赖氨酸共价连接，可制得二分枝肽MAP-B1-2、MAP-B2-2和MAP-B1/B2-2，其结构示意图如附图(A)、(D)和(G)所示；

将Eppin的功能肽段B1或/和B2的羧基端与三聚赖氨酸共价连接，可制得四分枝肽MAP-B1-2、MAP-B2-2和MAP-B1/B2-2，其结构示意图如附图(B)、(E)和(H)所示；

将Eppin的功能肽段B1或/和B2的羧基端与七聚赖氨酸共价连接，可制得八分枝肽MAP-B1-8、MAP-B2-8、MAP-B1/B2-8，其结构示意图如附图(C)、(F)和(I)所示。

二、多重抗原肽的制备

多重抗原肽MAP-B1-4的制备方法，包括以下步骤：

a、合成Eppin的功能肽段

采用标准Fmoc方案，在固相多肽合成仪(ABI431A型)上合成：称取0.1mmol的王树脂，按照树脂∶氨基酸＝1∶5(摩尔比)的反应比，根据功能肽段的氨基酸序列称取各氨基酸；以二氯甲烷(DCM)溶胀树脂，再依照去除Fmoc保护基、活化、偶联的步骤，按照功能肽段的氨基酸序列使肽链从羧基(C)端逐个向氨基(N)端延伸，待合成完毕后，将肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基，再以反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行纯化，即得；

b、合成三聚赖氨酸

采用标准Fmoc方案，在固相多肽合成仪(ABI431A型)上合成：称取0.1mmol的王树脂，按照树脂∶氨基酸＝1∶5(摩尔比)的反应比，称取2次反应的赖氨酸(Lys)；以DCM溶胀树脂，再依照去除Fmoc保护基、活化、偶联的步骤，依次连接第1级和第2级Lys，完成三聚赖氨酸的合成，进而将三聚赖氨酸从树脂上裂解下来，去除保护基，以RP-HPLC进行纯化，即得；

c、将Eppin的功能肽段与三聚赖氨酸共价连接

将步骤a制得的Eppin的功能肽段溶解于浓度为0.1mol/L、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中；于室温、搅拌反应条件下，在步骤b制得的三聚赖氨酸溶液中，缓慢加入MBS[即甲基丙烯酸甲酯(M)、丁二烯(B)和苯乙烯(S)的三元共聚物]溶液，加完后于室温下搅拌反应2小时，再按照功能肽段∶三聚赖氨酸＝8∶1(摩尔比)的反应比例，缓慢加入上述功能肽段溶液，加完后于室温下搅拌反应3小时，所得反应物经脱盐处理后，再以RP-HPLC进行纯化，即得多重抗原肽。

参照上述方法，可制得本发明其它多重抗原肽。

二、多重抗原肽的鉴定

方法：a、实验动物分组：将100只体重为18-20g的清洁级6-8周龄Balb/c雄性小鼠随机分成5组：MAP-B1-4样品组(多重抗原肽MAP-B1-4)、MAP-B1/B2-4样品组(多重抗原肽MAP-B1/B2-4)、B1对照组(Eppin的功能肽段B1)、B2对照组(Eppin的功能肽段B2)和空白对照组(PBS)，每组20只；

b、免疫方案：MAP-B1-4样品组和MAP-B1/B2-4样品组：将多重抗原肽稀释于浓度为0.1mol/L、pH值为7.5的PBS中，配制成浓度均为40μg/mL的溶液，再将此溶液与霍乱毒素B等体积混合，充分乳化，制得免疫原；B1对照组和B2对照组：以Eppin的功能肽段替代多重抗原肽，按样品组所述方法制得免疫原；空白对照组：以PBS替代多重抗原肽，按样品组所述方法制得免疫原；各组免疫步骤为：首次免疫，将免疫原于小鼠皮下多点注射，每只20μg(1mL)；以后每间隔2周，以同样方法加强免疫1次，共3次；

c、免疫原性检测：首次免疫前后，每间隔一定时间，对各组小鼠行尾静脉采血，分离血清，采用ELISA法测定血清中特异性抗体的滴度；ELISA法具体方法为：MAP-B1-4样品组和MAP-B1/B2-4样品组：将多重抗原肽稀释于浓度为0.1mol/L，pH值为7.5的PBS中，配制成浓度为2μg/mL的包被液；B1对照组和B2对照组：以Eppin的功能肽段替代多重抗原肽，按样品组所述方法制得包被液；空白对照组：以PBS为包被液；各组将包被液加至96孔反应板中，每孔100μl，置温度4℃包被过夜，弃去包被液，以PBST(含Tween-20的PBS)洗板3次，再对应加入倍比稀释的各组免疫小鼠血清，每孔100μl，置温度37℃孵育1小时，弃去血清稀释液，以PBST洗板3次，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG(稀释度为1∶5000，Promega公司)，每孔100μl，置温度37℃孵育1小时，弃去标记抗体，以PBST洗板3次，再加入四甲基联苯二胺(TMB)显色液，置温度37℃孵育10分钟后终止反应，测量450nm波长处的吸光度A值，待测孔A值大于或等于空白对照组2.1倍者判为阳性，以判为阳性的最高稀释倍数为抗体滴度。

d、抗生育能力检测：于末次免疫后2周，按雌雄小鼠数量比为1∶1行雌雄小鼠合笼实验，观察雌鼠受孕率；末次免疫结束并经过3个动情周期后，按雌雄小鼠数量比为1∶1再行雌雄小鼠合笼实验，监测雄鼠血清中特异性抗体的滴度和合笼后雌鼠的受孕率。

结果：MAP-B1-4样品组免疫小鼠血清特异性抗体生成曲线如图2所示，可见首次免疫后2周小鼠血清中即有抗MAP-B1特异性抗体产生，以后抗体滴度逐渐升高，于免疫后6周达到最高值1∶8000，再逐渐降低，于免疫后11周降至1∶2000；MAP-B1/B2-4样品组小鼠血清特异性抗体生成曲线与MAP-B1-4样品组相近，首次免疫后2周小鼠血清中即有抗MAP-B1/B2特异性抗体产生，以后抗体滴度逐渐升高，于免疫后6周达到最高值1∶8000，再逐渐降低，于免疫后11周降至1∶1000；

在末次免疫后2周的雌雄小鼠合笼实验中，各组雌鼠的受孕率分别是MAP-B1-4样品组15％(3/20)，MAP-B1/B2-4样品组20％(4/20)，B1对照组35％(7/20)，B2对照组30％(6/20)，空白对照组90％(18/20)，MAP-B1-4样品组、MAP-B1/B2-4样品组、B1对照组和B2对照组分别与空白对照组比较，均有显著性差异(P≤0.05)；

在末次免疫结束并经过3个动情周期后的雌雄小鼠合笼实验中，MAP-B1-4样品组雄鼠血清中的特异性抗体滴度为1∶1000，雌鼠受孕率为50％(8/16)；MAP-B1/B2-4样品组雄鼠血清中的特异性抗体滴度为1∶400，雌鼠受孕率为80％(12/16)。

基于上述实验结果，可得出如下结论：Eppin的肽段B1、B2具有免疫原性，能够刺激机体产生特异性抗体，诱导抗生育作用，证实为Eppin的功能肽段；本发明的多重抗原肽可提高功能肽段的免疫原性同时不影响其抗原特异性，能够刺激机体产生高滴度的特异于功能肽段的抗体，诱导高效、安全、可逆的抗生育作用，可用于制备男性避孕疫苗。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段及利用该功能肽段构建的多重抗原肽

<160>2

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>1

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>智人(Human)

<400>2

Claims

1.附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段，选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

2.利用权利要求1所述的附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段构建的多重抗原肽，由下式表示：

B₂K或B₄K₂K或B₈K₄K₂K

其中：

B是附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段，选自SEQ ID No.1或/和SEQ ID No.2所示氨基酸序列；

K是双官能单元，所述双官能单元为赖氨酸。

3.根据权利要求2所述的多重抗原肽，其特征在于：所述附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段，选自SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且两种序列的摩尔比为1∶1。

4.包含免疫学有效量的权利要求2所述的多重抗原肽和药学上可接受的载体的组合物。

5.权利要求1所述的附睾蛋白酶抑制剂的功能肽段在制备免疫原中的应用。

6.权利要求2所述的多重抗原肽在制备男性避孕疫苗中的应用。