CN101358969A - 用单一特异性捕获剂定量检测分析物的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用单一特异性捕获剂定量检测生物样本中分析物的方法，称为“分析物标记及倒置再捕获法”，简称ALIRA，是基于SALRA原理但采用不同再捕获手段的改进检测方法。步骤是，先在捕获装置上捕获分析物，形成捕获剂－分析物复合物；再用标记试剂标记复合物；将经过标记的分析物从复合物上洗脱下来；由检测装置上的第二捕获剂通过与标记分子的结合而将分析物再次捕获；然后加入特异检测剂，和分析物结合，通过检测特异检测剂上携带的报道分子产生的信号强度来确定分析物浓度。本发明的有益效果是采用一种特异性捕获剂就能灵敏地、简便地定量检测分析物，在疾病诊断、医学鉴定、新药研制、蛋白质微阵等应用和基础研究领域有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及采用一种特异性捕获剂定量检测一种分析物的新方法，适用于各种基于固相表面的检测平台，包括微孔板、滤膜、微磁球，等等。
背景技术
检测生物(包括人类)组织样本中特定蛋白质因子的含量，对于医学、生物学、农业、食品工业、环境保护等领域的基础研究和应用具有非常重要的意义。例如，检测病原微生物的特异性蛋白质组分是目前诊断传染病的主要手段；同样，测定癌症和心血管疾病的早期生物标记蛋白质因子含量的变化对于这些疾病的早发现早治疗和疗效观察极为重要。随着医学和生物学领域的不断进展，对各种蛋白质因子进行定量检测的需求也越来越大。
为满足这一不断增长的要求，近年来各种蛋白质和蛋白质组学检测方法应运而生，例如各种免疫检测技术、双向凝胶电泳、质谱分析和肽图谱分析等等。其中最方便、应用范围最广也是目前使用最多的是免疫检测技术中的酶联免疫吸附检测(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，简称ELISA；参见Engvall和Perlman，1971，Immunochemistry 8：871-4.)。ELISA的具体操作方式有若干种，其中最常用的是夹心法酶联免疫吸附检测(sandwich ELISA)，用于定量检测生物样本中某种蛋白质的浓度。夹心法ELISA采用能够和同一种抗原蛋白质的不同抗原决定簇结合的两种不同但是互相配合的抗体来完成，一种抗体和抗原的结合不干扰另一种抗体和同一个抗原分子的结合。这种方法的技术要点是：(1)将捕获抗体(capture antibody)包被在某一固相表面上(最常用的是96-孔微量板的微孔底部平面)；(2)加入待测生物样本，让其中含有的抗原蛋白质分子(分析物)与结合在固相表面上的捕获抗体特异性结合，然后洗除未结合的非特异性物质；(3)加入标有某种报道分子(酶、生物素、半抗原、荧光基团、寡聚核苷酸或其他类型分子)的检测抗体(detection antibody)，使之与固相表面上被捕获的抗原分子特异性结合，然后洗除未结合的检测抗体；(4)加入使报道分子产生信号的相关试剂(例如酶标亲和素、酶底物等)，然后用96-孔酶标仪读测信号强度，或者直接测定报道分子(例如荧光强度等)的量，或用实时PCR扩增寡聚核苷酸后检测。根据信号的强度，参照分析物的已知浓度标准校准曲线，从而确定样本中分析物的浓度。虽然夹心法ELISA的特异性和灵敏度都比较高，但是该方法的应用有一个重要局限性：如果要建立检测一种分析物的夹心法ELISA检测方法，必须拥有针对该分析物的两种不同抗体(捕获抗体和检测抗体)，而且要求这两种抗体对该分析物都拥有高度特异性和高度亲合力，同时它们之间必须互相配合，即捕获抗体和分析物的结合不影响检测抗体对同一分析物分子的结合。这些要求在很大程度上限制了夹心法ELISA的更广泛应用，这是因为，在实际工作中往往要经过很多努力、很长时间才能获得上述能够互相配合的针对同一个分析物的两种抗体。许多生物学上或临床检测上非常重要的蛋白质或蛋白质结构域，尽管多年反复试验仍然无法获得可以用于夹心法ELISA的配对抗体。而对于那些分子量较小或者抗原决定蔟较少并且靠在一起的蛋白质，就更难获得两种互相配合的抗体。有时可以获得一种拥有高特异性高亲和力的抗体，但是要找到另一种具有相似优点并且能够互相配对的另一种抗体却极为困难。这也是为什么目前市场上约有针对超过5000种不同蛋白质的抗体，但只有约400-500种蛋白质可以用夹心法ELISA进行定量检测。
为了克服夹心法ELISA的上述局限，人们提出并实验了若干种改进方法，其中之一是将生物样本中的所有抗原蛋白质预先用荧光化合物等报道分子进行直接标记(Miller等，2003，Proteomics.3：56-63)。然后与固相载体上的抗体结合，洗除非特异性物质后，直接检测结合在固相抗体上被标记的分析物。这个方法的原理目前已经被若干家制造商作为检测技术平台用于他们的蛋白质芯片产品。此方法虽然简单易行，只需要一种抗体(捕获抗体)就能够进行检测，但存在以下缺点：第一，生物样本中常常含有成千上万种大小分子，其中很多会直接或间接地干扰对特异性分析物的标记效率，浓度低的蛋白质往往更难有效地被标记。第二，标记过程本身很可能修饰改变分析物分子上的抗原决定簇特征，降低甚至抑制与固相上捕获抗体的结合。第三，样本中占压倒多数的非特异性物质在没有被清除之前就已经被有效标记，由于分析物未经过特异性富集(浓缩)，这些同样携带报道分子的非特异性物质将产生很强的检测本底噪音，造成特异性和灵敏度都大大降低，许多以微孔板或者蛋白质微阵作为检测平台的实验结果已经证明了这一点。
ELISA的另外一种形式是所谓“抗原在下(antigen-down)ELISA”，即用抗原包被微孔板的微孔，然后加入相应的抗体。这一形式主要是用来检测血清样本中某一抗体的存在，用于包被的抗原蛋白质是经过提纯的或半提纯的，而待测的血清经过适当稀释后加入其内，然后再加上酶标二级抗体，就能检测到该血清样本中是否存在针对该抗原的抗体。这一方法经过适当修饰后，也可以用来检测某一样本中抗原的存在。具体做法是，用待测样本包被微孔，然后加上标有信号分子的特异性抗体，除去未结合的抗体后，即可以通过报道分子显示信号。显而易见，这种方法只需要一种抗体就可以进行检测。理想情况下，所产生信号的强度和样本中抗原的浓度呈正线性关系。可是，由于生物样本中通常都含有上千中不同蛋白质，待测的抗原蛋白质只占其中很小一部分，用这样的样本包被微孔，包被上的物质大部分都是非特异蛋白质或其他分子。因此，这种方法的灵敏度和特异性很低，不能用来检测复杂样本中浓度比较低的抗原。
夹心法ELISA方法的另外一种改进是近来发展起来的免疫-PCR法，其中以DNA寡聚核苷酸来标记检测抗体，用捕获抗体将抗原蛋白质捕获到固相后，加入寡聚核苷酸标记的检测抗体，然后用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)方法扩增并读取信号。免疫-PCR方法的灵敏度特别高，检测的浓度范围跨度很大(1000-10000倍范围)，而且可以进行多重性同时检测多种抗原。但是上述夹心法ELISA方法中需要两个互相配对抗体的局限性依然存在。这一方法的其它缺点还包括，需要极为小心的操作步骤以避免PCR反应的污染，较长的检测时间，以及较高的设备和试剂成本。
已公开的申请号为20051040295(中国)的专利文献，提出了一种新的检测方法，只需采用一种捕获剂就能灵敏地、简便地定量检测一种分析物。这一方法称为“特异性分析物标记及再捕获法”，英文名称是“Specific Analyte Labelingand Recapture Assay”，简称SALRA。其步骤如下：首先在“捕获装置”上用特异性捕获剂(通常为抗体)捕获分析物；通过清洗而去除非特异性物质并富集分析物后，用报道分子标记捕获剂-分析物复合物；然后将经过标记的分析物从复合物上离解并洗脱下来，经过适当中和后，与“检测装置”上包被于固相的同一捕获剂再结合，通过检测报道分子的标记信号来确定分析物含量。SALRA方法只需要一种抗体就能检测一种抗原，适用于各类基于固相表面的检测平台，例如微孔板、滤膜、蛋白质(抗体)芯片、微珠(beads)，等等。SALRA方法既可以用来检测一种分析物，也可以用于多重性同时检测多种不同的分析物。SALRA虽然主要将用于检测抗体与抗原蛋白质的结合，也可以检测非免疫关系的蛋白质-蛋白质结合或者蛋白质与其他类型分子的结合。
虽然SALRA方法已经成功用于蛋白质的定量检测，尤其是用于多重性同时检测若干种蛋白质，实验中观察到，当一些待测样本中非特异物质含量较高或者含有容易和检测装置固相表面结合的非特异物质时，检测特异性和灵敏度会受到较大的负面影响。这是因为，在上述SALRA方法中，用于标记分析物的标记分子本身也是直接参与产生检测信号的报道分子。在标记分析物过程中，任何结合在捕获装置固相表面上的蛋白质，包括特异性分析物和非特异性物质(样本中的非特异组分、捕获抗体、以及用于封阻的蛋白质)都同时会被标记，这些非特异性物质中的相当一部分会被洗脱进入液相并进入检测装置。一旦和检测装置表面结合，这些非特异物质上携带的标记分子(报道分子)将产生本底噪音，而此时检测系统已经没有能够区分报道分子是来自特异性分析物还是来自非特异性物质的步骤(机制)。
发明内容
为了克服夹心法ELISA和上述SALRA方法的不足，本发明提供了一种新的免疫检测方法，采用一种特异性捕获剂就能灵敏地、简便地定量检测相应的分析物。这一方法称为“分析物标记及倒置再捕获法”，英文名称是“Analyte Labeling andInverse Recapture Assay”，简称ALIRA。本方法主要用来检测样本中的一种分析物，但是也可以用来多重性同时检测若干种分析物；既可以用于检测抗体与抗原蛋白质的结合，也可以检测非免疫关系的蛋白质-蛋白质结合或者蛋白质与其他类型分子的结合。
具体技术方案是：
(1)捕获分析物：将特异性捕获剂包被或者共价结合到到固相表面，成为捕获装置；加入待测生物样本，使捕获装置上的特异性捕获剂与样本中的分析物结合，形成捕获剂-分析物复合物；
(2)标记复合物：用标记试剂标记捕获剂-分析物复合物；
(3)洗脱分析物：将经过标记的分析物从复合物上洗脱下来；
(4)再捕获：将洗脱液加入检测装置，由检测装置上的第二捕获剂通过与标记分子的结合而再次捕获分析物；所说的检测装置是指包被了第二捕获剂的固相表面；
(5)检测：加入特异检测剂，和分析物结合，通过检测特异检测剂上携带的报道分子产生的信号强度来确定分析物浓度。
步骤(1)中的特异性捕获剂亦称为第一捕获剂，大多数情况下为抗体，包被或共价结合在某一适当的固相表面，比如96-孔微量板，成为捕获装置。加入待测生物样本，使捕获装置上的特异捕获剂与样本中特异性分析物的“特异结合位点”结合，形成“第一捕获剂-分析物”复合物；然后通过洗去非特异物质而富集特异性分析物。所说的特异结合位点是指分析物分子上与第一捕获剂结合的结构域。
步骤(2)标记复合物，加入标记试剂标记分析物。标记试剂为分析物分子提供下一步在检测装置上能够被“第二捕获剂”捕获的标记分子基团。例如，可以用生物素作为标记分子，而相应的第二捕获剂则是亲和素蛋白。
步骤(3)洗脱分析物，将经过标记的分析物从复合物上离解并洗脱下来进入液相。洗脱剂的选用将取决于分析物和第一捕获剂之间结合特点而定，比如提高或降低pH值、改变离子强度、改变有机溶剂浓度、改变洗涤剂浓度、改变实验温度，等等；同时，在保证洗脱分析物的同时，将尽量避免非特异蛋白质(包括第一捕获剂、封阻蛋白质、样本中固相结合的非特异蛋白质)进入液相。
步骤(4)再捕获分析物，将洗脱液加入检测装置。检测装置是用所说的第二捕获剂(例如亲和素或链亲和素)包被在固相表面(例如96-孔微量板)制作而成。分析物通过表面携带的标记分子(通常是生物素)与检测装置上的第二捕获剂结合而被再次捕获于固相。如果洗脱液因为pH、离子强度、有机溶剂浓度、洗涤剂浓度等原因而影响分析物和第二捕获剂的结合，在加入检测装置之前需要处理洗脱液，比如采取调节温度、调节pH、调节离子强度、调节有机溶剂浓度或洗涤剂浓度等措施，以促进分析物和第二捕获剂的结合。然后除去未结合物质。这种对分析物的捕获称为“倒置捕获(Inverse Recapturing)”，这是因为和捕获装置上对分析物的捕获相比，检测装置上的捕获是一种“头朝下”的状况，从而将步骤(1)中描述的原来在捕获装置上与第一捕获剂结合的“特异结合位点”暴露在外。
步骤(5)加入特异检测物：加入能够与分析物上“特异结合位点“结合的特异检测物。特异检测物一般为标记有报道分子的第一捕获剂或其衍生物(或类似物)，具有和第一捕获剂相同的对分析物的特异性结合能力和结合机制，即能够识别并结合分析物上的同一特异结合位点。二者的不同之处是，特异检测物标有报道分子而第一捕获剂没有。如果第一捕获剂是抗体，特异检测物则是标有某一报道分子的同一种抗体，在功能上类似于夹心法ELISA中的检测抗体。特异检测物和分析物上的特异结合位点结合后，洗去未结合物质，然后加入适当的试剂使报道分子显示信号。例如，如果报道分子是酶(例如辣根过氧化物酶，HRP)，则加入该酶的底物，使之产生颜色等信号，然后读测颜色反应。最后通过报道分子的信号强度来确定分析物含量。
本发明方法中所说的第一捕获剂可以是抗体，但也可以是抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab)2’片段、Fv片段或scFv片段，或者是非抗体类蛋白质、或者是抗体模仿物(antibody mimetics)或具有特异性捕获功能的肽、寡聚核苷酸或小分子化合物。当第一捕获剂是抗体时，所说的抗体最好是单克隆抗体，但也可以是多克隆抗体。
本发明方法中所说的分析物主要指能被所说的第一捕获剂特异性结合的非抗体类蛋白质，但也可以是抗体、肽、寡聚核苷酸适体(aptamers)、其他生物大分子及其复合物、非肽类小分子化合物、亚细胞结构，等等。
本发明方法中所说的标记试剂是指能够将特殊分子基团(标记分子)标记到分析物上的化合物，该标记分子能够被所说的第二捕获剂特异性结合。活化的生物素(即能够把生物素标记到分析物上的化合物)是常用的标记试剂，但是所说的标记分子也可以是肽，例如FLAG肽、链亲和素结合肽、MYC肽、组氨酸标签肽(HIS-tag peptide)，或者是半抗原，例如地高辛(异羟基洋地黄毒苷Digoxigenin)、荧光染料(例如荧光素)等，或者是寡聚核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)等。表1列出这些常用标记分子及其相对应的特异性结合分子(即所说的第二捕获剂)：
表1、常用标记分子及想对应的第二捕获剂
| 常用标记分子 | 对应的第二捕获剂 |
| 生物素 | 亲和素、链亲和素、抗生物素抗体 |
| 链亲和素结合肽 | 链亲和素 |
| FLAG肽 | 抗FLAG抗体 |
| MYC肽 | 抗MYC抗体 |
| 组氨酸(HIS-6)肽 | 抗组氨酸(HIS-6)抗体 |
| 地高辛(Digoxigenin) | 抗地高辛抗体 |
| 寡聚核苷酸 | 互补的寡聚核苷酸 |
| 各种荧光染料 | 抗相应荧光染料抗体 |
| 其他半抗原分子 | 抗相应半抗原分子的抗体 |
本发明方法所说的标记分子对分析物的标记一般通过与分析物的侧链基团形成共价结合而实现。如果分析物是蛋白质，可以通过标记试剂上的活化基团与蛋白质侧链上的特定基团反应而形成共价结合。表2列出标记试剂上常用的活化基团与其相对应的蛋白质侧链特定基团或其他分析物的关系。
表2、常用活化基团与对应蛋白质侧链基团的关系
| 常用活化基团 | 对应的侧链基团 |
| NHS(琥珀酰亚胺基) | 蛋白质的伯胺(蛋白质N-端及赖氨酸残基)的氨基 |
| TFP(Tetrafluorophenyl Ester) | 蛋白质的伯胺和仲胺(N-端氨基；赖氨酸、组氨酸及色氨酸上的氨基) |
| TFPA(tetraflurophenyl azide) | 蛋白质的C-H和N-H键 |
| (Biotin)Hydrazide(生物素)酰肼 | 蛋白质上的糖基 |
| (Biotin)-Amine(生物素)胺 | 蛋白质的羧基(天冬氨酸或谷氨酸) |
| BMCC | 蛋白质的-SH基团，形成巯酯键 |
| Iodoacetyl(吲哚乙酰) | 蛋白质的-SH基团，形成巯酯键 |
| HPDP | 蛋白质的-SH基团，形成二硫键 |
| Maleimide(马来酰亚胺) | 蛋白质的-SH基团，形成巯酯键 |
| (Biotin-LC)-ASA | 在光照激活下，与核酸等生物大分子共价结合 |
| Photoactivatable(Biotin)光学激活(生物素) | 在紫外光激活下，与核酸等生物大分子共价结合激活 |
本发明方法所说的第二捕获剂是能特异性结合并捕获标记分子(以及与之连接的分析物)的物质。当标记分子是生物素或其衍生物时，所说的第二捕获剂是亲和素或链亲和素或其衍生物；当标记分子是代表一种抗原决定蔟的半抗原或肽时，所说的第二捕获剂是能够与该抗原决定蔟特异结合的抗体，当标记分子是寡聚核苷酸时，所说的第二捕获剂是能够与之碱基互补的寡聚核苷酸或能特异识别该寡聚核苷酸(标记分子)的抗体或其它蛋白质。当第二捕获剂是抗体时，所说的抗体最好是单克隆抗体，但也可以是多克隆抗体。
本发明方法中所说的特异检测物，是指在对分析物的识别特异性上和第一捕获剂相同，但标有报道分子的试剂。和特异捕获剂一样，特异检测物可以是抗体，但也可以是抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab)2’片段、Fv片段或scFv片段，或者是非抗体类蛋白质、或者是抗体模仿物(antibody mimetics)或具有特异性捕获功能的肽、寡聚核苷酸或小分子化合物。当第一捕获剂是抗体时，所说的抗体最好是单克隆抗体，但也可以是多克隆抗体。
本发明方法中所说的报道分子包括但不限于：酶(HRP、AP[碱性磷酸酶]或其他酶)、代表一种抗原决定蔟因而可以被次级抗体识别的半抗原或肽、荧光化合物、寡聚核苷酸(用作PCR底物显示检测信号)、生物素或其衍生物(当分析物上的标记分子不是生物素时)、胶体金，等等。当所说的报道分子是代表一种抗原决定蔟的半抗原或肽从而可以被次级抗体识别时，所说的次级抗体连接有次级报道分子例如酶或荧光屏物质，并且最好是单克隆抗体。
ALIRA方法适用于各种基于固相表面的检测平台，包括微孔板、滤膜、微磁球，等等。ALIRA方法主要用来检测样本中的一种分析物，但是也可以用来多重性同时检测若干种分析物；既可以用于检测抗体与抗原蛋白质的结合，也可以检测非免疫关系的蛋白质-蛋白质结合或者蛋白质与其他类型分子的结合。
以下用一种抗体作为第一捕获剂，其相应的抗原蛋白质为分析物，NHS-生物素为标记试剂，链亲和素为第二捕获剂，来进一步说明通过“分析物标记及倒置再捕获法(ALIRA)”定量检测特异性抗原的方法：
(1)制作捕获装置：将能够特异性结合待测抗原的单克隆抗体(第一捕获剂)包被到固相表面，最常用的是微孔板表面，但也可以是尼龙(或其它介质)滤膜表面、微珠表面，等等；该固相表面的作用是捕获样本中的特异性抗原，所以称为“捕获装置”。根据检测系统、检测目标和样本特点的不同，捕获装置上包被的抗体或者是一种，或者是多种混合在一起(用于同时检测多种抗原)。包被完成后，用过量的非特异性蛋白质(例如脱脂奶粉或小牛血清蛋白)或者非蛋白质封阻液(例如美国PIRECE公司的Protein Free Blocking Reagent)封阻固相表面上未结合的平面空间，然后再洗去未结合的封阻液。
(2)捕获抗原：加入待测生物样本，放置一定时间，例如1-2小时，让捕获装置上的抗体结合并“捕获”样本中的特异性抗原(分析物)，形成紧密结合的抗体-抗原复合体；然后洗去未与抗体结合的非特异性蛋白质和其他组成成分。这一过程的作用是富集抗原并去除样本中绝大部分非特异物质。
(3)标记抗原：用标记试剂标记抗原抗体复合物。由于生物素与亲和素(或其类似物例如链亲和素[Streptavidin])结合的高度特异性和高度亲和力，绝大多数情况下采用生物素作为标记分子，而用亲和素作为检测装置上的第二捕获剂(见下段)。例如，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，简称NHS)-生物素(NHS-Biotin)能够将生物素共价结合在蛋白质赖氨酸的伯胺基团(primaryamine)上。由于赖氨酸几乎普遍存在于所有蛋白质中，因此NHS-生物素能够标记几乎所有的蛋白质。同时，复合物中抗原和抗体的紧密结合使抗原分子上的特异结合位点(特异性抗原决定簇)受到保护而不被NHS-生物素修饰，仍然保持对该抗体的结合能力。因此，当抗体-抗原复合物解离分开后，该抗原分子能够和检测抗体结合形成新的复合物。除了NHS，也可以用能够共价连接蛋白质其它基团(如巯基、羧基或羟基)的活性分子将生物素标记到抗原上。如果由于某种原因生物素不能作为标记分子，也可以用某种半抗原或者小肽分子等作为标记分子，同时相应地用针对该标记分子的抗体作为第二捕获剂。
(4)洗脱抗原：用含有过量伯胺基团的溶液(例如Tris-盐酸缓冲液或Tris-甘氨酸缓冲液)淬灭并洗去游离的NHS-生物素。如果标记试剂采用NHS之外的其它活化基团，则将根据具体情况采用相应的溶液淬灭并洗去未反应的标记试剂，例如，如果标记试剂是吲哚乙酰-LC-生物素，则加入过量的半胱氨酸淬灭之。然后加入抗原洗脱液，让标记过的抗原蛋白质从抗体-抗原复合物上离解出来。抗原洗脱液含有破坏分析物和第一捕获剂结合的成分，对于抗体-抗原复合物，可以采用低pH溶液，例如0.1M柠檬酸(pH2.8)，或者使用目前市场销售的抗原洗脱液(例如美国PIERCE公司的ImmunoPure洗脱液)；也可以采用高pH溶液，例如0.1M三乙胺(Triethylamine)，将捕获装置上的蛋白质洗脱下来进入液相。然后将含有抗原蛋白质的洗脱液移出，加入适当的中和缓冲液(含有非特异性蛋白质如脱脂奶粉等)中和。或者在移出抗原洗脱液将之前直接将中和缓冲液加入到捕获装置上。加入中和缓冲液的目的是使pH值回复到接近中性，并在一定程度上降低离子强度，使直不再影响下一步在检测装置上第二捕获剂和抗原蛋白质上的标记分子的结合。
(5)再次捕获抗原：将中和后的洗脱液立即加入到“检测装置”。检测装置通常由微孔板制备，但是也可以由滤膜、玻璃或塑料平面薄片、微珠(磁球)等固体表面承载。检测装置固相表面包被有第二捕获剂，并且已经经过非特异性蛋白质的封阻。本例中采用链亲和素(或亲和素)作为第二捕获剂。亲和素和生物素之间的高度亲和力保证了迅速有效地捕获携带有标记分子生物素的抗原以及非特异蛋白质。检测装置上亲和素的包被和封阻应该提前进行，以便当上述第“4”步骤完成，也就是被标记的抗原从捕获装置上洗脱下来后，能够立即转移至检测装置。
(6)加入检测试剂，例如检测抗体：在检测装置上，抗原通过其携带的标记分子(生物素)和亲和素结合而被捕获于固相，从而将特异结合位点(抗原决定蔟)翻转暴露在外。洗去未结合的非特异蛋白质后，加入检测抗体(特异检测物)。检测抗体由捕获抗体(第一捕获剂)连接报道分子制作而成，能够识别并结合抗原上的特异结合位点。如果捕获装置上的捕获剂不是抗体而是其他类型分子，则特异检测物是同样的分子连接报道分子而成。
(7)读测信号：洗去未结合的检测抗体后，加入使检测抗体上报道分子显示信号的试剂。根据报道分子的性质，信号产生及其检测方法包括但不限于以下几种：(a)酶(例如HRP、AP等)直接作为报道分子：加入该酶的底物，使之产生颜色、荧光或发光等信号，即可通过读测信号强度鉴定酶的活性。(b)半抗原小分子化合物或小肽作为报道分子：这类报道分子的作用是提供了特异性抗原决定蔟，可以加入针对该半抗原或小肽的抗体(次级抗体)，，次级抗体上携带次级标记信号，例如，酶、荧光染料分子等，再加入相应的酶底物或直接读测荧光强度以鉴定活性。(c)荧光基团作为报道分子，通过直接测读或扫描荧光强度来确定信号强度；或者利用一些荧光基团的半抗原特性，加入针对荧光基团的酶标抗体，按照上述方法检测酶的活性。(d)寡聚核苷酸作为报道分子，将该寡聚核苷酸洗脱后作为底物进行实时PCR反应以检测其含量；用寡聚核苷酸作为报道分子进行免疫-PCR，不仅可以提高检测灵敏度，而且能够进行多重性同时检测样本中的若干种抗原。
本发明所公开的ALIRA检测方法各步骤中涉及到的具体操作技术，例如用捕获剂包被微孔板的技术、捕获剂和分析物结合的技术、用NHS-生物素等标记分子标记蛋白质的技术、将报道分子连接到检测抗体的技术、显示并测定报道分子信号强度的技术等，是本领域技术人员所熟知的。
很显然，本发明公开的“分析物标记及倒置再捕获法”定量检测分析物的方法，只需要单一特异性捕获剂就能定量检测一种分析物，能够应用在疾病临床诊断、疾病生物标记(biomarkers)鉴定分析、分子生物学和细胞生物学研究分析、蛋白质组学研究分析、新药靶位鉴定分析、临床药物动力学和药效学分析等各个领域。根据这一方法的原理，能够开发、生产、调配和包装各种检测产品，包括完整试剂盒和试剂盒的组成部分，例如捕获装置、检测装置、各种相关试剂，等等。
本发明与现有技术相比其有益效果是：
提供了一种新的只需要单一特异性捕获剂就能定量检测特异性分析物的工艺流程。这种新流程在关键步骤上不同于传统的夹心法ELISA和SALRA方法。见图1。
1、和传统夹心法ELISA的比较：
和目前国内外广泛应用的夹心法ELISA方法相比，本发明所提出的ALIRA检测方法的主要优点如下：
(1)ALIRA方法的最重要优点是，只需使用一种特异性捕获剂就能定量检测分析物，也就是说，只要一种抗体就能检测一种抗原蛋白质，而夹心法ELISA需要两种互相配对的抗体。显而易见，获得一个高度特异性高度亲和力单克隆抗体比获得两个高度特异性高度亲和力并且互相配对的单克隆抗体要容易得多。对于很多蛋白质来说，由于这样或那样的原因，获得ELISA配对抗体非常困难。因此，对于那些目前没有配对抗体进行夹心法ELISA检测的抗原蛋白质，只要存在一种特异性强亲和力高的抗体，就能够利用ALIRA方法迅速建立起检测方法。这特别适用于检测只拥有一个或几个相邻很近抗原决定簇的蛋白质分子或分子结构域，比如分子量很小的蛋白质、抗原决定簇互相距离靠的很近的蛋白质、蛋白质的磷酸化状态、蛋白质的重要功能域及其活化状态，等等。和SALRA方法一样，ALIRA方法为那些在临床应用和基础研究中非常重要但是至今尚无理想检测手段的各类蛋白质提供了简便快捷的定量检测途径。这不仅仅大大缩短了建立检测方法的时间，而且为检测领域提供了新思路：技术人员不必再花大量人力物力和时间去进行抗体间的配对试验，可以把精力集中在筛选高特异性、高亲和力、包被性能好的单一抗体。由于只需要一种抗体就能够进行检测，因此ALIRA方法的适用范围非常广泛，将有力促进疾病诊断、新药研制、分子生物学和细胞生物学研究、蛋白质组学研究应用、食品及农产品卫生检查和化合物残留检测、环境保护等等各个领域的工作。
(2)ALIRA的原理和方法既适用于利用抗体来检测样本中抗原的存在，也适用于利用非抗体-抗原关系的蛋白质-蛋白质之间或者蛋白质和其它分子之间的互作关系，来检测某一蛋白质因子。这些互作和结合对于揭示生命奥秘、研究细胞过程、诊断疾病进程，研制新型药物都非常重要。例如，为了鉴定生物样本中某个蛋白质因子X的含量，可以用能够和蛋白质X结合的另一种蛋白质Y作为第一捕获剂包被在捕获装置的固相表面，采用ALIRA的原理，加入待测样本，形成蛋白质X-蛋白质Y复合物；然后用生物素标记复合物，洗脱后，由检测装置上的亲和素捕获携带生物素的蛋白质X，然后加入酶标的蛋白质Y，即可对蛋白质X进行定量检测。除了蛋白质，还可以用其他物质作为捕获剂，比如肽、核酸、多糖、脂类、半抗原小分子，等等，来检测与其特异性结合的各类分析物，例如蛋白质、肽、核酸适体(aptamer)，等等。
(3)检测特异性强、灵敏度高。ALIRA方法有两个步骤确保检测的特异性和降低检测噪音：第一，捕获装置只捕获样本中的特异性分析物。进行标记时，绝大多数非特异性物质已经被洗去，分析物被高度富集。第二，在检测装置上，标记有报道分子的检测抗体与被重新捕获的分析物的特异结合位点结合而显示信号。由于只需要一种特异捕获剂就能够进行检测，在选择抗体作为捕获剂时，不必受限于两个抗体是否配对的考虑，可以侧重选用那些特异性高、亲和力高、包被性能好的抗体，从而提高检测特异性和灵敏度。此外，由于捕获装置和检测装置是分开的，可以把来自捕获装置的分析物适当浓缩后加入到检测装置，从而放大检测信号。例如，可以采用面积比较大的或者表面粗糙的微孔作为捕获装置的载体，增加捕获固相的表面积，同时缩小检测装置的平面面积，以提高检测装置上分析物的浓度。
2、与SALRA方法比较：
本发明所提出的ALIRA检测方法和先前描述的SALRA方法一样，都只需要一种特异性捕获剂就能定量检测相应的分析物，但如图1所示，二者在以下几个关键步骤有所不同。
(1)最主要的区别是检测装置上对被标记的分析物的再捕获机制不同。在SALRA方法中，检测装置上的捕获剂和捕获装置上的捕获剂是同一种分子(通常是同一抗体)或具备同一种捕获机制，二者对分析物的捕获是通过结合分析物上的同一个位点(特异结合位点)而实现；而在本发明所描述的ALIRA方法中，检测装置上的捕获剂(即第二捕获剂)完全不同于捕获装置上的捕获剂(即第一捕获剂)。这里，第二捕获剂是通过识别并结合分析物上的标记分子而达到将分析物结合到固相的目的(即倒置捕获)。这一差别造成了检测流程的其它步骤也有相应的差异(见下)。
(2)SALRA方法中，用来标记捕获装置上分析物-捕获剂复合物的标记分子起到的是报道分子的作用，该标记分子要么本身就是信号分子(例如荧光素)，要么直接介导参与信号的产生(例如生物素-酶标亲和素信号系统)。而在ALIRA方法中，对分析物进行标记，是为了提供能够被检测装置上第二捕获剂结合的位点，标记分子不再用作报道分子，因此不必拥有直接或介导产生检测信号的功能。ALIRA方法的信号报道机制由下一步骤的特异检测物完成。
(3)SALRA方法中，分析物和检测装置上捕获剂结合后，其携带的报道分子直接介导检测信号的产生，任何标记了报道分子的非特异性结合物都会产生噪音信号。由于标记了报道分子的非特异物质可能包括捕获装置中的捕获剂、封阻蛋白质或者待测样本中的某些非特异组分，成分复杂，并且都有曾经与捕获装置非特异结合的历史，因此在检测装置上再次被非特异结合的可能性比较大。一旦结合，因为SALRA方法没有进一步识别分析物的后续步骤，这些非特异物质上携带的报道分子就会直接产生检测噪音。而在ALIRA方法中，检测装置上第二捕获剂对分析物的再捕获是针对标记分子而不是分析物本身。如果用生物素作为标记分子，亲和素作为第二捕获剂，二者的高度亲和力保证了最大限度地将样本中的分析物捕获，然后再加入检测抗体，识别并结合曾经在捕获装置上被第一捕获剂结合的特异结合位点，再由检测抗体上携带的报道分子产生检测信号。虽然任何携带标记分子的非特异物质都会被捕获到检测装置上，但由于检测抗体只识别分析物的特异结合位点，不识别非特异物质，因此基本上不产生检测噪音。换句话说，ALIRA方法拥有最后的“安全检查”机制，从而降低来自于非特异性物质的本底噪音。因此ALIRA方法在灵敏度和特异性两方面都比SALRA方法要高。尤其适合检测那些分析物含量低、非特异性成分复杂的生物样本。
(4)SALRA方法中，特异性捕获剂的作用是包被捕获装置和检测装置。而在SALIRA方法中，特异性捕获剂一方面作为第一捕获剂用于包被捕获装置，不要进行标记；另一方面是用作特异检测物(检测抗体)，则需要标记有报道分子。检测抗体的标记可以预先制备。
(5)SALRA方法中，检测装置对于分析物的再捕获是基于对分析物本身的特异性结合而实现的，因此在进行多重性检测时，将多种捕获抗体混合后包被捕获装置，而在检测装置上捕获抗体单独包被，不同抗体的特定地理位置决定了相应的不同分析物再次被捕获的地理位置，因此可以用荧光分子作为报道分子，在蛋白质芯片等微阵排列上直接进行多重性检测多种分析物。而在ALIRA方法中，检测装置对于分析物的再捕获是基于对标记物的结合而实现，由于标记分子是相同的，因此无法在检测装置上将不同的分析物固相结合在不同的地理位置。总的来说，SALRA方法可以用于单一检测，也可以用于多重性检测，包括采用蛋白质芯片等微阵排列作为承载表面的多重性检测；而SALIRA更适合于对一种分析物进行单一检测。不过，ALIRA方法也可以用于进行多重性检测多种分析物，其原理和步骤是：事先采用不同的报道分子标记不同的特异检测物，将针对不同分析物的第一捕获剂混合后包被捕获装置；加入待测样本，将相应的分析物捕获于固相；用标记分子标记分析物并洗脱之，加入到检测装置，然后将标有不同报道分子的特异检测物混合后加入，经过请洗，然后根据报道分子的性质，显示并读测信号。如果报道分子是荧光化合物，可以根据不同荧光化合物的激发光和发射光波长特点，分别进行读测；如果报道分子是不同的酶，可以将特异检测物洗脱，中和后，分成若干份，分别加入到含有不同酶底物的微孔中，然后检测酶的反应信号；如果报道分子是寡聚核苷酸，可以用洗脱液(例如0.1M三乙胺)洗脱特异检测物，中和后，用针对不同寡聚核苷酸的PCR前导物对(primer pairs)，进行实时PCR，然后根据样本和标准浓度的CT值计算分析物的浓度。
附图说明
图1是本发明方法的流程示意图及与ELISA和SALRA方法的对比图；
图2是实施例1的检测结果图。
图3是实施例2的检测结果图。
具体实施方式
以下结合图1中SALIRA方法的步骤来进一步阐述本发明方法。
实施例1：用HRP作为报道分子检测人p53蛋白质
在本实施例子中，待测抗原蛋白质为具有肿瘤抑制功能、促进细胞凋亡的人体p53蛋白质，捕获装置和检测装置都是96-孔微量板。捕获装置的微孔包被抗p53单克隆抗体，检测装置包被链亲和素。检测抗体是标记有荧光素的同一种抗p53单克隆抗体，这里报道分子是荧光素。
(1)捕获抗原蛋白质：
a、包被捕获抗体：取两个96-孔微量板(平底，对蛋白质高度结合)，一个作为捕获装置用来捕获待样本中的抗原，微孔内加入100μl浓度为2μg/ml(稀释于包被缓冲液，0.05M碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)的抗p53单克隆抗体(美国CalBiochem公司)，加入两个纵行共16个微孔。另一个微量板作为检测装置用来捕获并检测标记的抗原，微孔内加入100μl浓度为10μg/ml(稀释于PBS缓冲液)的链亲和素，加入两个纵行共16个微孔。将微量板置于4度过夜。
b、封阻非特异性结合位点：移去捕获装置和检测装置微孔中的抗体溶液，用PBS+0.05％Tween 20(PBST)清洗1次。移去PBST，加入380μl的2％脱脂奶粉(溶于PBS)，在室温下进行封阻。捕获装置的封阻时间为1小时；检测装置的封阻为2小时。
c、捕获抗原蛋白质：移去封阻液，在微孔中加入100μl经过系列稀释的不同浓度的提纯重组人p53蛋白质(从美国BD Biosciences Pharmingen公司购买，以Baculovirus为载体在昆虫细胞中重组表达；稀释于PBS+1％脱脂奶粉)。室温下1.5小时。
(2)标记抗原蛋白质：
清空微孔，用PBST清洗2次，PBS清洗1次。每一微孔加入100μl 0.02％NHS-生物素(溶于PBS)，室温保持30分钟。移去NHS-生物素，加入380μl 10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，淬灭并清洗残余的NHS-生物素，室温保持5分钟。用水清洗1次。
(3)洗脱抗原：
对准微孔中部，加入20μl抗原洗脱液(使用美国PIERCE公司的ImmunoPureElution Buffer)，室温保持15分钟(将微量板盖上以保持湿度)。与此同时，移去检测装置微孔中的封阻溶液，加入80μl PBS+1％脱脂奶粉。
(4)抗原再捕获：
将从捕获装置微孔中洗脱的抗原(约20μl)转移至检测装置上，适当摇震混匀，室温保持1小时。由于检测装置微孔已经含有80μl PBS+1％脱脂奶粉，抗原洗脱液被中和并稀释5倍，不会影响生物素(标记分子)和检测装置上链亲和素(第二捕获剂)的结合。
(5)检测：
a、加入检测抗体：移去未结合物质，用PBST清洗2次，PBS清洗1次。加入100μl经过荧光素标记的同一克隆的抗p53单克隆抗体(美国CalBiochem公司；用PBS+1％脱脂奶粉稀释至0.5μg/ml)，室温保持1小时。
b、显示信号：移去未结合物质，用PBST清洗3次。加入100μl辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体(美国Invitrogen公司，用PBS+1％脱脂奶粉稀释至0.5μg/ml)，室温保持1小时。用PBST清洗4次。加入100μl过氧化物酶底物溶液(美国KPL公司SureBlue Reserve HRP底物反应液，TMB为底物)，37度20分钟。加入50μl 2M硫酸，读测450nm波长光吸收。
c、检测结果：图2显示实施例1的检测结果。供试的p53信号强度和浓度之间从100ng/ml到1ng/ml都展现很好的线性关系，证明ALIRA方法能够在这一浓度范围检测该蛋白质，灵敏度(空白对照平均值加三个标准差)达到0.6ng/ml。
实施例2：用寡聚核苷酸作为报道分子检测人C-反应蛋白质
在本实施例子中，待测抗原蛋白质为在免疫反应中起重要作用的人体C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，捕获装置和检测装置都是96-孔微量板。捕获装置的微孔包被抗CRP单克隆抗体，检测装置包被链亲和素。检测抗体是标记有寡聚核苷酸(60碱基长)的同一种抗CRP单克隆抗体，这里报道分子是寡聚核苷酸。
(1)捕获抗原蛋白质：
a、包被捕获抗体：取两个96-孔微量板(平底，对蛋白质高度结合)，一个作为捕获装置用来捕获待样本中的抗原，微孔内加入100μl浓度为2μg/ml(稀释于包被缓冲液，0.05M碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)的抗CRP单克隆抗体(美国R&D Systems公司)，加入两个纵行共16个微孔。另一个微量板作为检测装置用来捕获并检测标记的抗原，微孔内加入100μl浓度为10μg/ml(稀释于PBS缓冲液)的链亲和素，加入两个纵行共16个微孔。将微量板置于4度过夜。
b、封阻非特异性结合位点：同实施例1。
c、捕获抗原蛋白质：移去封阻液，在微孔中加入100μl经过系列稀释的不同浓度的提纯重组人CRP蛋白质(从美国BioCheck公获得；稀释于PBS+1％脱脂奶粉)。室温下1.5小时。
(2)标记抗原蛋白质：
同实施例1。
(3)洗脱抗原：
对准微孔中部，加入20μl抗原洗脱液(0.1M三乙胺)，室温保持15分钟(将微量板盖上以保持湿度)。加入80μl含有1％脱脂奶粉和0.1M Tris-HCl(pH8.0)的RBST。与此同时，移去检测装置微孔中的封阻溶液，。
(4)抗原再捕获：
将从捕获装置微孔中洗脱并中和的抗原(约100μl)转移至检测装置上，适当摇震混匀，室温保持1小时。由于抗原洗脱液已经被中和并稀释5倍，不会影响生物素(标记分子)和检测装置上链亲和素(第二捕获剂)的结合。
(5)检测：
a、加入检测抗体：移去未结合物质，用PBST清洗2次，PBS清洗1次。加入100μl经过寡聚核苷酸标记的同一克隆的抗CRP单克隆抗体(美国R&DSystems公司；用PBS+1％脱脂奶粉稀释至0.5μg/ml)，室温保持30分钟。
b、洗脱报道分子：移去未结合物质，用PBST清洗6次。加入100μl的0.1M三乙胺，室温保持20分钟。加入50μl的1M Tris-HCl(pH8.0)，混合后，取5μl作为底物进行实时PCR反应。
c、显示信号：用美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)ABI7000实时PCR定量检测报道分子。PCR反应条件为：55度2分钟，95度10分钟，接着为40反应周期的95度15秒钟和60度1分钟。反应引物：1mM；荧光标记物：FAM；信号产生方法：TaqMan方法；反应体积：40μl。
d、检测结果：图3显示实施例2的检测结果。供试的CRP信号强度和浓度之间从500ng/ml到2ng/ml都展现很好的线性关系，证明ALIRA方法能够在这一浓度范围检测CRP蛋白质。本实验的检测灵敏度(空白对照平均值加三个标准差)为0.45ng/ml。
Claims (15)
1、一种用单一特异性捕获剂定量检测分析物的方法，其特征在于：
(1)捕获分析物：将特异性捕获剂包被到固相表面，成为捕获装置；加入待测生物样本，使捕获装置上的特异性捕获剂与样本中的分析物结合，形成捕获剂-分析物复合物；
(2)标记复合物：用标记试剂标记捕获剂-分析物复合物；
(3)洗脱分析物：将经过标记的分析物从复合物上洗脱下来；
(4)再捕获：将洗脱的分析物中和后加入检测装置，由检测装置上的第二捕获剂通过与标记分子的结合而再次将分析物捕获。所说的检测装置是指包被了第二捕获剂的固相表面；
(5)检测：加入特异检测剂，和分析物特异性结合，通过检测特异检测剂上携带的报道分子产生的信号强度来确定分析物浓度。
2、根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：其中所说的特异捕获剂是抗体、抗体片段、非抗体类蛋白质、肽、寡聚核苷酸或小分子化合物。
3、根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：其中所说的第二捕获剂是能够与所说的标记分子结合的物质，包括但不限于亲和素或链亲和素、抗体、或其他蛋白质。
4、根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：其中所说的特异检测剂是标有报道分子的特异捕获剂；特异检测剂和特异捕获剂与分析物的同一个位点结合，二者的不同是前者携带报道分子而后者不携带报道分子。
5、根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：其中所说的分析物是能与所说的捕获剂特异性结合的抗原蛋白质、抗体、肽、寡聚核苷酸适体、其他生物大分子及其复合物、小分子以及亚细胞结构。
6、根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所说的标记试剂是能够将标记分子标记到分析物上的试剂；所说的标记分子是最好是生物素；其他可以作为标记分子的化合物包括：各类半抗原小分子、肽、或寡聚核苷酸。
7、根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：其中所说的报道分子是荧光分子、生物素、半抗原小分子、酶、或寡聚核苷酸。
8、根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，其中所说的捕获装置的固相表面是试管、微量板、滤膜、可以结合蛋白质测试纸或微珠；所说的检测装置的固相表面为微量板、滤膜、测试纸、微珠、玻璃或塑料薄片载体。
9、权利要求1所述的定量检测方法，在临床检测诊断、生物标记鉴定分析、分子生物学和细胞生物学研究、蛋白质组学研究分析、新药靶位鉴定分析、临床药物动力学和药效学分析领域的应用。
10、一种用于权利要求1所说的用单一特异性捕获剂定量检测分析物的方法的试剂盒，其特征在于，包括捕获装置、检测装置，标记试剂、分析物中和液与洗脱液、标记有报道分子的特异检测剂、使报道分子显示信号的试剂、分析物标准样品、用法说明等。
11、根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所说的捕获装置是包被着特异性单克隆抗体的96-孔微量板；所说的检测装置是包被着链亲和素的96-孔微量板；所说的标记试剂是能够将生物素连接到分析物上的试剂，例如NHS-生物素；所说的标记有报道分子的特异检测剂是由用于包被捕获装置的特异性单克隆抗体连接上报道分子而产生。
12、根据权利要求10和11所述的试剂盒，其特征在于，所说的报道分子标记的特异检测剂是用辣根过氧化物酶标记的特异性单克隆抗体，所说的使报道分子显示信号的试剂包括但不限于辣根过氧化物酶底物和反应终止溶液。
13、根据权利要求10和11所述的试剂盒，其特征在于，所说的报道分子标记的特异检测剂是用一种半抗原小分子或肽标记的特异性单克隆抗体；所说的使报道分子显示信号的试剂包括但不限于能够与所说的半抗原小分子或肽特异性结合的酶联二级抗体、酶的底物、反应终止溶液等。。
14、根据权利要求10和11所述的试剂盒，其特征在于，所说的报道分子标记的特异检测剂是用寡聚核苷酸标记的特异性单克隆抗体。
15、根据权利要求10和11所述的试剂盒，其特征在于，所说的报道分子标记的特异检测剂是用荧光化合物标记的特异性单克隆抗体。
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Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102933968A (zh) * | 2010-04-29 | 2013-02-13 | 三星电子株式会社 | 离心微流体装置和用于免疫测定的方法 |
| CN103649753A (zh) * | 2011-06-30 | 2014-03-19 | 皇家飞利浦有限公司 | 用于具有低非特异性结合的亲和测定的磁性颗粒上的分子结构 |
| CN105223349A (zh) * | 2014-07-01 | 2016-01-06 | 艾博生物医药(杭州)有限公司 | 一种检测样本的装置 |
| CN105486855A (zh) * | 2015-11-26 | 2016-04-13 | 北京大学第一医院 | 改良间接酶联免疫吸附法 |
| CN105784990A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-07-20 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条 |
| CN106226522A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-12-14 | 福建广生堂药业股份有限公司 | 一种高尔基体蛋白73的检测方法、检测试剂和检测试剂盒 |
| CN106226523A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-12-14 | 福建广生堂药业股份有限公司 | 一种免疫标志物的检测方法、试剂和检测试剂盒 |
| CN108333358A (zh) * | 2017-01-19 | 2018-07-27 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 一种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法 |
| CN108369235A (zh) * | 2015-12-18 | 2018-08-03 | 丹麦科达有限公司 | 生色过氧化物酶底物 |
| CN108732145A (zh) * | 2017-04-13 | 2018-11-02 | 希森美康株式会社 | 受检物质的信息获取方法 |
| CN109791149A (zh) * | 2016-09-30 | 2019-05-21 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于功能分析多特异性分子的基于spr的双重结合测定法 |
| CN109863400A (zh) * | 2016-10-24 | 2019-06-07 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 固定化分析物 |
| CN110114667A (zh) * | 2016-12-23 | 2019-08-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于在分析系统中的过程期间标识试剂的方法 |
| CN112218720A (zh) * | 2017-06-12 | 2021-01-12 | Essenlix公司 | 均相测定 |
| CN113406045A (zh) * | 2020-03-16 | 2021-09-17 | 广州创瑞健康科技有限公司 | 一种疟原虫检测的荧光染色方法 |
| CN113474657A (zh) * | 2019-02-21 | 2021-10-01 | 丁勤学 | 使用微粒去除非特异性结合信号的方法 |
| US12203905B2 (en) | 2016-12-23 | 2025-01-21 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method for identifying a reagent during a process in an analysis system |
-
2007
- 2007-08-02 CN CNA2007100255710A patent/CN101358969A/zh active Pending
Cited By (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102933968A (zh) * | 2010-04-29 | 2013-02-13 | 三星电子株式会社 | 离心微流体装置和用于免疫测定的方法 |
| CN103649753A (zh) * | 2011-06-30 | 2014-03-19 | 皇家飞利浦有限公司 | 用于具有低非特异性结合的亲和测定的磁性颗粒上的分子结构 |
| CN103649753B (zh) * | 2011-06-30 | 2016-05-04 | 皇家飞利浦有限公司 | 用于具有低非特异性结合的亲和测定的磁性颗粒上的分子结构 |
| CN105223349A (zh) * | 2014-07-01 | 2016-01-06 | 艾博生物医药(杭州)有限公司 | 一种检测样本的装置 |
| CN105486855A (zh) * | 2015-11-26 | 2016-04-13 | 北京大学第一医院 | 改良间接酶联免疫吸附法 |
| CN108369235B (zh) * | 2015-12-18 | 2021-11-26 | 丹麦科达有限公司 | 生色过氧化物酶底物 |
| US12391981B2 (en) | 2015-12-18 | 2025-08-19 | Agilent Technologies, Inc. | Chromogenic peroxidase substrates |
| US11993810B2 (en) | 2015-12-18 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Chromogenic peroxidase substrates |
| CN108369235A (zh) * | 2015-12-18 | 2018-08-03 | 丹麦科达有限公司 | 生色过氧化物酶底物 |
| US11466314B2 (en) | 2015-12-18 | 2022-10-11 | Agilent Technologies, Inc. | Chromogenic peroxidase substrates |
| CN105784990A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-07-20 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条 |
| CN105784990B (zh) * | 2016-05-17 | 2018-06-01 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条 |
| CN106226523A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-12-14 | 福建广生堂药业股份有限公司 | 一种免疫标志物的检测方法、试剂和检测试剂盒 |
| CN106226522A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-12-14 | 福建广生堂药业股份有限公司 | 一种高尔基体蛋白73的检测方法、检测试剂和检测试剂盒 |
| CN109791149A (zh) * | 2016-09-30 | 2019-05-21 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于功能分析多特异性分子的基于spr的双重结合测定法 |
| US11585811B2 (en) | 2016-10-24 | 2023-02-21 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Immobilized analytes |
| CN109863400B (zh) * | 2016-10-24 | 2022-06-24 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 固定化分析物 |
| CN109863400A (zh) * | 2016-10-24 | 2019-06-07 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 固定化分析物 |
| US12031962B2 (en) | 2016-12-23 | 2024-07-09 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method for identifying a reagent during a process in an analysis system |
| US12203905B2 (en) | 2016-12-23 | 2025-01-21 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method for identifying a reagent during a process in an analysis system |
| CN110114667A (zh) * | 2016-12-23 | 2019-08-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于在分析系统中的过程期间标识试剂的方法 |
| CN108333358A (zh) * | 2017-01-19 | 2018-07-27 | 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 | 一种免疫亲和纯化洗脱液的筛选方法 |
| CN108732145B (zh) * | 2017-04-13 | 2021-09-17 | 希森美康株式会社 | 受检物质的信息获取方法 |
| CN108732145A (zh) * | 2017-04-13 | 2018-11-02 | 希森美康株式会社 | 受检物质的信息获取方法 |
| CN112218720A (zh) * | 2017-06-12 | 2021-01-12 | Essenlix公司 | 均相测定 |
| US12181472B2 (en) | 2017-06-12 | 2024-12-31 | Essenlix Corporation | Homogeneous assay |
| CN113474657A (zh) * | 2019-02-21 | 2021-10-01 | 丁勤学 | 使用微粒去除非特异性结合信号的方法 |
| CN113406045A (zh) * | 2020-03-16 | 2021-09-17 | 广州创瑞健康科技有限公司 | 一种疟原虫检测的荧光染色方法 |
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