CN101173002B - 植物耐逆性相关转录因子GmWRKY54及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆相关蛋白及其编码基因与应用。本发明中的应用提供的是一种培育耐逆植物的方法，是将耐逆相关蛋白GmWRKY54的编码基因导入植物细胞中，得到对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因植物品种；所述耐逆相关蛋白GmWRKY54的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

Description

植物耐逆性相关转录因子GmWRKY54及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用，特别是来源于大豆的耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB等等。

WRKY类转录因子是植物转录因子中的一个大家族，仅拟南芥就含有100多种WRKY成员，所有成员均含有一个或两个WRKY结构域，可与启动子中的W-box结合。WRKY家族参与植物多种生物学功能，例如对病原菌的防卫、植物衰亡、形态发生以及对非生物胁迫的应答等。W-box存在于许多与植物防御反应相关的基因启动子中，介导了病原物来源的激发子诱导的转录反应。病毒、细菌和真菌激发子的侵染以及信号物质如水杨酸的处理，也能够诱发WRKY转录因子的mRNA和蛋白质的合成，而且也能增强它与DNA的结合活性。W-box和WRKY转录因子联合调控其下游基因产物从而起到保护和防卫的作用。人们相继从不同植物中克隆得到在逆境下起作用的WRKY转录因子有：拟南芥AtWRKYs、烟草NtWRKYs以及马铃薯StWRKY。尚未克隆大豆中与非生物胁迫相关的该类转录因子。

大豆是重要的油料作物，是植物蛋白质的主要来源，阐明其耐逆机理，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的耐逆性相关蛋白，名称为GmWRKY54，来源于大豆，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。

序列表中的序列2由323个氨基酸残基组成，是大豆中的WRKY类转录因子。自序列2的氨基末端第172-178位氨基酸残基是保守的WRKYGQK结构，自序列2的氨基末端第192-197位氨基酸残基为一个锌指结构。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述结构域外进行取代和/或缺失和/或添加。

所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对干旱和/或盐胁迫的耐逆性。

为了使(a)中的GmWRKY54便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的GmWRKY54可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的GmWRKY54的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至972位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述植物耐逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由972个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第1至972位脱氧核糖核苷酸为GmWRKY54的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第1至3位脱氧核糖核苷酸为GmWRKY54的起始密码子ATG，自5’端的第970至972位脱氧核糖核苷酸为GmWRKY54的终止密码子TAG。GmWRKY54的表达受干旱、盐和低温胁迫的诱导。

含有GmWRKY54基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有GmWRKY54基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmWRKY54构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在pBin438的BamHI和KpnI位点间插入自序列表中序列1的自5’末端的第1-972位脱氧核苷酸得到的pBin438-GmWRKY54。本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有GmWRKY54基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的大豆WRKY家族转录因子GmWRKY54的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：大豆、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

实验证明，本发明的耐逆性相关蛋白及其编码基因能显著提高植物的耐盐性和耐旱性。本发明的耐逆性相关蛋白及其编码基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为Northern分析GmWRKY54在干旱、盐和低温胁迫处理下的表达特征

图2为植物表达载体pBin438-GmWRKY54的物理图谱

图3为Northern杂交检测GmWRKY54基因在转GmWRKY54基因植株中的表达量

图4为转空载体对照植株和转GmWRKY54基因植株在盐胁迫下的生长比较照片

图5为转空载体对照植株和转GmWRKY54基因植株在干旱胁迫下的生长比较照片

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、大豆耐逆性相关蛋白GmWRKY54编码基因的筛选及其cDNA克隆

在大豆EST数据库中进行BLAST检索，聚类到64个包括完整WRKY结构域的WRKY类基因片段。根据64个WRKY基因片段的序列设计64对引物，以常规方法从分别用250mM NaCl、干旱、-4℃处理及未处理的3周大豆科丰1号幼苗中提取总RNA，以RT-RCR方法测定64个基因的表达与胁迫处理的关系。筛选得到一种基因，其表达受干旱或盐胁迫诱导，略受低温诱导。

提取大豆科丰1号幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据上述检索获得的基因序列设计引物如下：

5’-ATCAGAATTCATGGAGAAGAAGGAGATGGC-3’

5’-GATGCTGCAGCTACTCTTCTTTCAACATGT-3’。

以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的GmWRKY54基因由972个脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列1的自5′末端第1至972位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。将含有序列表中序列1的自5′末端第1-972位脱氧核糖核苷酸的GmWRKY54基因的重组载体命名为pTE-GmWRKY54。

实施例2、逆境胁迫处理下大豆GmWRKY54基因的表达特征

将大豆科丰1号种子种在盆中，生长2个星期后取幼苗进行如下胁迫处理：1)盐胁迫处理：将大豆幼苗移入250mM NaCl溶液中；2)渗透胁迫处理：将大豆幼苗移入20％PEG溶液中；3)低温胁迫处理：将大豆幼苗移入4℃水溶液中。光照培养，分别在上述各种处理后0、0.5、1、3、6、12小时取样，收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀得到总RNA。以GmWRKY54 DNA为探针(序列表中的序列1)，进行Northern分析。

结果如图1所示，GmWRKY54基因的表达明显受干旱、250mM NaCl和低温(4℃)胁迫的诱导。

实施例3、用GmWRKY54基因培育耐盐和耐干旱胁迫植物

1)GmWRKY54表达载体pBin438-GmWRKY54的构建

以大豆科丰1号的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有BamHI和KpnI接头序列的特异引物PCR扩增GmWRKY54(序列表中的序列1)；然后BamHI和KpnI双酶切PCR产物，回收，将GmWRKY54正向插入植物双元表达载体pBin438(李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(B辑)，1994，24(3)：276-282.)的CaMV 35S启动子之后的BamHI和KpnI酶切位点之间，得到重组载体pBin438-GmWRKY54(图2)。

引物序列如下：

5’-ATC AGG ATC CAT GAC AGT AGA TCT GGT AGG-3’

5’-GAT GGG TAC CTG ACA GTA GAT CTG GTA GGT G-3’。

2)转GmWRKY54基因植株的获得和鉴定

将pBin438-GmWRKY54用电击法导入根癌农杆菌AGL1。PCR鉴定后，通过花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16：6，735-743)利用根癌农杆菌AGL1转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)，收获种子后，播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上，获得T₀代植株。待T₀代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长。

按照上述方法制备转pBin438的T₀代转空载体对照植株，获得10个转pBin438的T₀代转空载体对照植株，

提取野生型植株、T₀代转空载体对照植株、转GmWRKY54基因T₀代植株的总RNA进行RT-PCR鉴定分析，引物如下：

5’-ATC AGG ATC CAT GAC AGT AGA TCT GGT AGG-3’

5’-GAT GGGTAC CTG ACA GTA GAT CTG GTA GGTG-3’。

结果表明，在25株转GmWRKY54基因的T₀代植株中，有12株检测出GmWRKY54基因的表达，而10株野生型和10株转空载体的对照植株均没有检测出目的基因的表达。将分子鉴定阳性的植株单株收种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T₁代的分离情况，如此重复直至T₃代获得遗传稳定的转基因株系。共获得12个稳定遗传的转基因株系。

T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

选择稳定遗传的转基因株系中目的基因表达高的2个株系，进行Northern杂交验证。Northern杂交所用的探针为GmWRKY54基因(序列表中的序列1)，结果表明，该2株转GmWRKY54基因的T₀代植株54-19和54-24中，GmWRKY54基因有高表达，而空载体对照植株则未能检出表达(图3)。

3)转GmWRKY54基因植株耐逆性鉴定

<1>耐盐胁迫试验：

将2个转GmWRKY54基因株系(54-19和54-24)的遗传稳定的T₃代植株和转空载体对照植株的T₃代植株2周龄苗的根系分别移入150mM和180Mm NaCl溶液，处理2周后，再置于正常条件下恢复生长，观察表型并拍照同时进行存活率统计和基因表达量检测。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株均分别为15株。

图4中，A图为植株的表型照片，由左至右为转空载体对照植株、转GmWRKY54基因植株54-19、转GmWRKY54基因植株54-24，上图为正常条件下植株的表型、中图为150mM NaCl处理后植株的表型、下图为180mM NaCl处理后植株的表型。图4中，B图为植株的存活率比较，B图中的数据为三次重复实验的平均值±标准差。

从图4可见，在150mM NaCl处理时，移苗恢复生长的情况有明显差异。结果显示，转空载体对照植株的存活率为50％±11％，而转GmWRKY54基因植株均达83％±8％，其中54-19株系植株的存活率为85％±5％，54-24株系植株的存活率为81％±7％；在180mM NaCl处理时，两者差异更加明显，转空载体对照植株恢复生长后的存活率仅为25％±5％，大大低于转GmWRKY54基因植株的70％±14％的存活率，说明转GmWRKY54基因植株的耐盐性明显优于转空载体对照植株。

<2>耐干旱胁迫实验：

将2个转GmWRKY54基因株系(54-19和54-24)的T₃代植株和转空载体对照植株的T₃代植株的3周龄苗置于26-28℃、相对湿度为15-20％、连续光照下，18天不浇水，然后恢复浇水3天，观察表型并拍照同时进行存活率统计。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株均分别为15株。

图5中，A图为18天不浇水，恢复浇水3天后的植株表型照片，由左至右为转空载体对照植株、转GmWRKY54基因植株54-19和转GmWRKY54基因植株54-24。上图为正常条件下植株的表型，下图为干旱处理后植株的表型。图5中，B图为18天不浇水，恢复浇水3天后的植株存活率比较。

由图5可见，18天不浇水处理后，转空载体对照植株大部分萎蔫、死亡，而转GmWRKY54基因植株大部分能维持生长。结果显示，正常条件下植株的存活率均为100％；干旱处理后转空载体对照植株的存活率为31.3％±14％，54-19株系植株的存活率为72.9％±15％，54-24株系植株的存活率为85.4％±8％。在正常条件下生长的转GmWRKY54基因植株和对照植株之间没有明显差异，干旱条件下转空载体对照植株的存活率明显低于转GmWRKY54基因植株的存活率。

                                  序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>植物耐逆性相关转录因子GmWRKY54及其编码基因与应用

<130>CGGNARY71550

<160>2

<210>1

<211>972

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>1

atggagaaga aggagatgga tgtgaaaact gaggatgcgg ttgggtcctc ttctttccct     60

tgttataatt attcaaacct ttatccattc tcgaacgcgt ttgatttctc tgaggttgaa    120

aagagctctt tagggtttat ggagttactg ggtgtgcagg actatagtcc tctgcttgag    180

ttgcctcaac tttcaactgt gtccgtgcaa tctcatcatc actctacagt tacggttcct    240

tctgataacg ggaaagagtg ttctgaggtg ttgaaccacc agcctgccac tggaaactct    300

tcttccattt catccgcgtc cactgatgca gtcaatgatg aacagaagaa gactctagac    360

caagcagaag aagatgatga tgatgatgat gaaggacgac acaagactaa gaaacagttg    420

aagcccaaga agacaaatca gaagagacag agagaaccaa gattcgcgtt catgacgaaa    480

agcgaggtcg atcatctgga agatgggtac agatggagaa agtacggtca aaaggccgtg    540

aaaaatagcc cctttcccag gagctactat cgttgcacca gtgtttcatg taatgtgaag    600

aaacgtgtgg agagatcttt cactgatcca agcgttgtag tgacaaccta tgaaggccaa    660

cacacacatc ccagcccagt tatgcctcgc tcagttgtct cttctggata cgccaacaac    720

tttgcttcag ttttgccact aggaaactac ttatcccagt atcagcagca gcaccatcac    780

caccaacaac aaaagctact tgtcaacaca ttgtcctctt tgggttttcc ttacaatgat    840

tcttcatctc caaagaacgc tgtttttatt caagagagac ggctttgtag taatcaaggg    900

acgaatgcgt ttctgaggga ccatggactt cttcaagatg ttgttccttc acacatgttg    960

aaagaagagt ag                                                        972

<210>2

<211>323

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>2

Met Glu Lys Lys Glu Met Ala Val Lys Thr Glu Asp Ala Val Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Ser Phe Pro Cys Tyr Asn Tyr Ser Asn Leu Tyr Pro Phe Ser Asn

            20                  25                  30

Ala Phe Asp Phe Ser Glu Val Glu Lys Ser Ser Leu Gly Phe Met Glu

        35                  40                  45

Leu Leu Gly Val Gln Asp Tyr Ser Pro Leu Leu Glu Leu Pro Gln Leu

    50                  55                  60

Ser Thr Val Ser Val Gln Ser His His His Ser Thr Val Thr Val Pro

65                  70                  75                  80

Ser Asp Asn Gly Lys Glu Cys Ser Glu Val Leu Asn Met Gln Pro Ala

                85                  90                  95

Thr Pro Asn Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ala Ser Thr Asp Ala Val Asn

            100                 105                 110

Asp Glu Gln Lys Lys Thr Leu Asp Gln Ala Glu Glu Asp Asp Asp Asp

        115                 120                 125

Asp Asp Glu Gly Arg His Lys Thr Lys Lys Gln Leu Lys Pro Lys Lys

    130                 135                 140

Thr Asn Gln Lys Arg Gln Arg Glu Pro Arg Phe Ala Phe Met Thr Lys

145                 150                 155                 160

Ser Glu Val Asp His Leu Glu Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly

                165                 170                 175

Gln Lys Ala Val Lys Asn Ser Pro Phe Pro Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys

            180                 185                 190

Thr Ser Val Ser Cys Asn Val Lys Lys Arg Val Glu Arg Ser Phe Thr

        195                 200                 205

Asp Pro Ser Val Val Val Thr Thr Tyr Glu Gly Gln His Thr His Pro

    210                 215                 220

Ser Pro Val His Pro Arg Ser Val Val Ser Ser Gly Tyr Ala Asn Asn

225                 230                 235                 240

Phe Ala Ser Val Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Leu Ser Gln Tyr Gln Gln

                245                 250                 255

Gln His His His His Gln Gln Gln Lys Leu Leu Val Asn Thr Leu Ser

            260                 265                 270

Ser Leu Gly Phe Pro Tyr Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Asn Ala Val

        275                 280                 285

Phe Ile Gln Glu Arg Arg Leu Cys Ser Asn Gln Gly Thr Asn Ala Phe

    290                 295                 300

Leu Arg Asp His Gly Leu Leu Gln Asp Val Val Pro Ser His His Leu

305                 310                 315                 320

Lys Glu Glu

Claims (3)

1.一种培育耐逆植物的方法，是将耐逆相关蛋白GmWRKY54的编码基因导入植物细胞中，得到耐逆植物；所述耐逆相关蛋白GmWRKY54的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述耐逆植物是耐干旱和/或耐盐植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述耐逆相关蛋白GmWRKY54的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述耐逆相关蛋白GmWRKY54的编码基因是通过重组表达载体导入植物细胞中的。

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