CN101157918A - 建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种生物技术领域的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法。包括如下步骤：①将APP695基因克隆进pcDNA3.1(－)质粒；②将pcDNA3.1(－)－APP695用脂质体方法稳定转染进SH－EP1－α4β2细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；③稳定转染细胞克隆APP695 mRNA表达的鉴定；④稳定转染细胞克隆APP695和Aβ蛋白表达的鉴定；⑤稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体功能鉴定，用膜片钳鉴定稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体的功能。本发明获得稳定表达烟碱α4β2受体和Aβ的细胞株，建立神经元烟碱型乙酰胆碱α4β2亚型受体和Aβ共表达的细胞模型，是解决对于AD发病及治疗聚焦在烟碱受体亚型的疑难问题，它为此提供了有力工具。为预防和治疗AD的药物提供了有效的途径。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法。
背景技术
淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid protein precursor，APP)APP基因定主要以3种形式存在，分别为APP695、APP751和APP770，脑组织中主要是APP695。经过β和γ分泌酶水解剪切形成淀粉样蛋白(Aβ)。阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)的Aβ学说认为，病理状态下Aβ40及42产生增加形成寡聚体，进而形成斑块，对神经元产生多方面的毒性作用，表现为AD的一系列症状。神经元烟碱型乙酰胆碱受体广泛表达多种亚型，在中枢神经系统以α4β2亚型(由3个α亚单位和2个β亚单位组装成的五聚体)表达最为广泛。AD的Aβ学说认为，病理状态下Aβ40及42产生增加形成寡聚体，进而形成斑块，对神经元产生多方面的毒性作用，表现为AD的一系列症状。近年来关于烟碱型乙酰胆碱受体和AD的研究提示，神经元烟碱受体被认为是治疗AD药物开发的新靶点，但最为相关的受体亚型还并不清楚，针对受体亚型的药物开发也没有找到合适的筛选模型。
经对现有技术文献的检索发现，刘强在“阿尔茨海默病小鼠模型中尼古丁介导神经保护作用的信号通路机制”(Liu Q.，Zhang J.，Zhu H.，Qin C.，QinChuan.，Zhao B.1.(2007).Dissecting the signaling pathway ofnicotine-mediated neuroprotection in a mouse Alzheimer disease model.FASEB J.Research Communication：61-73.)一文中，在神经细胞发现烟碱受体激动会降低Aβ的表达，为了研究这种现象下所存在的细胞内机制，用RNA干扰技术在神经细胞进行受体亚型基因沉默，发现在亚型基因沉默后再进行烟碱受体激动，对Aβ降低作用消失。从而得出结论此种亚型受体和细胞内Aβ的水平有关，进而认为此种亚型受体在AD发病中起作用。这种用基因沉默研究烟碱受体亚型和Aβ的方法，只能得到比较浅表的此受体亚型和Aβ降低相关的结论，而不能进行深入的量化研究以及进而进行治疗和预防AD的相关化合物的筛选。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法。本发明采用脂质体转染的方法，实现了建立中枢神经系统神经元烟碱型乙酰胆碱α4β2受体亚型基因和Aβ基因共表达的细胞模型，对于观察α4β2受体激动剂对Aβ的影响，为阿尔茨海默病药物研究提供新的细胞筛选模型具有重大的实际意义。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下具体步骤：
①表达载体pcDNA3.1(-)-APP695的构建：将APP695基因克隆进pcDNA3.1(-)质粒；选择Xbal 1和Hindlll为进行双酶切的工具酶。
②稳定转染：将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法转染进SH-EP1-α4β2细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；然后用有限稀释法将细胞进行单克隆化
③稳定转染细胞克隆APP695 mRNA表达的鉴定：用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测APP695 mRNA表达；
④稳定转染细胞克隆APP695和Aβ蛋白表达的鉴定：用Western-blotting检测细胞克隆APP695和Aβ的表达；
a、检测细胞克隆APP695：
对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白；
用酶标仪测定蛋白浓度，上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜半干电转移，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。
b、检测Aβ：用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞；
BCA法测定蛋白浓度，上样进行Tris-tricine电泳，PVDF膜湿转，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。
⑤稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体功能鉴定：用膜片钳鉴定稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体的功能。
对Western-bloting挑选出的APP695表达较高的细胞克隆进行膜片钳实验，采取传统的全细胞记录技术；通过微操纵器移动快速给药装置的排管给药，测试和记录软件用Axon DigiData-1200A，结果分析用Axonscope 1.1.1软件。
本发明获得稳定表达烟碱α4β2受体和Aβ的细胞株，建立神经元烟碱型乙酰胆碱α4β2亚型受体和Aβ共表达的细胞模型，是解决国际上对于AD发病及治疗的研究聚焦在烟碱受体亚型的疑难问题，它为对烟碱受体亚型在AD发病作用的研究提供了有力工具。通过以此细胞模型为介导，可以研究烟碱受体亚型对于Aβ水平的影响，进而进行相关化合物的药物筛选。化合物(包括烟碱受体激动剂和拮抗剂)作用于细胞模型上烟碱受体亚型产生对Aβ的调节，为预防和治疗AD的药物提供了有效的途径。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一
将APP695基因和pcDNA3.1(-)进行Xbal 1和Hindlll双酶切，凝胶回收后用T4 DNA连接酶连接，转化至DH5α细菌，氨苄青霉素抗性筛选重组子pcDNA3.1(-)-APP695，扩增提取质粒，测序鉴定。将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法LipofectamineTM PLUS试剂转染进SH-EP1-α4β2细胞，转染3d后新霉素500g/L加压筛选，14d后细胞单克隆形成，有限稀释法将细胞进行单克隆化。
实施例二
稳定转染34d后收集单克隆细胞，用Trizol法按说明书步骤提取细胞总RNA。以总RAN为模板，APP695引物1和引物2进行PCR。
PCR程序具体为：94℃变性3min进入循环过程，94℃变性1.5min，55℃退火1.5min，72C延伸3min，循环31次后72℃复性10min。凝胶电泳鉴定PCR产物；然后用α4和β2基因引物进行PCR，α4引物为5’-CCATCGCTCAGCTCATTGACG-3’和5’-CTGGTCGGAGGGTGACTTGC-3’，β2引物为5’-TATTCCAATGCCGTGGTCTCC-3’和5’-TGGTCATCGTCCTCGCTC-3’，凝胶电泳鉴定PCR产物。
实施例三
对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白，用酶标仪测定蛋白浓度，取10μg上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用12％分离胶，5％积层胶，硝酸纤维素膜半干电转移，转膜时间2h，小鼠抗人APP695单抗孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照，检测细胞克隆APP695
用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度，取30.5μg上样进行Tris-tricine电泳，用16.5％分离胶，10％夹层胶，4％浓缩胶，PVDF膜湿转，转膜时间1h，6E10单抗室温孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照，检测细胞克隆Aβ
实施例四
对Western-bloting挑选出的APP695表达较高的细胞克隆进行膜片钳实验，采取传统的全细胞记录技术；钳制电位为-60mV，低通滤波为2kHz，采样滤波为5kHz，测试和记录软件用Axon DigiData-1200A，结果分析用Axonscope1.1.1软件；通过微操纵器移动快速给药装置的排管给药，给予100μmol·L-1烟碱4s，观察细胞上烟碱α4β受体通道活性。
本发明用脂质体转染的方法把烟碱α4β2亚型受体基因和APP695基因在SH-EP1细胞共同稳定表达，构建细胞模型，用来研究烟碱α4β2亚型受体和Aβ的关系，探讨烟碱α4β2受体激动与细胞内Aβ水平的关系。并可以使用此细胞模型进行化合物的筛选，为发现潜在的亚型特异性治疗和预防AD的化合物提供线索，对于AD发病机制探讨与药物开发具有重大意义。
Claims (9)
1.一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
①表达载体pcDNA3.1(-)-APP695的构建，将APP695基因克隆进pcDNA3.1(-)质粒；
②将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法稳定转染进SH-EP1-α4β2细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；
③稳定转染细胞克隆APP695 mRNA表达的鉴定，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测APP695 mRNA表达；
④稳定转染细胞克隆APP695和Aβ蛋白表达的鉴定，用Western-blotting检测细胞克隆APP695和Aβ的表达；
⑤稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体功能鉴定，用膜片钳鉴定稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体的功能。
2.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，所述的APP695基因和pcDNA3.1(-)进行Xbal 1和Hindlll双酶切，凝胶回收后用T4 DNA连接酶连接，转化至DH5α细菌，氨苄青霉素抗性筛选重组子pcDNA3.1(-)-APP695，扩增提取质粒，测序鉴定。
3.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，所述的稳定转染，采用脂质体法LipofectamineTM PLUS试剂进行转染。
4.根据权利要求3所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，所述的稳定转染，转染3d后新霉素500g/L加压筛选，14d后细胞单克隆形成，有限稀释法将细胞进行单克隆化，2周后单克隆长满96孔板，胰酶消化，转入24孔板，长满后转入12孔板培养，待长满后收集细胞进行蛋白表达鉴定。
5.根据权利要求1或者3或者4所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，稳定转染34d后收集单克隆细胞，用Trizol法按说明书步骤提取细胞总RNA。以总RAN为模板，APP695引物1和引物2进行PCR。
6.根据权利要求5所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，PCR程序具体为：94℃变性3min进入循环过程，94℃变性1.5min，55℃退火1.5min，72℃延伸3min，循环31次后72℃复性10min。凝胶电泳鉴定PCR产物；然后用α4和β2基因引物进行PCR，α4引物为5’-CCATCGCTCAGCTCATTGACG-3’和5’-CTGGTCGGAGGGTGACTTGC-3’，β2引物为5’-TATTCCAATGCCGTGGTCTCC-3’和5’-TGGTCATCGTCCTCGCTC-3’，凝胶电泳鉴定PCR产物。
7.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，步骤④中检测细胞克隆APP695，是指：
对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白；
用酶标仪测定蛋白浓度，取10μg上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用12％分离胶，5％积层胶，硝酸纤维素膜半干电转移，转膜时间2h，小鼠抗人APP695单抗孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。
8.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，步骤④中检测Aβ，是指：
给药6h后用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞；
BCA法测定蛋白浓度，取30.5μg上样进行Tris-tricine电泳，用16.5％分离胶，10％夹层胶，4％浓缩胶，PVDF膜湿转，转膜时间1h，6E10单抗室温孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。
9.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，所述的鉴定稳定转染细胞克隆上烟碱α4 β2受体的功能，是指：
对Western-bloting挑选出的APP695表达较高的细胞克隆进行膜片钳实验，采取传统的全细胞记录技术；钳制电位为-60mV，低通滤波为2kHz，采样滤波为5kHz，测试和记录软件用Axon DigiData-1200A，结果分析用Axonscope 1.1.1软件；通过微操纵器移动快速给药装置的排管给药，给予100μmol·L-1烟碱4s，观察细胞上烟碱α4β受体通道活性。
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| CNA2007100461493A CN101157918A (zh) | 2007-09-20 | 2007-09-20 | 建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN102124336A (zh) * | 2008-06-12 | 2011-07-13 | 健泰科生物技术公司 | 用于筛选抑制神经变性的化合物的方法 |
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2007
- 2007-09-20 CN CNA2007100461493A patent/CN101157918A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN102124336A (zh) * | 2008-06-12 | 2011-07-13 | 健泰科生物技术公司 | 用于筛选抑制神经变性的化合物的方法 |
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