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CN101146829A - 链球菌荚膜多糖的纯化 - Google Patents

链球菌荚膜多糖的纯化 Download PDF

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CN101146829A
CN101146829A CNA2006800073415A CN200680007341A CN101146829A CN 101146829 A CN101146829 A CN 101146829A CN A2006800073415 A CNA2006800073415 A CN A2006800073415A CN 200680007341 A CN200680007341 A CN 200680007341A CN 101146829 A CN101146829 A CN 101146829A
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P·科斯坦蒂诺
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Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
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Abstract

一种无乳链球菌荚膜多糖的纯化方法，其中首先用醇类和钙盐的水性混合物处理糖，然后用阳离子去污剂沉淀。该方法可在3天内完成，产率约为60％。其无需DNA酶、RNA酶和/或蛋白酶处理。该方法获得的糖中蛋白质污染极低并且280nm的吸光度极低。

Description

链球菌荚膜多糖的纯化
本文引用的所有文件全文纳入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及纯化细菌荚膜多糖的领域，特别是无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的那些荚膜多糖，特别是制备疫苗所用的荚膜多糖。
背景技术
细菌荚膜糖已用于抗有荚膜细菌的疫苗多年。然而，由于糖是不依赖T细胞的抗原，它们的免疫原性不佳。与运载体缀合能将不依赖T的抗原转化成依赖T的抗原，从而增强记忆反应并产生保护性免疫力。因此，最有效的糖疫苗以糖缀合物为基础，原型缀合物疫苗能抵御乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(“Hib”)[例如，见参考文献79的第14章]。
已描述其缀合物疫苗的另一种细菌是无乳链球菌，也称为“B群链球菌”，或简称为“GBS”。Dennis Kasper及同事从事了该项工作的大部分，见例如参考文献1-9的文件。
糖疫苗的起点是糖自身，它通常纯化自靶细菌。参考文献2和10详述了纯化GBS糖的Kasper方法，该方法包括细菌培养后的以下基本步骤：过滤除菌；用10kDa截断值的膜超滤；加入乙醇至含量为30％以沉淀污染物；将乙醇含量增加至80％过夜沉淀GBS糖；收集干燥沉淀物；依次用RNA酶、DNA酶和链霉蛋白酶处理；用氢氧化钠处理；透析；DEAE-Sephacel离子交换层析；透析；冻干；乙酸酐处理；刀豆球蛋白(conconavilin)亲和层析除去甘露聚糖；Ultragel尺寸排阻层析；和最终的冻干。
该方法非常慢，其中RNA酶、DNA酶、链霉蛋白酶和氢氧化钠处理均持续过夜，完成该方法要一星期以上。此外，该方法的产率低于50％。因此，需要其它的改进方法来纯化GBS荚膜多糖，特别是速度较快而产率较高的方法。
发明内容
本发明涉及一种纯化方法，该方法首先用醇类(例如，乙醇)和金属阳离子(例如，钙盐)的水性混合物处理糖，然后用阳离子去污剂(例如，CTAB)沉淀。糖从细菌释放后，该方法可以在3天内完成，产率约60％。
本发明提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：(a)用水性金属阳离子和醇类处理含有链球菌蛋白、核酸和荚膜多糖的混悬液以沉淀核酸和蛋白质；(b)分离沉淀的物质与水性物质；和(c)用阳离子去污剂处理水性物质以沉淀荚膜多糖。然后可分离并再溶解沉淀的多糖用于随后的疫苗制备。该方法可以包括其它加工步骤，例如超滤以除去低分子量污染物(例如群特异性的碳水化合物片段)，额外的沉淀和再溶解和/或干燥步骤。
本发明还提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，包括用阳离子去污剂沉淀糖的步骤。类似地，本发明对纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法提供改进，包括用阳离子去污剂沉淀糖。用阳离子去污剂沉淀简化了荚膜糖与存在的其它糖(例如群特异性糖)的分离。
本发明还提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，其包括采用沉淀来除去污染性核酸和/或蛋白质的步骤。类似地，本发明对纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法提供改进，包括采用沉淀来除去污染性核酸。沉淀避免了DNA酶或RNA酶处理的使用。
本发明还提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，其中该方法不包括DNA酶处理的步骤。类似地，本发明提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，其中该方法不包括RNA酶处理的步骤。类似地，本发明提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，其中该方法不包括蛋白酶处理的步骤。本发明方法最好不包括利用DNA酶、RNA酶和/或蛋白酶中的两种或三种，例如一种也不用。
本发明还提供纯化无乳链球菌细菌荚膜糖的方法，其中该方法的产率(始于细菌，终于荚膜多糖)至少有40％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)。实践的局限性提示该产率不会超过90％(例如，可能<90％、<80％、<70％等)。
本发明还提供纯化无乳链球菌细菌荚膜糖的方法，其中该方法提供含糖的组合物，与组合物中糖、蛋白质和核酸的总重相比，所述糖的纯度至少有89％(例如，≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％等)。
本发明还提供纯化无乳链球菌细菌荚膜糖的方法，其中(a)该方法的产率至少有40％(如上所述)和(b)糖的纯度至少有89％(如上所述)。
本发明还提供从无乳链球菌细菌中释放荚膜多糖的方法，包括用II型磷酸二酯酶处理细菌的步骤。这些酶与氢氧化钠一样能切割相同的磷酸酯(键)，但其优点是不会有氢氧化钠的脱-乙酰化反应性。
本发明还提供含无乳链球菌荚膜多糖的组合物，其中280nm的紫外吸光度小于0.20。优选吸光度<0.15或者甚至<0.10。发现本发明方法能得到蛋白质污染极低的组合物，从而使得280nm吸光度极低。这特别优于现有的方法，其得到的物质在约280nm显示有吸光度峰。
本发明还提供含无乳链球菌荚膜多糖的组合物，其中280nm紫外吸光度与260nm紫外吸光度之比大于0.85。优选>0.90、>0.95或者甚至>1.0的比例。该比例通常小于1.2。优选1.0±0.1的比例。
本发明还提供含无乳链球菌荚膜多糖的组合物，其中该组合物在220nm-300nm之间的紫外吸光度光谱在约270nm处显示肩峰或峰值。本发明还提供含无乳链球菌血清型Ia或血清型III荚膜多糖的组合物，其中250nm-275nm之间的紫外吸光度光谱未增加。本发明还提供含无乳链球菌荚膜多糖的组合物，其中该组合物在250nm-275nm之间的紫外光谱既无最大值也无拐点。
本发明还提供含无乳链球菌荚膜糖的组合物，其中与组合物中糖、蛋白质和核酸的总重相比，所述糖的纯度至少有89％(例如，≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％等)。
本发明还提供含无乳链球菌血清型Ia荚膜糖的组合物，其中所述糖具有单糖亚单位，其中不超过93％(例如，≤92％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％等)的所述单糖亚单位具有N-乙酰基。
本发明还提供含无乳链球菌血清型Ib荚膜糖的组合物，其中所述糖具有单糖亚单位，其中至少有78％(例如，≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％等)的所述单糖亚单位具有N-乙酰基。
本发明还提供含无乳链球菌血清型III荚膜糖的组合物，其中所述糖具有单糖亚单位，其中不超过76％(例如，≤74％、≤72％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％等)的所述单糖亚单位具有N-乙酰基。
本发明还提供含无乳链球菌血清型Ia荚膜糖的组合物，其中所述糖的分子量至少为100kDa。
本发明还提供含无乳链球菌血清型Ib荚膜糖的组合物，其中所述糖的分子量至少为40kDa。
本发明还提供含无乳链球菌血清型III荚膜糖的组合物，其中所述糖的分子量至少为40kDa。
荚膜糖
无乳链球菌荚膜多糖与细菌肽聚糖骨架中的GlcNAc残基共价相连，其不同于B群抗原，该抗原是与同一肽聚糖骨架上的MurNAc残基相连的另一种糖(图1[12])。不同血清型的荚膜多糖在化学上相关，但在抗原性上极为不同。所有GBS荚膜多糖共有以下三糖核心：β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp。
各种GBS血清型的区别在于该核心得到修饰。例如，该核心是用GlcNAc(Ia)还是用Gal(III)来连接连续的三糖核心造成血清型Ia和III之间的差异(图3)。血清型Ia和Ib均具有与核心中GlcNAc相连的[α-D-NeupNAc(2→3)β-D-Gal(1→)二糖，但连接键是1→4(Ia)或1→3(Ib)。
GBS-相关疾病主要由血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII导致，其中超过90％的疾病由五种血清型：Ia、Ib、II、III和V导致。本发明宜利用这五种血清型之一的糖。如图2所示，这五种血清型中每一种的荚膜糖包含：(a)末端N-乙酰基-神经氨酸(NeuNAc)残基(通常称为唾液酸)，在所有情况中该残基均是2→3连接于半乳糖残基；和(b)三糖核心内的N-乙酰基-葡糖胺残基(GlcNAc)。
所有五种糖在三糖核心中包含半乳糖残基，但血清型Ia、Ib、II和III在各自的重复单位中还包含额外的半乳糖残基，其中血清型II糖中每个重复单位含有3个半乳糖残基。按照本发明纯化的糖通常是其天然形式，但是它们也可是经过修饰的。例如，糖可以短于天然荚膜糖，或者可以化学修饰。
因此，本发明所用的糖可以是自然界中发现的基本上全长的荚膜多糖，或者可以短于该天然长度。全长多糖可以解聚从而得到本发明所用的较短片段，例如通过温和的酸水解，加热，尺寸排阻层析等。据报道，链长度可影响GBS糖在家兔体内的免疫原性[4]。
已有报道说可用内切-β-半乳糖苷酶解聚血清型III荚膜糖[参考文献1和4-6]。GBS血清型II、III和VIII荚膜糖的臭氧分解也可用来解聚[13]。优选用分子量>30kDa的糖，可以使用基本上全长的荚膜糖。对于血清型Ia，优选利用分子量最多约145kDa的多糖。对于血清型Ib，优选利用分子量最多约50kDa的多糖。对于血清型III，优选利用分子量最多约50kDa的多糖。可根据葡聚糖标准品(例如购自Polymer Standard Service的那些)，采用凝胶过滤测定这些分子量[14]。
与自然界发现的荚膜糖相比，可化学修饰所述糖。例如，糖可以脱-O-乙酰化(部分或全部)、脱-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酸化(部分或全部)等。根据具体的糖，脱-乙酰化可以影响或不影响免疫原性，例如NeisVac-CTM疫苗利用脱-O-乙酰化的糖，而MenjugateTM是乙酰化的，但二者均有效。参考文献15讨论了各种血清型的GBS糖上O-乙酰化的相关性，优选能在纯化之前、期间或之后保留7、8和/或9位唾液酸残基的O-乙酰化，例如利用甲醛提取糖和/或灭活细菌，通过保护/脱保护，再乙酰化等。可采用常规试验评估脱-乙酰化等的作用。
起始物质
本发明方法始于水性形式的荚膜糖，通常是含链球菌蛋白质、核酸和荚膜多糖的混悬液。
细菌生长期间，少量荚膜多糖释放入培养基，因此用于醇类沉淀污染性蛋白质和/或核酸的起始物质可以是离心的细菌培养液上清液。然而，通过处理有荚膜细菌本身(或含有细菌肽聚糖的物质)从而释放荚膜糖来制备起始物质更常见。参考文献10特征鉴定了从两种来源制备的糖。
可采用各种方法释放细菌的荚膜多糖，包括化学、物理或酶法处理。因此，可先处理多糖的水性制品，再进行最初的蛋白质/核酸沉淀反应。
典型的化学处理是能切割荚膜糖与肽聚糖骨架之间的磷酸二酯键的碱处理[16](例如，使用氢氧化钠)。碱提取是有利的，因为能在释放荚膜多糖的同时灭活细菌。此外，碱处理能释放完整的多糖并由于B群抗原具有多个磷酸二酯键而将其广泛切割(图4[12])，这有助于随后分离荚膜和群特异性糖抗原。因此，氢氧化钠处理是释放荚膜多糖的优选方法。然而由于氢氧化钠处理使得荚膜糖脱-N-乙酰化，之后可能需要再-N-乙酰化。
典型的酶法处理包括同时使用变溶菌素和β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶[12]。这些物质作用于GBS肽聚糖以释放本发明所用的荚膜糖，但也释放了群特异性碳水化合物抗原。另一酶法处理包括用II型磷酸二酯酶(PDE2)处理。PDE2酶与氢氧化钠一样能切割相同的磷酸酯(键)(见上文)，释放荚膜糖而不切割群特异性碳水化合物抗原并不使荚膜糖脱-N-乙酰化，从而能简化下游步骤。因此，PDE2酶是制备本发明方法所用GBS荚膜糖的较佳选择。
因此，本发明方法的优选起始物质是可通过参考文献16所述碱提取获得的脱-N-乙酰化的荚膜多糖。因此，另一优选起始物质是PDE2处理GBS的产物。可先浓缩(例如，超滤)这些物质，再通过本发明方法沉淀。
醇类沉淀和阳离子交换
培养后获得的GBS荚膜糖通常不纯，被细菌核酸和蛋白质污染。现有技术通过用RNA酶、DNA酶和蛋白酶连续过夜处理来除去这些污染物。相比之下，本发明整个纯化方法可以在短于现有技术这3个独立步骤的时间内进行。本发明利用醇类沉淀而不是酶法除去这些污染物。如果需要(例如，碱提取后)，通常可先中和这些物质再沉淀。
用于沉淀污染性核酸和/或蛋白质的醇类优选低级醇，例如甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二元醇等。可凭经验检验所选择的合适醇类而不需要过多的负担，但优选例如乙醇和异丙醇(丙-2-醇)的醇类，而不是诸如苯酚的醇类。
优选将醇类加入多糖混悬液至醇类的终浓度在10％-50％之间(例如，约30％)。最有用的浓度是足够沉淀污染物但不同时沉淀多糖的那些浓度。最佳的醇类终浓度可能取决于获得多糖的GBS血清型，这可通过常规试验测定而不需要过多的负担。随着乙醇浓度超过50％观察到多糖沉淀。
可将醇类以纯形式或用可混溶溶剂(例如，水)稀释的形式加入。优选的溶剂混合物是乙醇∶水混合物，优选的比例在约70∶30和约95∶5之间(例如，75∶25、80∶20、85∶15、90∶10)。
也用水性金属阳离子处理糖。优选单价和二价金属阳离子，特别优选二价阳离子，例如Mg++、Mn++、Ca++等，因为它们能更有效地形成复合物。钙离子特别有用，因此醇类混合物优选包含可溶性钙离子。这些离子可以固体或水性形式的钙盐加入糖/醇混合物。优选用氯化钙提供钙离子。
钙离子存在的终浓度优选在10-500mM之间，例如约0.1M。最佳的Ca++终浓度可能取决于获得多糖的GBS血清型，这可通过常规试验测定而不需要过多的负担。
醇类和阳离子发挥不同的作用(用醇类沉淀污染物，而阳离子稳定可溶形式的糖并与之形成复合物)，但能产生组合作用。虽然目的是制备糖、醇类和阳离子的混合物，但这三种组分不需要同时混合在一起。因此，可依次或同时使用醇类和阳离子。优选依次处理，特别优选的方法包括向糖中加入阳离子，然后向阳离子/糖混合物中加入醇类，虽然如果需要可在(加入)阳离子之前使用醇类。
醇类沉淀污染性蛋白质和/或核酸后，溶液中剩下GBS荚膜多糖。可通过任何合适的方法，例如离心分离沉淀的物质与多糖。上清液可经微孔过滤，特别是死端式过滤(垂直过滤)来除去可能在随后步骤中阻塞滤膜的颗粒(例如，直径大于0.22μm的沉淀颗粒)。可采用正切微孔过滤作为死端过滤的备选方案。
渗滤
本发明方法在沉淀蛋白质和/或核酸之后，去污剂介导的沉淀之前可包括渗滤步骤。如果采用碱提取或磷酸二酯酶释放荚膜糖，则特别优选该渗滤步骤，因为群特异性的糖也会水解从而产生远小于完整荚膜糖的片段。通过渗滤步骤可除去这些小片段。
常用切流渗滤。因此，滤膜应使群特异性抗原的水解产物通过，而截留荚膜多糖。常见的截断值范围是10kDa-30kDa。由于群特异性抗原的水解片段通常约为1kDa(5-单体、8-单体和11-单体的糖)，可采用较小的截断值，但优选较高的截断值来除去其它污染物而不导致丧失荚膜糖。
通常进行至少5轮切流渗滤，例如6、7、8、9、10、11或更多轮。
阳离子去污剂处理
本领域已知用于沉淀可溶性多糖的许多技术。按照本发明，利用一种或多种阳离子去污剂沉淀GBS糖。发明人发现用阳离子去污剂处理GBS荚膜糖和群特异性糖的混合物能优先沉淀荚膜糖，从而能有利且方便地尽可能降低群特异性糖的污染。
阳离子去污剂优选如以下通式所示：
Figure A20068000734100121
其中：R1、R2和R3相同或不同，各表示烷基或芳基；或者R1和R2与和它们相连的氮原子一起形成5-或6-元饱和的杂环，R3表示烷基或芳基；或者R1、R2和R3与和它们相连的氮原子一起形成5-或6-元杂环，其中氮原子未饱和，
R4表示烷基或芳基，和
X-表示阴离子。
本发明方法所用的特别优选的去污剂是四丁基铵盐或十六烷基三甲基铵盐(例如，溴化物盐)。特别优选十六烷基三甲基溴化铵(“CTAB”)[17]。CTAB也称为十六烷基三甲基溴化铵、溴化鲸蜡基三甲铵、Cetavlon和Centimide。其它去污剂包括溴化己二甲铵(hexadimethrine bromide)和肉豆蔻基三甲基铵盐。
去污剂介导的沉淀步骤优选对荚膜多糖有选择性。本发明优选使用能与糖的唾液酸残基(例如，通过唾液酸中的羧基)相互作用的去污剂，例如CTAB。因此，去污剂优先沉淀含唾液酸的荚膜糖，特别是混合群体中较长的糖，从而尽可能降低免疫原性上重要的唾液酸可能已在较早处理步骤中破坏的糖的污染。对于GBS，较长的糖往往比较短的糖更具免疫原性[18]，因此，本发明胜过得到较短解聚糖的现有技术方法。
沉淀后可通过离心分离荚膜糖。本发明人发现CTAB介导的沉淀后离心未得到简单团块，而是得到显示具有两相的团块。通常选择这些团块的底层进一步用于本发明。
再溶解
沉淀后，可将多糖(通常与阳离子构成复合物形式)再溶解在水性介质或醇介质中。对于水性再溶解，沉淀物中的CTA-阳离子通常被金属阳离子替代；对于醇类再溶解，CTA-阳离子通常被保留。选择水性还是醇类再溶解可能取决于获得多糖的GBS血清型以及该阶段仍存在的任何污染物。例如，沉淀的团块中有时存在色素，通过醇类再溶解，然后碳过滤可有效地除去这些色素。
再溶解的典型水性介质包含金属阳离子。优选单价和二价金属阳离子，特别优选二价阳离子，例如Mg++、Mn++、Ca++等。钙离子特别有用，因此再溶解优选使用氯化钙提供的Ca++。Ca++的浓度优选在10-500mM之间(例如约0.1M)。最佳的Ca++终浓度可能取决于获得多糖的GBS血清型，这不难通过常规试验测定。
用于再溶解的典型醇介质以乙醇为基础。可利用与沉淀核酸和/或蛋白质所用相同的醇类，但沉淀荚膜糖所需的浓度通常更高，例如优选加入醇类至终浓度在70％-95％之间(如约70％、75％、80％、85％、90％或95％)。最佳的醇类终浓度可能取决于获得多糖的GBS血清型。为实现高的醇浓度，优选加入水含量低的醇，例如96％的乙醇。
通常在室温下进行再溶解。最好避免酸性条件，通常在约pH7进行再溶解。
与沉淀前的混悬液相比，再溶解的物质得到高度纯化。
荚膜多糖的进一步处理
再溶解后，可进一步处理多糖以除去污染物。这对于即使少许污染也不能接受的场合(例如，人用疫苗生产)特别重要。
优选的进一步步骤是进一步沉淀。如前文所述，在进行水性再溶解的情况下，则该沉淀通常利用醇类；相反，如前文所述，在进行醇类再溶解的情况下，则该沉淀通常使用水性阳离子溶液。然后可通过，例如离心分离沉淀的糖和其余任何水性污染物。沉淀的物质是稳定的，可保存待日后使用。
可真空干燥沉淀的物质。该处理一般不用来稳定糖以保存，而是用于干燥糖并除去残留的任何醇类。
也可再进行几轮沉淀和过滤。也可采用深部过滤，例如作为离心的备选方案。一般在用醇类溶解后进行深部过滤。
可解聚多糖以形成寡糖。对于疫苗使用，寡糖优于多糖，据报道，链长度可影响GBS糖在家兔体内的免疫原性[4]。可在去污剂介导的沉淀之前或之后将多糖解聚成寡糖。如果进行解聚，通常按大小分级产物以分离长度短的寡糖。这可通过各种方法实现，例如超滤、接着进行离子交换层析。本发明组合物包含解聚的寡糖时，优选先解聚再缀合。
如果GBS糖中的唾液酸残基已脱-N-乙酰化，本发明方法则可包括再-N-乙酰化的步骤。使用例如5％碳酸氢铵配制的乙酸酐(CH3CO)2O的试剂不难进行受控的再-N-乙酰化[10]。
通常可在室温下进行这些其它步骤。
缀合
可利用本发明最终纯化的荚膜多糖作为抗原而无需进一步修饰，例如用于体外诊断试验，用于免疫接种等。
然而，为免疫接种的目的，优选将糖与运载体分子，例如蛋白质缀合。共价缀合糖与运载体通常能增强糖的免疫原性，因为共价缀合将糖从不依赖T的抗原转化为依赖T的抗原，从而能引发免疫记忆。缀合在儿科疫苗中特别有用[例如，参考文献19]并且是熟知的技术[例如，参考文献20-28中总结的]。因此，本发明方法可进一步包括缀合纯化的糖与运载体分子的步骤。
已广泛报道了GBS糖的缀合，例如见参考文献1-9。GBS糖缀合的典型现有技术通常包括纯化的糖与运载体蛋白，例如破伤风类毒素(TT)或CRM197的还原胺化[2]。还原胺化涉及运载体中氨基酸侧链上的胺基与糖中的醛基。由于天然形式的GBS荚膜糖不包含醛基，因此应在缀合之前用高碘酸盐氧化糖的唾液酸残基一部分(例如，5-15％之间，优选约10％)来产生醛基[2，29]。以此方式制备的GBS各血清型(Ia、Ib、II、III和V)的缀合物疫苗显示在人体内安全且有免疫原性[30]。如参考文献31所述，另一种缀合方法包括利用糖中的-NH2基团(从脱-N-乙酰化得到，或在引入胺后得到)与双功能接头缀合。
优选的运载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉类毒素或破伤风类毒素。白喉毒素的CRM197突变体[32-34]是特别优选的运载体，因为它是一种白喉类毒素。其它合适的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白[35]、合成肽[36，37]、热激蛋白[38，39]、百日咳蛋白[40，41]、细胞因子[42]、淋巴因子[42]、激素[42]、生长因子[42]、人血清白蛋白(优选重组体)、含各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白[43](例如，N19[44])、流感嗜血杆菌的D蛋白[45，46]、肺炎球菌表面蛋白PspA[47]、肺炎球菌溶菌素[48]、铁摄取蛋白[49]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[50]、GBS蛋白[109]等。
优选通过-NH2基团(例如运载体蛋白的赖氨酸残基或精氨酸残基侧链中的-NH2基团)与运载体连接。也可以通过-SH(例如半胱氨酸侧链中的-SH)进行连接。
可能利用多种运载体蛋白来，例如降低运载体抑制的风险。因此，不同GBS血清型可用不同运载体蛋白，例如血清型Ia糖可与CRM197缀合，而血清型Ib糖可与破伤风类毒素缀合。具体的糖抗原也可能利用多种运载体蛋白，例如血清型III糖可以分成两组，其中一些与CRM197缀合，其它与破伤风类毒素缀合。然而，所有糖通常优选利用相同的运载体蛋白。
一种运载体蛋白可携带多种糖抗原[51，52]。例如，一种运载体蛋白可与血清型Ia和Ib的糖缀合。为实现此目标，可先混合不同的糖再进行缀合反应。然而，一般优选每种血清型具有各自的缀合物，缀合后再混合不同的糖。所述各自的缀合物可基于相同的运载体。
优选糖：蛋白质之比(w/w)在1∶5(即，过量的蛋白)和5∶1(即，过量的糖)之间的缀合物。优选1∶2和5∶1之间的比例，例如1∶1.25和1∶2.5之间的比例。
缀合物可与游离运载体联用[53]。当本发明组合物中给定的运载体蛋白同时存在游离和缀合形式时，未缀合形式优选不超过组合物中所有运载体蛋白总量的5％，更优选低于2％(以重量计)。
缀合后，可以分离游离和缀合的糖。合适的方法有许多，包括疏水层析、正切超滤、渗滤等。[也见参考文献54和55等]。
如图5所示，总体上可制备两种类型的缀合物：(a)一个糖与一个运载体相连(例如通过其还原性末端)的缀合物；和(b)一个糖与多个运载体相连的缀合物，例如由于几个单糖亚单位具有反应性。在两种情况中，一个运载体蛋白可与多个糖分子相连，因为运载体具有多个暴露的赖氨酸侧链。(b)型缀合物在本发明中更常见，因为本发明修饰的唾液酸或半乳糖残基出现在一个糖(分子)的多个位点[56]。因此，在优选的缀合物中，一个糖分子平均与一个以上运载体分子偶联。
缀合物与其它抗原的组合
通过本发明方法制备的糖(特别是如上所述缀合后)可以，例如彼此和/或与其它抗原混合。因此，本发明方法可进一步包括将糖与一种或多种其它抗原混合的步骤。
混合多种不同GBS缀合物时，这些缀合物可包括同一GBS血清型的不同类型缀合物和/或不同GBS血清型的缀合物。例如，这些缀合物可以得自血清型Ia、Ib和III的两种或三种。可通过先制备不同缀合物(例如，各血清型的不同缀合物)，再混合这些缀合物来产生组合物。
如下所述，其它抗原可包含GBS氨基酸序列。
其它抗原可包括非GBS病原体的抗原。因此，本发明组合物还可包含一种或多种非-GBS抗原，包括其它细菌、病毒或寄生虫抗原。这些抗原可选自以下抗原：
-脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清群B的蛋白质抗原，例如参考文献57-63所述的那些，其中特别优选蛋白质‘287’(见下文)和衍生物(例如，‘ΔG287’)。
-脑膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜囊泡制品(OMV)，例如参考文献64、65、66、67等公开的。
-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献68公开的血清群C的寡糖或参考文献69的寡糖。
-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如，参考文献70-72；参考文献79的第22和23章]。
-甲肝病毒抗原，如灭活病毒[例如，73、74；参考文献79的第15章]。
-乙肝病毒抗原，例如表面和/或核心抗原[例如，74、75；参考文献79的第16章]。
-丙肝病毒抗原[例如，76]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3联用[例如，参考文献77和78；参考文献79的第21章]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献79的第13章]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献79的第27章]。
-B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae B)的糖抗原[例如，参考文献79的第14章]。
-淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)的抗原[例如，57、58、59]。
-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如，80、81、82、83、84、85、86]。
-砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的抗原[例如，87]。
-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原[例如，88]。
-脊髓灰质炎抗原[例如，89、90；参考文献79的第24章]，如IPV。
-狂犬病抗原[例如，91]，如冻干的灭活病毒[例如，92，RabAvertTM]。
-麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹抗原[例如，参考文献79的第19、20和26章]。
-流感抗原[例如，参考文献79的第17和18章]，如血球凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[例如，93]。
-酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)抗原[例如，94、95、96]。
利用糖或碳水化合物时，优选与运载体缀合以增强免疫原性。熟知乙型流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌和肺炎球菌糖抗原的缀合。
可视需要对有毒的蛋白抗原解毒(例如通过化学和/或遗传方法对百日咳毒素解毒[78])。
组合物包含白喉抗原时，优选也包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，组合物包含破伤风抗原时，优选也包含白喉和百日咳抗原。类似地，组合物包含百日咳抗原时，优选也包含白喉和破伤风抗原。
可将抗原吸附到铝盐上。
组合物中各抗原的浓度通常是至少1μg/ml。任何给定抗原的浓度通常足以引发针对该抗原的免疫反应。
可用编码抗原的核酸作为在本发明组合物中蛋白抗原的备选方案[例如，参考文献97-105]。因此，可用编码该蛋白质的核酸(优选DNA，例如质粒形式)替代本发明组合物的蛋白质组分。
实际上，本发明组合物中抗原的种数有上限。本发明组合物中抗原(包括GBS抗原)种数可以小于20、小于19、小于18、小于17、小于16、小于15、小于14、小于13、小于12、小于11、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4或小于3。本发明组合物中GBS抗原种数可以小于6、小于5或小于4。
药物组合物和方法
本发明提供制备药物组合物的方法，包括混合(a)本发明糖(任选缀合物的形式)和(b)药学上可接受的运载体的步骤。“药学上可接受的运载体”通常包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生的任何运载体。合适的运载体一般是大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、多乳酸、多乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、乳糖和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。本领域普通技术人员熟知这些运载体。疫苗也可含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。灭菌无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的运载体。药学上可接受的赋形剂的详尽讨论见参考文献106。
药物组合物可装在药瓶或注射器中。注射器可以配或不配针头。注射器含有单剂量的组合物，而药瓶可含有单剂量或多剂量。
本发明水性组合物也适用于重建冻干形式的其它疫苗。本发明组合物用于这种临时重建时，本发明提供重建这种冻干疫苗的方法，包括混合冻干物质与本发明水性组合物的步骤。重建的物质可用于注射。
GBS蛋白抗原
如上所述，本发明组合物中可包含GBS蛋白。这些蛋白可用作本发明缀合物的运载体蛋白、其它缀合物的运载体蛋白或未缀合的蛋白抗原。
本发明所用的GBS蛋白抗原包括参考文献94和107-109中公开的那些。本发明所用的5种优选GBS抗原称为：GBS67；GBS80；GBS104；GBS276和GBS322[参见参考文献94]。这5种抗原的其它细节见下文。
这5种GBS蛋白的全长序列见本文的SEQ ID NO1-5。因此，本发明组合物可包含(a)含有选自SEQ ID NO1-5的氨基酸序列的多肽，和/或(b)含有(i)与SEQID NO 1-5中一条或多条具有序列相同性的氨基酸序列和/或(ii)SEQ ID NO1-5的片段的多肽。
根据具体的SEQ ID NO，(i)的序列相同性程度优选大于50％(例如，60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。这些多肽包括同源物、直向同源物(orthologs)、等位变体和功能突变体。通常认为两条多肽序列之间有50％或更高的相同性表明在功能上等价。优选采用MPSRCH程序(Oxford Molecular)执行的Smith-Waterman同源性检索算法测定多肽之间的相同性，该程序利用仿射空位检索，参数是空位开放罚分(gap open penalty)＝12，空位延伸罚分(gap extension penalty)＝1。
根据具体的SEQ ID NO，(ii)的片段应含有这些序列的至少n个连续氨基酸，根据具体的序列，n是7或更大(例如，8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更大)。片段可含有序列的至少一个T细胞或优选B细胞表位。可以凭经验鉴定T-细胞和B-细胞表位(例如，采用PEPSCAN[110，111]或相似的方法)，或者可估计这些表位(例如，采用Jameson-Wolf抗原指数[112]、矩阵方法[113]、TEPITOPE[114]、神经网络[115]、OptiMer & EpiMer[116，117]、ADEPT[118]、Tsites[119]、亲水性[120]、抗原性指数[121]或参考文献122公开的方法等)。其它的优选片段是不含N-末端氨基酸残基或不含N-末端信号肽的SEQ ID NO 1-5。可采用除去一个或多个结构域，例如前导序列或信号序列区、跨膜区、胞质区或细胞壁锚定基序。优选的片段如下文所示(SEQ ID NO 6-19)。
与SEQ ID NO 1-5相比，这些多肽可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守性氨基酸取代，即用具有相关侧链的另一氨基酸取代某一氨基酸。遗传学编码的氨基酸通常可分为4个家族：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)未荷电的极性，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起分为芳香族氨基酸。这些家族内的单氨基酸取代不会对生物学活性造成主要影响。与SEQ ID NO 1-5相比，这些多肽也可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单氨基酸缺失。与SEQ ID NO 1-5相比，这些多肽也可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(例如，各是1、2、3、4或5个氨基酸)。
可采用许多方法，例如通过化学合成(全部或部分)、用蛋白酶消化较长的多肽、从RNA翻译、从细胞培养物(例如，重组表达)纯化、从生物自身纯化(例如，细菌培养后或直接从患者纯化)等来制备本发明多肽。产生长度<40个氨基酸的肽的优选方法包括体外化学合成[123，124]。特别优选固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc化学的方法[125]。也可部分或完全采用酶合成[126]。可采用生物合成作为化学合成的备选方案，例如可通过翻译产生多肽。这可在体外或体内进行。生物学方法通常局限于产生基于L-氨基酸的多肽，但可利用对翻译机制(例如，氨酰基tRNA分子)的操控来引入D-氨基酸(或其它非天然氨基酸，例如碘酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮基高丙氨酸(azidohomoalanine))[127]。然而，当包含D-氨基酸时，优选采用化学合成。本发明多肽可在C-末端和/或N-末端具有共价修饰。
如果本发明组合物中包含这些GBS蛋白，则它们可采取各种形式(例如，天然的、融合体、糖基化的、非糖基化的、脂化的、非脂化的、磷酸化的、非磷酸化的、肉豆蔻酰化的、非肉豆蔻酰化的、单体的、多聚的、颗粒化的、变性的等)。它们优选以纯化或基本上纯化的形式使用，即基本上不含其它多肽(例如，不含天然产生的多肽，特别是不含其它GBS或宿主细胞多肽)。
GBS67
从血清型V菌株2603V/R测序得到的GBS67核苷酸序列和氨基酸序列见参考文献94的SEQ ID NO3745和3746。在本文中氨基酸序列是SEQ ID NO：1：
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GBS67含有C-末端跨膜区，该区域最接近以上SEQ ID NO：1的C-末端区域，以下划线标出。可除去跨膜区的一个或多个氨基酸，或者可截短跨膜区前的氨基酸。这种GBS67片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：18。
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GBS67含有表示细胞壁锚定的氨基酸基序，其在以上SEQ ID NO：1中以斜体字显示。在一些重组宿主细胞系统中，优选除去该基序以帮助重组GBS67蛋白从宿主细胞分泌。因此，在本发明所用一优选GBS67片段中，除去了GBS67的跨膜和细胞壁锚定基序。这种GBS67片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：19。
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GBS80
GBS80指推定的细胞壁表面锚定家族蛋白。从血清型V的分离菌株2603V/R测序得到的GBS80核苷酸序列和氨基酸序列见参考文献94的SEQ ID NO8779和8780。在本文中氨基酸序列是SEQ ID NO：2：
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N
GBS80含有N-末端前导序列区或信号序列区，该区域在以上序列中以下划线标出。可除去GBS80的前导序列区或信号序列区的一个或多个氨基酸。这种GBS80片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：6：
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GBS80含有C-末端跨膜区，该区域在接近以上SEQ ID NO：2的末端，以带下划线的序列标出。可除去跨膜区和/或胞质区的一个或多个氨基酸。这种片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：7：
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GBS80含有表示细胞壁锚定的氨基酸基序，其在以上SEQ ID NO：2中以斜体字显示。在一些重组宿主细胞系统中，优选除去该基序以帮助重组GBS80蛋白从宿主细胞分泌。因此，可除去GBS80的跨膜区和/或胞质区及细胞壁锚定基序。这种片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：8。
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或者，在一些重组宿主细胞系统中，优选用细胞壁锚定基序将重组表达的蛋白锚定到细胞壁上。可在纯化期间切除所表达蛋白的胞外结构域，或者最终组合物中的重组蛋白可维持连接于灭活的宿主细胞或细胞膜。
在一个实施方式中，可除去GBS80序列的前导序列区或信号序列区、跨膜区和胞质区及细胞壁锚定基序。这种GBS80片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：9：
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ELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAV
TGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPD
TIKNNKRPS
尤其(具有)免疫原性的GBS80片段位于该蛋白的N-末端，在本文以SEQ IDNO：10表示：
AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTV
EAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEIN
IYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRD
EHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKG
GBS104
GBS104指推定的细胞壁表面锚定家族蛋白。已被称为emaA。从血清型V的分离菌株2603V/R测序得到的GBS104核苷酸序列和氨基酸序列见参考文献94的SEQ ID NO8777和8778。在本文中氨基酸序列是SEQ ID NO：3：
MKKRQKIWRGLSVTLLILSQIPFGILVQGETQDTNQALGKVIVKKTGDNATPLGKATFVLKNDNDKSETSHETVEGSGE
ATFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDKTWKVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEVLNAQYPKSAIYEDTKENYPLVNVE
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SYLNLTNDANEVNILKSRIPKEAEHINGDRTLYQFGATFTQKALMKANEILETQSSNARKKLIFHVTDGVPTMSYAINF
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GYAINSGYIYLYWRDYNWVYPFDPKTKKVSATKQIKTHGEPTTLYFNGNIRPKGYDIFTVGIGVNGDPGATPLEAEKFM
QSISSKTENYTNVDDTNKIYDELNKYFKTIVEEKHSIVDGNVTDPMGEMIEFQLKNGQSFTHDDYVLVGNDGSQLKNGV
ALGGPNSDGGILKDVTVTYDKTSQTIKINHLNLGSGQKVVLTYDVRLKDNYISNKFYNTNNRTTLSPKSEKEPNTIRDF
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DGNYKLYEISSPDGYIEVKTKPVVTFTIQNGEVTNLKADPNANKNQIGYLEGNGKHLITNTPKRPPGVFPKTGGIGTIV
YILVGSTFMILTICSFRRKQL
GBS104含有N-末端前导序列区或信号序列区，该区域在以上SEQ IDNO：3的起始处，以带下划线的序列标出。可除去GBS104的前导序列区或信号序列区的一个或多个氨基酸。这种GBS104片段的一个例子见下文的SEQID NO：11：
GETQDTNQALGKVIVKKTGDNATPLGKATFVLKNDNDKSETSHETVEGSGEATFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDKT
WKVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEVLNAQYPKSAIYEDTKENYPLVNVEGSKVGEQYKALNPINGKDGRREIAEGWL
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DRTLYQFGATFTQKALMKANEILETQSSNARKKLIFHVTDGVPTMSYAINFNPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGILQE
DFIINGDDYQIVKGDGESFKLFSDRKVPVTGGTTQAAYRVPQNQLSVMSNEGYAINSGYIYLYWRDYNWVYPFDPKTKK
VSATKQIKTHGEPTTLYFNGNIRPKGYDIFTVGIGVNGDPGATPLEAEKFMQSISSKTENYTNVDDTNKIYDELNKYFK
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KVNKDKHSESLLGAKFQLQIEKDFSGYKQFVPEGSDVTTKNDGKIYFKALQDGNYKLYEISSPDGYIEVKTKPVVTFTI
QNGEVTNLKADPNANKNQIGYLEGNGKHLITNTPKRPPGVFPKTGGIGTIVYILVGSTFMILTICSFRRKQL
GBS104含有C-末端跨膜区和/或胞质区，该区域接近以上SEQ ID NO：3的末端，以带下划线的区域标出。可除去跨膜区和/或胞质区的一个或多个氨基酸。这种GBS104片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：12：
MKKRQKIWRGLSVTLLILSQIPFGILVQGETQDTNQALGKVIVKKTGDNATPLGKATFVLKNDNDKSETSHETVEGSGE
ATFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDKTWKVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEVLNAQYPKSAIYEDTKENYPLVNVE
GSKVGEQYKALNPINGKDGRREIAEGWLSKKITGVNDLDKNKYKIELTVEGKTTVETKELNQPLDVVVLLDNSNSMNNE
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SYLNLTNDANEVNILKSRIPKEAEHINGDRTLYQFGATFTQKALMKANEILETQSSNARKKLIFHVTDGVPTMSYAINF
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GYAINSGYIYLYWRDYNWVYPFDPKTKKVSATKQIKTHGEPTTLYFNGNIRPKGYDIFTVGIGVNGDPGATPLEAEKFM
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DGNYKLYEISSPDGYIEVKTKPVVTFTIQNGEVTNLKADPNANKNQIGYLEGNGKHLITNT
可除去前导序列区或信号序列区的一个或多个氨基酸和跨膜区或胞质区的一个或多个氨基酸。这种GBS104片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：13：
GETQDTNQALGKVIVKKTGDNATPLGKATFVLKNDNDKSETSHETVEGSGEATFENIKPGDYTLREETAPIGYKKTDKT
WKVKVADNGATIIEGMDADKAEKRKEVLNAQYPKSAIYEDTKENYPLVNVEGSKVGEQYKALNPINGKDGRREIAEGWL
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DRTLYQFGATFTQKALMKANEILETQSSNARKKLIFHVTDGVPTMSYAINFNPYISTSYQNQFNSFLNKIPDRSGILQE
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QNGEVTNLKADPNANKNQIGYLEGNGKHLITNT
GBS104的其它片段包括GBS104氨基酸28-858(按照SEQ ID NO：3编号)的830个氨基酸的片段，GBS104氨基酸28-387的359个氨基酸的片段，GBS104氨基酸28-609的581个氨基酸的片段或GBS104氨基酸28-768的740个氨基酸的片段。
GBS276
GBS276指C5a肽酶。GBS276的其它描述见参考文献128-131。从血清型V的分离菌株2603V/R测序得到的GBS104核苷酸序列和氨基酸序列见参考文献94的SEQ ID NO 8941和8942。在本文中氨基酸序列是SEQ ID NO：4：
MRKKQKLPFDKLAIALISTSILLNAQSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADD
ANDLAPQAPAKTADTPATSKATIRDLNDPSHVKTLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKENLEK
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LEGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKPEQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRALATKAST
RDQLPTTNDKDTNRLHLLKLVMTTFFLG
GBS276含有N-末端前导序列区或信号序列区，该区域在以上SEQ ID NO：4的起始处，以带下划线的序列标出。可除去GBS276的前导序列区或信号序列区的一个或多个氨基酸。这种GBS276片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：14：
QSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADDANDLAPQAPAKTADTPATSKATIRD
LNDPSHVKTLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKENLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSK
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NAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGVSIVTSAGNDSSFGGKPRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQLTETA
TVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQD
KGFPIELPNVDQMPAAFISRRDGLLLKDNPPKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKPDIAAPGQDILSS
VANNKYAKLSGTSMSAPLVAGIMGLLQKQYETQYPDMTPSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAK
KASAATMYVTDKDNTSSKVHLNNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQELYYQVTVQTDKVDGKHFALAPKALYETSWQKITIPA
NSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLEGFVRFKQDPTKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEA
NSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTI IKAVKEGVENIEDIESSEITETI FAGTFAKQDDDSHYYIHRHANG
KPYAAISPNGDGNRDYVQFQGTFLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKD
GKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDL
PTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKP
EQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRALATKASTRDQLPTTNDKDTNRLHLLKLVMTTF
FLG
GBS276含有C-末端跨膜区和/或胞质区，该区域在接近以上SEQ ID NO：4的末端，以带下划线的序列标出。可除去GBS276的跨膜区或胞质区的一个或多个氨基酸。这种GBS276片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：15：
MRKKQKLPFDKLAIALISTSILLNAQSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADD
ANDLAPQAPAKTADTPATSKATIRDLNDPSHVKTLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKENLEK
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YNNDLASTLGSTRFEKTRWDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLT
LASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKL
LEGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKPEQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRALATK
可除去GBS276的前导序列区或信号序列区中的一个或多个氨基酸和跨膜区或胞质区的一个或多个氨基酸。这种GBS276片段的一个例子见下文的SEQID NO：16：
QSDIKANTVTEDTPATEQAVEPPQPIAVSEESRSSKETKTSQTPSDVGETVADDANDLAPQAPAKTADTPATSKATIRD
LNDPSHVKTLQEKAGKGAGTVVAVIDAGFDKNHEAWRLTDKTKARYQSKENLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSK
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TVKTDDHQDKEMPVISTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVEGKIALIERGDIDFKDKIANAKKAGAVGVLIYDNQD
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NSDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESSEITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANG
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GKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATSATFSTEDSRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDL
PTTEYISPNEDGTFTLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNKPEQDGSDQAPDKKPEAKP
EQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQKGQSSRTLEKRSSKRALATK
GBS322
GBS322指表面免疫原性蛋白，也称为“sip”。从血清型V的分离菌株2603V/R测序得到的GBS322核苷酸序列和氨基酸序列见参考文献94的SEQ ID NO 8539和8540。在本文中氨基酸序列是SEQ ID NO：5：
MNKKVLLTSTMAASLLSVASVQAQETDTTWTARTVSEVKADLVKQDNKSSYTVKYGDTLSVISEAMSIDMNVLAKINNI
ADINLIYPETTLTVTYDQKSHTATSMKIETPATNAAGQTTATVDLKTNQVSVADQKVSLNTISEGMTPEAATTIVSPMK
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YSNTNSIYGPANTWNAMPDRGGVTANHYDHVHVSFNK
GBS322含有N-末端前导序列区或信号序列区，该区域在SEQ ID NO：5的起始处，以带下划线的序列标出。可除去GBS322的前导序列区或信号序列区的一个或多个氨基酸。这种GBS322片段的一个例子见下文的SEQ ID NO：17：
DLVKQDNKSSYTVKYGDTLSVISEAMSIDMNVLAKINNIADINLIYPETTLTVTYDQKSHTATSMKIETPATNAAGQTT
ATVDLKTNQVSVADQKVSLNTISEGMTPEAATTIVSPMKTYSSAPALKSKEVLAQEQAVSQAAANEQVSPAPVKSITSE
VPAAKEEVKPTQTSVSQSTTVSPASVAAETPAPVAKVAPVRTVAAPRVASVKVVTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSP
ATDSKLQATEVKSVPVAQKAPTATPVAQPASTTNAVAAHPENAGLQPHVAAYKEKVASTYGVNEFSTYRAGDPGDHGKG
LAVDFIVGTNQALGNKVAQYSTQNMAANNISYVIWQQKFYSNTNSIYGPANTWNAMPDRGGVTANHYDHVHVSFNK
通用术语
术语“含有”包括“包含”以及“由……构成”，例如“含有”X的组合物可仅由X构成或可包含其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示例如x±10％。
“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
当本发明提供的方法包括多个连续步骤时，本发明也提供包括的步骤少于所述全部数量步骤的方法。例如，如果已通过除去污染性核酸和/或蛋白质而部分纯化了糖，则本发明方法可以省去此步骤。类似地，可执行除去污染物的步骤以得到准备好进行去污剂介导沉淀的物质，但无需进行沉淀。不进行沉淀步骤也属于本发明的范围，因为预先沉淀的物质已用作糖制备的中间体，并且可为随后的应用(例如用于随后的沉淀)而使用、保存、运输等。可在不同时间由不同的人在不同地点(例如，在不同国家)进行这些不同的步骤。
应理解糖环可存在开放和封闭形式，虽然本文结构式显示了封闭形式，但开放形式也包括在本发明中。类似地，应理解糖可以存在吡喃和呋喃形式，虽然本文结构式显示了吡喃形式，但也包括呋喃形式。也包括不同端基异构形式的糖。
附图简述
图1显示了与GBS的肽聚糖相连的荚膜多糖(左图)和群特异性多糖(右图)。
图2显示了GBS血清型Ia、Ib、II、III和V荚膜糖的重复结构。
图3显示了GBS血清型Ia和III的重复结构之间的差异。
图4显示了B群抗原的四触角结构(tetraantennary structure)。A-D代表主要组分寡糖，P代表磷酸(基团)[12]。
图5显示了可以制备的两类缀合物。
图6是本发明总体方法的流程图。
图7是6种GBS荚膜多糖制品的紫外吸光度图谱。在约275nm可见峰或肩峰。在那时，上面3个图谱是按照现有技术方法纯化的物质，而下面3个图谱是本发明纯化的物质。在约275nm处从上往下依次是：Ib；Ia；III；Ia；Ib；III。
图8-10显示了不同血清型的NMR图谱：(8)Ia；(9)Ib；(10)III。
本发明实施方式
A.纯化GBS血清型Ia、Ib和III的荚膜糖
离心后收集B群链球菌培养液的上清液，37℃用氢氧化钠(最浓度为0.8M)处理36小时。加入HCl中和得到的上清液。将水性乙醇(30％)和CaCl2(0.1M)的混合物加入中和的混合物中。快速形成沉淀物，将其离心除去。唾液酸试验显示荚膜糖保留在上清液中。采用死端微孔过滤(dead-end microfiltration)以再生纤维素膜(0.22μm截断值)过滤上清液，然后用30kDa截断值的纤维素膜进行切线流渗滤约2小时。荚膜糖保留在超滤渗余物中。加入10％CTAB去污剂处理该渗余物直至形成沉淀(数分钟内)。离心分离沉淀物(包含荚膜多糖)。加入0.1M CaCl2水溶液再溶解沉淀物。加入96％乙醇至终浓度为80％再次沉淀。再次离心取出沉淀物，真空干燥该沉淀物。
整个方法(图6所示)需要2-3天，产率约60％。检验最终的干燥物质以下参数：总重、荚膜糖重量和唾液酸含量。3种血清型的结果如下所示：
总重w/v(mg/ml)＊ 唾液酸含量(mg/ml) 糖含量(mg/ml) 纯度(％)
Ia 18.33 4.57 14.74 80.4
lb 19.67 5.03 16.23 82.5
III 16.33 4.08 13.16 80.6
*将干燥的粉末溶解于水中得到的标准溶液
各情况中的纯度优于现有技术方法获得的纯度，特别是血清型III物质(89％对74％)。然而，与现有技术相反，该方法需要2-3天(与15-20天相比)，产率约60％(与约20％相比)。
通过紫外吸光度评估蛋白质和核酸污染。为比较，也检验现有技术方法制备的糖。图谱示于图7，对于三种血清型的每种，现有技术(制备的)物质在约270nm有明显的峰。相反，本发明方法纯化的物质在此区域的图谱平坦。280nm和260nm的吸光度之比如下所示：
血清型 现有技术280nm/260nm 本发明280nm/260nm
Ia 0.81 1.11
Ib 0.79 1.03
III 0.80 1.04
这些比例显示本发明方法制备的物质污染程度低于现有技术方法制备的物质。
采用NMR研究糖，特别是评估N-乙酰化的程度。NMR图谱示于图8-10。现有技术方法和本发明方法的图谱重叠，较低的图谱是现有技术(制备的)物质。计算的N-乙酰化％如下所示：
血清型 现有技术％ 本发明％
Ia 95.5 52.0
Ib 76.4 85.4
III 77.9 66.0
B.缀合纯化的荚膜糖
纯化并再乙酰化GBS血清型Ia、Ib和III中的每一种的荚膜糖。然后采用直接还原胺化将这些糖与单体破伤风类毒素(TT)或CRM197运载体蛋白共价缀合。结果如下所示：
缀合物 氧化％ 糖(mg/ml) 运载体(mg/ml) 糖/蛋白质之比(w/w)
Ia-TT 10.8 2.033 0.865 2.35
Ia-CRM 9.1 1.156 0.401 2.88
Ib-TT 15.2 1.740 1.271 1.37
Ib-CRM 8.2 0.898 0.448 2.00
III-TT 14.3 0.964 0.631 1.53
III-CRM 6.5 1.105 0.626 1.77
C.缀合物攻击研究
采用现有技术方法或本发明方法纯化血清型Ia菌株的荚膜糖。为缀合，氧化糖中唾液酸残基的部分，目标为5-15％之间。
两批采用现有技术方法纯化的物质的氧化百分比为54.5％和17.6％。本发明纯化的物质有6.6％被氧化。
通过还原胺化将这些糖与破伤风类毒素缀合。用这3种缀合物在第0天和第21天以每剂1μg糖平行进行小鼠免疫。多组6-7周龄的CD-1远亲后代(outbred)雌性小鼠(Charles River Laboratories)通过腹膜内注射接受悬浮于250μlPBS中的缀合物和等体积的含氢氧化铝佐剂(2mg/ml终浓度)的PBS。然后，用3种不同血清型(菌株)攻击小鼠。存活率如下所示：
攻击菌株
糖 A909 515 090
现有技术，54.5％ 7 24 18
现有技术，17.6％ 100 47 50
本发明，5.5％ 100 97 93
PBS对照 12 17 0
因此，本发明方法纯化的糖的免疫原性优于现有技术方法纯化的那些糖。
调理吞噬(opsonophagocytosis)研究
通过现有技术方法[1-9]或本发明方法制备血清型Ia、Ib和III的TT-缀合物糖。用悬浮于250μl PBS中的缀合物(剂量：1μg糖)和等体积的含氢氧化铝佐剂(2mg/ml终浓度)的PBS免疫多组(每组4只)6-7周龄的CD-1远亲后代雌性小鼠(Charles River Laboratories)。各组在第0天和第21天通过腹膜内注射接受两剂量。在各免疫接种方案中，也使用阴性和阳性对照组。
测定在第0和36天取得的血清样品的免疫反应。分析各组小鼠抗7种不同GBS菌株，包括“515”(Ia型；MLST型ST23)、“COH1”(III型；MLST型ST17)和“H36B”(Ib型；MLST型ST6)的合并血清。检测保护作用和调理素滴度，结果如下所示：
血清型缀合物 攻击菌株保护作用(％) 调理性滴度
Ia COH1 M781 —
本发明 100 92 — 1400
现有技术 100 — — 380
PBS对照 15 17 — —
Ib 7357b H36B —
本发明 95 87 6500
现有技术 90 — — 500
PBS对照 25 0 — —
III 515 090 A909
本发明 93 95 100 2150
现有技术 47 50 100 300
PBS对照 5 0 17 —
数据显示，与现有技术方法纯化的物质相比，本发明方法纯化的糖能赋予相等或提高的保护效力。此外，在保护效力相当时，本发明方法纯化的物质能赋予提高的调理性滴度。
应该知道只是用实施例描述了本发明，可作出改进而仍属于本发明的范围和构思。
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Claims (32)

1.一种纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：(a)用水性金属阳离子和醇类处理含有链球菌蛋白、核酸和荚膜多糖的混悬液以沉淀核酸和蛋白质；(b)分离沉淀的物质与水性物质；和(c)用阳离子去污剂处理水性物质以沉淀荚膜多糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多糖是选自Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII的无乳链球菌血清型。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述血清型选自Ia、Ib、II、III或V。
4.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述多糖是基本上全长的荚膜多糖。
5.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述多糖的分子量＞30kDa。
6.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述糖部分或完全脱-O-乙酰化。
7.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述糖部分或完全脱-N-乙酰化。
8.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述混悬液是经离心的无乳链球菌培养物的上清液。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，通过处理无乳链球菌来释放荚膜糖从而制备所述混悬液。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，通过化学或酶学处理来释放所述荚膜糖。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，通过碱提取释放所述荚膜糖。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，通过同时用变溶菌素和β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶处理来释放所述荚膜糖。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，用II型磷酸二酯酶处理来释放所述荚膜糖。
14.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述醇类是低级醇。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述醇类是乙醇或异丙醇。
16.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，向所述混悬液中加入所述醇类至最终醇类浓度在10％-50％之间。
17.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述水性金属阳离子是单价或二价的。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述阳离子是Mg++、Mn++或Ca++。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，使用了Ca++离子，其最终浓度在10和500mM之间。
20.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括离心。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，离心后的上清液经微孔过滤。
22.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之后和步骤(c)之前进行渗滤步骤。
23.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，步骤(c)中的阳离子步骤是四丁基铵盐或十六烷基三甲基铵盐，例如CTAB。
24.如以上任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述糖再溶解于水性介质或醇类介质中。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，使用水性介质再溶解所述糖，其中所述水性介质包含Mg++、Mn++或Ca++。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，使用醇类介质再溶解所述糖，其中所述醇类的终浓度在70％-95％之间。
27.一种包含通过以上任一项权利要求所述方法获得的无乳链球菌荚膜多糖的组合物。
28.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物的280nm紫外吸光度小于0.20。
29.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物的280nm紫外吸光度与260nm紫外吸光度之比大于0.85。
30.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物在220nm和300nm之间的紫外吸光度光谱在约270nm确实显示肩峰或峰。
31.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述组合物在250nm和275nm之间的紫外光谱既无最高点也无拐点。
32.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，相对于组合物中糖、蛋白质和核酸的总重，所述糖的纯度至少为89％。
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