CN101107016A

CN101107016A - 靶向细胞外基质的造影剂

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Publication number: CN101107016A
Application number: CNA2005800470720A
Authority: CN
Inventors: D·洛夫豪格; M·埃里克森; H·B·菲耶丁斯塔; A·赫利
Original assignee: GE Healthcare AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 2004-11-22
Filing date: 2005-11-21
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2025-11-21
Also published as: KR20070091609A; WO2006054904A3; RU2007118385A; US8182790B2; AU2005307195A1; MX2007006050A; ATE494913T1; BRPI0518328A2; JP2008520658A; NO20073039L; ES2358745T3; EP2243496A3; EP2243496A2; EP1814598A2; ZA200705043B; JP5116480B2; DE602005025911D1; US20090208412A1; CN101107016B; EP1814598B1

Abstract

一种通式(I)的造影剂：Z₁－L－V－Z₂ (I)其中存在至少Z₁和Z₂之一，它们是在人或动物体体内成像中相同或不同的可检测指示部分，V是与胶原形成区域有结合亲和力的靶向部分，L是共价键、生物修饰物或连接部分。

Description

靶向细胞外基质的造影剂

发明领域

本发明涉及新的造影剂和其在诊断成像技术中的用途。更具体地说本发明涉及包含靶向载体的造影剂，该载体结合胶原形成区域和细胞外基质ECM。这种造影剂可用于活性纤维化(胶原沉积)的靶向和许多疾病病症的诊断，病症例如心衰、肝和肺纤维化、腹膜后纤维化、动脉粥样硬化、关节炎、癌症和皮肤病症。这种造影剂可进一步用于显示慢性结瘢性炎性疾病、癜痕组织和粘连，观察梗死大小，显示早期梗死和诊断充血性心衰。

发明背景

胶原是动物界最丰富的蛋白质。现已知25种不同类型。其基本结构单元是三股螺旋，在胶原I中，螺旋由三种多肽组成，各自含有1050个氨基酸。胶原纤维由三股螺旋间的侧向相互作用形成。某些胶原，特别是胶原IV，形成二维片层。

胶原分子的氨基酸序列是高度重复的，这种规律反映在胶原纤维结构中。胶原I的氨基酸序列含有约20个18-氨基酸基序的拷贝，基序中的每第三氨基酸是甘氨酸。

各种胶原由成纤维细胞和某些上皮细胞产生。原始转录物是包含用于从细胞输出的信号序列的前胶原多肽，也是阻止缔合形成三股螺旋的前肽。在前胶原链中约50％的脯氨酸残基和15-20％的赖氨酸经历细胞内加工形成羟脯氨酸和羟赖氨酸。这些修饰对胶原的机械性能是必须的。在细胞外，前肽被切割，开始自我组装的过程。

一般而言胶原是如骨、腱的结构和细胞外基质的主要成分。例如，胶原IV形成基底膜基本网络，上皮细胞和内皮细胞附着在其上。部分胶原多样性由不同类型胶原解释，但也有大量各种胶原相关分子。胶原纤维经常缔合至蛋白聚糖。这些蛋白由核心多肽和一种或多种葡糖胺聚糖侧链组成，也是非常多样化的家族。在基底膜中，层粘连蛋白和触觉蛋白(巢蛋白)是重要成分。纤蛋白是一类有几种基底膜蛋白的结合位点的蛋白。粗纤维调节素(undulin)是纤维形成蛋白，发现其在正常肝中少量与胶原缔合，而在纤维化肝中大量缔合。

结缔组织中的胶原和其它蛋白包含Arg-Gly-Asp氨基酸序列，该序列赋予与细胞粘附分子整联蛋白家族的结合。其它氨基酸序列也可组成核心结合基序，配体其它部分提供了亲和性以及特异性。β₁整联蛋白在胶原蛋白结合中很重要。其它胶原-结合蛋白包括盘基菌蛋白区域受体，通过活化酪氨酸激酶应答于胶原。

胶原纤维是横向柔韧的，但既无弹性也无可压缩性。结缔组织的弹性特性由弹性蛋白和其相关蛋白耐酸纤维蛋白(oxytalan)和弹性纤维蛋白(elaunin)提供。纤蛋白1和2是其它蛋白，所述蛋白形成缔合弹性蛋白和其它结构成分微纤维相关糖蛋白的弹性纤维。异常弹性纤维发现于肝纤维化区域。

胶原沉积是损伤愈合的常见过程，导致常见的“癜痕组织”形成。胶原沉积是降低组织功能性的过程。这在组织的弹性重要时是明显的，突出的实例是心肌梗塞愈合中形成的癜痕组织。在肝中，硬质纤维的作用较不明显。肝纤维化部分过程是肝细胞和肝窦有孔内皮间的细胞外基质物质的沉积，伴有窦状隙向有普通基底膜的毛细血管的转化。这种转化通过阻止血液和肝细胞间溶质的转移降低肝功能。

肝纤维化开始于导致肝细胞损伤或死亡的损伤。该损伤启动炎症反应。细胞因子、趋化因子和ECM基质蛋白(胶原和纤连蛋白)片段的释放导致肝细胞的活化和炎性细胞如粒细胞的募集。炎症，包括氧化应激，是大多数肝纤维化起因的常见因素。重要事件是星形细胞(aka贮脂细胞或Ito细胞)的活化。正常肝中这些细胞的最已知功能是贮存维生素A。活化时，它们失去其维生素A，分化成肌成纤维细胞。这些细胞是产胶原细胞。

肝纤维化致病因子有多种：乙醇、肝炎病毒、胆管炎、血色病、Wilson氏病和schizostomiasis。在试验动物(通常大鼠)中，纤维化可由四氯化碳或硫代乙酰胺诱导。这些试剂多数产生特殊模式的肝损伤，包括胶原沉积。炎症反应的作用是多样的，在某些病症例如血色病中，氧化应激很重要。

如果限制损伤的程度和时间，所致纤维化是可逆的。在肝脏，持续应激可导致肝硬化，其特征在于普遍损伤，再生结节形成和使肝结构变形的纤维化。在大鼠中，I型胶原的半衰期为30天，III型半衰期为15天。当肝硬化由四氯化碳诱导时，两种胶原的半衰期减少50％。胶原的量达到高于正常值的5-10倍(但不超过30-35 mg/g)。

肝纤维化的诊断和治疗要点是预防不可逆的肝损伤和其后的功能降低。胶原沉积的量增加和模式转变指示肝纤维化。阳性组织活检认为是确定答案。组织活检是侵入性方法，有1-5％频率的严重并发症。单次未导向的组织活检将漏掉10-30％病例中的肝硬化。如果检测三份样品，正确的诊断可增加到100％。由于并发症发生率随着组织活检进行的次数而增加，似乎三次组织活检可增加并发症发生率到10％水平。此外，组织活检的评价远非直截了当的。

在肝病任何阶段中，纤维化区域中最多有四倍变异；而且，不同阶段间的纤维化区域有大量重叠。因此，胶原量，如通过计算机辅助成像分析计算的，在确定纤维化阶段中具有极小价值。有经验的观察者使用标准化评分方法确实提供可信的阶段信息。实际上，这些系统工作如此好，以至只有极小动机去进一步寻找胶原以外的组织学标记。然而，ECM基质蛋白生腱蛋白在早期损伤时沉积，且在经常不存在于成熟的癜痕组织，而玻连蛋白是成熟纤维组织的标记。

使用至今的肝纤维化的血清学标记可分为两种：肝功能改变标记(平板计数，肝转氨酶)和ECM反转标记。后者可包括胶原沉积(例如循环的胶原前肽)和/或胶原降解(例如胶原IV循环片段)的标记。谨慎选择的标记组合可比单标记得到更精确的结果，但关于此问题没有广泛的认可。

明确需求可在早期阶段、不可逆损伤发生前诊断纤维化的可信试验。将来试验的非常期待的特征是定量ECM变化的能力。

如上所述，胶原过度沉积减少组织弹性。这也包括在心肌梗塞愈合中形成癜痕组织。在心脏损伤或心壁压力持续增加后，心脏试图由重建补偿。这种过程意味着心室腔大小和形状的进行性改变，伴随心肌组成的改变。典型的反应包括存活心肌细胞的扩大和胶原类型、交联和浓度的改变。似乎开始时细胞外基质部分退化，伴随心肌细胞肥大。随后是慢性补偿阶段，胶原浓度回复正常。但是，如果心脏不能补偿，除显著纤维化外重构导致显著的心室扩张。心衰最后阶段的特征在于细胞外基质的进一步重构，伴随肌原纤维瓦解和肌细胞减少。胶原持续累积，但胶原纤维以不规则方式堆积。

纤维化是超过200种肺病的构成成分。重复损伤或持续应激例如炎症和/或吸入的颗粒，与改变结缔组织沉积方向平衡的遗传因素一起，是常见的病因学成分。一个实例是α₁蛋白酶抑制剂的缺乏，该蛋白的活性也可作为吸烟的后果而减低。其主要功能是抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。如在其它器官的纤维化中，合成和降解之间的不平衡可启动实际上损伤功能的修复过程。如在心脏或肝的纤维化中，肌成纤维细胞在病理学中显著出现。它们最初作为成纤维细胞募集，随后分化。似乎“修复过程”可在没有可察觉炎症时持续，导致进行性的功能缺失。

相关技术描述

WO 89/10758描述了结合生物颗粒表面膜的化合物。这些化合物包括生物-影响物质，选择至少一种烃取代基以使化合物有足够非极性，以赋予化合物脂质结合能力，其中生物-影响物质可以是菁染料。

WO 93/11120描述了结合含脂质生物相容性颗粒如细胞和病毒的化合物。选择这些化合物，以使化合物有足够的非极性以赋予化合物脂质结合能力。

发明概述

本发明提供新造影剂，用于诊断和监测治疗涉及胶原过度形成的疾病。胶原过度沉积相关疾病和适应症为例如心衰、肺和肝纤维化、动脉粥样硬化、关节炎和皮肤疾病。

因此，本发明提供造影剂，用于诊断心衰和涉及胶原过度沉积的其它疾病，例如上述疾病，该造影剂包含结合一个或多个可成像部分的靶向部分。可成像部分可以是给予对象时可产生所述造影剂分布的至少部分所述对象的图像的任何可成像部分，例如通过放射成像、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、正电子发射断层成像(PET)、磁共振成像(MRI)、X射线、光学成像(OI)、超声(US)、电阻抗或磁强成像模式。

本发明进一步提供所述疾病的成像方法和监测这种疾病治疗进程的方法。本发明也提供新的药物组合物和制备诊断性造影剂的前体。提供造影剂试剂盒，特别是制备放射药物造影剂的试剂盒。

本发明造影剂用通式(I)描述：

Z₁-L-V-Z₂ (I)

通式(I)将进一步描述于下文中。

发明详述

从一个方面看，本发明提供如权利要求中定义的式(I)的造影剂。在通式(I)的造影剂中：

Z₁-L-V-Z₂ (I)

至少Z₁和Z₂之一存在，是在人和动物体体内成像中相同或不同的可检测指示部分，V是与胶原形成区域有结合亲和力的靶向部分，L是共价键、生物修饰物或连接部分。

Z在下文中用于表示Z₁和Z₂之一或全部。Z可以是任何可成像部分。

对用于诊断、具体地说是体内诊断的造影剂，Z部分包含一个或多个可成像部分。当可成像部分自身不能直接结合到V或L(当存在时)时，例如当可成像部分是金属颗粒或下文中标注为M的金属离子时，那么Z包含Y₁M部分，其中Y₁是可结合到V或L(当存在时)并同时带有M的部分。带有是指在Y₁和M部分之间任何形式的缔合例如化学键，如共价键或电价键或离子键或通过吸附或任何其它类型的缔合。

当M是金属颗粒或金属离子时，Y₁表示螯合剂。

Z和/或Y₁M的性质将依赖于应用于诊断的成像模式。在体内诊断成像方法中Z和/或Y₁M必须可直接或间接检测，例如发射或可被引起发射可检测辐射(例如通过放射性衰变、荧光激发、自旋共振激发等)的部分、影响局部电磁场(例如顺磁性、超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性类)的部分、吸收或散射射线能量(例如生色团、颗粒(包括含有气体或液体的小泡)、重元素和其化合物等)的部分和产生可检测物质(例如微气泡发生器)的部分。

特别优选下文中式(II)和(III)的螯合剂。

合适的可成像部分的宽范围从例如WO 98/18496中已知，其内容通过引用整体结合到本文中。

成像模式和可成像部分Z和M详述于下文中。

在第一个实施方案中，在式(I)化合物中Z部分包含带有一个或多个可成像M部分的Y₁部分，M用于辐射和SPECT成像模式。优选M是低或无α-和β-发射的γ发射器，半衰期超过1小时。优选基团M是放射性核素⁶⁷Ga、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、^81mKr、⁹⁹Mo、^99mTc、²⁰¹TI和¹³³Xe。最优选为^99mTc。

M可进一步由下列同位素或同位素对表示，其用于成像和治疗而不需要改变放射标记方法或螯合剂：⁴⁷Sc₂₁；¹⁴¹Ce₅₈；¹⁸⁸Re₇₅；¹⁷⁷Lu₇₁；¹⁹⁹Au₇₉；⁴⁷Sc₂₁；¹³¹I₅₃；⁶⁷Cu₂₉；¹³¹I₅₃和¹²³I₅₃；¹⁸⁸Re₇₅和^99mTc₄₃；⁹⁰Y₃₉和⁸⁷Y₃₉；⁴⁷Sc₂₁和⁴⁴Sc₂₁；⁹⁰Y₃₉和¹²³I₅₃；¹⁴⁶Sm₆₂和¹⁵³Sm₆₂；⁹⁰Y₃₉和¹¹¹In₄₉。

当M表示金属放射性核素时，Y₁表示适合于与M形成稳定螯合物的螯合剂。这种螯合剂是本领域技术人员已知的，这种螯合剂的典型实例描述于WO 01/77145的表I中。

特别优选式(II)的螯合剂Y₁：

其中R₁、R₂、R₃和R₄各自独立表示H、C_1-10烷基、C_3-10烷芳基、C_2-10烷氧基烷基、C_1-10羟烷基、C_1-10烷基氨基、C_1-10氟烷基，或2个或更多个R基团与其连接的原子一起形成饱和或不饱和的碳环或杂环。

更特别优选式(II)的螯合剂Y₁，其中R₁、R₂和R₃是氢或甲基，R₄是烷基氨基，最具体为式(III)化合物，在下文中标注为cPN216。

最优选Z是cPN216与^99mTc的螯合物。

式(II)和(III)的螯合剂的合成描述于WO 03/006070。

非金属放射性核素Z基团如¹²³I、¹²⁵I和¹³¹I可通过本领域技术人员已知的取代或加成反应共价结合到V和L(当存在时)部分。

在第二个实施方案中，包含Z部分的式(I)化合物用于PET成像模式。Z此时表示正电子发射性质的放射发射物。优选基团Z是放射性核素¹¹C、¹⁸F、⁶⁸Ga、¹³N、¹⁵O和⁸²Rb。特别优选¹⁸F。也优选与螯合剂Y₁螯合的金属放射性核素⁸²Rb和⁶⁸Ga。

硫醇偶联化学、¹⁸F-合成子和使用硫醇偶联化学制备的标记肽描述于WO 03/080544，其内容通过引用整体结合到本文中。

使用硫醇偶联化学标记的肽的描述可见于WO2005/01235，其内容通过引用整体结合到本文中。

在另一个优选实施方案中Y₁表示DOTA螯合剂，M是可使用微波化学容易地导入螯合剂中的⁶⁸Ga。

非金属放射性核素Z基团例如¹⁸F可通过本领域技术人员已知的取代或加成反应共价结合到V和L(当存在时)部分，也描述于如WO03/080544，其内容通过引用整体结合到本文中。

在第三个实施方案中，式(I)化合物的Z部分包含带有一个或多个可成像部分M的Y₁部分，M用于MR(磁共振)成像模式。此处M指顺磁性金属离子，如美国专利4 647 447中提及的。特别优选顺磁性金属离子Gd³⁺、Dy³⁺、Fe³⁺和Mn²⁺。Y₁表示螯合剂，特别是螯合剂如无环或环状聚氨基羧酸酯(例如DTPA、DTPA-BMA、DOTA和DO3A)，例如美国专利4 647 447和WO 86/02841中所述。

在MR成像中，M也可表示金属氧化物例如超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性物类，其被Z吸附，例如Z作为金属氧化物的包衣。用作MR造影剂的金属氧化物描述于如美国专利4 647 447，其内容通过引用整体结合到本文中。

在第四个实施方案中，式(I)化合物的Z部分包括带有一个或多个可成像部分M的Y₁部分，M用于X射线成像模式。此处M表示重金属如W、Au和Bi，其可为吸附到Z的氧化物形式或为金属实体(氧化价为O)形式。Z也可表示碘化芳基衍生物，具体地说是已知的碘化X射线造影剂，例如商标名为Iopamidol^TM和Omnipaque^TM的已知造影剂。这些试剂可通过其酰胺或氨基功能度连接到式(I)的V和L(当存在时)部分。

在另一个实施方案中式(I)化合物包含充气微囊形式的Z部分。这种超声成像剂可应用于受体成像，例如当将它们功能化以结合肽时，如本领域现有技术例如WO98/18500中的描述。

在本发明的第六个实施方案中，式(I)化合物的Z部分可以是任何在光学成像方法中可直接或间接检测的部分。可检测部分可以是光散射体(例如有色或无色粒子)、光吸收体或光发射体。更优选Z由染料表示，例如生色团或荧光化合物。Z部分可以是任何染料，该染料与波长从紫外到近红外的电磁谱内的光相互作用。优选形式的Z有荧光特征。

优选的有机染料部分包括具有广泛的不定域电子系统的基团，例如菁、份菁、吲哚菁、酞菁、萘菁(naphthalocyanine)、三苯基甲川、卟啉、吡啶菁(pyrilium)染料、硫代吡啶菁(thiapyrilium)染料、方酸菁(squarylium)染料、克酮酸菁(croconium)染料、薁菁(azulenium)染料、靛苯胺、苯并吩嗪染料、苯并硫代吩噻嗪染料、蒽醌、萘醌、靛蒽酮(indathrene)、邻苯二甲酰吖啶酮、三(苯酚合苯醌)、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移染料和染料复合物、环庚三烯酮、四嗪、二(二硫杂环戊烯)复合物、二(苯二硫酚)复合物、碘苯胺染料、二(S，O-二硫杂环戊烯)复合物。荧光蛋白，例如具有不同吸收/发射特征的绿色荧光蛋白(GFP)和GFP修饰物也是有用的。某些稀土金属(例如铕、钐、铽或镝)的复合物在某些情况下使用，例如为荧光纳米晶体(量子点)。

优选光学成像部分的实例是菁染料(CyDyeTM)。菁染料定义为含有奇数个碳原子的多烯链化合物，所述碳原子由交替的单个和多个(优选两个)碳-碳键连接，两端均结束于氨基，其中一个氨基季铵化。菁和类似的芳基-连接基团-芳基生色团任选带有侧链或稠环取代基。菁染料的一般描述和其合成描述于美国专利6,048,982、5,268,486和欧洲专利1 037 947，它们均通过引用结合到本文中。菁染料因为宽范围光谱特征和可获得的结构变异而特别有用。一系列菁染料是已知并测试过的，它们具有低毒性，可市售获得(GE Healthcare，原为Amersham Biosciences)。菁染料是有良好水溶性的高强度染料的单一家族。它们在pH 3-10之间pH不敏感，显示出低的非特异性结合，比荧光素更耐光。

菁染料优选选自碳杂菁、氧杂菁、硫杂菁和氮杂菁，由下列通式表示。

式VI：碳杂菁式VII：氧杂菁

式VIII.硫杂菁式IX.氮杂菁

在这些结构中J1基团相同或不同，是取代或未取代的烷基，优选C1-C6烷基，可含有醚或-N-CO-N-基团。烷基任选由羧基、磺酸基团、氨基、铵基或酯基取代。J1基团可与任何多烯链的碳原子形成桥，例如通过-N-CO-N-基团或醚基。J2基团也相同或不同，是取代或未取代的烷基。烷基任选由羧基或磺酸基团取代，但优选J2基团是低级烷基，例如C1-C6烷基，最优选甲基。任选的芳基以虚线指示，以包括含有稠合苯并环或稠合萘并环两者的结构。环是取代或未取代的。环可以由磺酸基团、羧基、羟基、烷基(磺基烷基)氨基、二(磺基烷基)氨基、磺基烷氧基、磺基烷基磺酰基、烷基或取代烷基或磺基烷基氨基取代。烷基基团优选为低级烷基如具有1-6个碳原子。Y选自氢、卤素、氨基或磺酰基，优选氢。菁染料多烯链也可含有一个或多个环状化学基团，在多烯链的两个或更多个碳原子之间形成桥，例如通过包括在链的两个碳原子间的-CO-基团，如在squaraine染料中，或通过包括烷基桥。这些桥可用来增加染料的化学稳定性或耐光性。

在式VI-IX中，I是正整数1、2、3或4得到有三碳原子碳桥的三甲川菁、五甲川菁、七甲川菁或九甲川菁染料。优选地，菁染料分别是具有3、5或7碳原子碳桥的染料。

J1和J2是连接染料到靶向部分V的潜在连接点，任选通过连接物部分L，优选J1。在优选方面中一个J1连接到靶向部分V，而其它R1基团是任选取代的C1-C6烷基。

适合光学成像方法的部分的进一步描述见于WO 2005/003166，其内容通过引用整体结合到本文中。

式(I)的化合物的V部分含有对胶原形成区域有亲和力的氨基酸序列X₃-G-D。化合物优选含有其它氨基酸和任选的其它部分，其中序列X₃-G-D是肽载体结合位点，肽载体功能是作为载体结合到胶原形成区域。

可约束(constrain)本发明的式(I)化合物，如通过在肽载体部分中形成一个或多个环化桥。单环肽化合物可通过在氨基酸之间形成二硫键或硫醚键得到。式(I)化合物优选包含化合物的不同氨基酸之间的两个环化桥。术语“环化桥”指允许导入桥的氨基酸或氨基酸与与带有功能基团的-(CH₂)_n-或-(CH₂)_n-C₆H₄-基团的任何组合。n表示从1到10的正整数。优选实例是二硫化物、二硫化物模拟物例如-(CH₂)₄-碳桥、硫代乙缩醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫氨酸)和含酯和醚的桥。优选地，一个桥形成二硫键，第二个桥含有硫醚(硫化物)键。

在另一个实施方案中，式(I)的载体V由式(VI)表示

R_a-C(＝O)-X₁-X₂-X₃-G-D-X₄-X₅-X₆

(VI)

含有两个环化桥，其中，

X1表示共价键或1、2、3、4或5个氨基酸残基，其中一个氨基酸残基任选用连接部分L功能化，优选所述氨基酸残基拥有功能侧链例如酸或胺基团，优选选自天冬氨酸或谷氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸；

X₂和X₄独立表示能形成环化桥的氨基酸残基，例如形成二硫键或硫醚键的半胱氨酸或高半胱氨酸残基，或其它能形成环化桥的氨基酸残基如天冬氨酸和赖氨酸，优选X₂和X₄表示半胱氨酸或高半胱氨酸残基；

X₃表示精氨酸、N-甲基精氨酸或精氨酸模拟物；

X₅表示疏水氨基酸或其衍生物，优选表示酪氨酸、苯丙氨酸、3-碘-酪氨酸或萘丙氨酸残基，更优选苯丙氨酸或3-碘-酪氨酸残基；

X₆表示能形成环化桥的氨基酸残基，优选含巯基氨基酸残基，优选半胱氨酸或高半胱氨酸残基；

R_a表示能形成桥至X₂、X₄或X₆之一的-(CH₂)_n-或-(CH₂)_n-C₆H₄-部分；

n表示从1到10的正整数。

在本发明一个方面中，式(I)的L部分表示优选基于单分散PEG构件的同系生物修饰物部分，含有1-10个所述构件，所述生物修饰物有改变所述造影剂药代动力学和血液清除率的功能。另外，L也可表示1-10个氨基酸残基，优选甘氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或丝氨酸。在一个优选实施方案中，L表示含有单分散PEG样结构的生物修饰物单元，式(V)的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七烷酸。

其中m等于1-10整数，C末端单元是酰胺部分。

如上所注明，生物修饰物L改变化合物的药代动力学和血液清除率。生物修饰物有效降低化合物在组织即肌肉、肝等中的摄取，由此作为更少背景干扰的结果得到更好的诊断成像。主要通过肾分泌，这为生物修饰物增加了其它优点。

L可进一步表示优选从戊二酸和/或丁二酸和/或聚乙烯二醇基础单元和/或如上说明的式(V)单元衍生的部分。

其它代表性L成分包括结构型多糖、储存型多糖、聚氨基酸和其甲酯和乙酯、多肽、低聚糖和寡核苷酸，它们可含有或不含酶切位点。

本发明肽可使用所有已知的化学合成方法合成，但特别有用的是使用自动肽合成仪的Merrifield固相方法(J.Am.Chem.Soc.，85：2149(1964))。合成策略的标准方法描述于E.Atherton&R.C.Sheppard，“Solid phase peptide synthesis：a practical approach”，1989，IRL出版社，Oxford。

使用合成树脂与酸敏感连接基团，希望的受保护C末端氨基酸残基通过酰胺键形成与其连接。例如，可应用所谓的Rink酰胺AM树脂与(二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基-衍生的连接基团(Rink，H.(1987)，Tetrahedron Lett.30，p.3787)。肽从这种树脂上酸解断裂将产生肽酰胺。或者，可使用O-二-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂(K.Barlos et al(1988)，Liebigs Ann.Chem，p.1079)，其在酸解断裂时产生有伯胺末端(handle)的肽。

肽酰树脂从C末端到N末端方向组装。首先除去C末端氨基酸的N-氨基-保护基，使用合适的缩合剂偶联序列中的第二个氨基酸。然后在交替步骤中重复N-氨基-去保护和偶联环，直至组装完期望的序列。

一般地，肽合成中所有存在的反应基团都被保护。已知宽范围的氨基酸保护基(见，如Greene，T.W.&Wuts，P.G.M.(1991)Protectivegroups in organic synthesis，John Wiley&Sons，New York)。可使用正交保护基策略(Barany，G.et al(1977)，J.Am.Chem.Soc，99，p.7363)。因此，例如，组合不同氨基保护基例如对哌啶敏感的9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)基团和对酸高度敏感的4-甲基三苯甲基(Mtt)基团，对肼敏感的2-乙酰基二甲基环己二酮(Dde)基团和对酸敏感的叔-丁氧基羰基(Boc)基团，可在不同氨基位点选择性导入不同部分。更进一步，通过组合Cys侧链的对酸敏感的三苯甲基(Trt)保护基和其它Cys残基的叔丁基保护(在酸性氧化性条件如TFA-2％二甲基亚砜下敏感)，得到选择性二硫化物形成。

完全肽酰树脂可在N末端氯乙酰化，在N末端和Cys残基之间导入硫醚桥。

如本领域技术人员已知，通过在氮气氛下用Sn-MDP和Na^99mTcO₄溶液处理溶于蒸馏无氧缓冲溶液(pH约9)的化合物，以^99mTc标记肽。

本发明通过非限制性实施例1-4进一步说明。实施例描述了具有两种不同Z和/或Y₁M部分的化合物的合成。也描述了化合物用^99mTc的标记。

肽中各种氨基酸的位置通过上标数字而可见(如Cys²)。

实施例

实施例1

Cys2-6；c[CH₂CO-Lys(N-(5-磺基-萘-2-基)-Succ)-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-GlutcPn216)-NH₂(4)和其^99mTc螯合物(4a)

ClCH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg(Pmc)-Gly-Asp(tBu)-Cys(tBu)-Phe-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Rink酰氨MBHA树脂1的固相合成

对应上述序列的肽酰树脂通过标准固相肽化学(Barany，G；Kneib-Cordonier，N；Mullenm D.G.(1987)Int.J.Peptide Protein Research 30，705-739)在Rink酰氨MBHA树脂(0.73mmol/g；自NovaBiochem)上组装。使用Applied Biosystems(Perkin Elmer)433A型肽合成仪。残基(从羧基末端)以0.25mmol规模在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中用4倍摩尔过量的N^α-Fmoc-保护的氨基酸(1mmol筒)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU)/1-羟基-苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基-胺(DIEA)使用单偶联组装，使用2.5小时偶联循环。使用NMP中的20％哌啶电导监测完成Fmoc去保护。使用的氨基酸侧链保护基对Lys¹是4-甲基三苯甲基(Mtt)，对Cys²、Cys⁶和Asp是叔丁基(tBu)，对Arg是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)，对Cys⁸是三苯甲基(Trt)，对Lys¹⁰是叔丁氧基羰基(Boc)。

组装的肽酰树脂然后转移到手动氮气起泡器装置(Wellings，D.A.，Atherton，E.(1997)in Methods in Enzymology(Fields，G.ed)，289，p.53-54，Academic Presss，New York)。N末端脱Fmoc保护，然后在二甲基甲酰胺(DMF)中氯乙酰化，使用10倍摩尔过量的对称酐，该酐通过在二氯甲烷(DCM)中反应氯醋酸(20 eq)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)(10eq)形成。通过用含5％三异丙基硅烷(TIS)和1％三氟乙酸(TFA)的DCM处理肽酰树脂5x2分钟，或直至滤液变成无色，选择性除去N^ε-Lys¹的Mtt-保护基。完整的肽酰树脂ClCH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg(Pmc)-Gly-Asp(tBu)-Cys(tBu)-Phe-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Rink酰胺MBHA树脂1用DMF中的5％DIEA中和，最后以DMF和DCM洗涤，在真空下干燥。

Cys2-6；c[CH₂CO-Lys(N-(5-磺基-萘基-2-基)-Succ)-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-Lys-NH₂3的合成

6-氨基-1-萘磺酸(Dahl氏酸)(1eq，0.5mmol)溶于含有N-甲基吗啉(NMM)(2eq)的DMF中，然后加入丁二酸酐(10eq)。反应过夜后，减压下除去溶剂，产物以制备型RP-HPLC(反相HPLC)纯化。柱(Phenomenex Luna C18 10，22×250mm)用在40分钟内0.1％TFA水溶液中5-15％乙腈(ACN)的梯度以10ml/min洗脱。混合从6次连续运行收集的期望峰级分并冻干，得到146mg纯的N-(-5-磺基-萘-2-基)-琥珀酰胺酸2。分析型RP-HPLC：t_R＝16.7分钟，(Phenomenex Luna 5，4.6x250mm，20分钟内0.1％TFA水溶液中5-15％ACN，1ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物的期望[M+H]⁺是324.0m/z，实测值是324.0m/z。

向肽酰树脂1中加入含有NMM(15eq)的N-(-5-磺基-萘-2-基)-琥珀酰胺酸2(5eq)和N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物(HATU)(5eq)的DMF溶液。反应在手动氮气起泡装置中反应过夜。

得到的肽酰树脂然后以含有2.5％TIS和2.5％水的TFA处理2小时，以从树脂上切下Cys^2，6叔丁基保护的肽，同时从肽除去所有其它侧链保护基。过滤出树脂残留物，以少量纯TFA洗涤。合并的滤液和洗液通过旋转蒸发仪浓缩，然后以乙醚研磨，得到粗肽。沉淀通过离心分离，以醚洗涤，然后从50％ACN-0.1％TFA水溶液冻干，收得60mg粗产物。

然后环化线性肽，首先在室温下将肽以0.5mg/ml在pH7.5(以液氨调节)的50％乙腈-水中搅拌60分钟，通过形成硫醚桥进行。环化产物冻干分离。其次，通过在室温下60分钟内以0.5mg/ml于TFA-2％二甲亚砜中同时脱叔丁基保护和形成二硫化物，形成内二硫桥。在减压下除去TFA，从醚中分离肽，如上所述干燥，收得62mg环状产物。粗肽通过制备型RP-HPLC纯化。柱(Phenomenex Luna C1810μ，50×250mm)用60分钟内0.1％TFA水溶液中5-15％ACN的梯度以50ml/分钟洗脱。混合期望的峰级分并冻干，得到12mg纯的产物3。分析型RP-HPLC：t_R＝12.9分钟，(Phenomenex Luna 5μ，4.6×250mm，20分钟内0.1％TFA水溶液中的15-25％ACN，1ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物期望的[M+H]+为1458.5m/z，测定值为1458.2m/z。

cPN216-戊二酰基缀合至肽3

cPN216-戊二酰基-四氟苯硫基酯(2eq)的DMF溶液加入到肽3(1eq，0.008mmol))的DMF溶液中，随后是NMM(6eq)。在搅拌过夜后，反应混合物以减压下除去溶剂，随后用制备型RP-HPLC处理。柱(Phenomenex Luna C18 10μ，22×250mm)用60分钟内0.1％TFA水溶液中13-20％ACN的梯度以10ml/分钟洗脱。混合期望的峰级分并冻干，得到8mg纯的化合物4。分析型RP-HPLC：t_R＝18.4分钟，(Phenomenex Luna 5μ，4.6×250mm，20分钟内0.1％TFA水溶液中15-25％ACN，1ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物的期望[M+H]⁺为949.4m/z，测定值为949.5m/z。

肽4的^99mTc标记

肽4(0.1mg)在盐水或甲醇(0.1ml)中重构，转移至赋形剂的冷冻干燥工具试剂盒。所述工具试剂盒设计为为基于氨基的螯合物提供一般的放射标记条件，含有无水氯化亚锡(16μg)、亚甲基二磷酸(25μg)、碳酸氢钠(4500μg)、碳酸钠(600μg)、对氨基苯甲酸钠(200μg)，试剂盒pH＝9.2。然后加入盐水(3ml)中的高锝酸钠(^99mTc)注射液(2.1GBq)，反转试剂盒几次以溶解内含物，然后放置于室温下孵育15-20分钟。立即以HPLC和ITLC分析样品，在试剂盒重构后1-3小时之间给予试验对象^99mTc标记的肽。

实施例2

Cys2-6；c[CH₂CO-Lys(N-[5-磺基-萘基-2-基]-Succ-Lys(N-[5-磺基-萘基-2-基]-Succ)-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys)-Gly-Lys(Glut-cPn216)-NH₂(9)和其^99mTc螯合物(9a)

Cys2-6；c[CH₂CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-Lys(Glut-cPn216)NH₂7的合成

以上实施例1中描述的肽酰树脂1是N^ε-Lys¹-保护的，通过使用手动氮气起泡装置用2-乙酰基二甲基环己二酮(Dde-OH)的DMF溶液处理2小时。部分保护的肽通过与包含2.5％TIS和2.5％水的TFA处理2小时从树脂上切下。处理反应混合物，从醚分离肽，如实施例1所述冻干，收得70mg的ClCH₂CO-Lys(Dde)-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-Gly-Lys-NH₂5。

线性肽5通过如实施例1描述形成的硫醚桥环化，粗产物(78mg)以制备型RP-HPLC纯化。柱(Phenomenex Luna C18 10μ，50×250mm)用60分钟内0.1％TFA水溶液中20-45％ACN的梯度以50ml/分钟洗脱。混合期望的峰级分并冻干，得到26mg纯的c[CH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-Gly-Lys-NH₂6。分析型RP-HPLC：t_R＝16.35分钟，(Phenomenex Luna 5μ，4.6×250mm，20分钟内0.1％TFA水溶液中20-50％ACN，1ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物的期望[M+H]⁺为716.8m/z，测定值为716.7m/z。

然后将DMF中的cPN216-戊二酰基-四氟苯硫基酯螯合物(2eq)加入到肽6(1eq，0.009mmol)，随后是NMM(3eq)，混合物搅拌过夜。然后N^ε-Lys¹的Dde-基团通过加入足够的肼到反应混合物中产生2％溶液而除去。30分钟后在减压下除去溶剂，产物通过沉淀分离并如上所述冻干。最后如实施例1所述完成肽的脱叔丁基保护和形成二硫化物，收得18mg肽7。

在肽7的N^ε-Lys¹位导入支链Dahl氏酸部分

N-(N^α，ε-二-Boc-赖氨酰氧基)琥珀酰亚胺(3eq)的DMF溶液加入到肽7(1eq，0.006mmol)，随后是NMM(5eq)。18小时后，反应完成，在减压下除去溶剂。肽残基以含2.5％TIS和2.5％水的TFA处理15分钟，得到Cys2-6；c[CH₂CO-Lys(N-Lys)-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-Lys(Glut-cPn216)-NH₂ 8，通过沉淀分离，如上所述冻干。

N-(-5-磺基-萘-2-基)-琥珀酰胺酸3(10eq)由DMF中含NMM(30eq)的HATU(10eq)活化。30分钟后，混合物加入到肽8(1eq)的DMF溶液中，允许反应进行24小时。混合物如上所述处理，冻干的肽产物以制备型RP-HPLC纯化。柱(Phenomenex Luna C18 10μ，10×250mm)用40分钟内0.1％TFA水溶液中10-30％ACN的梯度以5ml/分钟洗脱。混合期望的峰级分并冻干，得到2mg纯的肽9。分析型RP-HPLC：t_R＝17.4分钟，(Phenomenex Luna 5μ，4.6×250mm，20分钟内0.1％TFA水溶液中5-30％ACN，1ml/min，λ＝214nm)。MALDI-TOF MS：产物的期望[M+H]⁺为2330.95m/z，测定值为2330.27m/z。

肽9的^99mTc标记

肽9在如实施例1中标记肽4的条件下用^99mTc标记。

实施例3

Cys2-6；c[CH₂CO-Lys(Cy5.5)-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-Lys(Glut-cPn216)-NH₂ 10和其^99mTc螯合物(10a)

偶联Cy5.5至肽7

Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(2eq)溶于NMP中，溶液中加入肽7(1e.q.0.005mmol)中，随后是NMM(5eq)。反应允许在暗处进行2天。反应混合物然后在45度通过旋转蒸发仪浓缩，然后以0.1％TFA水溶液稀释，以制备型RP-HPLC纯化。柱(Phenomenex Luna C18 10μ，22×250mm)用60分钟内0.1％TFA水溶液中15-30％CAN的梯度以10ml/分钟洗脱。混合期望的峰级分并冻干，得到3.2mg纯的肽10。分析型RP-HPLC：t_R＝20.9分钟，(Phenomenex Luna 5μ，4.6×250mm，20分钟内0.1％TFA水溶液中15-30％ACN，1ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物的期望[M+H]⁺为1245.97m/z，测定值为1246.1m/z。

肽10的^99mTc标记

肽10在如实施例1中标记肽4的条件下用^99mTc标记。

实施例4

Cys2-6；c[CH₂CO-Lys(8-硫脲基-芘-1，3，6-三磺酸)-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-BAEG-Glut-cPn216 14和其^99mTc螯合物(14a)

Cys2-6c[CH₂CO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-CysPhe-Cys]-Gly-BAEG-Glut-cPN216 13的合成

上述序列对应的肽基树脂以类似实施例1中肽基树脂的方式在O-二-(氨基乙基)乙二醇(BAEG)三苯甲基树脂(0.44mmol/g；自NovaBiochem)上组装。使用的N^ε-Lys¹保护基是1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)。组装的肽基树脂然后转移到手动氮气起泡装置，N末端脱Fmoc保护，然后使用DMF中10倍摩尔过量的对称酐氯乙酰化，对称酐通过在DCM中反应氯乙酸(20eq)和DIC(10eq)形成。通过用含2.5％TIS和2.5％水的TFA处理肽基树脂2小时，进行从树脂切下部分保护的肽。处理反应混合物，肽ClCH₂CO-Lys(Dde)-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-Gly-DEG-NH₂ 11从醚分离，如上实施例1所述冻干。

如实施例1所述通过形成硫醚桥环化线性肽11(30mg)，粗产物以制备型RP-HPLC纯化。C-18柱(Vydac 218TP1022，10μ，22×250mm)用60分钟内0.1％TFA水溶液中25-40％ACN的梯度以10ml/分钟洗脱。混合期望的峰级分并冻干，得到15mg纯的肽c[CH₂CO-Lys(Dde)-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-Gly-DEG-NH₂12。分析型RP-HPLC：t_R＝19.2分钟，(Phenomenex Luna 5μ，4.6×250mm，20分钟内0.1％TFA水溶液中25-40％ACN，1ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物的期望[M+H]⁺为1434m/z，测定值为1434.6m/z。

肽12(1eq，15mg)溶于DMF，加入cPN216-戊二酰基-四氟苯硫基酯(2eq)，随后是NMM(3eq)，混合物搅拌过夜。然后通过加入足够的肼到反应混合物产生2％溶液除去N^ε-Lys¹的Dde-基团。30分钟后，在减压下除去溶剂，以沉淀分离产物，如上所述冻干。最后如实施例1所述进行肽的脱叔丁基保护和形成二硫化物。收得18mg完全环化的肽13。

偶联8-异硫氰酰芘-1，3，6-三磺酸到肽13

肽13(1eq，5mg)溶于DMF，加入少量等份的NMM调节pH至8。然后加入DMF中的8-异硫氰酰芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(5eq)，反应混合物搅拌过夜。反应以RP-HPLC和MS分析监测，产物以制备型RP-HPLC纯化。柱(Phenomenex Luna C18 10μ，22×250mm)用60分钟内0.1％TFA水溶液中5-60％ACN的梯度以10ml/分钟洗脱。混合期望的峰级分并冻干，得到0.8mg纯的肽14。分析型RP-HPLC：t_R＝2.04分钟(宽峰)，(Phenomenex Luna 3μ，4.6×5mm，10分钟内0.1％TFA水溶液中10-80％ACN，2ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物的期望[M+H]⁺为1047.8m/z，测定值为1048.2m/z。

肽14的^99mTc标记

肽14在如实施例1中标记肽4的条件下用^99mTc标记。

<110>Amersham Health AS

<120>造影剂

<130>PN0466

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>THIOETH

<222>(1)..(8)

<223>残基1和8之间的硫醚桥

<220>

<221>DISULFID

<222>(2)..(6)

<223>残基2和6之间的二硫桥

<400>1

Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Lys

1 5 10

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>THIOETH

<222>(1)..(9)

<223>残基1和9之间的硫醚桥

<220>

<221>DISULFID

<222>(2)..(6)

<223>残基2和6之间的二硫桥

<400>2

Lys Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Lys

1 5 10

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<220>

<221>THIOETH

<222>(1)..(8)

<223>残基1和8之间的硫醚桥

<220>

<221>DISULFID

<222>(2)..(6)

<223>残基2和6之间的二硫桥

<400>3

Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly

1 5

Claims

1.一种通式(I)的造影剂：

Z₁-L-V-Z₂ (I)

其中至少Z₁和Z₂之一存在，它们是在人和动物体体内成像中相同或不同的可检测指示部分，V是结合胶原形成区域和细胞外基质的靶向部分，L是共价键、生物修饰物或连接部分。

2.权利要求1的造影剂，其中V包含氨基酸序列-X₃-G-D-，其中X₃表示精氨酸、N-甲基精氨酸或精氨酸模拟物。

3.权利要求1和2中任一项的造影剂，其中V是式(VI)的部分

R_a-C(＝O)-X₁-X₂-X₃-G-D-X₄-X₅-X₆

(VI)

包含2个环化桥，其中

X₁表示共价键或1、2、3、4或5个氨基酸残基；

X₂和X₄独立表示能形成环化桥的氨基酸残基；

X₃表示精氨酸、N-甲基精氨酸或精氨酸模拟物；

X₅表示疏水氨基酸或其衍生物，

X₆表示能形成环化桥的氨基酸残基，

n表示1-10的正整数。

4.权利要求3的造影剂，其中

X₁表示1、2、3、4或5个氨基酸残基，其中至少一个氨基酸残基具有功能侧链如酸或胺基团，优选选自天冬氨酸或谷氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸。

5.权利要求3-4中任一项的造影剂，其中

X₂和X₄独立表示形成二硫键或硫醚键的半胱氨酸或高半胱氨酸残基，或能形成环化桥的氨基酸残基如天冬氨酸和赖氨酸。

6.权利要求3-5中任一项的造影剂，其中

X₂和X₄独立表示半胱氨酸或高半胱氨酸残基。

7.权利要求3-6中任一项的造影剂，其中

X₅表示酪氨酸、苯丙氨酸、3-碘-酪氨酸或萘丙氨酸残基。

8.权利要求3-7中任一项的造影剂，其中

X₆表示含巯基氨基酸残基。

9.权利要求3-8中任一项的造影剂，其中

X₆表示半胱氨酸或高半胱氨酸残基。

10.前述权利要求中任一项的造影剂，其中L表示含有1-10个氨基酸残基的肽。

11.前述权利要求中任一项的造影剂，其中L表示甘氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或丝氨酸残基。

12.权利要求1-9中任一项的造影剂，其中L含有一个或多个二羧酸单元、乙二醇单元或PEG样成分或其组合。

13.权利要求1-9和12中任一项的造影剂，其中L含有一个或多个diclycolyl、羟乙酰基或琥珀酰基单元或其组合。

14.权利要求1-9和12-13中任一项的造影剂，其中L表示生物修饰物单元，所述单元含有式(V)的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七烷酸的单分散PEG样结构，

其中m等于1-10的整数，C末端单元是酰胺部分。

15.前述权利要求中任一项的造影剂，其中Z₁和Z₂表示相同或不同的发射辐射和/或影响局部电磁场和/或吸收或散射辐射能量的指示部分。

16.权利要求15的造影剂，其中Z₁和Z₂表示在SPECT、PET或光学成像模式中可成像的指示部分。

17.权利要求15和16中任一项的造影剂，其中至少Z₁和Z₂之一包含共价连接到V和/或L部分的非金属放射性核素。

18.权利要求17的造影剂，其中至少Z₁和Z₂之一包含¹¹C、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和/或¹³¹I。

19.权利要求18的造影剂，其中至少Z₁和Z₂之一表示式Y₁M的指示部分，其中M是金属实体，优选金属离子实体，Y₁是能结合V和/或L和带有M的螯合剂。

20.权利要求19的造影剂，其中Y₁是式(II)的螯合剂，

21.权利要求20的造影剂，其中所述螯合剂具有式(III)

22.权利要求19-21中任一项的造影剂，其中M部分表示金属放射性核素、顺磁性金属离子、荧光金属离子、重金属离子或簇离子。

23.权利要求19-22中任一项的造影剂，其中M部分选自⁹⁰Y、^99mTc、¹¹¹In、⁴⁷Sc、⁶⁷Ga、⁵¹Cr、^177mSn、⁶⁷Cu、¹⁶⁷Tm、⁹⁷Ru、¹⁸⁸Re、¹⁷⁷Lu、¹⁹⁹Au、²⁰³Pb、¹⁴¹Ce或¹⁸F。

24.权利要求15-23中任一项的造影剂，其中Z₁和Z₂部分之一是包含2个或更多个磺酸部分的菁染料，其它的Z₁和Z₂部分是用辐射发射物标记的式(III)部分。

25.权利要求19的造影剂，其中螯合剂Y₁是DOTA。

26.前述权利要求中任一项的造影剂，其中指示部分是用于SPECT成像的^99mTc或碘同位素，或用于PET成像方法的¹¹C、¹⁸F或⁶⁸Ga同位素，或用于MR成像的Gd³⁺。

27.一种药物组合物，所述组合物包含有效量的式(I)造影剂或其盐，以及一种或多种药物可接受辅料、赋形剂或稀释剂，用于增强在体内成像中的图像对比。

28.式I造影剂用于制备造影剂的用途，所述造影剂用于胶原形成相关疾病的诊断方法。

29.一种产生人或动物体的增强图像的方法，所述人或动物体给予了包含式(I)定义造影剂的造影剂组合物，所述方法包括产生至少部分所述机体的图像。

30.一种生产人或动物体的增强图像的方法，所述人或动物体预先给予了包含式(I)定义造影剂的造影剂组合物，所述方法包括产生至少部分所述机体的图像。

31.一种用于制备式I的放射性药物组合物的试剂盒，所述组合物包含配体-螯合剂缀合物和还原剂。

32.权利要求31的试剂盒，其中所述还原剂是亚锡盐。

33.权利要求31和32中任一项的试剂盒，所述试剂盒另外包含一种或多种用于冻干的稳定剂、抗氧化剂、填充剂和增溶剂。