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CN101087879A - 气味受体的调控剂 - Google Patents

气味受体的调控剂 Download PDF

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CN101087879A CNA2005800275380A CN200580027538A CN101087879A CN 101087879 A CN101087879 A CN 101087879A CN A2005800275380 A CNA2005800275380 A CN A2005800275380A CN 200580027538 A CN200580027538 A CN 200580027538A CN 101087879 A CN101087879 A CN 101087879A
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Abstract

本发明涉及能促进气味受体细胞表面定位和气味受体功能性表达的多肽。本发明还提供了用于检测对多种气味受体特异性的配体的测定。另外，本发明提供了筛选气味受体辅助蛋白多态性和与疾病状态有关的突变的方法，以及筛选治疗剂、这样的蛋白的配体和调控剂的方法。

Description

气味受体的调控剂
本申请要求2004年6月18日提交的美国临时申请系列号60/581,087和2004年6月22日提交的美国临时申请系列号60/582,011的优先权，它们各自的内容在这里整体引作参考。
本发明在国立卫生研究院颁发的资助号DC05782的政府支持下完成。
发明领域
本发明涉及能促进气味受体细胞表面定位和气味受体功能性表达的多肽。本发明还提供了用于检测对多种气味受体特异性的配体的测定。另外，本发明提供了筛选气味受体辅助蛋白多态性和与疾病状态有关的突变的方法，以及筛选这样的蛋白的治疗剂、配体和调控剂的方法。
发明背景
嗅觉机能障碍由多种原因引起，且深刻地影响患者的生活质量。大约200万美国人经历某种类型的嗅觉机能障碍。研究表明，嗅觉机能障碍影响至少1％低于65岁的人群，和大大超过50％高于65岁的人群。嗅觉决定着食物和饮料的香味，并作为检测环境危害的预警系统，所述环境危害例如腐烂的食物，泄漏的天然气，烟雾或空气传播的污染物。嗅觉的丧失或失真，会不利地影响食物偏好、食物摄入和食欲。
嗅觉障碍分为：1)嗅觉丧失：不能检测定性的嗅觉(例如，缺乏嗅觉功能)，2)部分的嗅觉丧失：能察觉一些、但不是全部的气味，3)嗅觉减退或microsmia：降低的对气味的敏感性，4)嗅觉过敏：异常敏锐的嗅觉功能，5)嗅觉障碍(恶臭或嗅觉倒错)：扭曲的或歪曲的嗅觉或气味刺激，6)幻嗅(phantosmia)：在没有气味刺激的情况下感知的嗅觉障碍性感觉(也称作嗅幻觉)和7)嗅觉性认识不能：不能识别气味感觉。
嗅觉机能障碍还分为：1)鼻道的阻塞(例如，慢性鼻炎症，息肉病等)引起的传导性或运输性损伤，2)神经上皮的破坏(例如，病毒感染，空气传播的毒素，等)引起的感觉神经的损伤，3)中枢神经系统损伤(例如，肿瘤，影响嗅束的肿块，神经变性障碍，等)引起的中枢嗅觉神经损伤。这些分类不是相互排斥的。例如，病毒可以造成对嗅觉神经上皮的损伤，且它们也可以通过嗅神经转运进入中枢神经系统，造成对嗅觉系统的中枢元件的损伤。
嗅觉能力最初由嗅上皮中的神经元决定，即嗅感觉神经元(在下文中称作“嗅觉神经元”)。在嗅觉神经元中，在内质网中合成气味受体(odorant receptor)(在下文中称作″OR″)蛋白，它们是G-蛋白偶联受体(在下文中称作″GPCR″)超家族的成员，运输并最终集中在树突尖端的纤毛的细胞表面膜处。考虑到OR在形成嗅觉轴突的靶物识别中起作用，OR蛋白也存在于轴突末端(见，例如，Mombaerts，P.，(1996)Cell87，675-686；Wang，F.等(1998)Cell 93，47-60；各自在本文中整体引作参考)。在啮齿动物中，气味通过由多基因家族编码的多达1000种不同的OR转导(见，例如，Axe l，R.(1995)Sci Am 1273，154-159；Buck，L.和Axel，R.(1991)Cell 65，175-187；Firestein，S.(2001)Nature 413，211-218；Mombaerts，P.(1999)Annu RevNeurosci 22，487-509；Young，J.M.等，(2002)Hum Mol Genet 11，535-546；Zhang，X.和Firestein，S.(2002)Nat Neurosci 5，124-133；各自在本文中整体引作参考)。每个嗅觉神经元仅仅表达一类OR，形成嗅觉神经元辨别气味的细胞基础(见，例如，Lewcock，J.W.和Reed，R.R.(2004)Proc Natl Acad Sci USA；Malnic，B.等，(1999)Cell 96，713-723；Serizawa，S.等，(2003)Science 302，2088-2094；各自在本文中整体引作参考)。
需要更好地理解嗅觉感觉。还需要更好地理解气味受体功能。
发明简述
本发明涉及能促进气味受体细胞表面定位和气味受体功能性表达的多肽。本发明还提供了用于检测对多种气味受体特异性的配体的测定。另外，本发明提供了筛选气味受体辅助蛋白多态性和与疾病状态有关的突变的方法，以及筛选治疗剂、这样的蛋白的配体和调控剂的方法。
在优选的实施方案中，本发明提供了鉴定气味受体配体的方法，包括下述步骤：a)提供i)细胞系或其细胞膜，其包含气味受体和报道试剂，和ii)测试化合物；b)将测试化合物暴露于细胞系；和c)测量报道试剂的活性。在有些实施方案中，细胞系表达REEP1，RTP1，RTP2，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2和RTP1-D3。在有些实施方案中，细胞系是异源的细胞系或天然的细胞系。在有些实施方案中，细胞系是293T细胞系。在优选的实施方案中，气味受体是人气味受体。在其它优选的实施方案中，测试化合物是气味分子。在其它实施方案中，报道试剂由cAMP效应元件调节，在优选的实施方案中，细胞系还包含Gαolf。在其它实施方案中，气味受体是鼠气味受体。在其它实施方案中，气味受体是合成的气味受体。在优选的实施方案中，气味受体包括S6/79，S18，S46，S50，MOR23-1，MOR31-4，MOR31-6，MOR32-5和/或MOR32-11。在其它实施方案中，报道试剂是发光剂。在其它实施方案中，发光剂是萤光素酶。在替代实施方案中，该方法还包括基于报道试剂活性检测气味受体配体是否存在的步骤。
在优选的实施方案中，本发明提供了表达气味受体的细胞系，其中该表达定位于细胞表面。在优选的实施方案中，细胞系包含异源基因。在优选的实施方案中，异源基因包含REEP1，RTP1和RTP2中的一个或多个。在其它优选的实施方案中，细胞系是293T细胞系。在有些实施方案中，气味受体是人气味受体。在优选的实施方案中，气味受体标记有报道试剂。在有些实施方案中，报道试剂是发光的报道试剂。在有些实施方案中，发光的报道试剂包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，c-myc，6-组氨酸(6X-His)，绿色荧光蛋白(GFP)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，甲型流感病毒血球凝集素(HA)，β-半乳糖苷酶或GAL4。在优选的实施方案中，细胞系还包含Gαolf表达。在优选的实施方案中，气味受体是鼠气味受体。在有些实施方案中，气味受体是合成的气味受体。在优选的实施方案中，气味受体包括S6/79，S18，S46，S50，MOR23-1，MOR31-4，MOR31-6，MOR32-5和MOR32-11。
本发明还提供了分离的核酸，其包含序列，后者编码包含SEQ IDNO：21，27，33，34，37，38和41-50的蛋白，以及与SEQ ID NO：21，27，33，34，37，38和41-50至少80％一致的其变体。在优选的实施方案中，该序列可操作地连接到异源启动子上。在优选的实施方案中，该序列包含在载体中。在优选的实施方案中，该载体是在宿主细胞中。
本发明也提供了分离的和纯化的核酸序列，其能在高严格性条件下与包含SEQ ID NO：1，7，13，14，17和/或18的核酸杂交。在优选的实施方案中，该序列可操作地连接到异源启动子上。在优选的实施方案中，该序列包含在载体中。在有些实施方案中，宿主载体是在宿主细胞中。在进一步优选的实施方案中，在宿主细胞中表达宿主载体。在优选的实施方案中，宿主细胞位于生物中，其中该生物是非人的动物。在优选的实施方案中，本发明提供了包含至少15(例如，15，18，20，21，25，50，100，1000，...)个核苷酸的多核苷酸序列，其能在严格的条件下与分离的核苷酸序列杂交。
在优选的实施方案中，本发明提供了由选自SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18的核酸以及与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少80％一致的其变体编码的多肽。在其它实施方案中，蛋白与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少90％一致。在其它实施方案中，蛋白与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少95％一致。
在优选的实施方案中，本发明提供了包含核酸的组合物，所述核酸会抑制选自SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18的核酸的至少一部分与它们的互补序列的结合。
在优选的实施方案中，本发明提供了检测受试对象中的变体REEP多肽的方法，包括提供来自受试对象的生物样品，其中生物样品包含REEP多肽；和检测生物样品中是否存在变体REEP多肽。在优选的实施方案中，生物样品选自血液样品，组织样品，尿样品和羊水样品。在其它实施方案中，受试对象选自胚胎，胎儿，新生动物和幼小动物。在其它实施方案中，动物是人。在优选的实施方案中，检测包括差异抗体结合。在其它实施方案中，检测包括蛋白印迹。在有些优选的实施方案中，变体REEP多肽是变体REEP1多肽。在其它实施方案中，检测包括检测REEP1核酸序列。
在优选的实施方案中，本发明提供了检测受试对象中的变体RTP多肽的方法，包括提供来自受试对象的生物样品，其中生物样品包含RTP多肽；和检测生物样品中是否存在变体RTP多肽。在优选的实施方案中，生物样品选自血液样品，组织样品，尿样品和羊水样品。在其它实施方案中，受试对象选自胚胎，胎儿，新生动物和幼小动物。在其它实施方案中，动物是人。在优选的实施方案中，检测包括差异抗体结合。在其它实施方案中，检测包括蛋白印迹。在有些优选的实施方案中，变体RTP多肽是变体RTP1和/或RTP2多肽。在其它实施方案中，检测包括检测RTP1和/或RTP2核酸序列。在优选的实施方案中，RTP1变体选自RTP1-A1，RTP1-D1和RTP1-D3。
在优选的实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含用于检测生物样品中是否存在变体REEP多肽的试剂。在有些实施方案中，试剂盒还包含关于使用试剂盒来检测生物样品中是否存在变体REEP多肽的说明书。在优选的实施方案中，REEP多肽是REEP1多肽。在其它实施方案中，REEP多肽选自REEP1-6。在优选的实施方案中，说明书包括美国食品和药品管理局要求的体外诊断试剂盒说明书。在优选的实施方案中，试剂是一种或多种抗体。在优选的实施方案中，生物样品选自血液样品，组织样品，尿样品和羊水样品。在优选的实施方案中，配置试剂，以检测REEP1核酸序列。
在优选的实施方案中，本发明提供了包含试剂盒，其包含用于检测生物样品中是否存在变体RTP多肽的试剂。在有些实施方案中，试剂盒还包含关于使用试剂盒来检测生物样品中是否存在变体RTP多肽的说明书。在优选的实施方案中，RTP多肽是RTP1和/或RTP2多肽。在其它实施方案中，RTP多肽选自RTP1-4。在优选的实施方案中，说明书包括美国食品和药品管理局要求的体外诊断试剂盒说明书。在优选的实施方案中，试剂是一种或多种抗体。在优选的实施方案中，生物样品选自血液样品，组织样品，尿样品和羊水样品。在优选的实施方案中，配置试剂，以检测RTP1和/或RTP2核酸序列。在优选的实施方案中，RTP1多肽是选自RTP1-A1，RTP1-D1和RTP1-D3的变体RTP1多肽。
在优选的实施方案中，本发明提供了筛选化合物的方法，包括提供表达异源REEP多肽的样品和测试化合物；和将样品暴露于测试化合物，并检测生物效应。在优选的实施方案中，REEP多肽选自REEP1-6。在优选的实施方案中，样品包含细胞。在优选的实施方案中，样品包含组织。在优选的实施方案中，样品发现于受试对象中。在有些实施方案中，生物效应包含REEP活性的变化。在有些实施方案中，生物效应包含REEP表达的变化。
在优选的实施方案中，本发明提供了筛选化合物的方法，包括提供表达异源RTP多肽的样品和测试化合物；和将样品暴露于测试化合物，并检测生物效应。在优选的实施方案中，RTP多肽选自RTP1-4和RTP1-A1，RTP1-D1和RTP1-D3。在优选的实施方案中，样品包含细胞。在优选的实施方案中，样品包含组织。在优选的实施方案中，样品发现于受试对象中。在有些实施方案中，生物效应包含RTP活性的变化。在有些实施方案中，生物效应包含RTP表达的变化。
附图说明
图1显示了用于鉴别会促进气味受体的细胞表面表达的分子的筛选策略。从数字差异显示分析得到REEP1。从SAGE文库得到RTP1。
图2显示了REEP和/或RTP促进气味受体在293T细胞中的细胞表面表达。(A)用或不用REEP1，RTP1和/或RTP2转染编码不同OR(MOR203-1，OREG，olfr62，OR-S46和大鼠I7)的cDNA。在共表达辅助蛋白的细胞中，观察到OR的增加的细胞表面染色。相反地，在表达β2肾上腺素能受体的细胞中，没有观察到细胞表面染色的差异。使用活细胞染色方案，将细胞表面荧光信号视作特征斑点染色。比例尺等于50um。(B)为每种转染条件，显示了标记的细胞的标准化数目(N＝4918-15526)。针对Rho-标记的受体和HA-标记的β2肾上腺素能受体双免疫荧光染色后，进行FACS分析，以定量免疫阳性的细胞。将Rho-标记的受体阳性的细胞的数目相对于HA-标记的β2肾上腺素能受体阳性的细胞的数目标准化。在几乎所有情况下，当不同的OR与REEP1，RTP1和/或RTP2一起表达时，观察到更多的免疫阳性的细胞。相反地，当使用VR4和mT2R5受体替代OR时，没有观察到增强。(C)显示了标记的细胞的标准化的平均荧光。使用β2肾上腺素能受体的平均荧光作为对照。当不同的OR与REEP1，RTP1和/或RTP2一起表达时，观察到更强的荧光。相反地，当使用VR4和mT2R5受体替代OR时，没有观察到增强。(D)显示了FACS分析的总结。
图3表明，REEP和/或RTP不促进VR4和mT2R5在293T细胞中的细胞表面表达。用或不用REEP1，RTP1和/或RTP2转染编码VR4和mT2R5的cDNA。与OR不同，在表达这些蛋白的细胞中，没有看到增加的细胞表面染色。显示了BFP表达，以证实VR4转染的细胞的高(约70％)转染效率。使用活细胞染色方案，将细胞表面荧光信号视作特征斑点染色。比例尺等于50um。
图4显示了具有气味受体(A)olfr62和(B)mT2R5的REEP1，RTP1和RTP2表达的荧光直方图数据。
图5显示了REEP和RTP家族。(A)REEP1的推定的氨基酸序列。实心条代表推定的跨膜区(TM)。第一个TM区可起信号肽的作用。(B)REEP家族成员的无根的系统树。在小鼠基因组上，鉴别出了至少6个REEP家族成员(REEP1-6)。酵母YOP1P，大麦HVA22和人DP1与REEP蛋白同源。(C)RTP1和RTP2的推定的氨基酸序列。实心条代表推定的跨膜域。有阴影的氨基酸在RTP1和RTP2之间是保守的。在小鼠基因组上，存在另2个成员(RTP3和4)。
图6显示了REEP1，RTP1和RTP2的表达。(A)RNA印迹分析。总RNA用于RNA印迹分析。嗅上皮，犁鼻器和脑表现出与REEP1 mRNA相对应的约3.6kb条带。仅仅嗅上皮和犁鼻器RNA表现出分别与RTP1和RTP2 mRNA相对应的约3.5kb和约2.6kb条带。显示18S rRNA的溴化乙锭染色作为对照。(B)嗅上皮中的原位杂交分析。在REEP成员中，嗅觉神经元仅仅特异性地表达REEP1。支持细胞表达REEP6。在RTP成员中，嗅觉神经元强烈表达RTP1和RTP2。嗅觉神经元也表达RTP4，但是以低得多的水平。OMP是成熟的嗅觉神经元的标志。REEP1，RTP1和RTP2的高倍放大表明，所有嗅觉神经元都可以表达所有3种分子。比例尺：200um(在高倍放大照片中为70um)。(C)脑中的REEP1的原位分析。一小组脑细胞表达REEP1。比例尺：200um。
图7显示了气味受体与REEP1和RTP1的关联。(A)指示着HA-标记的MOR203-1、Flag-标记的REEP1，RTP1和ICAP1在293T细胞中的表达的对照蛋白印迹分析。(B)当Flag-RTP1或Flag-REEP1沉淀时，HA-MOR203-1蛋白共沉淀(泳道1和2)。但是，当Flag-ICAP-1(阴性对照蛋白)沉淀时，没有检测到HA-MOR203-1蛋白(泳道3)。(C)当HA-MOR203-1沉淀时，Flag-REEP1和Flag-RTP1在共表达时共纯化(泳道1和2)。阴性对照蛋白(Flag-ICAP-1)没有共沉淀(泳道3)。星号指示非特异性的Ig蛋白。(D)当将RTP1转染进293T细胞时，几乎没有观察到细胞表面表达。但是，当RTP1和气味受体(OREG)共转染时，观察到更多的RTP1染色信号。(E)当将REEP1转染进293T细胞时，观察到少量细胞表面信号。OR(olfr62)的共表达未改变REEP1的表达。比例尺等于50um。
图8表明，REEP1，RTP1或RTP2的表达增强气味受体活化。(A)显示cAMP效应元件(CRE)和萤光素酶用于监测OR的活化的简图。OR的活化会增加cAMP，这会通过CRE增强萤光素酶报道基因的表达。(B)标准化的萤光素酶活性±SEM(N＝4)。与单独的OR相比，与OREG一起以多种不同组合表达的REEP1，RTP1和RTP2，增强萤光素酶活性。(C)相对萤光素酶活性+SEM(N＝4)。使用OREG或OR-S46来检测REEP1，RTP1或RTP2是否会改变OR的配体特异性。为了得到对不同气味的相对活化，将对300uM香草醛(OREG)或癸酸(OR-S46)的萤光素酶活性视作每种表达条件下的1。(D)标准化的萤光素酶活性+SEM(N＝8)。当表达3种不同的OR时，在Hana3A细胞(一种表达REEP1，RTP1，RTP2和Golf的稳定细胞系)中的增强的反应。(E)cAMP测定。当转染OREG时，Hana3A细胞中对不同浓度的丁香酚的增强的cAMP产生。相反地，当转染β2肾上腺素能受体并使用异丙肾上腺素时，cAMP产生在表达Gαolf的Hana3A细胞和293T细胞之间没有差异。
图9显示了Hana3A细胞的RT-PCR分析；+表示使用来自Hana3A细胞的cDNA样品作为模板DNA的PCR产物；-表示没有逆转录酶的阴性对照；M表示DNA标记。
图10显示了Hana3A和293T细胞中的气味受体的细胞表面表达。将编码3种OR(OREG，olfr62和OR-S46)的cDNA转染进Hana3A细胞或293T细胞。在Hana3A细胞中，观察到增强的细胞表面染色。比例尺等于50um。
图11显示了气味受体对气味的识别谱。(A)测试气味显示在左侧。颜色表示相对萤光素酶活性(N＝4)。每种OR对不同的气味子集作出响应。(B)和(C)标准化的萤光素酶活性(N＝4)。139种化学物质用于MOR203-1和olfr62的初步配体筛选。MOR203-1对壬酸作出响应。Olfr62对五种相关的芳香化合物作出响应。
图12显示了Hana3A细胞中的8种气味受体的细胞表面表达。比例尺等于50um。
图13显示了REEP和/或RTP在气味受体表达中的作用的模型。
图14显示了鼠REEP1的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。
图15显示了鼠REEP2的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：2)和氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。
图16显示了鼠REEP3的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。
图17显示了鼠REEP4的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：4)和氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。
图18显示了鼠REEP5的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：5)和氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。
图19显示了鼠REEP6的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：6)和氨基酸序列(SEQ ID NO：26)。
图20显示了人REEP1的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：7)和氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。
图21显示了人REEP2的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：8)和氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。
图22显示了人REEP3的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：9)和氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。
图23显示了人REEP4的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：10)和氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。
图24显示了人REEP5的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：11)和氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。
图25显示了人REEP6的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：12)和氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。
图26显示了鼠RTP1的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：13)和氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。
图27显示了鼠RTP2的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：14)和氨基酸序列(SEQ ID NO：34)。
图28显示了鼠RTP3的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：15)和氨基酸序列(SEQ ID NO：35)。
图29显示了鼠RTP4的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：16)和氨基酸序列(SEQ ID NO：36)。
图30显示了人RTP1的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：17)和氨基酸序列(SEQ ID NO：37)。
图31显示了人RTP2的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：18)和氨基酸序列(SEQ ID NO：38)。
图32显示了人RTP3的核酸(mRNA)序列(SEQ ED NO：19)和氨基酸序列(SEQ ID NO：39)。
图33显示了人RTP4的核酸(mRNA)序列(SEQ ID NO：20)和氨基酸序列(SEQ ID NO：40)。
图34显示了响应气味剂暴露引起的人气味受体的活化模式。
图35图示了与RTP1相比较的RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E的氨基酸片段。
图36显示了RTP1-A的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：41)。
图37显示了RTP1-B的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：42)。
图38显示了RTP1-C的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：43)。
图39显示了RTP1-D的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：44)。
图40显示了RTP1-E的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：45)。
图41显示了Hana3A和293T细胞中的OLFR62的细胞表面表达。将编码RTP1，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E的cDNA转染进Hana3A细胞或293T细胞。在表达RTP1-D的Hana3A细胞和293T细胞中，观察到增加的细胞表面染色。
图42图示了用于监测OLFR62活性的萤光素酶测定。使用cAMP效应元件(CRE)和萤光素酶来监测OLFR62的活化。OLFR62的活化会增加cAMP，这会通过CRE增强萤光素酶报道基因的表达。
图43显示了如表达RTP1，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D，RTP1-E和对照pCI的Hana3A细胞和293T细胞中的萤光素酶表达所指示的OLFR62活性。
图44图示了分别与RTP1-A和RTP1-D相比较的RTP1-A1、RTP1-D1、RTP1-D2和RTP1-D3的氨基酸片段。
图45显示了RTP1-A1的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：46)和RTP1-A1的人氨基酸序列(SEQ ID NO：47)。
图46显示了RTP1-D1的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：48)。
图47显示了RTP-D2的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：49)。
图48显示了RTP-D3的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。
图49显示了293T细胞中的OLFR62的细胞表面表达。将编码RTP1，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3和对照pCI的cDNA转染进293T细胞。在表达RTP1-A1，RTP1-D1和RTP1-D3的293T细胞中，观察到增加的细胞表面染色。
图50显示了如表达RTP1，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3和对照pCI的293T细胞中的萤光素酶表达所指示的OLFR62，OREG，S6和23-1活性。
图51显示了如表达RTP1，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3和对照pCI的Hana3A细胞中的萤光素酶表达所指示的OLFR62，OREG，S6和23-1活性。
图52显示了共转染RTP1，RTP1-A1或对照pCI的293T细胞中的OLFR62，OREG，MOR203-1，S6和23-1的细胞表面表达。将编码RTP1，RTP1-A1和对照pCI的cDNA转染进细胞。
图53示意地显示了RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)的氨基酸片段。
图54显示了表达RTP1，RTP4，嵌合体1，嵌合体2，嵌合体3，嵌合体4，嵌合体5，嵌合体6和对照pCI的细胞中的OR的细胞表面表达。将编码RTP1，RTP4，RTP1-A1，嵌合体1，嵌合体2，嵌合体3，嵌合体4，嵌合体5，嵌合体6和对照pCI的cDNA转染进293T细胞。
图55显示了如表达RTP1，RTP4，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2，嵌合体1，嵌合体2，嵌合体3，嵌合体4，嵌合体5，嵌合体6和对照pCI的293T细胞中的萤光素酶表达所指示的OLFR62，OREG，S6和23-1活性。
图56显示了使用抗-RTP1检测RTP1，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-A1，RTP1-D，嵌合体4，嵌合体5，RTP1-D3，RTP1-D1，嵌合体6和RTP4。
定义
为了有助于理解本发明，下面定义了许多术语。
如本文所使用的，当提及蛋白或核酸时使用的术语″REEP″指本发明的REEP蛋白或编码REEP蛋白的核酸。术语REEP包括与野生型REEP(例如，REEP1，REEP2，REEP3，REEP4，REEP5和REEP6)相同的蛋白和源自野生型REEP的那些(例如，本发明的REEP多肽的变体)。在有些实施方案中，″REEP″是野生型鼠REEP核酸(mRNA)(例如，SEQID NO：1-6)或由野生型鼠REEP氨基酸序列编码的多肽(例如，SEQ IDNO：21-26)。在其它实施方案中，″REEP″是野生型人REEP核酸(mRNA)(例如，SEQ ID NO：7-12)或由野生型人REEP氨基酸序列编码的多肽(例如，SEQ ID NO：27-32)。REEP蛋白或核酸的实例包括，但不限于，REEP1，REEP2，REEP3，REEP4，REEP5和REEP6。
如本文所使用的，当提及蛋白或核酸时使用的术语″RTP″指本发明的RTP蛋白或编码RTP蛋白的核酸。术语RTP包括与野生型RTP(例如，RTP1，RTP2，RTP3和RTP4)相同的蛋白和源自野生型RTP的那些(例如，本发明的RTP多肽的变体，包括但不限于RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D，RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3或用RTP1编码区的部分构建的嵌合基因(例如，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)))。在有些实施方案中，″RTP″是野生型鼠RTP核酸(mRNA)(例如，SEQ ID NO：13-16)或由野生型或变体鼠RTP氨基酸序列编码的多肽(例如，SEQ IDNO：33-36，41-50)。在其它实施方案中，″RTP″是野生型人RTP核酸(mRNA)(例如，SEQ ID NO：17-20)或由野生型人RTP氨基酸序列编码的多肽(例如，SEQ ID NO：37-40)。RTP蛋白或核酸的实例包括，但不限于，RTP1，RTP2，RTP3，RTP4，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D，RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)。
如本文所使用的，术语″气味受体″指从嗅觉感觉神经元产生的气味受体。气味受体的实例包括，但不限于，S6/79，S18，S46，S50，MOR23-1，MOR31-4，MOR31-6，MOR32-5和MOR32-11。
如本文所使用的，术语″气味受体细胞表面定位″或等同术语指气味受体向细胞表面膜的分子运输。细胞表面定位的实例包括，但不限于，定位于树突尖端的纤毛，和定位于轴突末端。
如本文所使用的，术语″气味受体功能性表达″或等同术语指气味受体与气味受体配体(例如，气味分子)相互作用的能力。
如本文所使用的，术语″嗅觉障碍″、″嗅觉机能障碍″、″嗅觉疾病″或类似的术语指导致减弱的嗅觉感觉(例如，嗅觉失常)的障碍、机能障碍或疾病。嗅觉障碍、机能障碍和/或疾病的实例包括，但不限于，头部创伤，上呼吸道感染，颅前窝肿瘤，Kallmann综合征，福斯特·肯尼迪综合征，帕金森病，阿耳茨海默病，亨廷顿舞蹈病和暴露于毒性化学物质或感染。减弱的嗅觉感觉可以分为：嗅觉丧失-缺乏嗅觉感觉；嗅觉减退-减弱的嗅觉感觉；嗅觉障碍-嗅觉感觉的失真；恶臭-坏的或恶臭味的感觉；和嗅觉倒错-在没有适当的刺激下的嗅觉感觉。
如本文所使用的，当提及蛋白或核酸时使用的术语″REEP1″指本发明的REEP1蛋白或编码REEP1蛋白的核酸。术语REEP1包括与野生型REEP1相同的蛋白和源自野生型REEP1的那些(例如，本发明的REEP1多肽的变体)或用REEP1编码区的部分构建的嵌合基因)。在有些实施方案中，″REEP1″是野生型鼠REEP1核酸(mRNA)(SEQ ID NO：1)或由野生型鼠氨基酸序列编码的多肽(SEQ ID NO：21)。在其它实施方案中，″REEP1″是野生型人REEP1核酸(mRNA)(SEQ ID NO：7)或由野生型人REEP1氨基酸序列编码的多肽(SEQ ID NO：27)。在其它实施方案中，″REEP1″是变体或突变体核酸或氨基酸。
如本文所使用的，当提及蛋白或核酸时使用的术语″RTP1″指本发明的RTP1蛋白或编码RTP1蛋白的核酸。术语RTP1包括与野生型RTP1相同的蛋白和源自野生型RTP1的那些(例如，本发明的RTP1多肽的变体，包括但不限于RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D，RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3)或用RTP1编码区的部分构建的嵌合基因(例如，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6))。在有些实施方案中，″RTP1″是野生型鼠RTP1核酸(mRNA)(SEQ ID NO：13)或由野生型鼠氨基酸序列编码的多肽(SEQ ID NO：33)。在其它实施方案中，″RTP1″是野生型人RTP1核酸(mRNA)(SEQ ID NO：17)或由野生型人RTP1氨基酸序列编码的多肽(SEQ ID NO：37)。在其它实施方案中，″RTP1″是变体或突变体核酸或氨基酸。
如本文所使用的，当提及蛋白或核酸时使用的术语″ RTP2″指本发明的RTP2蛋白或编码RTP2蛋白的核酸。术语RTP2包括与野生型RTP2相同的蛋白和源自野生型RTP2的那些(例如，本发明的RTP2多肽的变体)或用RTP2编码区的部分构建的嵌合基因)。在有些实施方案中，″RTP2″是野生型鼠RTP2核酸(mRNA)(SEQ ID NO：14)或由野生型鼠氨基酸序列编码的多肽(SEQ ID NO：34)。在其它实施方案中，″RTP2″是野生型人RTP2核酸(mRNA)(SEQ ID NO：18)或由野生型人RTP2氨基酸序列编码的多肽(SEQ ID NO：38)。在其它实施方案中，″RTP2″是变体或突变体核酸或氨基酸。
如本文所使用的，术语″受试对象″和″患者″指任意的动物，例如哺乳动物如狗、猫，鸟，家畜，和优选为人。″受试对象″和″患者″的具体实例包括，但不限于，具有嗅觉障碍的个体，和具有嗅觉障碍-相关的特征或症状的个体。
如本文所使用的，短语″嗅觉障碍的症状″和″嗅觉障碍的特征″包括，但不限于，减弱的嗅觉感觉(例如，嗅觉失常)。
短语″在使症状减轻的条件下″指可检测的嗅觉障碍症状的任意程度的定性或定量的减轻，包括但不限于，对疾病恢复速度的可检测的影响，或至少一种嗅觉障碍症状的减轻。
术语″siRNA″指短干扰RNA。使用siRNA的方法记载在美国专利申请号：20030148519/A1(这里引作参考)。在有些实施方案中，siRNA包含约18-25个核苷酸长的双链体或双链区；siRNA经常在每条链的3′端含有约2至4个不成对的核苷酸。siRNA的双链体或双链区的至少一条链与目标RNA分子基本上同源或基本上互补。与目标RNA分子互补的链是″反义链″，与目标RNA分子同源的链是″有义链″，且也与siRNA反义链互补。siRNA也可以含有另外的序列；这样的序列的非限制性实例包括连接序列，或环，以及茎和其它折叠结构。siRNA似乎起着在无脊椎动物和脊椎动物中触发RNA干扰、和在植物的转录后基因沉默过程中触发序列-特异性的RNA降解的关键媒介体的作用。
术语″RNA干扰″或″RNAi″指siRNA对基因表达的沉默或降低。它在动物和植物中是序列特异性的、转录后的基因沉默过程，由其双链体区域中与被沉默的基因序列同源的siRNA启动。该基因可以是生物内源的或外源的，整合进染色体中存在，或存在于未整合进基因组的转染载体中。该基因的表达被完全地或部分地抑制。也可以考虑RNAi来抑制目标RNA的功能；目标RNA的功能可以是完整的或部分的。
如本文所使用的，术语″关于使用所述试剂盒检测所述生物样品中是否存在变体REEP1核酸或多肽的说明书″、″关于使用所述试剂盒检测所述生物样品中是否存在变体RTP1核酸或多肽的说明书″、″关于使用所述试剂盒检测所述生物样品中是否存在变体RTP2核酸或多肽的说明书″包括，关于使用包含在试剂盒中的试剂检测变体和野生型REEP和/或RTP核酸或多肽的说明书。
术语″基因″指核酸(例如，DNA)序列，其包含产生多肽、RNA(例如，包括但不限于，mRNA，tRNA和rRNA)或前体(例如，REEP1，RTP1或RTP2)必需的编码序列。多肽、RNA或前体可以由全长编码序列或编码序列的任意部分编码，只要能维持全长或片段的需要的活性或功能性质(例如，酶活性，配体结合，信号转导，等)。该术语也包括结构基因的编码区，和在5′和3′末端离任一个末端约1kb距离的位于编码区邻近的序列，使得该基因相应于全长mRNA的长度。位于编码区的5′且存在于mRNA上的序列称作5′非翻译序列。位于编码区的3′或下游且存在于mRNA上的序列称作3′非翻译序列。术语″基因″包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有被称作″内含子″或″间插区″或″间插序列″的非编码序列间断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可以含有调节元件，例如增强子。内含子从核或初级转录物去除或“剪接出”；因此信使RNA(mRNA)转录物中没有内含子。mRNA在翻译过程中起作用，规定新生多肽中的氨基酸的顺序或次序。
更具体地，术语″REEP1基因″、″RTP1基因″、″RTP1基因(复数)″、″RTP2基因″或″RTP2基因(复数)″指各全长REEP和/或RTP核苷酸序列(例如，包含在SEQ ID NO：1，2和3中)。但是，该术语也意在包括REEP和/或RTP序列的片段(例如，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3)，用RTP1编码区的部分构建的嵌合基因(例如，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6))，REEP和/或RTP序列的突变体，以及在全长REEP和/或RTP核苷酸序列内的其它结构域。而且，术语″REEP1核苷酸序列″、″REEP1多核苷酸序列″、″RTP1核苷酸序列″、″RTP1多核苷酸序列″、″RTP2核苷酸序列″或″RTP2多核苷酸序列″包括DNA序列，cDNA序列，RNA(例如，mRNA)序列和有关的调节序列。
当在本文中列述″氨基酸序列″涉及天然存在的蛋白分子的氨基酸序列时，″氨基酸序列″和类似的术语例如″多肽″或″蛋白″不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白分子有关的完整的、天然的氨基酸序列。
除了含有内含子以外，基因的基因组形式还可以包含位于存在于RNA转录物上的序列的5′和3′端的序列。这些序列称作″侧翼″序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5′或3′)。5′侧翼区可以含有调节序列，例如控制或影响基因的转录的启动子和增强子。3′侧翼区可以含有指导转录终止、转录后剪切和多腺苷酸化的序列。
术语″野生型″指基因或基因产物，其具有该基因或基因产物从天然存在的来源分离时的特性。野生型基因是在群体中最频繁地观察到的基因，因而任意地设计基因的″正常的″或″野生型″形式。相反地，术语″修饰的″、″突变体″、″多态性″和″变体″指，与野生型基因或基因产物相比，表现出序列和/或功能性质的修饰(即，改变的特性)的基因或基因产物。应当指出，可以分离天然存在的突变体；通过它们与野生型基因或基因产物相比具有改变的特性的事实，可以鉴别它们。
如本文所使用的，术语″编码......的核酸分子″、″编码......的DNA序列″和″编码......的DNA″指沿着脱氧核糖核酸的一条链的脱氧核糖核苷酸的次序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的次序，决定沿着多肽(蛋白)链的氨基酸的次序。DNA序列从而编码氨基酸序列。
据称DNA分子具有″5′末端″和″3′末端″，因为使单核苷酸反应，以使一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸基在一个方向通过磷酸二酯键结合到它邻近的3′氧上的方式，制备寡核苷酸或多核苷酸。因此，如果它的5′磷酸基没有连接单核苷酸戊糖环的3′氧，则寡核苷酸或多核苷酸的该末端称作″5′末端″；如果它的3′氧没有连接下一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸基，则称作″3′末端″。如本文所使用的，即使在更大的寡核苷酸或多核苷酸的内部，核酸序列也可称作具有5′和3′末端。在线性或环状的DNA分子中，离散的元件称作在″下游″或3′元件的″上游″或5′。该术语反映了下述事实，即转录沿着DNA链以5′至3′的方式进行。指导连接的基因的转录的启动子和增强子元件通常位于编码区的5′或上游。但是，甚至当位于启动子元件和编码区的3′时，增强子元件也可以发挥它们的作用。转录终止和多腺苷酸化信号位于编码区的3′或下游。
如本文所使用的，术语″具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸″和″具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸″指，包含基因的编码区的核酸序列，换而言之，编码基因产物的核酸序列。编码区可以以cDNA，基因组DNA或RNA的形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的(即，有义链)或双链的。如果需要允许转录的适当起始和/或初级RNA转录物的正确加工，可以将合适的控制元件(例如增强子/启动子，剪接点，多腺苷酸化信号等)置于紧挨基因编码区的附近。或者，在本发明的表达载体中使用的编码区可以含有内源增强子/启动子，剪接点，间插序列，多腺苷酸化信号等或内源和外源控制元件的组合。
如本文所使用的，术语″调控元件″指控制核酸序列的表达的某些方面的遗传元件。例如，启动子是会促进可操作连接的编码区的转录起始的调控元件。其它调控元件包括剪接信号，多腺苷酸化信号，终止信号，等。
如本文所使用的，术语″互补的″或″互补性″用于指通过碱基配对规则关联的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，对于序列5′-″A-G-T-3′″，与序列3′-″T-C-A-5′″互补。互补性可以是“部分的”，其中仅仅有些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可以存在″完全″或″全部″互补性。核酸链之间的互补性的程度，对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中，这是特别重要的。互补性可以包括任意类型的核苷酸之间的碱基对的形成，包括非天然的碱基，修饰的碱基，合成的碱基等。
术语″同源性″指互补性的程度。可以存在部分的同源性或完全的同源性(即，同一性)。部分互补的序列是这样的序列，其至少部分地抑制完全互补的序列与目标核酸的杂交，并使用功能术语″基本上同源的″来指它。当提及核酸结合时使用的术语″结合的抑制″指，由同源序列竞争结合目标序列造成的结合抑制。使用低严格性条件下的杂交测定(DNA或RNA印迹，溶液杂交等)，可以检查完全互补的序列与目标序列的杂交的抑制。在低严格性条件下，基本上同源的序列或探针会竞争和抑制完全同源物向靶物的结合(即，杂交)。这不是说，低严格性的条件是允许非特异性结合的条件；低严格性条件要求，2个序列彼此的结合是特异性的(即，选择性的)相互作用。使用甚至缺乏部分程度互补性(例如，小于约30％同一性)的第二种靶物，可以测试非特异性结合的缺失；在没有非特异性结合的情况下，探针不会与第二种非互补的靶物杂交。
本领域确知，可以采用许多等同条件来构成低严格性条件；考虑因素例如探针的长度和性质(DNA，RNA，碱基组成)和靶物的性质(DNA，RNA，碱基组成，存在于溶液中或固定化，等)，和盐的浓度和其它组分(例如，是否存在甲酰胺，硫酸葡聚糖，聚乙二醇)，且可以改变杂交溶液，以产生与上述条件不同(但是等同)的低严格性杂交条件。另外，本领域知道促进高严格性条件下的杂交的条件(例如，升高杂交和/或洗涤步骤的温度，在杂交溶液中使用甲酰胺等)。
当提及双链核酸序列(例如cDNA或基因组克隆)时使用的术语″基本上同源的″指，可以在如上所述的低严格性的条件下，与双链核酸序列的任一条或两条链杂交的任意探针。
基因可以生成由初级RNA转录物的差别剪接产生的多种RNA种类。作为相同基因的剪接变体的cDNA，将含有序列同一性或完全同源性的区域(代表着在两条cDNA上存在相同外显子或相同外显子部分)和完全非同一性的区域(例如，代表着在cDNA 1上存在外显子″A″，其中cDNA 2取而代之含有外显子″B″)。因为2条cDNA含有序列同一性的区域，它们都会与源自含有存在于2条cDNA上的序列的整个基因或基因部分的探针杂交；因此，2个剪接变体与这样的探针基本上同源，且彼此基本上同源。
当提及单链核酸序列时使用的术语″基本上同源的″指，可以在如上所述的低严格性的条件下，与该单链核酸序列杂交(即，是它的互补物)的任意探针。
如本文所使用的，术语″竞争结合″用于指具有活性的第一种多肽与具有活性的第二种多肽结合相同的底物，其中第二种多肽是第一种多肽的变体或相关的或不相似的多肽。第一种多肽的结合效率(例如，动力学或热力学)可以与第二种多肽的底物结合效率相同，或比其更大或更小。例如，2种多肽结合底物的平衡结合常数(KD)可以不同。如本文所使用的术语″Km″指酶的米氏常数，且定义为给定的酶在酶催化反应中产生它的最大速度的一半时的特定底物的浓度。
如本文所使用的，术语″杂交″用于指互补的核酸的配对。杂交和杂交的强度(即，核酸之间的结合的强度)受下述因素的影响：例如核酸之间的互补程度，包含的条件的严格性，形成的杂合体的Tm，和核酸内的G∶C比。
如本文所使用的，术语″Tm″用于指″解链温度″。解链温度是一群双链核酸分子半数离解成单链时的温度。本领域众所周知计算核酸的Tm的方程。如标准的文献所指示的，当核酸是在1M NaCl含水溶液中时，可以通过下述方程计算Tm值的简单估计值：Tm＝81.5+0.41(％G+C)(见例如，Anderson和Young，Quantitative FilterHybridization，Nucleic Acid Hybridization[1985])。其它文献包括更复杂的计算，其在Tm的计算中考虑结构以及序列特性。
如本文所使用的，术语″严格性″用于指进行核酸杂交的温度、离子强度、其它化合物(例如有机溶剂)的存在的条件。本领域的技术人员会认识到，通过个别地或协同地改变上述的参数，可以改变″严格性″条件。利用″高严格性″条件，核酸碱基配对仅仅发生在具有高频率的互补碱基序列的核酸片段之间(例如，在″高严格性″条件下的杂交可以发生在具有约85-100％同一性、优选约70-100％同一性的同源物之间)。利用中等严格性条件，核酸碱基配对会发生在具有中等频率的互补碱基序列的核酸之间(例如，在″中等严格性″条件下的杂交可以发生在具有约50-70％同一性的同源物之间)。因而，源自遗传上不同的生物的核酸，经常需要″弱″或″低″严格性的条件，因为互补序列的频率通常更低。
当提及核酸杂交时使用的″高严格性条件″包含等同于下述的条件：当采用约500核苷酸长的探针时，在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调节pH至7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt氏试剂和100μg/ml变性的鲑精DNA组成的溶液中在42℃结合或杂交，随后在包含0.1X SSPE、1.0％SDS的溶液中在42℃洗涤。
当提及核酸杂交时使用的″中等严格性条件″包含等同于下述的条件：当采用约500核苷酸长的探针时，在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调节pH至7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt氏试剂和100μg/ml变性的鲑精DNA组成的溶液中在42℃结合或杂交，随后在包含1.0K SSPE、1.0％SDS的溶液中在42℃洗涤。
″低严格性条件″包含等同于下述的条件：当采用约500核苷酸长的探针时，在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调节pH至7.4)、0.1％SDS、5X Denhardt氏试剂[50X Denhardt氏试剂每500ml含有：5g Ficoll(Type 400，Pharamcia)，5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100μg/ml变性的鲑精DNA组成的溶液中在42℃结合或杂交，随后在包含5X SSPE、0.1％SDS的溶液中在42℃ 洗涤。
本发明不限于约500核苷酸长的探针的杂交。本发明包括使用长度为大约10核苷酸直到数千(例如，至少5000)核苷酸的探针。相关领域的技术人员会理解，可以为其它大小的探针改变严格性条件(见例如，Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization，Nucleic Acid Hybridization[1985]和Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，NY[1989])。
使用下面的术语来描述2个或多个多核苷酸之间的序列关系：″参照序列″，″序列同一性″，″序列同一性百分比″和″实质的同一性″。″参照序列″是用作序列对比的基础的特定序列；参照序列可以是更大序列的子集，例如，作为在序列表中给出的全长cDNA序列的片段，或可以包含完整的基因序列。通常，参照序列是至少20核苷酸长，经常至少25核苷酸长，经常至少50核苷酸长。由于2个多核苷酸可以各自(1)包含在2个多核苷酸之间类似的序列(即，完整的多核苷酸序列的一部分)，且(2)可进一步包含在2个多核苷酸之间不同的序列，典型地通过在″对比窗″中对比2个多核苷酸的序列，进行2个(或多个)多核苷酸之间的序列对比，以鉴别和对比具有序列相似性的局部区域。如本文所使用的，″对比窗″指至少20个连续核苷酸位置的概念上的片段，其中可以对比多核苷酸序列和至少20个连续核苷酸的参照序列，且其中与进行2个序列的最佳比对的参照序列(其不包含添加或缺失)相比，对比窗中的多核苷酸序列的部分可以包含20％或更少的添加或缺失(即，缺口)。通过Smith和Waterman的局部同源性算法[Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)]，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法[Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)]，通过Pearson和Lipman的搜索类似性方法[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)]，通过这些算法的计算机化执行(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA inthe Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)或通过检查，可以进行比对对比窗的序列的最佳比对，并选择由多种方法产生的最佳比对(即，在对比窗中产生最高的同源性百分比)。术语″序列同一性″指，对比窗中2个多核苷酸序列是一致的(即，在逐个核苷酸的基础上)。如下计算术语″序列同一性百分比″：在对比窗中对比2个最佳地比对的序列，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A，T，C，G，U或I)的位置的数目，产生匹配的位置的数目，用匹配的位置的数目除以对比窗中的总位置数(即，窗大小)，并将结果乘以100，产生序列同一性百分比。如本文所使用的，术语″实质的同一性″表示多核苷酸序列的一个特性，其中该多核苷酸包含的序列与至少20核苷酸位置的对比窗(经常地，至少25-50核苷酸的对比窗)中的参照序列相比，具有至少85％序列同一性，优选地至少90-95％序列同一性，更经常地至少99％序列同一性，其中如下计算序列同一性百分比：在对比窗中对比参照序列和多核苷酸序列，后者可以包含共占参照序列的20％或更少的缺失或添加。参照序列可以是更大的序列的子集，例如，作为本发明要求保护的组成的全长序列(例如，REEP1，RTP1或RTP2)的片段。
如应用于多肽的，术语″实质的同一性″指，当最佳地比对时(例如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认缺口权重)，2个肽序列具有至少80％序列同一性，优选地至少90％序列同一性，更优选地至少95％序列同一性或更高(例如，99％序列同一性)。优选地，不一致的残基位置的差别在于保守氨基酸置换。保守氨基酸置换指具有类似侧链的残基的互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所使用的，术语″片段″指与天然蛋白相比具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但是其中剩余的氨基酸序列与从全长cDNA序列推出的氨基酸序列中的相应位置相同。片段典型地是至少4氨基酸长，优选地至少20氨基酸长，通常至少50氨基酸长或更长，且跨越(本发明要求保护的)组合物与它的不同配体和/或底物的分子间结合所需的多肽部分。
术语″多态性优点″是存在于群体中表现出群体成员之间的变异的基因座(即，最常见的等位基因具有小于0.95的频率)。相反地，″单态性位点″是在群体成员之间几乎没有或没有观察到变异的遗传位点(通常是群体基因库中最常见的等位基因超过0.95的频率的基因座)。
如本文所使用的，术语″遗传变异信息″或″遗传变体信息″指特定基因(例如，本发明的REEP和/或RTP基因)的给定等位基因中是否存在一个或多个变体核酸序列(例如，多态性或突变)。
如本文所使用的，术语″检测测定″指用于检测特定基因(例如，REEP和/或RTP基因)的给定等位基因中是否存在变体核酸序列(例如，多态性或突变)的测定。
如本文所使用的，应用于对象的术语″天然存在的″指可以在自然界发现该对象的事实。例如，存在于可以从天然来源分离的生物(包括病毒)中且尚未在实验室中有意人工修饰的多肽或多核苷酸序列，是天然存在的。
″扩增″是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。它与非特异性的模板复制(即，模板依赖性的、但是不依赖于特异性模板的复制)形成对比。模板特异性在此区别于复制的保真度(即，适当的多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖-或脱氧核糖-)特异性。经常以“靶物”特异性描述模板特异性。在试图从其它核酸中分选出来的意义上，目标序列是“靶物”。最初为该分选设计了扩增技术。
如本文所使用的，术语″引物″指，当置于诱发与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件(即，在有核苷酸和诱发剂例如DNA聚合酶存在下，在合适的温度和pH)下，能作为合成的起始点的寡核苷酸，无论是自然地发生的(如在纯化的限制酶切消化中)还是合成地生成的。为了最高扩增效率，引物优选地是单链的，但是可以替代地是双链的。如果是双链的，首先处理引物，以分开它的链，然后用于制备延伸产物。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在有诱发剂存在下，引发延伸产物的合成。引物的精确长度依赖于许多因素，包括温度、引物的来源和方法的使用。
如本文所使用的，术语″探针″指能与另一种感兴趣寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即，核苷酸序列)，无论是自然地发生的(如在纯化的限制酶切消化中)还是合成地、重组地或通过PCR扩增生成的。探针可以是单链或双链。探针可以用于检测、鉴别和分离特定的基因序列。预期在本发明中使用的任意探针可以标记有任意的″报道分子″，所以在任意的检测系统中是可检测的，包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光的、放射性的和发光的系统。本发明无意限于任何特定的检测系统或标记。
如本文所使用的，术语″靶物″指要检测或表征的核酸序列或结构。因而，试图从其它核酸序列中分选出″靶物″。将″片段″定义为在靶序列内的核酸区域。
如本文所使用的，术语″扩增试剂″指除了引物、核酸模板和扩增酶以外的扩增必需的那些试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸，缓冲液，等)。典型地，将扩增试剂以及其它反应组分置于且包含在反应器(试管，微孔，等)中。
如本文所使用的，术语″限制性内切核酸酶″和″限制酶″指细菌酶，它们中的每一种在特异性的核苷酸序列处或附近切割双链DNA。
如本文所使用的，术语″重组DNA分子″指通过分子生物学技术连接到一起的DNA片段组成的DNA分子。
如本文所使用的，术语″反义″用于指与特定RNA序列(例如，mRNA)互补的RNA序列。该定义包括参与细菌的基因调节的反义RNA(″asRNA″)分子。反义RNA可以通过任意的方法生成，包括通过将感兴趣基因反向剪接到允许编码链的合成的病毒启动子上来合成。一旦导入胚胎中，该转录链与胚胎生成的天然mRNA结合，形成双链体。这些双链体然后阻断mRNA的进一步转录或它的翻译，以此方式，可以产生突变体表型。术语″反义链″用于指与″有义″链互补的核酸链。标识(-)(即，″负的″)有时用于指反义链，标识(+)有时用于指有义(即，″正″)链。
当与核酸一起使用时，如在″分离的寡核苷酸″或″分离的多核苷酸″中，术语″分离的″指，从通常在它的天然来源中伴随它的至少一种污染核酸鉴别和分离出的核酸序列。分离的核酸以不同于它的天然状态的形式或环境存在。相反地，非分离的核酸是这样的核酸，例如以它们的天然存在状态发现的DNA和RNA。例如，在宿主细胞染色体上邻近基因附近发现给定的DNA序列(例如，基因)；在细胞中发现RNA序列，例如编码特定蛋白的特定mRNA序列，作为与编码多种蛋白的许多其它mRNA的混合物。但是，作为实例，编码REEP和/或RTP的分离的核酸包括，通常表达REEP和/或RTP的细胞中的这样的核酸，其中核酸是在不同于天然细胞的染色体位置，或由不同于天然发现的核酸序列侧接。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以单链或双链形式存在。当使用分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸来表达蛋白时，寡核苷酸或多核苷酸最少含有有义或编码链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，但是可以含有有义和反义链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。
如本文所使用的，″染色体的部分″指染色体的离散的部分。细胞遗传学家将染色体分成如下的位点或部分：染色体的短(相对于着丝粒)臂称作″p″臂；长臂称作″q″臂。然后，将每个臂分成2个区域，称作区域1和区域2(区域1离着丝粒最近)。将每个区域进一步分成带。带可以进一步分成亚带。例如，人染色体11的11p15.5部分是位于染色体11(11)的短臂(p)的第1个区域(1)的第5条带(5)的亚带5(.5)上的部分。可以“改变”  染色体的一部分；例如，由于缺失，可以缺少整个部分，或可以重排(例如，倒位，易位，由于重复区域的变化而扩展或收缩)。在缺失的情况下，尝试杂交(即，特异性地结合)与染色体的特定部分同源的探针，可产生阴性结果(即，探针不能结合含有被怀疑含有染色体的缺失部分的遗传物质的样品)。因而，与染色体的特定部分同源的探针的杂交，可以用于检测染色体的一部分的改变。
术语″与染色体有关的序列″指染色体的制品(例如，中期染色体的展开)，从含有染色体DNA的样品(例如，基因组DNA的制品)提取的核酸，通过位于染色体上的基因的转录生成的RNA(例如，hnRNA和mRNA)，和从位于染色体上的DNA转录的RNA的cDNA拷贝。通过许多技术，包括用含有与上述制品中的核酸同源的序列的探针探测DNA和RNA印迹和与RNA、DNA或中期染色体的原位杂交，可以检测与染色体有关的序列。
如本文所使用的，当提及结构基因时使用的术语″编码区″指核苷酸序列，其编码在作为mRNA分子的翻译结果的新生多肽中发现的氨基酸。在真核生物中，编码区在5′侧以编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体″ATG″为界，在3′侧以指定终止密码子的三个三联体(即，TAA，TAG，TGA)之一为界。
如本文所使用的，术语″纯化的″或″纯化″指从样品去除污染物。例如，通过去除污染的非免疫球蛋白蛋白，纯化REEP和/或RTP抗体；还通过去除不结合REEP和/或RTP多肽的免疫球蛋白纯化它们。非免疫球蛋白蛋白的去除和/或不结合REEP和/或RTP多肽的免疫球蛋白的去除，导致样品中REEP1、RTP1或RTP2-反应性的免疫球蛋白的百分比的增加。在另一个实例中，在细菌宿主细胞中表达重组的REEP和/或RTP多肽，并通过去除宿主细胞蛋白，纯化多肽；从而增加样品中重组的REEP和/或RTP多肽的百分比。
如本文所使用的，术语″重组DNA分子″指通过分子生物学技术连接到一起的DNA片段组成的DNA分子。
如本文所使用的，术语″重组蛋白″或″重组多肽″指从重组DNA分子表达的蛋白分子。
如本文所使用的，术语″天然蛋白″用于指不含有由载体序列编码的氨基酸残基的蛋白；天然蛋白仅含有在天然存在的蛋白中找到的那些氨基酸。天然蛋白可以通过重组方式生成，或可以从天然存在的来源分离。
如本文所使用的，当提及蛋白时(如在″给定蛋白的一部分″中)，术语″部分″指该蛋白的片段。片段的大小可以从4个连续氨基酸残基至整个氨基酸序列减去1个氨基酸。
术语″DNA印迹″指在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上分析DNA，以根据大小将DNA分级分离，随后将DNA从凝胶转移到固体支持物，例如硝酸纤维素或尼龙膜。然后，用标记的探针探测固定化的DNA，以检测与使用的探针互补的DNA种类。在电泳之前，可以用限制酶切割DNA。电泳后，在转移到固体支持物之前或过程中，DNA可被部分地脱嘌呤和变性。DNA印迹是分子生物学家的标准工具(J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，NY，pp9.31-9.58[1989])。
如本文所使用的，术语″RNA印迹″指通过在琼脂糖凝胶上电泳RNA来分析RNA，以根据大小将RNA分级分离，随后将RNA从凝胶转移到固体支持物，例如硝酸纤维素或尼龙膜。然后，用标记的探针探测固定化的RNA，以检测与使用的探针互补的RNA种类。RNA印迹是分子生物学家的标准工具(J.Sambrook，等，同上，pp7.39-7.52[1989])。
术语″蛋白印迹″指固定化到支持物(例如硝酸纤维素或膜)上的蛋白(或多肽)的分析。在丙烯酰胺凝胶上跑蛋白，以分离蛋白，随后将蛋白从凝胶转移到固体支持物，例如硝酸纤维素或尼龙膜。然后，将固定化的蛋白暴露于具有对目标抗原的反应性的抗体。通过多种方法，包括使用放射标记的抗体，可以检测抗体的结合。
如本文所使用的，术语″抗原决定簇″指与特定抗体接触的抗原部分(即，表位)。当使用蛋白或蛋白片段来免疫宿主动物时，蛋白的许多区域可以诱发特异性地结合该蛋白上给定区域或三维结构的抗体的生成；这些区域或结构称作抗原决定簇。抗原决定簇可以与完整的抗原(即，用于引发免疫应答的″免疫原″)竞争向抗体的结合。
如本文所使用的，术语″转基因″指通过将基因导入新受精的卵或早期胚胎而置入生物中的外源的、异源的或自体同源的基因。术语″外源基因″指通过实验操作导入动物基因组中的任何核酸(例如，基因序列)，且可以包括在该动物中发现的基因序列，只要导入的基因不是位于与天然存在的基因相同的位置。术语″自体同源的基因″意在包括天然存在的基因的变体(例如，多态性或突变体)。术语转基因因而包括将天然存在的基因替换为该基因的变体形式。
如本文所使用的，术语″载体″用于指将DNA片段从一个细胞转移到另一个细胞中的核酸分子。术语″媒介″有时与″载体″可互换地使用。
如本文所使用的，术语″表达载体″指含有希望的编码序列和在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当核酸序列的重组DNA分子。原核细胞中的表达必需的核酸序列通常包括启动子，操纵基因(任选)和核糖体结合位点，经常伴有其它序列。已知真核细胞会利用启动子，增强子，以及终止和多腺苷酸化信号。
如本文所使用的，术语″宿主细胞″指任意的真核或原核细胞(例如，细菌细胞例如大肠杆菌，酵母细胞，哺乳动物细胞，鸟细胞，两栖动物细胞，植物细胞，鱼细胞和昆虫细胞)，无论是位于体外还是体内。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。
术语″过表达″和语法上的等同表述用于指mRNA的水平，以表示比在对照或非转基因动物的给定组织中典型地观察到的水平高大约3倍的表达水平。使用本领域的技术人员已知的众多技术中的任一种，包括但不限于RNA印迹分析(见，实施例10，进行RNA印迹分析的方案)，可以测量mRNA的水平。
如本文所使用的，术语″转染″指外源DNA向真核生物细胞中的导入。通过本领域已知的多种方式，可以完成转染，包括，磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖-介导的转染，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物-介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体融合，脂转染，原生质体融合，逆转录病毒感染和生物弹。
术语″稳定的转染″或″稳定地转染″指外源DNA向转染的细胞的基因组中的导入和整合。术语″稳定的转染子″指已经将外源DNA稳定地整合进基因组DNA中的细胞。
术语″瞬时转染″或″瞬时地转染″指将外源DNA导入细胞中，其中外源DNA没有整合进转染的细胞的基因组中。外源DNA在转染的细胞的核中存留数天。在这期间，外源DNA受到支配染色体中的内源基因的表达的调节控制。术语″瞬时转染子″指已经摄入外源DNA、但是没有整合该DNA的细胞。
术语″磷酸钙共沉淀″指将核酸导入细胞的技术。当将核酸呈现为磷酸钙-核酸共沉淀时，会增强细胞对核酸的摄入。几个研究组已经改良了Graham和van der Eb的原始技术(Graham和van der Eb，Virol.，52：456[1973])，以优化特定细胞类型的条件。本领域熟知这多种改进。
如本文所使用的，″包含给定的多核苷酸序列的组合物″广泛地指含有给定的多核苷酸序列的任意组合物。组合物可以包含含水溶液。
可以采用包含编码REEP1、RTP1或RTP2的多核苷酸序列(例如，SEQ IDNO：1，2和3)或其片段的组合物作为杂交探针。在该情况下，典型地在含有盐(例如，NaCl)、去污剂(例如，SDS)和其它组分(例如，Denhardt氏溶液，奶粉，鲑精DNA，等)的含水溶液中，使用编码REEP和/或RTP的多核苷酸序列。
术语″测试化合物″指可以用来治疗或预防疾病或躯体功能的障碍、或改变样品的生理或细胞状态的任何化学实体、药物等。测试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物。通过使用本发明的筛选方法进行筛选，可以确定测试化合物是治疗性的。″已知的治疗化合物″指已经证实在这样的治疗或预防中有效的治疗化合物(例如，通过动物试验或施用于人的现有经验)。
如本文所使用的，以它的最广泛的含义使用术语″样品″。被怀疑含有人染色体或与人染色体有关的序列的样品可以包含细胞，从细胞分离的染色体(例如，中期染色体的展开)，基因组DNA(在溶液中或结合到固体支持物上，例如用于DNA印迹分析)，RNA(在溶液中或结合到固体支持物上例如用于RNA印迹分析)，cDNA(在溶液中或结合到固体支持物上)等。被怀疑含有蛋白的样品可以包含细胞，组织的一部分，含有一种或多种蛋白的提取物等。
如本文所使用的，当提及测定时使用的术语″反应″指可检测的信号的产生(例如，报道蛋白的积累，离子浓度的增加，可检测的化学产物的积累)。
如本文所使用的，术语″报道基因″指编码可被测定的蛋白的基因。报道基因的实例包括但不限于，萤光素酶(见，例如，deWet等，Mol.Cell.Biol.7：725[1987]和美国专利号，6,074,859；5,976,796；5,674,713；和5,618,682；它们都在这里引作参考)，绿色荧光蛋白(例如，GenBank登记号U43284；许多GFP变体可从CLONTECHLaboratories，Palo Alto，CA商业地得到)，氯霉素乙酰转移酶，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
一般描述
不能在异源细胞中功能性表达OR以鉴别同源配体，这显著阻碍了理解嗅觉编码的持续进展。为了克服该问题，在本发明的过程中进行的实验搜寻了在OR的细胞表面表达中包含的分子。鉴别出会促进293T细胞中的OR的功能性细胞表面表达的3种跨膜蛋白REEP1，RTP1和RTP2，及其变体。嗅上皮中的嗅觉神经元特异性地表达REEP和/或RTP。REEP1和RTP1与OR蛋白相互作用。使用表达REEP1和RTP1和RTP2的细胞，鉴别出了对脂族气味剂起反应的新OR。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，在本发明的过程中进行的实验证实了OR的辅助蛋白在功能性细胞表面表达和解码OR-配体特异性中的重要性。
参与OR的定位的蛋白的鉴别和使用，提供了许多研究、诊断、药物筛选和治疗应用。例如，本发明的核酸和蛋白允许OR在试验细胞上的选择性的和可控制的呈现，以特别鉴别新OR，表征OR，鉴别OR配体，关联嗅觉反应和这样的反应潜在的分子相互作用，鉴别和表征负责嗅觉反应和健康状况的OR和配体组，和鉴别、选择和表征OR反应的调节剂，以研究和控制嗅觉反应。本发明因而也提供了体外和体内地操纵嗅觉反应和这样的反应的分子基础的方式。从而使得许多商业用途成为可能，包括表达希望的定位的OR的体外或体内细胞阵列的生产、表征和使用，用于筛选(例如，高通量筛选)化合物或用作合成的嗅觉系统。本发明的组合物和方法可以特别用于任何工业，包括食品工业，健康工业，化妆品工业，军用，卫生机构，嗅探动物(例如，对于药物，爆炸物，事故受害者，等)。
通过本发明的方法鉴别出的OR/配体相互作用的抑制剂(例如，抗体，小分子，适体，等)具有多种用途。例如，本发明提供了鉴别哪些受体和配体负责特定嗅觉(例如，感知的气味)的系统途径。因而，例如，通过阻断特定相互作用(例如，通过含有抑制剂的鼻喷雾)或增强特定相互作用(例如，通过鼻喷雾，其提供某些配体或在发出某些配体的对象的表面上提供涂层)，可以控制感知的气味。因而，可以封闭、覆盖或改变不希望的气味(例如，可以处理嗅探狗，使其仅嗅探感兴趣的目标，而非其它迷惑气味，可以使卫生工作者对垃圾的气味有免疫，等)，并可以增强希望的气味。
本发明也提供了新基因和蛋白序列和它们的使用方法。下面描述了某些优选的实施方案的详细描述和本发明的应用。本发明不限于这些具体的例示性的实施方案。
发明详述
本发明涉及能促进气味受体细胞表面定位和气味受体功能性表达的肽。本发明还提供了用于检测治疗剂和用于检测气味受体辅助蛋白多态性和与疾病状态有关的突变的测定。下面描述了本发明的示例性的实施方案。
在下面的部分中，更详细地描述了本发明的示例性的组合物和方法：I.嗅觉感觉；II.REEP和RTP多核苷酸；III.REEP和RTP多肽；IV.REEP和RTP等位基因的检测；V.REEP和RTP抗体的产生；VI.使用REEP和RTP的基因治疗；VII.表达外源REEP和RTP基因和其同源物、突变体和变体的转基因动物；VIII.使用REEP和RTP的药物筛选；IX.含有REEP和RTP核酸、肽和类似物的药物组合物；X.RNA干扰(RNAi)；XI.REEP和RTP的RNAi；和XII.气味受体配体的鉴别。
除非另有说明，本发明的实践采用有机化学、药理学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们属于本领域的技术范围之内。在文献中充分解释了这样的技术，例如，″Molecular cloning：a laboratory manual″第2版(Sambrook等，1989)；″Oligonucleotide synthesis″(M.J.Gait编，1984)；″Animal Cell culture″(R.I.Freshney编，1987)；系列″Methods inenzymology″(Academic Press，Inc.)；″Handbook of experimentalimmunology″(D.M.Weir&CC.Blackwell编)；″Gene transfervectors for mammalian cells″(J.M.Miller&M.P.Calos编，1987)；″Current protocols in molecular biology″(F.M.Ausubel等编，1987和定期更新)；″PCR：the polymerase chain reaction″(Mullis等编，1994)；和″Current protocols in immunology″(J.E.Coligan等编，1991)，它们中的每一篇在这里整体引作参考。
I.嗅觉感觉
嗅觉系统代表着哺乳动物的种系发生历史中最古老的感觉模态之一。人的嗅觉不如其它哺乳动物(例如啮齿动物)发达。作为化学传感器，嗅觉系统探测食物，并影响社会和性行为。特化的嗅上皮细胞表征着唯一一组能再生的神经元。当气味分子接触称作嗅泡的特化突起时，发生活化。在鼻腔内，鼻甲骨或鼻甲用于将吸入的空气导向后上区域中的嗅上皮。该区域(仅仅几公分宽)含有超过1亿嗅觉受体细胞。这些特化的上皮细胞产生含有动纤毛的嗅泡，其作为刺激转导的位置。
在人的鼻腔内存在3个专门的神经系统：1)主嗅觉系统(脑神经I)，2)三叉神经身体感觉系统(脑神经V)，3)终神经(脑神经0)。脑神经I介导气味感觉。它负责确定气味。脑神经V介导身体感觉，包括烧伤，冷，刺激和瘁。脑神经0是有神经节的神经丛。它分布在大多数鼻粘膜中，然后穿过筛板，进入嗅束内侧的前脑。尚不清楚人的终神经的确切功能。
嗅神经上皮是假复层的柱状上皮。特化的嗅上皮细胞是唯一一组能再生的神经元。嗅上皮位于每个鼻孔的上部，包括筛板，上鼻甲骨，上隔和中鼻甲的部分。它包含主嗅觉系统的感觉受体和一些脑神经V游离神经末梢。嗅上皮在出生后丧失它的总体均匀性，且早在生命的前几周，就出现呼吸-样上皮的组织转化岛。在整个生命中，组织转化的范围增加。推测该过程是来自环境的刺激(例如病毒、细菌和毒素)的结果。
嗅神经上皮中存在6种不同的细胞类型：1)双极感觉受体神经元，2)微绒毛细胞，3)支持细胞，4)球形基细胞，5)水平基细胞，6)衬在嗅腺的细胞。在成年嗅神经上皮中，存在大约6,000,000个双极神经元。它们是薄树突细胞，在一端具有含纤毛的柱，在另一端具有形成嗅丝的长中枢突。嗅觉受体位于有纤毛的树突末端。无髓鞘的轴突合并成40束，称作嗅丝，它们包盖着Schwann-样细胞。嗅丝横穿过筛板，进入颅前窝，并构成脑神经I。微绒毛细胞在神经上皮的表面附近，但是不清楚这些细胞的确切功能。支持细胞也在上皮的表面。它们紧密连接神经元和微绒毛细胞。它们也把微绒毛伸入粘液中。它们的功能包括，使受体细胞彼此绝缘，调节粘液的组成，灭活气味剂和保护上皮免受外来试剂影响。基细胞位于基底膜附近，且是其它细胞类型来源的祖细胞。嗅腺是嗅上皮区域内的粘液的主要来源。
气味受体位于受体细胞的纤毛上。每种受体细胞表达单一气味受体基因。现在有大约1,000种受体。嗅觉受体连接到刺激性鸟嘌呤核苷酸结合蛋白Golf。当受到刺激时，它可以激活腺苷酸环化酶，生成第二信使cAMP，随后的事件导致细胞膜的去极化和信号传播。尽管每种受体细胞仅仅表达一类受体，每种细胞会电生理地对广泛的但是有限范围的刺激作出响应。这意味着，单一受体接受一定范围的分子实体。
嗅球位于在颅前窝的额叶底部的筛板的上面。它接受来自嗅觉受体神经元的数千初级轴突。在嗅球内，这些轴与数目少得多的二级神经元形成突触，后者形成嗅束，并伸向嗅皮质。嗅皮质包括额叶和颞叶，丘脑和下丘脑。
尽管在超过10年前就鉴别出了哺乳动物OR，几乎不知道不同OR对化学刺激的选择性，主要因为难以在异源细胞的细胞表面上表达OR，并测定它们的配体-结合特异性(见，例如，Mombaerts，P.(2004)Nat Rev Neurosci 5，263-278；这里整体引作参考)。原因是，OR蛋白被保留在ER中，并随后在蛋白体中降解(见，例如，Lu，M.等，(2003)Traffic 4，416-433；McClintock，T.S.，(1997)Brain Res MolBrain Res 48，270-278；各自在本文中整体引作参考)。尽管存在这些困难，广泛的努力已经以不同的确定程度，将约20种OR与同源配体相匹配(见，例如，Bozza，T.等，(2002)J Neurosci 22，3033-3043；Gaillard，L等，(2002)Eur J Neurosci 15，409-418；Hatt，H.等，(1999)Cell Mol Biol 45，285-291；Kajiya，K.等，(2001)JNeurosci 21，6018-6025；Krautwurst，D.等，(1998)Cell 95，917-926；Malnic，B.等，(1999)Cell 96，713-723；Raming，K.等，(1993)Nature 361，353-356；Spehr，M.等，(2003)Science 299，2054-2058；Touha ra，K.等，(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96，4040-4045；Zhao，H.等，(1998)Science 279，237-242；各自在本文中整体引作参考)。向N-末端添加视紫红质的20个N-末端氨基酸(例如，Rho-标记)或外来信号肽，会促进异源细胞中的一些OR的表面表达(见，例如，Hatt，H.等，(1999)Cell Mol Biol 45，285-291；Krautwurst，D.等，(1998)Cell 95，917-926；各自在本文中整体引作参考)。但是，对于大多数OR，修饰不能可靠地促进细胞表面表达。例如，美丽线虫的化学感觉受体的适当定位所需的ODR-4，对促进一种大鼠OR的细胞表面表达具有小的作用，但是对另一种OR则不然(见，例如，Gimelbrant，A.A.等，(2001)J Biol Chem 276，7285-7290；这里引作参考)。这些发现表明，嗅觉神经元具有促进OR蛋白向细胞表面的适当靶向的选择性的分子机理，但是尚未鉴别出该机理的组成成分(见，例如，Gimelbrant，A.A.等，(2001)J Biol Chem276，7285-7290；McClintock，T.S.和Sammeta，N.(2003)Neuroreport 14，1547-1552；各自在本文中整体引作参考)。
对于有些GPCR，需要辅助蛋白来向细胞表面膜正确靶向(见，例如，Brady，A.E.和Limbird，L.E.(2002)Cell Signal 14，297-309；这里整体引作参考)。这些蛋白包括对于果蝇属视紫红质的NinaA(见，例如，Baker，E.K.等，(1994)Embo J 13，4886-4895；Shieh，B.H.等，(1989)Nature 338，67-70；各自在本文中整体引作参考)，对于哺乳动物视锥视蛋白的RanBP2(见，例如，Ferreira，P.A.等，(1996)Nature 383，637-640；这里整体引作参考)，对于哺乳动物降钙素受体-样受体(CRLR)的RAMP(见，例如，McLatchie，L.M.等，(1998)Nature 393，333-339；这里整体引作参考)和最后对于V2R的MHC I类蛋白的M10家族和β2微球蛋白，V2R是推定的哺乳动物信息素受体(见，例如，Loconto，J.等，(2003)Cell 112，607-618；这里整体引作参考)。除了NinaA和RanBP2以外，这些辅助蛋白彼此都不具有任何序列同源性；它们的唯一共同特征是它们与膜的关联。
本发明提供了促进OR细胞表面定位和OR功能性表达的新蛋白(例如，REEP1，RTP1，RTP2，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D，RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6))，和与这些发现有关的许多组合物和方法。
II.REEP和RTP多核苷酸
如上所述，本发明提供了促进气味受体细胞表面定位和气味受体功能性表达的新蛋白。更具体地，本发明提供了REEP基因和多肽(例如，REEP1，REEP2，REEP3，REEP4，REEP5和REEP6)和RTP基因和多肽(例如，RTP1，RTP2，RTP3，RTP4，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D，RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6))。在优选的实施方案中，REEP1，RTP1，RTP2和RTP1的变体(例如，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)会促进气味受体细胞表面定位和气味受体功能性表达。
因此，本发明提供了编码REEP基因、同源物、变体(例如，多态性和突变体)的核酸，包括但不限于，SEQ ID NO：1-12所述的那些。本发明提供了编码RTP基因、同源物、变体(例如，多态性和突变体)的核酸，包括但不限于，SEQ ID NO：13-20所述的那些。表1描述了本发明的示例性的REEP和RTP基因。在有些实施方案中，本发明提供了能在低至高严格性条件下与SEQ ID NO：1-20杂交的多核苷酸序列，只要能杂交的多核苷酸序列编码保留天然存在的REEP和/或RTP蛋白的生物活性的蛋白。在有些实施方案中，保留天然存在的REEP和/或RTP的生物活性的蛋白与野生型REEP和/或RTP 70％同源，优选地与野生型REEP和/或RTP 80％同源，更优选地与野生型REEP和/或RTP 90％同源，最优选地与野生型REEP和/或RTP 95％同源。在优选的实施方案中，杂交条件是基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，并参照如上解释的定义的″严格性″(见例如，Wahl等，Meth.Enzymol.，152：399-407(1987)，在这里引作参考)。
在本发明的其它实施方案中，提供了REEP和/或RTP基因的另外的等位基因。在优选的实施方案中，等位基因源自多态性或突变(即，核酸序列的变化)，且通常产生改变的mRNA或多肽，其结构或功能可以改变或不改变。任何给定的基因可以具有0、1或多种等位基因形式。产生等位基因的常见突变变化通常归于核酸的缺失、添加或置换。这些变化类型中的每一种可以单独地或彼此组合地在给定的序列中发生一次或多次。其它实例包括截短突变(例如，使得编码的mRNA不生成完整的蛋白)。
在本发明的其它实施方案中，可以工程改造本发明的核苷酸序列，以便为多种原因改变REEP和/或RTP编码序列，包括但不限于，修饰基因产物的克隆、加工和/或表达的改变。例如，可以使用本领域众所周知的技术导入突变(例如，定点诱变以插入新限制位点，改变糖基化模式，改变密码子偏好，等)。RTP1的变体包括但不限于RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C、RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)。
在本发明的有些实施方案中，在本领域已知的多种方法中，使用核苷酸序列，可以延伸REEP和/或RTP的多核苷酸序列，以检测上游序列例如启动子和调控元件。例如，预期限制位点聚合酶链式反应(PCR)可以用于本发明中。这是使用通用引物来恢复邻近已知基因座的未知序列的直接方法(Gobinda等，PCR Methods Applic，2：318-22(1993)；这里整体引作参考)。首先，在有连接序列的引物和对已知区域特异性的引物存在下，扩增基因组DNA。然后，使用相同的连接引物和在第一种之内的另一种特异性的引物，对扩增的序列进行第二轮PCR。用适当的RNA聚合酶，转录每一轮PCR的产物，并使用逆转录酶测序。
在另一个实施方案中，使用基于已知区域的发散的引物，可以使用反向PCR来扩增或延伸序列(Triglia等，Nucleic Acids Res.，16：8186[1988])。使用Oligo 4.0(National Biosciences Inc，Plymouth Minn.)或另一种适当的程序，可以将引物设计成22-30核苷酸长，具有50％或更高的GC含量，和在约68-72℃的温度退火到靶序列。该方法使用几种限制酶，产生已知基因区域中的合适的片段。然后通过分子内连接，环化该片段，并用作PCR模板。在其它实施方案中，使用步增PCR。步增PCR是靶向的基因步增的方法，其允许恢复未知序列(Parker等，Nucleic Acids Res.，19：3055-60[1991])。PROMOTERFINDER试剂盒(Clontech)使用PCR、巢式引物和特殊文库来″步入″基因组DNA。该过程不需要筛选文库，且可以用于发现内含子/外显子接头。
优选的用于筛选全长cDNA的文库包括已经按尺寸选择的包含更大的cDNA的哺乳动物文库。另外，随机引物的文库也是优选的，因为它们会含有更多的含有5′和上游基因区域的序列。在寡d(T)文库不产生全长cDNA的情况下，随机引物的文库可能是特别有用的。基因组哺乳动物文库可以用于得到内含子和延伸5′序列。
在本发明的其它实施方案中，提供了公开的REEP和/或RTP序列的变体。在优选的实施方案中，变体源自多态性或突变(即，核酸序列的变化)，且通常产生改变的mRNA或多肽，其结构或功能可以改变或不改变。任何给定的基因可以具有0、1或多种变体形式。产生变体的常见突变变化通常归于核酸的缺失、添加或置换。这些变化类型中的每一种可以单独地或彼此组合地在给定的序列中发生一次或多次。
为了改变生物活性等目的(例如，改变的REEP和/或RTP功能)，预期可以修饰具有功能(例如，REEP和/或RTP功能)的肽的结构。这样的修饰的肽视作具有如本文定义的REEP和/或RTP肽的活性的肽的功能等同物。可以生成修饰的肽，其中已经改变了编码多肽的核苷酸序列，例如通过置换、缺失或添加，在特别优选的实施方案中，这些修饰不会显著降低经修饰的REEP和/或RTP基因的生物活性，换而言之，可以评价构建体″X″，以确定它是否是功能上(而不是结构上)定义的本发明的修饰的或变体REEP和/或RTP属的成员。在优选的实施方案中，通过本文所述的方法(例如，转基因动物的产生或使用信号转导测定)，评价变体REEP和/或RTP多肽的活性。
而且，如上所述，REEP和/或RTP基因的变体形式也视作等同于本文详述的那些肽和DNA分子。例如，预期下述分离的替换不会对得到的分子的生物活性产生重大影响：将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸，将天冬氨酸替换为谷氨酸，将苏氨酸替换为丝氨酸或将氨基酸替换为结构上相关的氨基酸的类似替换(即，保守突变)。因此，本发明的有些实施方案提供了含有保守替换的REEP和/或RTP的变体。保守替换是发生在它们的侧链相关的氨基酸家族内的替换。遗传编码的氨基酸可以分成4个家族：(1)酸性的(天冬氨酸，谷氨酸)；(2)碱性的(赖氨酸，精氨酸，组氨酸)；(3)非极性的(丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)；和(4)不带电荷的极性的(甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同地归为芳香族氨基酸。以类似的方式，所有氨基酸可以分成：(1)酸性的(天冬氨酸，谷氨酸)；(2)碱性的(赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，(3)脂族的(甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸)，将丝氨酸和苏氨酸任选地单独归为脂族-羟基；(4)芳香族(苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺，谷氨酰胺)；和(6)含硫的(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如，Stryer编，Biochemistry，第17-21页，第2版，WH Freeman和Co.，1981)。通过评价变体肽以类似于野生型蛋白的方式起作用的能力，可以容易地确定肽的氨基酸序列的变化是否会产生功能性多肽。以相同的方式，可以容易地测试具有超过一个替换的肽。
更罕见地，变体包括″非保守的″变化(例如，将甘氨酸替换为色氨酸)。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入或二者。使用计算机程序(例如，LASERGENE软件，DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)，可以发现确定可以置换、插入或删除哪个氨基酸残基而不破坏生物活性的指南。
如下面更详细地描述的，通过定向进化或下面更详细地描述的产生变体的组合文库的其它技术等方法，可以产生变体。在本发明的其它实施方案中，可以工程改造本发明的核苷酸序列，以便改变REEP和/或RTP编码序列，包括但不限于，修饰基因产物的克隆、加工、定位、分泌和/或表达的改变。例如，可以使用本领域众所周知的技术导入突变(例如，定点诱变以插入新限制位点，改变糖基化模式，或改变密码子偏好，等)。
RTP1的变体包括但不限于RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)。
  表1OR调控基因
  基因   SEQ ID NO(核酸)  SEQ ID NO(多肽)
  鼠REEP1   1  21
  鼠REEP2   2  22
  鼠REEP3   3  23
  鼠REEP4   4  24
  鼠REEP5   5  25
  REEP6   6  26
  人REEP1   7  27
  人REEP2   8  28
  人REEP3   9  29
  人REEP4   10  30
  人REEP5   11  31
  人REEP6   12  32
  鼠RTP1   13  33
  鼠RTP2   14  34
  鼠RTP3   15  35
  RTP4   16  36
  人RTP1   17  37
  人RTP2   18  38
  人RTP3   19  39
  人RTP4   20  40
III.REEP和RTP多肽
在其它实施方案中，本发明提供了编码REEP和/或RTP多肽序列(例如，分别为SEQ ID NO：21-40，41-50的多肽)的REEP和/或RTP多核苷酸序列。在优选的实施方案中，本发明提供了由选自SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18的核酸以及与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少80％一致的其变体编码的多肽。在其它实施方案中，该蛋白与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少90％一致。在其它实施方案中，该蛋白与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少95％一致。本发明的其它实施方案提供了REEP和/或RTP蛋白的片段、融合蛋白或功能等同物(例如，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)。在有些实施方案中，本发明提供了REEP和/或RTP多肽的突变体。在本发明的其它实施方案中，可以使用与REEP和/或RTP变体、同源物和突变体相对应的核酸序列，产生指导REEP和/或RTP变体、同源物和突变体在适当的宿主细胞中的表达的重组DNA分子。在本发明的有些实施方案中，多肽可以是天然地纯化的产物。在其它实施方案中，它可以是化学合成方法的产物，在其它实施方案中，可以通过重组技术，使用原核生物或真核生物宿主(例如，通过培养的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)生产它。在有些实施方案中，根据在重组生产方法中采用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。在其它实施方案中，本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
在本发明的一个实施方案中，由于遗传密码的固有简并性，可以使用除了SEQ ID NO：21-50的多核苷酸序列以外的编码基本上相同的或功能上等同的氨基酸序列的DNA序列，来克隆和表达REEP和/或RTP蛋白，通常，这样的多核苷酸序列会在如上所述的高至中等严格性的条件下，与SEQ ID NO：21-50之一杂交。如本领域的技术人员会理解的，可以有利地生成具有非天然存在的密码子的REEP和/或RTP-编码核苷酸序列。因此，在有些优选的实施方案中，选择特定原核生物或真核生物宿主优选的密码子(Murray等，Nucl.Acids Res.，17[1989])，例如，以增加REEP和/或RTP表达速度，或生成具有希望的性质(例如比天然存在的序列产生的转录物更长的半衰期)的重组RNA转录物。
在优选的实施方案中，REEP1，RTP1和RTP2多肽会促进气味受体细胞表面定位和气味受体功能性表达。
1.用于生产REEP和RTP的载体
本发明的多核苷酸可以用于通过重组技术生产多肽。因而，例如，多核苷酸可以包含在用于表达多肽的多种表达载体中的任一种中。在本发明的有些实施方案中，载体包括，但不限于，染色体的，非染色体的和合成的DNA序列(例如，SV40衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA；杆状病毒，酵母质粒，源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，和病毒DNA例如牛痘，腺病毒，鸡痘病毒和伪狂犬病)。预期可以使用任意载体，只要它可在宿主中复制和存活。
更具体地，本发明的有些实施方案提供了重组构建体，其包含一种或多种如上广泛描述的序列(例如，SEQ ID NO：1-20)。在本发明的有些实施方案中，构建体包含其中已经正向或反向插入了本发明的序列的载体，例如质粒或病毒载体。在其它实施方案中，在适当的阶段，将异源的结构序列(例如，SEQ ID NO：1-20)与翻译起始和终止序列装配到一起。在本发明的优选的实施方案中，使用多种方法中的任一种，将适当的DNA序列插入载体中。通常，通过本领域已知的方法，将DNA序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。
大量合适的载体是本领域的技术人员已知的，且可以商业上得到。这样的载体包括，但不限于，下面的载体：1)细菌的：pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pbluescriptSK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)；2)真核生物的-pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，PXT1，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)；和3)杆状病毒-pPbac和pMbac(Stratagene)。可以使用任意的其它质粒或载体，只要它们在宿主中可以复制和存活。在本发明的有些优选的实施方案中，哺乳动物表达载体包含复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列和5′侧翼非转录序列。在其它实施方案中，DNA序列源自SV40剪接，且可以使用多腺苷酸化位点来提供需要的非转录遗传元件。
在本发明的某些实施方案中，表达载体中的DNA序列可操作地连接到适当的表达控制序列(启动子)上，指导mRNA合成。在本发明中有用的启动子包括，但不限于，LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp，噬菌体λPL和PR，T3和T7启动子和巨细胞病毒(CMV)立即早期，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶和小鼠金属硫蛋白-I启动子和已知会控制基因在原核生物或真核生物细胞或它们的病毒中的表达的其它启动子。在本发明的其它实施方案中，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞的转化的选择标记(例如，用于真核生物细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或大肠杆菌中的四环素或氨苄西林抗性)。
在本发明的有些实施方案中，通过将增强子序列插入载体中，增强高等真核生物对编码本发明的多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，其作用于启动子，以增强它的转录。在本发明中有用的增强子包括，但不限于，在复制起点后侧100至270碱基对的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点后侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。
在其它实施方案中，表达载体还含有翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。在本发明的其它实施方案中，载体也可以包含用于放大表达的适当序列。
2.用于生产REEP和RTP多肽的宿主细胞
在另一个实施方案中，本发明提供了含有上述构建体的宿主细胞。在本发明的有些实施方案中，宿主细胞是高等真核生物细胞(例如，哺乳动物或昆虫细胞)。在本发明的其它实施方案中，宿主细胞是低等真核生物细胞(例如，酵母细胞)。在本发明的其它实施方案中，宿主细胞可以是原核生物细胞(例如，细菌细胞)。宿主细胞的特定实例包括，但不限于，大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，枯草芽孢杆菌和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的不同物种，以及酿酒酵母，粟酒裂殖酵母，果蝇S2细胞，Spodoptera Sf9细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，猴肾成纤维细胞的COS-7系，(Gluzman，Cell 23：175[1981])，C127，3T3，293，293T，HeLa和BHK细胞系。
可以以常规方式使用宿主细胞中的构建体，生产由重组序列编码的基因产物。在有些实施方案中，通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔，可以将构建体导入宿主细胞(见例如，Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，[1986])。或者，在本发明的有些实施方案中，通过常规的肽合成仪，可以合成地生产本发明的多肽。
蛋白可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在适当启动子控制下表达。也可以采用无细胞的翻译系统，使用源自本发明的DNA构建体的RNA，生产这样的蛋白。与原核生物和真核生物宿主一起使用的适当的克隆和表达载体记载在Sambrook，等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，[1989]。
在本发明的有些实施方案中，转化合适的宿主株和宿主株生长至适当的细胞密度后，通过适当的方式诱导选择的启动子(例如，温度变动或化学诱导)，并培养细胞额外的时间段。在本发明的其它实施方案中，典型地通过离心收获细胞，通过物理或化学的方式破碎，保留得到的粗提物，用于进一步纯化。在本发明的其它实施方案中，通过任意的方便的方法，包括冷冻-融化循环，超声处理，机械破碎，或使用细胞裂解剂，可以破碎在蛋白的表达中采用的微生物细胞。
在优选的实施方案中，本发明提供了细胞系(例如，异源的293T细胞系)，其包含定位于细胞表面上的气味受体(例如，人气味受体，鼠气味受体，合成的气味受体)，REEP1，RTP1，RTP2和Gαolf的表达。在有些实施方案中，气味受体标记有报道试剂(例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，c-myc，6-组氨酸(6X-His)，绿色荧光蛋白(GFP)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，甲型流感病毒血球凝集素(HA)，β-半乳糖苷酶和GAL4)。在该实施方案中描述的细胞系不限于特定气味受体。在有些实施方案中，在细胞系中表达的气味受体包括，但不限于，S6/79，S18，S46，S50，MOR23-1，MOR31-4，MOR31-6，MOR32-5和MOR32-11。在优选的实施方案中，表达气味受体的细胞系用于气味受体的功能性表达的分类(例如，配体特异性)。在其它实施方案中，表达气味受体的细胞系用于动物的嗅觉感觉的分类。
3.REEP和RTP多肽的纯化
本发明也提供了从重组细胞培养物回收和纯化REEP和/或RTP多肽的方法，包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，磷酸纤维素色谱，疏水相互作用色谱，亲和色谱，羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。在本发明的其它实施方案中，可以根据需要使用蛋白-重折叠步骤，完成成熟蛋白的构型。在本发明的其它实施方案中，可以在最后的纯化步骤中，采用高效液相色谱(HPLC)。
本发明还提供了多核苷酸，其具有符合读框地与标记序列相融合的REEP和/或RTP基因的编码序列(例如，SEQ ID NO：1-20)，所述标记序列允许纯化本发明的多肽。标记序列的非限制性实例是六组氨酸标记，其可以由载体(优选地pQE-9载体)提供，在细菌宿主的情况下，其提供与标记融合的多肽的纯化；或者，例如，当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，标记序列可以是血球凝集素(HA)标记。HA标记对应着源自流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson等，Cell，37：767[1984])。
4.REEP和RTP多肽的截短突变体
另外，本发明提供了REEP和/或RTP多肽的片段(即，截短突变体)。在本发明的有些实施方案中，当希望表达REEP和/或RTP蛋白的一部分时，可能必需将起始密码子(ATG)添加到含有要表达的目标序列的寡核苷酸片段上。本领域众所周知，使用酶甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)，可以酶促地切割在N-末端位置的甲硫氨酸。已经从大肠杆菌(Ben-Bassat等，J.Bacterid.，169：751[1987])和鼠伤寒沙门氏菌克隆出MAP，并在重组蛋白上证实了它的体外活性(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2718[1990])。因此，如果需要，可以通过在生产MAP的宿主(例如，大肠杆菌或CM89或酿酒酵母)中表达这样的重组多肽，体内地去除N-末端甲硫氨酸，或通过使用纯化的MAP，体外地去除。
5.含有REEP和RTP的融合蛋白
本发明也提供了融合蛋白，其掺入了本发明的REEP和/或RTP多肽的全部或部分。因此，在本发明的有些实施方案中，多肽的编码序列可以整合为融合基因的一部分，该融合基因包括编码不同多肽的核苷酸序列。预期在希望生产REEP和/或RTP蛋白的免疫原片段的条件下，可以使用这类表达系统。在本发明的有些实施方案中，将轮状病毒的VP6衣壳蛋白用作免疫学载体蛋白，用于REEP和/或RTP多肽的部分，以单体形式或是以病毒颗粒形式。在本发明的其它实施方案中，可以将与要针对它产生抗体的REEP和/或RTP多肽的部分相对应的核酸序列掺入包含晚期痘苗病毒结构蛋白的编码序列的融合基因构建体中，生成一组重组病毒，其表达包含REEP和/或RTP的一部分的融合蛋白作为病毒体的一部分。已经使用利用乙型肝炎表面抗原融合蛋白的免疫原性融合蛋白证实，在该作用中也可以利用重组乙型肝炎病毒体。类似地，在本发明的其它实施方案中，建立了编码含有REEP和/或RTP多肽的一部分和脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白的融合蛋白的嵌合构建体，以增强该组多肽抗原的免疫原性(见例如，欧洲公开号025949；和Evans等，Nature 339：385[1989]；Huang等，J.Virol.，62：3855[1988]；和Schlienger等，J.Virol.，66：2[1992])。
在本发明的其它实施方案中，可以使用用于基于肽的免疫的多抗原肽系统。在该系统中，从寡聚分支赖氨酸核心上的肽的有机化学合成，直接得到希望的REEP和/或RTP的一部分(见例如，Posnett等，J.Biol.Chem.，263：1719[1988]；和Nardelli等，J.Immunol.，148：914[1992])。在本发明的其它实施方案中，也可以由细菌细胞表达和呈递REEP和/或RTP蛋白的抗原决定簇。
除了利用融合蛋白来增强免疫原性以外，广泛地认识别，融合蛋白也可以促进蛋白的表达，例如本发明的REEP和/或RTP蛋白。因此，在本发明的有些实施方案中，可以产生REEP和/或RTP多肽，作为谷胱甘肽-S-转移酶(即，GST融合蛋白)。预期这样的GST融合蛋白能使REEP和/或RTP多肽的纯化容易，例如通过使用谷胱甘肽-衍生化的基质(见例如，Ausabel等(编)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，NY[1991])。在本发明的另一个实施方案中，编码纯化先导序列的融合基因，可以允许通过使用Ni2+金属树脂的亲和色谱来纯化表达的REEP和/或RTP融合蛋白，所述纯化先导序列例如在希望的REEP和/或RTP多肽的部分的N-末端处的聚-(His)/肠激酶切割位点序列。在本发明的另一个实施方案中，可以随后通过肠激酶处理，去除纯化先导序列(见例如，Hochuli等，J.Chromatogr.，411：177[1987]；和Janknecht等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8972)。
制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，根据常规技术，采用用于连接的平端或交错端末端、提供适当末端的限制酶消化、适当时粘性末端的填入、避免不希望的连接的碱性磷酸酶处理和酶促连接，进行编码不同多肽序列的多种DNA片段的连接。在本发明的另一个实施方案中，通过常规技术，包括自动化的DNA合成仪，可以合成融合基因。或者，在本发明的其它实施方案中，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物产生2个相邻基因片段之间的互补突出端，其可以随后退火，产生嵌合基因序列  (见例如，CurrentProtocols in Molecular Biology，同上)。
6.REEP和RTP的变体
本发明的其它实施方案提供了REEP和/或RTP多肽的突变体或变体形式(即，突变型蛋白)。为了增强治疗或预防功效、灭活蛋白或稳定性(例如，离体贮存期限和/或对体内蛋白水解降解的抗性)等目的，可以修饰具有本发明的REEP和/或RTP多肽的活性的肽的结构。将这样的修饰的肽视作具有如本文定义的主题REEP和/或RTP蛋白的活性的肽的功能等同物。可以生成修饰的肽，其中已经改变了氨基酸序列，例如通过氨基酸置换、缺失或添加。
RTP1的变体形式包括但不限于RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)。
而且，如上所述，预期主题REEP和/或RTP蛋白的变体形式(例如，突变体或多态性序列)也与详述的那些肽和DNA分子等同。例如，如上所述，本发明包括含有保守的或非保守的氨基酸置换的突变体和变体蛋白。
本发明还包括产生本发明的REEP和/或RTP蛋白的组合突变体组以及截短突变体的方法，且特别适用于鉴别参与神经障碍(例如，嗅觉障碍)或对神经障碍的抗性的潜在变体序列(即，突变体或多态性序列)。筛选这样的组合文库的目的是，产生例如可以起激动剂或拮抗剂作用或者具有新活性的新REEP和/或RTP变体。
因此，在本发明的有些实施方案中，通过本发明的方法工程改造REEP和/或RTP变体，以提供改变的(例如，增加的或降低的)生物活性。在本发明的其它实施方案中，产生组合地衍生的变体，其与天然存在的REEP和/或RTP相比具有选择性效力。当从重组DNA构建体表达时，这样的蛋白可以用于基因治疗方案中。
本发明的其它实施方案提供了REEP和/或RTP变体，其具有与对应的野生型蛋白显著不同的细胞内半衰期。例如，可以使得改变的蛋白对蛋白水解降解或导致破坏或以其它方式灭活REEP和/或RTP多肽的其它细胞过程更稳定或更不稳定。可以利用这样的变体和编码它们的基因，通过调控蛋白的半衰期，改变REEP和/或RTP表达的定位。例如，短半衰期可以产生更短暂的REEP和/或RTP生物效应，当作为诱导型表达系统的一部分时，可以允许更紧密地控制细胞内的REEP和/或RTP水平。如上，这样的蛋白、特别是它们的重组核酸构建体，可以用于基因治疗方案中。
在本发明的其它实施方案中，通过重组方法生产REEP和/或RTP变体，起拮抗剂的作用，因为它们能妨碍对应的野生型蛋白调节细胞功能的能力。
在本发明的组合诱变方案的有些实施方案中，比对了一群REEP和/或RTP同源物、变体或其它有关蛋白的氨基酸序列，优选地促进可能的最高同源性。这样的变体群体可以包括，例如，来自一个或多个物种的REEP和/或RTP同源物，或来自相同物种、但是由于突变或多态性而不同的REEP和/或RTP变体。选择出现在比对的序列的每个位置处的氨基酸，建立组合序列的简并组。
在本发明的优选的实施方案中，通过编码多肽文库的基因的简并文库，每种所述多肽至少包括潜在REEP和/或RTP蛋白序列的一部分，生产组合的REEP和/或RTP文库。例如，可以将合成的寡核苷酸的混合物酶促地连接进基因序列，使得潜在的REEP和/或RTP序列的简并组可以表达为单个的多肽，或者，作为一组较大的融合蛋白(例如，用于噬菌体展示)，其中包含REEP和/或RTP序列组。
存在许多从简并寡核苷酸序列产生潜在的REEP和/或RTP同源物和变体的文库的方法。在有些实施方案中，在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，将合成的基因连接进适当的基因中，进行表达。基因的简并组的目的是，在一种混合物中，提供编码需要的潜在REEP和/或RTP序列组的所有序列。简并寡核苷酸的合成是本领域众所周知的(见例如，Narang，Tetrahedron Lett.，39：39[1983]；Itakura等，Recombinant DNA，in Walton(编)，Proceedings of the3rd Cleveland Symposium on Macromoleculars，Elsevier，Amsterdam，pp 273-289[1981]；Itakura等，Annu.Rev.Biochem.，53：323[1984]；Itakura等，Science 198：1056[1984]；Ike等，Nucl.Acid Res.，11：477[1983])。这样的技术已经用于其它蛋白的定向进化(见例如，Scott等，Science 249：386[1980]；Roberts等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2429[1992]；Devlin等，Science 249：404[1990]；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6378[1990]；它们各自在这里引作参考；以及美国专利号5,223,409，5,198,346和5,096,815；它们各自在这里引作参考)。
预期本发明的REEP和/或RTP核酸(例如，SEQ ID NO：1-20和它们的片段和变体)可以用作定向进化的起始核酸。这些技术可以用于开发具有希望的性质(例如增加的或降低的生物活性)的REEP和/或RTP变体。
在有些实施方案中，通过随机诱变进行人工进化(例如，通过使用易出错的PCR，将随机突变导入给定的编码序列)。该方法要求，精细调节突变的频率。作为一般规律，有益的突变罕见，而有害的突变常见。这是因为，有害的突变和有益的突变的组合经常产生无活性的酶。对于靶向基因的碱基置换的理想数目通常是1.5至5(Moore和Arnold，Nat.Biotech.，14，458[1996]；Leung等，Technique，1：11[1989]；Eckert和Kunkel，PCR Methods Appl.，1：17-24[1991]；Caldwell和Joyce，PCR Methods Appl.，2：28[1992 ]；和Zhao和Arnold，Nuc.Acids.Res.，25：1307[1997])。诱变后，选择得到的克隆的希望的活性(例如，筛选REEP和/或RTP活性)。经常需要连续轮数的诱变和选择，以开发具有希望的性质的酶。应当指出，仅仅有用的突变进入下一轮诱变。
在本发明的其它实施方案中，本发明的多核苷酸用于基因改组或性PCR方法(例如，Smith，Nature，370：324[1994]；美国专利号5,837,458；5,830,721；5,811,238；5,733,731；它们都在这里引作参考)。基因改组涉及几个突变型DNA的随机断裂，然后通过PCR，使它们重新装配成全长分子。各种基因改组方法的实例包括，但不限于，DNA酶处理后装配，交错的延伸过程(STEP)和随机引物体外重组。在DNA酶介导的方法中，用DNA酶I将从阳性突变体库分离的DNA片段切割成随机片段，并在没有加入引物的情况下，进行多轮PCR。随着PCR循环的进行，随机片段的长度接近未剪切的片段的长度，导致存在于不同克隆中的突变在有些得到的序列中混合和积累。多个循环的选择和改组，已经导致几种酶的功能增强(Stemmer，Nature，370：398[1994]；Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：10747[1994]；Crameri等，Nat.Biotech.，14：315[1996]；Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4504[1997]；和Crameri等，Nat.Biotech.，15：436[1997])。通过本文所述的方法，可以筛选通过定向进化生成的变体的REEP和/或RTP活性。
本领域已知许多筛选通过点突变制备的组合文库的基因产物的技术，和筛选cDNA文库中具有某些性质的基因产物的技术。这样的技术通常可适于快速筛选通过REEP和/或RTP同源物或变体的组合诱变或重组产生的基因文库。最广泛地使用的筛选大基因文库的技术，典型地包含将基因文库克隆进可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化适当的细胞，并在对希望的活性的检测有利于相对容易地分离编码其产物受到检测的基因的载体的条件下表达组合基因。
7.REEP和/或RTP多肽的化学合成
在本发明的一个替代实施方案中，使用本领域众所周知的化学方法(见例如，Caruthers等，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.，7：215[1980]；Crea和Horn，Nucl.Acids Res.，9：2331[1980]；Matteucci和Caruthers，Tetrahedron Lett.，21：719[1980]；和Chow和Kempe，Nucl.Acids Res.，9：2807[1981])，全部地或部分地合成REEP和/或RTP的编码序列。在本发明的其它实施方案中，使用化学方法，以合成整个REEP和/或RTP氨基酸序列或其一部分，生产蛋白本身。例如，通过固相技术可以合成肽，从树脂裂解，并通过制备型高效液相色谱纯化(见例如，，Creighton，Protein Structures and MolecularPrinciples，W H Freeman和Co，New York N.Y.[1983])。在本发明的其它实施方案中，通过氨基酸分析或测序，证实合成的肽的组成(见例如，Creighton，同上)。
使用各种固相技术，可以进行直接的肽合成(Roberge等，Science269：202[1995])，且可以实现自动化的合成，例如，根据生产商提供的说明书，使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)。另外，在直接合成过程中，可以改变REEP和/或RTP多肽或其任意部分的氨基酸序列，和/或使用化学方法与其它序列组合，生产变体多肽。
IV.REEP和RTP等位基因的检测
在有些实施方案中，本发明提供了检测野生型或变体(例如，突变型或多态的)REEP和/或RTP核酸或多肽的存在的方法。突变型REEP和/或RTP多肽的检测，可以用于诊断疾病(例如，嗅觉障碍)。
A.变体REEP和/或RTP等位基因的检测
在有些实施方案中，本发明提供了REEP和/或RTP的等位基因，其会增加患者对嗅觉障碍(例如，上呼吸道感染，颅前窝肿瘤，Kallmann综合征，福斯特·肯尼迪综合征，帕金森病，阿耳茨海默病和亨廷顿舞蹈病)的易感性。会导致改变的表型(例如，减弱的嗅觉感觉能力)的任何突变，都在本发明的范围内。
因此，本发明提供了通过直接或间接测定个体是否具有变体REEP和/或RTP等位基因，确定患者是否具有增加的对嗅觉障碍(例如，上呼吸道感染，颅前窝肿瘤和Kallmann综合征，福斯特·肯尼迪综合征，帕金森病，阿耳茨海默病，亨廷顿舞蹈病)的易感性的方法。在其它实施方案中，本发明提供了基于一种或多种变体REEP和/或RTP等位基因的存在与否，为个体提供嗅觉障碍的增加危险的预后的方法。
可以得到许多分析变体(例如，突变型或多态的)核酸或多肽序列的方法。通过核酸分析检测变体(例如，多态性或突变)的测定，可分成几类，包括但不限于，直接测序测定，片段多态性测定，杂交测定和基于计算机的数据分析。可以得到用于进行这些测定的多种变化的实验方案和商业上可得到的试剂盒或服务。在有些实施方案中，组合地或杂合地进行测定(例如，组合来自几种测定的不同试剂或技术，产生一种测定)。下面是在本发明中有用的示例性的测定：直接测序测定，PCR测定，通过dHPLC(例如，可从Transgenomic，Omaha，NE或Varian，Palo Alto，CA得到)的突变分析，片段长度多态性测定(例如，RFLP或CFLP(见例如，美国专利号5,843,654；5,843,669；5,719,208；和5,888,780；它们各自在这里引作参考))，杂交测定(例如，杂交的直接检测，使用DNA芯片测定的杂交检测(见例如，美国专利号6,045,996；5,925,525；5,858,659；6,017,696；6,068,818；6,051,380；6,001,311；5,985,551；5,474,796；PCT公开WO99/67641和WO 00/39587，它们各自在这里引作参考)，杂交的酶检测(见例如，美国专利号5,846,717，6,090,543；6,001,567；5,985,557；5,994,069；5,962,233；5,538,848；5,952,174和5,919,626，它们各自在这里引作参考))，直接或间接地检测的多态性(例如，检测具有处于与要鉴别的多态性的连锁不平衡中的序列(其它多态性)；例如，可以使用SPG-6基因座中的其它序列；该方法记载在美国专利号：5,612,179(这里引作参考))和质谱测定。
另外，检测变体REEP和/或RTP蛋白的测定可以用于本发明(例如，无细胞的翻译方法，见例如，美国专利6,303,337，这里引作参考)和抗体结合测定。下面讨论了特异性地识别突变型相对于野生型蛋白的抗体的产生。
B.用于分析嗅觉障碍的危险的试剂盒
本发明也提供了用于确定个体是否含有REEP和/或RTP的野生型或变体(例如，突变型或多态的)等位基因或多肽的试剂盒。在有些实施方案中，试剂盒可以用于确定受试对象是否处于发生嗅觉障碍(例如，上呼吸道感染，颅前窝肿瘤和Kallmann综合征，福斯特·肯尼迪综合征，帕金森病，阿耳茨海默病，亨廷顿舞蹈病)的危险中。以多种方式生成诊断试剂盒。在有些实施方案中，试剂盒含有至少一种用于特异性地检测突变型REEP和/或RTP等位基因或蛋白的试剂。在优选的实施方案中，该试剂是核酸，其会与含有突变的核酸杂交，且不会结合不含有突变的核酸。在其它实施方案中，该试剂是引物，其用于扩增含有突变的DNA区域。在其它实施方案中，该试剂是抗体，其优先结合野生型或突变型REEP和/或RTP蛋白。
在有些实施方案中，试剂盒含有关于确定受试对象是否处于嗅觉障碍(例如，上呼吸道感染，颅前窝肿瘤和Kallmann综合征，福斯特·肯尼迪综合征，帕金森病，阿耳茨海默病，亨廷顿舞蹈病)的危险中的说明书。在优选的实施方案中，说明书指出，通过检测受试对象中是否存在突变型REEP和/或RTP等位基因，确定发生嗅觉障碍的危险，其中具有突变型等位基因的受试对象处于更高的发生嗅觉障碍的危险中。
可以使用REEP和/或RTP基因中是否存在疾病相关的突变，来作出治疗或其它医学决定。例如，具有气味受体相关的疾病的家族史的夫妻，可以选择通过体外受精和植入前的遗传筛选来怀孕。在该情况下，对受精胚胎筛选REEP和/或RTP基因的突变型(例如，疾病相关的)等位基因，仅将具有野生型等位基因的胚胎植入子宫中。
在其它实施方案中，在发育中的胎儿上进行子宫内筛选(例如，羊膜穿剌术或绒毛膜绒毛筛选)。在其它实施方案中，进行对新生婴儿或非常幼小的儿童的遗传筛选。对已知与嗅觉障碍有关的REEP和/或RTP等位基因的早期检测，允许早期干预(例如，遗传的或药物的治疗)。
在有些实施方案中，试剂盒包括辅助试剂例如缓冲剂，核酸稳定剂，蛋白稳定剂和信号产生系统(例如，荧光产生系统，如Fret系统)。可以以任何合适的方式包装测试试剂盒，典型地将元件根据需要放在单个容器或多个容器中，以及一张关于进行测试的说明书。在有些实施方案中，试剂盒也优选地包含阳性对照样品。
C.生物信息学
在有些实施方案中，本发明提供了基于REEP和/或RTP基因的一种或多种变体等位基因的存在，确定个体发生嗅觉障碍(例如，上呼吸道感染，颅前窝肿瘤和Kallmann综合征，福斯特·肯尼迪综合征，帕金森病，阿耳茨海默病，亨廷顿舞蹈病)的危险的方法。在有些实施方案中，使用储存在计算机中的信息(例如，在数据库中)，通过计算机，进行变体数据的分析处理。例如，在有些实施方案中，本发明提供了生物信息学研究系统，其包含许多运行多平台的面向对象的编程语言的计算机(见例如，美国专利6,125,383；这里引作参考)。在有些实施方案中，计算机之一储存着遗传数据(例如，接触与给定的多态性有关的REEP和/或RTP相关的嗅觉障碍的危险，以及序列)。在有些实施方案中，计算机之一储存着应用程序(例如，用于分析检测测定的结果)。然后将结果传输给用户(例如，通过计算机之一或通过因特网)。
例如，在有些实施方案中，使用基于计算机的分析程序，将通过检测测定产生的原始数据(例如，给定的REEP和/或RTP等位基因或多肽的存在与否，或数量)翻译成临床医生的预测值的数据。使用任何合适的方式，临床医生可以存取预测数据。因而，在有些优选的实施方案中，本发明提供了其它益处，即可能未受过遗传学或分子生物学培训的临床医生不需要理解原始数据。数据以它最有用的形式，直接呈现给临床医生。然后，临床医生能立即利用信息，以便优化对受试对象的护理。
本发明包括能向和从进行测定的实验室、信息提供者、医学人员和受试对象接受、加工和传递信息的任何方法。例如，在本发明的有些实施方案中，从受试对象得到样品(例如，活组织检查或血清或尿样品)，并呈交给位于世界上任意位置(例如，在受试对象居住国以外的国家，或最终使用该信息的国家以外的国家)的profiling service(例如，在医疗设施中的临床实验室，基因组profiling business，等)，产生原始数据。当样品包含组织或其它生物样品时，受试对象可以访问医学中心来得到样品，并送给profiling中心，或受试对象可以自己收集样品(例如，尿样品)，并直接送给profiling中心。当样品包含以前确定的生物学信息时，受试对象可以将该信息直接送给profiling service(例如，可以用计算机扫描含有该信息的信息卡片，并使用电子通信系统，将数据传送给profiling中心的计算机)。一旦profiling service收到后，处理样品，并生成对受试对象希望的诊断或预后信息特异性的profile(即，野生型或突变型REEP和/或RTP基因或多肽的存在)。
然后，将profile数据制成适于主治临床医生解释的格式。例如，不是提供原始数据，准备的格式可以表示对受试对象的诊断或危险评估(例如，发生REEP和/或RTP相关的嗅觉障碍的可能性)，以及对特定治疗选择的推荐。通过任何合适的方法，可以将数据显示给临床医生。例如，在有些实施方案中，profiling service产生一份报道，其可以由临床医生打印(例如，在护理点)或在计算机显示器上显示给临床医生。
在有些实施方案中，在护理点或在地区设施处，首先分析信息。然后，将原始数据送到中心处理设施，进行进一步分析，和/或将原始数据转换成对临床医生或患者有用的信息。中心处理设施提供下述优点：隐私(所有数据都储存在具有统一的安全性方案的中心设施中)，速度和数据分析的一致性。然后，中心处理设施可以控制治疗受试对象后的数据的命运。例如，使用电子通信系统，中心设施可以给临床医生、受试对象或研究人员提供数据。
在有些实施方案中，受试对象能使用电子通信系统，直接获取数据。基于结果，受试对象可以选择其它干预或咨询。在有些实施方案中，数据用于研究用途。例如，数据可以用于进一步优化给定的REEP和/或RTP等位基因与嗅觉障碍的关联。
V.REEP和RTP抗体的产生
本发明提供了分离的抗体或抗体片段(例如，FAB片段)。可以产生抗体，以允许检测本发明的REEP和/或RTP蛋白(例如，野生型或突变型)。可以使用各种免疫原制备抗体。在一个实施方案中，免疫原是人REEP和/或RTP肽，以产生识别人REEP和/或RTP的抗体。这样的抗体包括，但不限于，多克隆的、单克隆的、嵌合的、单链、Fab片段、Fab表达文库或重组的(例如，嵌合的，人源化的，等)抗体，只要它可以识别该蛋白。根据常规的抗体或抗血清制备方法，使用本发明的蛋白作为抗原，可以生产抗体。
可以使用本领域已知的多种方法，生产针对REEP和/或RTP多肽的多克隆抗体。为了生产抗体，通过注射与REEP和/或RTP表位相对应的肽，可以免疫各种宿主动物，包括但不限于兔子、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个优选的实施方案中，将肽缀合到免疫原性的载体(例如，白喉类毒素，牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH))。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来增加免疫应答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)，矿物胶(例如，氢氧化铝)，表面活性物质(例如，溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，钥孔血蓝蛋白，二硝基酚和潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌)。
为了制备针对REEP和/或RTP的单克隆抗体，预期在本发明中可以使用通过培养的连续细胞系生产抗体分子的任何技术(见例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。它们包括但不限于由Kohler和Milstein最初开发的杂交瘤技术(Kohler和Milstein，Nature 256：495-497[1975])，以及三源杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术(见例如，Kozbor等，Immunol.Tod.，4：72[1983])和EBV-杂交瘤技术，以生产人单克隆抗体(Cole等，in MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96[1985])。
在本发明的另一个实施方案中，使用例如PCT/US90/02545所述的技术，在无菌动物中生产单克隆抗体。而且，预期人杂交瘤会产生人抗体(Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030[1983])，或通过用EBV病毒体外转化人B细胞(Cole等，in MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，pp.77-96[1985])。
另外，预期描述的用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778；这里引作参考)，可以用于生产REEP和/或RTP特异性的单链抗体。本发明的另一个实施方案利用描述的用于构建Fab表达文库的技术(Huse等，Science 246：1275-1281[1989])，以允许迅速且容易地鉴别具有希望的对REEP和/或RTP多肽的特异性的单克隆Fab片段。
在其它实施方案中，本发明包括针对本发明的蛋白的重组抗体或其片段。重组抗体包括，但不限于，人源化的和嵌合的抗体。本领域已知产生重组抗体的方法(见例如，美国专利6,180,370和6,277,969和″Monoclonal Antibodies″H.Zola，BIOS Scientific PublishersLimited 2000.Springer-Verlay New York，Inc.，New York；它们各自在这里引作参考)。
预期适于生产抗体片段的任何技术都可以用于产生含有抗体分子的独特型(抗原结合区)的抗体片段。例如，这样的片段包括但不限于：F(ab′)2片段，其可以通过对抗体分子的胃蛋白酶消化来生产；Fab′片段，其可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键来生产；和Fab片段，其可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子来生产。
在抗体的生产中，预期通过本领域已知的技术，可以完成对希望的抗体的筛选(例如，放射免疫测定，ELISA(酶联免疫吸附测定)，″夹心″免疫测定，免疫放射测定，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散测定，原位免疫测定(例如，使用胶体金，酶或放射性同位素标记)，蛋白印迹，沉淀反应，凝集测定(例如，凝胶凝集测定，血细胞凝集测定，等)，补体结合测定，免疫荧光测定，蛋白A测定和免疫电泳测定，等。
在一个实施方案中，通过检测一抗上的标记，检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测第二种抗体或试剂向一抗的结合，检测一抗。在另一个实施方案中，二抗是标记的。本领域已知许多用于检测免疫测定中的结合的方法，且在本发明的范围内。如本领域众所周知的，提供的免疫原性的肽应当不含有在任何免疫方案中使用的载体分子。例如，如果肽缀合在KLH上，它可以缀合到BSA上，或者直接用于筛选测定中。
前面的抗体可以用于本领域已知的与REEP和/或RTP的定位和结构有关的方法(例如，蛋白印迹)、测量其在适当的生物样品中的水平等的方法中。抗体可以用于检测来自个体的生物样品中的REEP和/或RTP。生物样品可以是含有细胞的生物液体，例如，但不限于，血液，血清，血浆，间质液，尿，脑脊液等。
然后，可以使用适当的策略(例如，ELISA或放射免疫测定)和格式(例如，微孔，浸渍片(例如，如国际专利公开WO 93/03367所述)等，直接测试生物样品中人REEP和/或RTP的存在。或者，可以按尺寸分离样品中的蛋白(例如，在有或没有十二烷基硫酸钠(SDS)存在下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，并通过免疫印迹(蛋白印迹)，检测REEP和/或RTP的存在。使用针对与蛋白的表位相对应的肽产生的抗体时，免疫印迹技术通常更有效，因而特别适用于本发明。
另一种方法使用抗体作为改变信号转导的试剂。结合REEP和/或RTP或参与细胞内信号传递的其它蛋白的结合域的特异性抗体，可以用于抑制各种蛋白之间的相互作用和它们与其它配体的相互作用。结合复合物的抗体，也可以在治疗上用于抑制信号转导途径中的蛋白复合物的相互作用，其导致REEP和/或RTP的各种生理的和细胞的效应。这样的抗体也可以在诊断上用于测量REEP1和/或RTP的异常表达，或蛋白复合物的异常形成，其可能指示着疾病状态。
VI.使用REEP和RTP的基因治疗
本发明也提供了适用于改变REEP和/或RTP表达、生产或功能的基因治疗的方法和组合物，用于研究、产生转基因动物和/或治疗用途。如上所述，本发明提供了人REEP和/或RTP基因，并提供了从其它物种得到REEP和/或RTP基因的方法。因而，下面描述的方法通常适用于许多物种。在有些实施方案中，预期通过给受试对象提供REEP和/或RTP基因的野生型等位基因(即，不含有REEP和/或RTP疾病等位基因的等位基因(例如，没有造成疾病的多态性或突变))，进行基因治疗。通过上述的方法，鉴别需要这样的治疗的受试对象。在有些实施方案中，使用瞬时的或稳定的治疗核酸(例如，反义寡核苷酸，siRNA)来降低或阻止突变型蛋白的表达。在其它实施方案中，删除基因，以减轻或阻断希望的嗅觉感觉。
通常用于体内或离体靶向和治疗程序的病毒载体是基于DNA的载体和逆转录病毒载体。构建和使用病毒载体的方法，是本领域已知的(见例如，Miller和Rosman，BioTech.，7：980-990[1992])。优选地，病毒载体是复制缺陷型，也就是说，它们不能在靶细胞中自主地复制。通常，在本发明的范围内使用的复制缺陷型病毒载体的基因组缺乏至少1个该病毒在感染的细胞中复制所必需的区域。可以消除这些区域(全部或部分地)，或可以通过本领域的技术人员已知的任何技术使其无功能。这些技术包括全部去除，置换(用其它序列，尤其是插入的核酸)，向(对于复制)必需的区域部分地缺失或添加一个或多个碱基。使用遗传操作技术，或通过用诱变剂处理，可以体外(即，在分离的DNA上)或原位地进行这样的技术。
优选地，复制缺陷型病毒保留病毒颗粒壳体化所需的其基因组序列。DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，包括但不限于，单纯疱疹病毒(HSV)，乳头瘤病毒，EB病毒(EBV)，腺病毒，腺伴随病毒(AAV)等。完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒是优选的，因为缺陷型病毒在导入细胞后不能感染。缺陷型病毒载体的使用，允许在特定的局限的区域施用给细胞，无需担心载体会感染其它细胞。因而，可以特异性地靶向特定的组织。具体载体的实例包括，但不限于，缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等，Mol.Cell.Neurosci.，2：320-330[1991])，缺少糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体(见例如，专利公开RD 371005 A)或其它缺陷型疱疹病毒载体(见例如，WO 94/21807；和WO 92/05263)；减毒的腺病毒载体，例如Stratford-Perricaudet等所述的载体(J.Clin.Invest.，90：626-630[1992]；也见，La SaUe等，Science 259：988-990[1993])；和缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski等，J.Virol.，61：3096-3101[1987]；Samulski等，J.Virol.，63：3822-3828[1989]；和Lebkowski等，Mol.Cell.Biol.，8：3988-3996[1988])。
优选地，对于体内施用，与病毒载体(例如，腺病毒载体)相联合地采用适当的免疫抑制处理，以避免对病毒载体和转染细胞的免疫失活。例如，可以施用免疫抑制性细胞因子，例如白介素-12(IL-12)，干扰素-γ(IFN-γ)或抗-CD4抗体，以阻断针对病毒载体的体液或细胞免疫反应。另外，可以有利地采用改造成表达最少数目的抗原的病毒载体。
在一个优选的实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是真核生物DNA病毒，其可以被修饰，以向多种细胞类型有效地输送本发明的核酸。存在多种腺病毒血清型。在这些血清型中，在本发明的范围内，优选2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或动物起源的腺病毒(见例如，WO 94/26914)。可以在本发明的范围内使用的动物起源的那些腺病毒包括犬、牛、鼠(例如，Mavl，Beard等，Virol.，75-81[1990])、羊、猪、鸟和猿猴(例如，SAV)起源的腺病毒。优选地，动物起源的腺病毒是犬腺病毒，更优选地是CAV2腺病毒(例如，曼哈顿或A26/61株(ATCC VR-800))。
优选地，本发明的复制缺陷型腺病毒载体包含ITR，壳体化序列和目标核酸。更优选地，至少腺病毒载体的E1区域是无功能的。E1区域中的缺失优选地从Ad5腺病毒序列中的核苷酸455延伸至3329(PvuII-BglII片段)或从382延伸至3446(HinfII-Sau3A片段)。也可以修饰其它区域，尤其是E3区域(例如，WO 95/02697)，E2区域(例如，WO 94/28938)，E4区域(例如，WO 94/28152，WO 94/12649和WO 95/02697)或任何晚期基因L1-L5。
在一个优选的实施方案中，腺病毒载体具有E1区域中的缺失(Ad1.0)。E1-缺失的腺病毒的实例公开在EP 185,573中，其内容在这里引作参考。在另一个优选的实施方案中，腺病毒载体具有E1和E4区域中的缺失(Ad 3.0)。E1/E4-缺失的腺病毒的实例公开在WO 95/02697和WO 96/22378中。在另一个优选的实施方案中，腺病毒载体具有E1区域中的缺失，向其中插入了E4区域和核酸序列。
通过本领域的技术人员已知的任何技术，可以制备出根据本发明的复制缺陷型重组腺病毒(见例如，Levrero等，Gene 101：195[1991]；EP 185573；和Graham，EMBO J.，3：2917[1984])。更具体地，通过腺病毒和携带尤其是目标DNA序列的质粒之间的同源重组，可以制备出它们。腺病毒和质粒向适当的细胞系中共转染后，完成同源重组。采用的细胞系应当优选地：(i)可被要使用的元件转化，和(ii)含有能弥补复制缺陷型腺病毒的基因组的该部分的序列，优选地以整合形式，以便避免重组的危险。可以使用的细胞系的实例是人胚肾细胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.，36：59[1977])，其含有整合进它的基因组中的Ad5腺病毒基因组的左手部分(12％)，和能弥补E1和E4功能的细胞系，如申请WO 94/26914和WO 95/02697所述。使用本领域的普通技术人员众所周知的标准的分子生物学技术，回收和纯化重组腺病毒。
腺伴随病毒(AAV)是相对小尺寸的DNA病毒，其可以以稳定的且位点特异性的方式，整合进它们所感染的细胞的基因组中。它们能感染广谱的细胞，而不对细胞生长、形态学或分化诱发任何作用，且它们似乎不参与人病理情况。已经克隆并测序和表征了AAV基因组。它包括大约4700碱基，且在每个末端含有大约145碱基的反向末端重复(ITR)区域，其用作病毒的复制起点。基因组的剩余部分分成2个携带壳体化功能的基本区域：基因组的左手部分，其含有参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因；基因组的右手部分，其含有编码病毒的衣壳蛋白的cap基因。
已经描述了源自AAV的载体在体外和体内转移基因中的应用(见例如，WO 91/18088；WO 93/09239；美国专利号4,797,368；美国专利号5,139,941；和EP488528，它们都在这里引作参考)。这些出版物描述了多种AAV-衍生的构建体，其中删除了rep和/或cap基因，并被目标基因替代，和这些构建体在体外(向培养的细胞)或体内(直接进入生物)转移目标基因中的应用。通过将含有侧接2个AAV反向末端重复(ITR)区域的目标核酸序列的质粒，和携带AAV壳体化基因(rep和cap基因)的质粒，共转染进感染了人辅助病毒(例如，腺病毒)的细胞系中，可以制备出根据本发明的复制缺陷型重组AAV。然后，通过标准的技术，纯化所产生的AAV重组体。
在另一个实施方案中，可以将基因导入逆转录病毒载体(例如，如美国专利号5,399,346，4,650,764，4,980,289和5,124,263所述；它们都在这里引作参考；Mann等，Cell 33：153[1983]；Markowitz等，J.Virol.，62：1120[1988]；PCT/US 95/14575；EP453242；EP178220；Bernstein等Genet.Eng.，7：235[1985]；McCormick，BioTechnol.，3：689[1985]；WO 95/07358；和Kuo等，Blood 82：845[1993])。逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。逆转录病毒基因组包括2个LTR，壳体化序列和3个编码区(gag，pol和env)。在重组的逆转录病毒载体中，通常全部或部分地删除gag，pol和env基因，并替换为目标异源核酸序列。可以从不同类型的逆转录病毒，例如，HIV，MoMuLV(″鼠莫洛尼白血病病毒″MSV(″鼠莫洛尼肉瘤病毒″)，HaSV(″Harvey肉瘤病毒″)；SNV(″脾坏死病毒″)；RSV(″劳氏肉瘤病毒″)和弗里德病毒，构建这些载体。在WO 95/02697中也公开了缺陷型逆转录病毒载体。
通常，为了构建含有核酸序列的重组逆转录病毒，构建含有LTR、壳体化序列和编码序列的质粒。该构建体用于转染包装细胞系，该细胞系能反向提供质粒缺乏的逆转录病毒功能。通常，包装细胞系因而能表达gag，pol和env基因。这样的包装细胞系已经记载在现有技术中，尤其是细胞系PA317(美国专利号4,861,719，这里引作参考)，PsiCRIP细胞系(见，WO90/02806)和GP+envAm-12细胞系(见，WO89/07150)。另外，重组逆转录病毒载体可以含有LTR内的修饰以抑制转录活性，以及广泛的壳体化序列，后者可以包括gag基因的一部分(Bender等，J.Virol.，61：1639[1987 ])。通过本领域的普通技术人员已知的标准技术，纯化重组逆转录病毒载体。
或者，可以通过脂转染体内地导入载体。在过去的十年中，已经增加了用于体外包封和转染核酸的脂质体的应用。设计用于限制脂质体介导的转染所遇到的困难和危险的合成的阳离子脂质，可以用于制备体内转染编码标志物的基因的脂质体(Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417[1987]；也见，Mackey，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027-8031[1988]；Ulmer等，Science259：1745-1748[1993])。阳离子脂质的使用，可以促进带负电荷的核酸的包封，也可以促进与带负电荷的细胞膜的融合(Feigner和Ringold，Science 337：387-388[1989])。在这里引作参考的WO95/18863和WO96/17823和美国专利号5,459,127中，描述了特别有用的用于转移核酸的脂质化合物和组合物。
其它分子也可以用于促进核酸的体内转染，例如阳离子的寡肽(例如，WO95/21931)，源自DNA结合蛋白的肽(例如，WO96/25508)或阳离子的聚合物(例如，WO95/21931)。
也可以体内地导入载体，作为裸露DNA质粒。配制和向哺乳动物肌肉组织施用裸露DNA的方法，记载在美国专利号5,580,859和5,589,466中，它们二者都在这里引作参考。
通过本领域已知的方法，包括但不限于转染，电穿孔，显微注射，转导，细胞融合，DEAE葡聚糖，磷酸钙沉淀，使用基因枪，或使用DNA载体运载体(见例如，Wu等，J.Biol.Chem.，267：963[1992]；Wu和Wu，J.Biol.Chem.，263：14621[1988 ]；和Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2726[1991])，可以将用于基因治疗的DNA载体导入希望的宿主细胞。也可以使用受体-介导的DNA输送方法(Curiel等，Hum.Gene Ther.，3：147[1992 ]；和Wu和Wu，J.Biol.Chem.，262：4429[1987])。
VII.表达外源REEP和RTP基因和其同源物、突变体和变体的转基因动物
本发明包括包含外源REEP和/或RTP基因或其同源物、突变体或变体的转基因动物的产生。在优选的实施方案中，转基因动物与野生型动物相比会表现出改变的表型。在有些实施方案中，改变的表型是与REEP和/或RTP表达的野生型水平相比，REEP和/或RTP基因的mRNA的过表达。在其它实施方案中，改变的表型是与内源REEP和/或RTP表达的野生型水平相比，内源REEP和/或RTP基因的mRNA的降低表达。在有些优选的实施方案中，转基因动物包含REEP和/或RTP的突变型等位基因。用于分析这样的表型存在与否的方法包括RNA印迹，mRNA保护测定和RT-PCR。在其它实施方案中，转基因的小鼠具有REEP和/或RTP基因的敲除突变。在优选的实施方案中，转基因动物表现出改变的对嗅觉障碍(例如，上呼吸道感染，颅前窝肿瘤和Kallmann综合征，福斯特·肯尼迪综合征，帕金森病，阿耳茨海默病，亨廷顿舞蹈病)的易感性。
这样的动物可以用于研究用途(例如，鉴别REEP和/或RTP蛋白参与的信号传递途径)，以及药物筛选用途(例如，筛选预防或治疗嗅觉障碍的药物)。例如，在有些实施方案中，将测试化合物(例如，怀疑可用于治疗嗅觉障碍的药物)施用给转基因动物和具有野生型REEP和/或RTP等位基因的对照动物，并评价作用。然后，评估测试和对照化合物对疾病症状的作用。
通过多种方法，可以产生转基因动物。在有些实施方案中，使用不同发育阶段的胚细胞来导入转基因，用于生产转基因动物。根据胚细胞的发育阶段，使用不同的方法。受精卵是显微注射的最好靶物。在小鼠中，雄前核达到直径约20微米的大小，这允许可重复地注射1-2皮升(p1)DNA溶液。受精卵作为基因转移的靶物的应用，具有很大的优点，因为在大多数情况下，注射的DNA会在首次切割之前整合进宿主基因组中(Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sc i.USA82：4438-4442[1985])。结果，转基因的非人动物的所有细胞都会携带整合的转基因。这通常也会反映在转基因向建立者的后代的有效传递，因为50％生殖细胞会携带转基因。美国专利号4,873,191描述了显微注射受精卵的方法；该专利的内容在这里整体引入。
在其它实施方案中，使用逆转录病毒感染来将转基因导入非人动物。在有些实施方案中，通过将逆转录病毒载体注射进卵母细胞的卵周隙，使用逆转录病毒载体来转染卵母细胞(美国专利号6,080,912，在这里引作参考)。在其它实施方案中，可以体外培养发育的非人胚胎至胚泡期。在该时期，卵裂球可以作为逆转录病毒感染的靶物(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73：1260[1976])。通过酶处理去除透明带，得到卵裂球的有效感染(Hogan等，inManipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.[1986])。用于导入转基因的病毒载体系统典型地是携带转基因的复制-缺陷型逆转录病毒(Jahner等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 82：6927[1985])。通过在病毒生产细胞的单层上培养卵裂球，可以容易地且有效地得到转染(Van derPutten，同上；Stewart，等，EMBO J.，6：383[1987])。或者，可以在更晚的阶段进行感染。可以将病毒或病毒生产细胞注射进囊胚腔(Jahner等，Nature 298：623[1982])。大多数建立者是转基因的嵌合体，因为整合仅仅发生在一小组形成转基因动物的细胞中。而且，建立者可以含有通常在后代中分离的基因组不同位置处的转基因的多种逆转录病毒插入。另外，通过对妊中期(midgestation)胚胎的子宫内逆转录病毒感染，也可以将转基因导入种系，尽管效率低(Jahner等，同上[1982])。本领域已知的使用逆转录病毒或逆转录病毒载体建立转基因动物的其它方法，包含将逆转录病毒颗粒或丝裂霉素C-处理的生产逆转录病毒的细胞显微注射进受精卵或早期胚胎的卵周隙中(PCT国际申请WO 90/08832[1990]和Haskell和Bowen，MoL Reprod.Dev.，40：386[1995])。
在其它实施方案中，将转基因导入胚胎干细胞，并使用转染的干细胞形成胚胎。通过在适当的条件下，体外培养植入前的胚胎，得到胚胎干细胞(Evans等，Nature 292：154[1981]；Bradley等，Nature309：255[1984]；Gossler等，Proc.Acad.Sci.USA 83：9065[1986]；和Robertson等，Nature 322：445[1986])。通过本领域已知的多种方法进行DNA转染，包括磷酸钙共沉淀，原生质体或球状体融合，脂转染和DEAE-葡聚糖-介导的转染，可以将转基因有效地导入胚胎干细胞。通过逆转录病毒-介导的转导或通过显微注射，也可以将转基因导入胚胎干细胞。随着它们向胚泡期胚胎的囊胚腔中的导入，这样的转染的胚胎干细胞此后可以在胚胎中定殖，并促成所得到的嵌合动物的种系(综述见，Jaenisch，Science 240：1468[1988])。在将转染的胚胎干细胞导入囊胚腔之前，可以对转染的胚胎干细胞进行多种选择实验，以富集已经整合转基因的胚胎干细胞，假定转基因会提供这样的选择的方法。或者，可以使用聚合酶链式反应来筛选已经整合转基因的胚胎干细胞。该技术不需要在转入囊胚腔之前在适当的选择条件下生长转染的胚胎干细胞。
在其它实施方案中，使用同源重组来敲除基因功能或建立缺失突变体(例如，其中删除了REEP和/或RTP的特定结构域的突变体)。同源重组的方法记载在美国专利号5,614,396，在这里引作参考。
VIII.使用REEP和RTP的化合物筛选
在有些实施方案中，将本发明的REEP和/或RTP基因的分离的核酸和多肽(例如，SEQ ID NO：1-50)和有关的蛋白和核酸用于对改变(例如，增强或抑制)REEP和/或RTP活性和信号传递的化合物的药物筛选用途。本发明还提供了鉴别本发明的REEP和/或RTP蛋白的配体和信号传递途径的方法。
本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，基于在本发明的过程中进行的OR表达分析实验，预期REEP和/或RTP家族蛋白在促进气味受体细胞表面定位和功能性表达中起作用。
在有些实施方案中，本发明提供了筛选化合物的改变天然配体(例如，使用上述方法鉴别的)介导的REEP和/或RTP活性的能力的方法。这样的化合物可以用于治疗由REEP和/或RTP介导的疾病(例如，嗅觉障碍)，改变嗅觉感觉反应等。
在有些实施方案中，本发明提供了筛选化合物的与突变型REEP和/或RTP核酸和/或突变型REEP和/或RTP多肽相互作用、同时不与野生型REEP和/或RTP核酸(例如，SEQ ID NO：1-20)和/或野生型REEP和/或RTP多肽(例如，SEQ ID NO：21-50)相互作用的能力的方法。这样的化合物可以用于治疗由于存在REEP和/或RTP核酸和/或蛋白的突变体形式而促进的嗅觉障碍。
在有些实施方案中，评价了化合物(例如，候选物或配体或抑制剂)引起的表达外源REEP或RTP多肽的细胞中的细胞表面定位的OR的活性。
一种技术使用如上所述产生的REEP，RTP或OR抗体。这样的抗体能特异性地结合REEP，RTP或OR肽，并与测试化合物竞争向REEP，RTP或OR肽的结合。用小分子文库、适体等，可以进行类似的筛选。
本发明包括用REEP和/或RTP基因和其变体转染的细胞系在筛选化合物的活性中的应用，尤其是来自组合文库(例如，含有超过104种化合物的文库)的化合物的高通量筛选。本发明的细胞系可以用于多种筛选方法中。在有些实施方案中，所述细胞可用于监测活化细胞表面受体后的信号转导的第二信使测定中。在其它实施方案中，所述细胞可用于监测转录/翻译水平的细胞反应的报道基因测定中。
在第二信使测定中，优选地如上所述，用编码REEP和/或RTP或其变体或突变体的载体转染宿主细胞。然后，用一种或多种化合物(例如，来自组合文库)处理宿主细胞，测定是否存在反应。预期组合文库中的至少有些化合物可以用作载体编码的一种或多种蛋白或定位在细胞膜上的OR的激动剂、拮抗剂、激活剂或抑制剂。还预期，组合文库中的至少有些化合物可以用作在信号转导途径中在载体编码的蛋白的上游或下游起作用的蛋白的激动剂、拮抗剂、激活剂或抑制剂。
在有些实施方案中，第二信使测定测量来自报道分子的荧光信号，所述报道分子对由刺激膜受体和离子通道(例如，配体门控的离子通道；见Denyer等，Drug Discov.Today 3：323[1998]；和Gonzales等，Drug.Discov.Today 4：431-39[1999])引起的细胞内变化(例如，Ca2+浓度，膜电位，pH，IP3，cAMP，花生四烯酸释放)作出响应。报道分子的实例包括，但不限于，FRET(荧光共振能量转移)系统(例如，Cuo-脂质和氧鎓醇，EDAN/DABCYL)，钙敏感的指示剂(例如，Fluo-3，FURA 2，INDO 1和FLUO 3/AM，BAPTA AM)，氯-敏感的指示剂(例如，SPQ，SPA)，钾-敏感的指示剂(例如，PBFI)，钠-敏感的指示剂(例如，SBFI)和pH敏感的指示剂(例如，BCECF)。
通常，在暴露于化合物之前，给宿主细胞装载指示剂。通过本领域已知的方法，包括但不限于，荧光显微镜检，共聚焦显微镜检(例如，FCS系统)，流式细胞术，微流态装置，FLIPR系统(见，例如，Schroeder和Neagle，J.Biomol.Screening 1：75[1996])和平板阅读系统，可以检测宿主细胞对化合物处理的反应。在有些优选的实施方案中，将由未知活性的化合物造成的反应(例如，荧光强度的增加)与由已知的激动剂产生的反应相比较，并表达为已知激动剂的最大反应的百分比。将已知激动剂造成的最大反应定义为100％反应。类似地，向含有已知或测试拮抗剂的样品添加激动剂后记录的最大反应，可检测地低于100％反应。
所述细胞也可以用于报道基因测定。报道基因测定包含使用载体转染的宿主细胞，所述载体编码包含靶基因(即，控制疾病靶物的生物表达和功能的基因)的转录控制元件的核酸，后者剪接到报道基因的编码序列上。因此，靶基因的活化会导致报道基因产物的活化。
使用本领域已知的组合文库方法中的众多方案中的任一种，包括生物学文库；类肽文库(具有肽的官能团、但是具有新的非肽主链的分子的文库，其能抗酶降解，但是仍然保持生物活性；见，例如，Zuckennann等，J.Med.Chem.37：2678-85[1994])；空间上可寻址的平行固相或溶液相文库；需要解卷积的合成文库方法；“一个珠子一种化合物”文库方法；和使用亲和色谱选择的合成文库方法，可以得到本发明的测试化合物。生物学文库和类肽文库方案优选地用于肽文库，而其它4种方案适用于肽、非-肽寡聚物或小分子文库的化合物(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。
也可以评价测试化合物的调控REEP和/或RTP向化合物(例如，气味受体)的结合的能力。这可以如下实现：例如，通过使化合物(例如，底物)偶联放射性同位素或酶标记，从而可以通过检测复合物中标记的化合物(例如，底物)来测定化合物(例如，底物)向REEP和/或RTP的结合。
或者，使REEP和/或RTP偶联放射性同位素或酶标记，以监测测试化合物的调控REEP和/或RTP向复合物中的REEP和/或RTP底物结合的能力。例如，可以用125I，35S 14C或3H直接地或间接地标记化合物(例如，底物)，并通过直接计数放射性发射或通过闪烁计数，检测放射性同位素。或者，可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶酶促地标记化合物，并通过测定适当的底物向产物的转化，检测酶标记。
可以在标记或不标记任一种相互作用物的情况下，评价化合物(例如，气味受体)与REEP和/或RTP相互作用的能力。例如，可以在没有标记化合物或REEP和/或RTP的情况下，使用microphysiometer检测化合物与REEP和/或RTP的相互作用  (McConnell等Science257：1906-1912[1992])。如本文所使用的，″microphysiometer″(例如，Cytosensor)是一种分析仪器，其使用光-可寻址的电势测定传感器(LAPS)，测量细胞酸化其环境的速度。该酸化速度的变化，可以用作化合物和REEP和/或RTP多肽之间的相互作用的指示剂。
在另一个实施方案中，提供了无细胞的测定，其中使REEP和/或RTP蛋白或其生物活性部分接触测试化合物，并评价测试化合物结合REEP和/或RTP蛋白或其生物活性部分的能力。要在本发明的测定中使用的优选的REEP和/或RTP蛋白的生物活性部分包括参与与底物或其它蛋白的相互作用的片段，例如，具有高表面概率分数的片段。
无细胞的测定包括，在足以允许2种组分相互作用和结合的条件和时间下，制备靶基因蛋白和测试化合物的反应混合物，从而形成可以去除和/或检测的复合物。
也可以检测2种分子之间的相互作用，例如，使用荧光能量转移(FRET)(见，例如，Lakowicz等，美国专利号5,631,169；Stavrianopoulos等，美国专利号4,968,103；它们各自在这里引作参考)。选择荧光团标记，使得第一种供体分子发射的荧光能被第二种′受体′分子上的荧光标记吸收，后者又由于吸收的能量而能发出荧光。
或者，′供体′蛋白分子可以简单地利用色氨酸残基的天然荧光能。选择发射不同波长光的标记，使得′受体′分子标记可以与′供体′区分开。由于标记之间的能量转移的效率与分开分子的距离有关，可以评估分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的情况下，测定中的′受体′分子标记的荧光发射应当是最高的。通过本领域众所周知的标准荧光检测方法(例如，使用荧光光度计)，可以方便地测量FRET结合事件。
也可以鉴别REEP和/或RTP表达的调控剂。例如，使细胞或无细胞的混合物接触候选化合物，并评价与没有候选化合物的情况下REEP和/或RTP mRNA或蛋白的表达水平相比，REEP和/或RTP mRNA或蛋白的表达。当有候选化合物存在下REEP和/或RTP mRNA或蛋白的表达大于没有它时，将候选化合物鉴别为REEP和/或RTP mRNA或蛋白表达的刺激剂。或者，当有候选化合物存在下REEP和/或RTP mRNA或蛋白的表达小于(即，统计上显著小于)没有它时，将候选化合物鉴别为REEP和/或RTP mRNA或蛋白表达的抑制剂。通过本文所述的检测REEP和/或RTP mRNA或蛋白的方法，可以测定REEP和/或RTP mRNA或蛋白表达的水平。
使用基于细胞的或无细胞的测定，可以鉴别调控剂，且可以体内地证实该试剂调控REEP和/或RTP蛋白的活性的能力，例如，在动物例如疾病的动物模型(例如，具有REEP和/或RTP相关的嗅觉障碍的动物)中。
B.治疗剂
本发明还涉及通过上述筛选测定鉴别出的新试剂。因此，进一步使用如本文所述鉴别出的试剂(例如，REEP和/或RTP调控剂或模拟物，REEP和/或RTP特异性抗体，REEP和/或RTP-结合配偶体或OR激动剂或抑制剂)在适当的动物模型(例如本文所述的那些)中测定用这样的试剂治疗的功效、毒性、副作用或作用机理，是在本发明的范围内。而且，如上所述，通过上述筛选测定鉴别出的新试剂可以用于例如治疗嗅觉障碍(例如，包括但不限于，嗅觉障碍)。
IX.含有REEP和RTP核酸、肽和类似物的药物组合物
本发明还提供了药物组合物，其可以包含REEP和/或RTP多核苷酸序列、REEP和/或RTP多肽、REEP和/或RTP生物活性的抑制剂或拮抗剂的全部或部分，包括单独的或与至少一种其它试剂(例如稳定化合物)相组合的抗体，且可以在任意的无菌的、生物相容的药物载体中施用，包括但不限于，盐水，缓冲盐水，葡萄糖和水。
本发明的方法可以用于治疗疾病或改变生理状态，其特征在于突变型REEP和/或RTP等位基因(例如，上呼吸道感染，颅前窝肿瘤和Kallmann综合征，福斯特·肯尼迪综合征，帕金森病，阿耳茨海默病，亨廷顿舞蹈病)。可以在药学上可接受的载体例如生理盐水中，将肽静脉内地施用给患者。可以使用细胞内输送肽的标准方法(例如，通过脂质体输送)。这样的方法是本领域的普通技术人员众所周知的。本发明的制剂可以用于肠胃外给药，例如静脉内的，皮下的，肌肉内的和腹膜内的。使用如上所述的基因治疗，也可以完成细胞内地治疗性施用多肽。
如医学领域众所周知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小，体表面积，年龄，要施用的特定化合物，性别，给药时间和途径，总体健康和与同时施用的其它药物的相互作用。
因此，在本发明的有些实施方案中，可以单独地或与其它核苷酸序列、药物或激素相组合地或在药物组合物(其中它与赋形剂或其它药学上可接受的载体相混合)中，将REEP和/或RTP核苷酸和REEP和/或RTP氨基酸序列施用给患者。在本发明的一个实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。在本发明的另一个实施方案中，可以将REEP和/或RTP多核苷酸序列或REEP和/或RTP氨基酸序列单独地施用给处于或患有疾病的个体。
根据所治疗的状况，可以配制这些药物组合物，并全身地或局部地施用。在最新版″Remington′s Pharmaceutical Sciences″(MackPublishing Co，Easton Pa.)中，可以发现配制和施用的技术。合适的途径可以，例如，包括经口的或透粘膜的施用；以及肠胃外输送，包括肌肉内的，皮下的，髓内的，鞘内的，心室内的，静脉内的，腹膜内的或鼻内的施用。
对于注射，可以在含水溶液、优选地在生理上相容的缓冲液例如汉克斯氏溶液、林格氏溶液或生理缓冲盐水中，配制本发明的药物组合物。对于组织或细胞给药，在制剂中使用对要穿透的特定屏障适合的穿透剂。这样的穿透剂通常是本领域已知的。
在其它实施方案中，可以使用本领域众所周知的药学上可接受的载体，以适合经口给药的剂量，配制本发明的药物组合物。这样的载体能允许将药物组合物配制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，由要治疗的患者经口或经鼻摄入。
适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中包含有效量的活性成分，以达到预期的目的。例如，REEP和/或RTP的有效量可以是抑制嗅觉障碍相关的症状的量。有效量的确定是在本领域的技术人员的能力范围内，尤其是参考本文提供的内容。
除了活性成分外，这些药物组合物可以含有合适的药学上可接受的载体，包含有助于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制品的赋形剂和辅料。为经口施用配制的制品可以是片剂、锭剂、胶囊或溶液的形式。
可以以自身已知的方式(例如，通过常规的混合，溶解，造粒，制备锭剂，磨碎，乳化，包封，俘获或冻干过程)，生产本发明的药物组合物。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的含水溶液。另外，可以将活性化合物的悬浮液制备成适当的含油的注射悬浮液。合适的亲脂的溶剂或介质包括脂肪油例如芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。含水的注射悬浮液也可以含有增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可以含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
可以如下得到经口使用的药物制品：组合活性化合物和固体赋形剂，任选地磨碎所得到的混合物，并在必要时加入合适的辅料后，加工颗粒的混合物，得到片剂或锭剂心。合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白填充剂，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、稻谷、马铃薯等的淀粉；纤维素例如甲基纤维素，羟丙基甲基-纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶包括阿拉伯树胶和黄蓍树胶；和蛋白例如明胶和胶原。如果需要，可以加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
给锭剂心提供合适的包衣，例如浓糖溶液，其也可以含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚羧乙烯凝胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或锭剂包衣中添加染料或颜料，作为产品标识，或表征活性化合物的量(即，剂量)。
可以经口使用的药物制品包括由明胶制成的推入配合式胶囊，以及由明胶和包衣(例如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。推入配合式胶囊可以含有与填充剂或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及任选存在的稳定剂相混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在含有或没有稳定剂的合适的液体中，例如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙二醇。
可以制备包含在药学上可接受的载体中配制的本发明化合物的组合物，置于适当的容器中，并加标签用于治疗适应症。对于REEP和/或RTP的多核苷酸或氨基酸序列，在标签上指示的状况可以包括与嗅觉障碍有关的状况的治疗。
可以将药物组合物提供成盐，且可以与许多酸形成，包括但不限于盐酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸等。盐倾向于比对应的游离碱形式更易溶于含水溶剂或其它质子溶剂中。在其它情况下，优选的制品可以是在1mM-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露醇中4.5至5.5的pH范围的冻干的粉末，其在使用前与缓冲液相组合。
对于在本发明的方法中使用的任何化合物，可以从细胞培养测定初步估计治疗上有效的剂量。然后，优选地，可以在动物模型(尤其是鼠模型)中配制剂量，以达到希望的调节REEP和/或RTP水平的循环浓度范围。
治疗上有效的剂量指能改善疾病状态的症状的REEP和/或RTP的量。在细胞培养或实验动物中通过标准的药物方法，可以测定这样的化合物的毒性和治疗功效，例如，测定LD50(使50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗上有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表达为比LD50/ED50。表现出大治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养测定和另外的动物研究得到的数据，可以用于配制人用的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地在包括ED50的循环浓度的范围内，几乎没有或没有毒性。剂量随采用的剂型、患者的敏感性和给药途径而在该范围内变化。
各个医生根据要治疗的患者选择精确剂量。调节剂量和给药，以提供足够水平的活性部分，或维持希望的效应。可以考虑的其它因素包括疾病状态的严重性；患者的年龄、体重和性别；饮食，给药的时间和频率，药物组合，反应敏感性，和对治疗的耐受性/反应。根据特定制剂的半衰期和清除率，可以每3-4天、每周或每2周1次地施用长效的药物组合物。
根据给药途径，正常的剂量范围可以为0.01至100,000微克，直至约1g的总剂量。文献中提供了关于特定剂量和输送方法的指南(见，美国专利号4,657,760；5,206,344；或5,225,212，它们都在这里引作参考)。本领域的技术人员对REEP和/或RTP将采用与对REEP和/或RTP的抑制剂不同的制剂。向骨髓的施用，可能需要以不同于静脉内注射的方式输送。
X.RNA干扰(RNAi)
RNAi代表着控制外源基因在大多数真核生物(包括人)中的表达的进化保守的细胞防御。RNAi由双链RNA(dsRNA)触发，并对dsRNA响应，造成同源的单链目标RNA的序列-特异性的mRNA降解。mRNA降解的介导物是小干扰RNA双链体(siRNA)，其通常通过细胞中的酶切割，从长dsRNA生成。siRNA通常是大约21个核苷酸长(例如，21-23个核苷酸长)，且具有特征在于2个核苷酸3′-突出端的碱基-配对结构。随着小RNA(或RNAi)向细胞中的导入，认为该序列被输送至称作RISC(RNA-诱导的沉默复合物)的酶复合物。RISC会识别靶物，并用内切核酸酶切割它。应当指出，如果要将更大的RNA序列输送给细胞，RNase III酶(Dicer)将长dsRNA转化成21-23核苷酸的ds siRNA片段。
化学合成的siRNA已经成为基因组-范围分析培养的体细胞中的哺乳动物基因功能的强有力试剂。除了它们验证基因功能的价值外，siRNA也具有作为基因-特异性的治疗剂的巨大潜力(Tuschl和Borkhardt，Molecular Intervent.2002；2(3)：158-67，这里引作参考)。
siRNA向动物细胞中的转染，会导致对特定基因的有效的、持久的转录后沉默(Caplen等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.2001；98：9742-7；Elbashir等，Nature.2001；411：494-8；Elbashir等，GeneDev.2001；15：188-200；和Elbashir等，EMBO J.2001；20：6877-88，它们都在这里引作参考)。用siRNA进行RNAi的方法和组合物，记载在例如，这里引作参考的美国专利6,506,559。
siRNA能非常有效地降低靶向的RNA的量，且通过延伸蛋白，经常达到不可检测的水平。该沉默效应可以持续数月，且是非常特异性的，因为目标RNA和siRNA的中心区域之间的1个核苷酸错配，经常足以阻止沉默。BruMmeIkamp等，Science 2002；296：550-3；和Holen等，Nucleic Acids Res.2002；30：1757-66，它们二者都在这里引作参考。
XI.REEP和RTP的RNAi
如上面所讨论的，本发明提供了用于抑制REEP和/或RTP多肽在细胞中的表达的RNAi，OR或参与这样的组分的表达或活性的途径组分。
A.设计和测试REEP和/或RTP的RNAi
为了设计REEP和/或RTP的siRNA(例如，靶向REEP和/或RTPmRNA)，可以在本领域得到软件设计工具(例如，在因特网上)。例如，Oligoengine的网页有一个这样的设计工具，它基于Elbashir的标准(Elbashir等，Methods 2002；26：199-213，这里引作参考)寻找RNAi候选物。也可以使用其它设计工具，例如由Ambion提供的CenixBioscience设计工具。另外，还有由Oligoengine提供的Si2沉默双链体。
也有可得到的RNA折叠软件程序，其允许测定mRNA是否具有自身折叠并形成“发夹”(在dsRNAi的情况下不希望，因为一个目标是使RNAi结合mRNA，而不是自身)的趋势。一个优选的构型是具有3个或更少键的开放构型。通常，需要正ΔG来证实，它不会倾向于自发地自身折叠。
可以使用与上述类似的技术，在例如嗅觉障碍的动物模型中，筛选产生的siRNA候选分子，以体内地定量评价REEP和/或RTP表达。
B.表达盒
可以化学地合成本发明的REEP和/或RTP特异性的siRNA。通过本领域已知的或发现的任何方法，可以实现化学合成。或者，通过包含转录合成的方法，可以合成本发明的REEP和/或RTP特异性的siRNA。在有些实施方案中，转录是体外的，如从DNA模板和噬菌体RNA聚合酶启动子。在其它实施方案中，合成是体内的，如从基因和启动子。通过本领域已知的或发现的任何方法，也可以化学地合成分开链的双链体siRNA，其中分开地合成2条链并退火。或者，通过包含转录合成的方法，合成ds siRNA。在有些实施方案中，体外地(例如，在转录系统中)或在宿主细胞中体内地，由2个不同的表达盒分开地表达siRNA的双链区的2条链，然后结合到一起，形成双链体。
因而，在另一个方面，本发明提供了包含表达盒的组合物，所述表达盒包含启动子和编码对REEP和/或RTP特异性的siRNA的基因。在有些实施方案中，转录的siRNA形成约18至25碱基对长的分开链的双链体(或双链或ds)siRNA的一条链；因而，ds siRNA的形成需要ds siRNA的2条不同链中的每一条的转录。术语表达盒中的″基因″指核酸序列，其包含生成siRNA必需的编码序列。因而，基因包括但不限于ds siRNA的一条链的编码序列。
通常，DNA表达盒包含化学合成的或重组的DNA分子，其含有至少一个基因或希望的ds siRNA的一条链的编码序列，和体外或体内地表达可操作地连接的编码序列所需的适当的核酸序列。体外表达可以包括在转录系统和转录/翻译系统中的表达。体内表达可以包括在特定宿主细胞和/或生物中的表达。在原核生物细胞或原核生物体外表达系统中的表达所需的核酸序列是众所周知的，通常包括启动子、操纵基因和核糖体结合位点，经常伴有其它序列。已知真核生物体外转录系统和细胞利用启动子、增强子以及终止和多腺苷酸化信号。通过细菌RNA聚合酶(例如T3，T7和SP6)表达所需的核酸序列(在本领域称作转录模板)包括模板DNA链，其具有聚合酶启动子区域，后面是希望的RNA序列的互补物(或siRNA的编码序列或基因)。为了建立转录模板，将互补链退火到模板链的启动子部分。
在任一种上述的表达盒中，基因可以编码含有至少一个切割位点的转录物，以便当被切割时，产生至少2个切割产物。这样的产物可以包括ds siRNA的2条相反链。在真核生物细胞中表达的表达系统中，启动子可以是组成型或诱导型；启动子也可以是组织或器官特异性的(例如，对眼睛特异性)，或对发育阶段特异性的。优选地，启动子位于转录区的5’。也预期其它启动子；这样的启动子包括其它聚合酶III启动子和microRNA启动子。
优选地，真核生物的表达盒还包含适合与启动子一起使用的转录终止信号；例如，当启动子被RNA聚合酶III识别时，终止信号是RNA聚合酶III终止信号。该盒也可以包括向宿主细胞基因组中稳定整合的位点。
C.载体
在本发明的其它方面，组合物包含载体，后者包含编码对REEP和/或RTP特异性的siRNA的基因，或优选地至少一个表达盒，该表达盒包含启动子和编码生产对REEP和/或RTP特异性的siRNA所需的序列的基因(siRNA基因)。载体还可以包含标记基因、报道基因、选择基因或感兴趣基因，例如实验基因。本发明的载体包括克隆载体和表达载体。表达载体可以用于体外转录/翻译系统中，以及体内地在宿主细胞中。在宿主细胞中体内地使用的表达载体可以瞬时地或稳定地转染进宿主细胞中。因而，  载体也可以包含向宿主细胞基因组中稳定整合的位点。
在有些实施方案中，有用地将位于噬菌体RNA聚合酶启动子下游的siRNA基因克隆进多拷贝质粒中。可以得到许多种含有噬菌体RNA聚合酶启动子(例如T7启动子)的转录载体。或者，可以使用DNA合成来添加位于siRNA编码序列上游的噬菌体RNA聚合酶启动子。然后，可以将用限制酶线性化的克隆的质粒DNA用作转录模板(见例如，Milligan，JF和Uhlenbeck，OC(1989)Method in Enzymology 180：51-64)。
在本发明的其它实施方案中，载体包括，但不限于，染色体的，非染色体的和合成的DNA序列(例如，病毒DNA的衍生物，所述病毒例如牛痘，腺病毒，鸡痘病毒和伪狂犬病)。预期可以使用任意的载体，只要它能在适当的系统中表达(无论体外还是体内)并当体内地使用时能在宿主中存活；这2个标准对于瞬时转染是足够的。对于稳定转染，载体还可在宿主中复制。
大量合适的载体是本领域的技术人员已知的，且可商业上得到。在本发明的有些实施方案中，哺乳动物表达载体包含复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列和5′侧翼非转录序列。在其它实施方案中，可以使用源自SV40剪接的DNA序列和多腺苷酸化位点来提供要求的非转录遗传元件。
在本发明的某些实施方案中，可以将不是包含siRNA基因(对REEP1，RTP1，RTP2，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)特异性的)的表达盒的一部分的表达载体中的基因序列，可操作地连接到适当的表达控制序列(启动子)上，以指导mRNA合成。在有些实施方案中，基因序列是标志基因或选择基因。在本发明中有用的启动子包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子和小鼠金属硫蛋白启动子和已知控制基因在哺乳动物细胞或它们的病毒中的表达的其它启动子。在本发明的其它实施方案中，重组表达载体包括复制起点和允许转化宿主细胞的选择标记(例如，对于真核生物细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性)。
在本发明的有些实施方案中，通过将增强子序列插入载体中，增强编码基因的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300碱基对，其作用于启动子来增强它的转录。在本发明中有用的增强子包括，但不限于，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点晚侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。
优选地，将载体设计成输送RNAi以进行更永久的抑制。例如，由Ambion提供的pSilencer siRNA表达载体，由Oligoengine提供的pSuper RNAi系统，和由IMGENEX提供的GneSilencer系统。它们都是基于质粒载体的RNAi。BD Biosciences提供RNAi-Ready pSIREN载体，其允许基于质粒的载体和腺病毒或逆转录病毒输送格式。预期Ambion会立即释放siRNA的腺病毒载体。至于载体的设计，没有关于折叠模式的限制，因为不关心发夹的形成，或至少没有研究发现与mRNA折叠模式有关的性能的任何差异。因此，SEQ ID NO：1-20，例如，可以与载体(质粒和病毒的)输送系统一起使用。
应当指出，Ambion在它们的网页上提供了载体的设计工具，且BDBiosciences提供了载体设计的手册，它们二者都可以用于设计siRNA的载体。
D.转染细胞
在其它方面，本发明提供了组合物，其包含用如上所述的本发明的表达盒或本发明的载体转染的细胞，其中载体包含如上所述的本发明的表达盒(或仅仅siRNA基因)。在本发明的有些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。转染的细胞可以是培养的细胞或组织、器官或生物细胞。培养的宿主细胞的具体实例包括，但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，猴肾成纤维细胞的COS-7系，293T，C127，3T3，HeLa和BHK细胞系。体内宿主细胞的具体实例包括肿瘤组织和眼组织。
可以瞬时地或稳定地转染细胞(例如，表达siRNA的DNA稳定地整合进宿主细胞的基因组中，并被其表达)。也可以用本发明的表达盒转染细胞，或用本发明的表达载体转染它们。在有些实施方案中，转染的细胞是培养的哺乳动物细胞，优选人细胞。在其它实施方案中，它们是组织、器官或生物细胞。
在本发明中，典型地培养要体外转染的细胞，然后根据本领域众所周知的方法转染，例如，通过美国组织培养中心定义的优选的方法。在本发明的某些实施方案中，用外源地(或体外地，如通过化学方法或体外转录方法)合成的siRNA转染细胞，或用表达盒或载体(其在转染的细胞中表达siRNA)转染它们。
在有些实施方案中，通过任意的本领域已知的或发现的允许细胞摄入外源RNA并保持存活的方法，用siRNA转染细胞。非限制性实例包括电穿孔，显微注射，转导，细胞融合，DEAE葡聚糖，磷酸钙沉淀，使用基因枪，渗透压休克，温度休克和电穿孔和压力处理。在替代实施方案中，如已经报道的(例如，Elbashir等(2001)Nature 411：494-498，这里引作参考)，通过脂转染体内地导入siRNA。
在其它实施方案中，通过本领域已知的方法，包括但不限于转染，电穿孔，显微注射，转导，细胞融合，DEAE葡聚糖，磷酸钙沉淀，使用基因枪或使用DNA载体运载体(见例如，Wu等(1992)J.Biol.Chem.，267：963；Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.，263：14621；和Williams等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：272)，将表达盒或包含至少1个表达盒的载体导入期望的宿主细胞。也可以使用受体-介导的DNA输送方案(Curiel等(1992)Hum.Gene Ther.，3：147；和Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.，262：4429)。在有些实施方案中，使用多种方法来增强细胞的转染。这些方法包括但不限于渗透压休克，温度休克和电穿孔和压力处理。
或者，通过脂转染体内地导入载体。在过去的十年中，已经增加了用于体外包封和转染核酸的脂质体的应用。设计用于限制脂质体介导的转染所遇到的困难和危险的合成的阳离子脂质，可以用于制备体内转染编码标志物的基因的脂质体。阳离子脂质的使用，可以促进带负电荷的核酸的包封，也可以促进与带负电荷的细胞膜的融合。在这里引作参考的WO95/18863和WO96/17823和美国专利号5,459,127中，描述了特别有用的用于转移核酸的脂质化合物和组合物。其它分子也可以用于促进核酸的体内转染，例如阳离子寡肽(例如，WO95/21931)，源自DNA结合蛋白的肽(例如，WO96/25508)或阳离子聚合物(例如，WO95/21931)。
也可以体内导入编码siRNA的序列，作为裸露DNA，无论是作为表达盒还是作为载体。配制和向哺乳动物肌肉组织施用裸露DNA的方法，记载在美国专利号5,580,859和5,589,466中，它们二者都在这里引作参考。
稳定的转染典型地要求在用于转染的载体中存在选择标记。然后，对转染的细胞进行选择操作。通常，选择包含使细胞在有毒的物质(例如G418或潮霉素B)中生长，使得仅仅表达转染的标记基因的那些细胞存活和生长，所述标记基因赋予转染的细胞对有毒物质的抗性。这样的选择技术是本领域众所周知的。典型的选择标记是众所周知的，包括编码对G418或潮霉素B的抗性的基因。
在优选的实施方案中，转染剂是OLIGOFECTAMINE。OLIGOFECTAMINE是基于脂质的转染剂。设计用于转染dsRNAi的基于脂质的转染剂的其它实施例是由Mirus(Madison，WI)提供的Transit-TKO试剂和由Polyplus-trasfection SAS引入的jetSI。另外，由Ambion提供的Silencer siRNA转染试剂盒包括siPORT Amine和siPORT Lipid转染剂。Roche提供了Fugene 6转染剂，它也是基于脂质的。在细胞培养中，也有使用电穿孔的选择。优选地，使用Invitrogen提供的OLIGOFECTAMINE或Ambion提供的siPORT XP-I转染剂，将质粒载体输送系统转染进细胞。
在某些实施方案中，可以采用dsRNAi的某些化学修饰，例如改变分子的亲脂性(例如，亲脂的残基结合到dsRNA的3′末端)。使用以前开发的用于反义寡核苷酸应用的方法，例如注射脂质体-包裹的分子，也可以将dsRNA输送进生物中。
E.试剂盒
本发明也提供了包含至少1个表达盒的试剂盒，所述表达盒包含对REEP和/或RTP特异性的siRNA基因。在有些方面，来自表达盒的转录物形成约18至25碱基对长的双链siRNA。在其它实施方案中，表达盒包含在如上所述的载体中，其中载体可以用于体外转录或转录/翻译系统中，或体内地用于瞬时地或稳定地转染细胞。
在其它方面，试剂盒包含至少2个表达盒，各自包含siRNA基因，至少一个基因编码siRNA的一条链，其与第二个盒编码的链结合，形成ds siRNA；这样生成的ds siRNA是任何上述的实施方案。这些盒可以包含启动子和编码ds siRNA的一条链的序列。在有些进一步的实施方案中，2个表达盒存在于一个载体中；在其它实施方案中，2个表达盒存在于2个不同的载体中。具有至少一个表达盒的载体，或2个不同的载体，各自包含一个表达盒，可以用于体外转录或转录/翻译系统中，或体内地用于瞬时地或稳定地转染细胞。
在其它方面，试剂盒包含至少一个表达盒，其包含编码ds siRNA的2条分开的链的基因和位于编码每条链的序列之间的加工位点，所以当转录基因时，转录物被加工，例如通过切割，产生2条分开的链，它们可以结合，形成如上所述的ds siRNA。
在有些实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含：a)组合物，其包含配置用于抑制REEP和/或RTP蛋白的表达的小干扰RNA双链体(siRNA)，和b)打印的材料，其具有关于在切割或以其它方式灭活REEP和/或RTP mRNA的条件下，使用组合物治疗通过REEP和/或RTPmRNA的表达而表达REEP和/或RTP蛋白的靶细胞的说明。在某些实施方案中，打印的材料包含关于使用组合物治疗眼病的说明。
F.产生REEP和/或RTP特异性的siRNA
本发明也提供了合成对REEP和/或RTP(例如，人REEP和/或RTP)特异性的或对REEP和/或RTP的突变体或野生型形式特异性的siRNA的方法。可以体外或体内地合成siRNA。体外合成包括化学合成和通过体外转录的合成。体外转录在转录系统中实现，如来自噬菌体RNA聚合酶或在转录/翻译系统中实现，如来自真核生物的RNA聚合酶。体内合成发生在转染的宿主细胞中。
使用体外合成的siRNA(无论化学地或通过转录)来转染细胞。因此，本发明也提供了使用体外合成的siRNA转染宿主细胞的方法；在特定的实施方案中，通过体外转录合成siRNA。本发明还提供了通过用体外合成的siRNA转染细胞，在体内沉默REEP和/或RTP基因的方法。在其它方法中，在转录/翻译系统中，从表达盒或表达载体，以及编码和表达报道基因的表达载体，体外地表达siRNA。
本发明也提供了通过用指导siRNA体内合成的表达盒或载体转染细胞，体内表达siRNA的方法。本发明也提供了通过用指导siRNA体内合成的表达盒或载体转染细胞，体内沉默基因的方法。
XII.气味受体配体的鉴别
本发明提供了鉴别对气味受体特异性的配体的方法。本发明不限于鉴别对气味受体特异性的配体的特定方法。在优选的实施方案中，本发明提供了细胞系(例如，异源293T细胞系)，其表达定位于细胞表面上的目标气味受体(例如，任意的人气味受体)，REEP1，RTP1或其变体，RTP2和Gαolf。气味受体的活化会导致cAMP的增加。这样，在有些实施方案中，细胞系还包含cAMP效应元件，其与用于检测气味受体活化的报道试剂(例如，萤光素酶)相关联。将气味分子(例如，丁香酚)暴露于细胞系。如果气味分子是对气味受体特异性的配体，萤光素酶表达或萤光素酶表达的变化是可检测的(见，例如，实施例7)。
实施例
为了鉴别参与将OR靶向细胞表面的辅助蛋白，筛选基因在HEK293T(293T)细胞中诱导OR的功能性细胞表面表达的能力。发现REEP1，RTP1，RTP2，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2，RTP-D3，RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP4-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)会促进OR的细胞表面表达。这些蛋白由嗅觉神经元表达，与OR蛋白相互作用，并在293T细胞中与OR共表达时增强对气味剂的响应。而且，这已经允许构建异源表达系统，以鉴别对脂族气味剂响应的新OR。
实施例1.气味受体辅助蛋白的鉴别
假定哺乳动物OR需要辅助蛋白进行功能性细胞表面表达后，进行了一项研究，以检测这样的分子。从单个的嗅觉神经元以及来自犁鼻器的神经元，构建Long-SAGE(基因表达的系列分析)文库(见，例如，Saha，S.等，(2002)Nat Biotechnol 20，508-512；这里整体引作参考)，并收集由这些神经元表达的基因。为了鉴别由嗅觉神经元表达的候选基因，也使用数字差异显示(见，例如，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/info-ddd.shtml)。研究了候选基因的编码膜相关蛋白的ORF。选择与已知的侣伴蛋白具有相似性的基因，并从嗅上皮cDNA克隆cDNA。通过原位杂交，证实每个基因的mRNA表达。分离并亚克隆进哺乳动物表达载体后，将每个cDNA与用视紫红质的20个N-末端氨基酸(Rho-标记)标记的小鼠OR(MOR203-1)一起，转染进293T细胞。进行测量，通过使用针对Rho-标记的抗体对活细胞染色(见，例如，Laird，D.W.和Molday，R.S.(1988)Invest Ophthalmol Vis Sci 29，419-428；这里整体引作参考)，评价这些克隆是否对OR的细胞表面表达有影响。当单独地转染MOR203-1时，抗体染色仅仅在少于1％细胞中检测到微弱的细胞表面表达。在图1中，提供了描绘本发明使用的筛选方法的示意图。
实施例2.REEP和/或RTP增强OR的细胞表面表达
2个不相关的克隆(在测试的61个中)增强了MOR203-1的细胞表面表达的数目和染色强度(见图2A)。由这些克隆编码的蛋白命名为REEP1(即受体表达增强蛋白1)和RTP1(即受体运输蛋白1)。随后，发现了RTP2，其与RTP1密切相关。RTP2也会增强MOR203-1的细胞表面表达。接着，测试REEP1，RTP1和RTP2，以检测在促进其它OR的细胞表面表达中的类似作用。在有或没有REEP1，RTP1或RTP2的情况下，在293T细胞中表达了4种不同的OR(小鼠OREG，小鼠olfr62，小鼠OR-S46和大鼠I7)。BFP或GFP的共转染证实，转染效率是一致的(约70％)。另外，与没有REEP和/或RTP的OR相比，用REEP和/或RTP转染的OR产生更多免疫荧光的细胞和在阳性的细胞中更强的信号(见图2A)。当在每种条件下使用不同的OR时，免疫阳性的细胞的信号强度和数目会变化。例如，在大鼠I7的情况下，表面表达显著低于测试的其它OR。尽管如此，仅仅在共表达辅助蛋白时，观察到偶见的免疫阳性的细胞。RTP1或RTP2的作用一致地强于REEP1的作用。细胞表面表达的增强是对OR特异性的，而非对其它GPCR：REEP和/或RTP都不增强β2肾上腺素能受体，mT2R5(小鼠苦味受体)(见，例如，Chandrashekar，J.等(2000)Cell 100，703-711；这里整体引作参考)或V2R信息素受体(VR4)(见，例如，Matsunami，H.和Buck，L.B.(1997)Cell 90，775-784；这里整体引作参考)的表达(见图2A和图3)。最后，当共表达REEP和RTP家族的其它成员(REEP2和RTP4)时，没有观察到MOR203-1的细胞表面表达的增强。
为了定量免疫阳性的细胞的数量和强度，进行荧光-活化的细胞分选(FACS)分析。为了监测转染和染色效率，使用HA-标记的β2肾上腺素能受体作为对照。当OR与辅助蛋白一起表达时，标记了更多的细胞，且荧光信号更高(见图2B和2C和图4)。
实施例3.REEP和/或RTP基因编码跨膜蛋白
REEP1基因编码201个氨基酸的蛋白，其含有2个推定的跨膜域(见图5A)。C-末端标记的REEP1蛋白的免疫染色表明，C-末端是细胞外的。BLAST搜索鉴别出了不同的真核生物物种中的同源基因。REEP1表现出与酵母YOP1，大麦HVA22和人DP1/TB2有限的相似性(见图5B)。YOP1参与囊泡运输(见，例如，Brands，A.和Ho，T.H.(2002)Plant Physiol 130，1121-1131；这里整体引作参考)。HVA22的表达由脱落酸诱导，并受多种环境应激的调节，例如极端的温度或脱水(见，例如，Chen，C.N.等(2002)Plant Mol Biol 49，633-644；Shen，Q.等(1993)J Biol Chem 268，23652-23660；各自在本文中整体引作参考)。DP1/TB2由结肠癌中缺失的基因编码(见，例如，Kinzler，K.W.等(1991)Science 253，661-665；这里整体引作参考)，当肥大细胞被IgE+抗原触发时，DP1的小鼠同源物(REEP5)受到下调(见，例如，Prieschl，E.等(1996)Gene 169，215-218；这里整体引作参考)。在小鼠基因组中，REEP1具有至少5个额外的同源基因(称作REEP2-6)(见图5B)。
RTP1和RTP2基因分别编码具有263和223个氨基酸的蛋白，且在氨基酸水平具有73％序列同一性(见图5C)。两种蛋白似乎都没有信号序列，但是二者都具有一个推定的跨膜域，其位于C-末端附近。C-末端标记的RTP1的免疫染色表明，C-末端是细胞外的。对小鼠基因组的BLAST搜索鉴别出了2个额外的成员RTP3和RTP4。在脊椎动物物种以外，没有明显的RTP同源物。尽管如此，美丽线虫ODR-4(见，例如，Dwyer，N.D.等(1998)Cell 93，455-466；这里整体引作参考)似乎具有与RTP相同的膜拓扑学。
实施例4.REEP和/或RTP在嗅觉神经元中特异性地表达
用从不同小鼠组织提取的RNA进行的RNA印迹分析表明，REEP1和尤其是RTP1和RTP2，在嗅觉器官和犁鼻器中最显著地表达。在脑中，也检测到显著水平的REEP1 RNA(见图6A)。长期暴露揭示了RTP1和RTP2在脑中的微弱信号。没有观察到在睾丸中的表达，OR的亚群在那里表达(见，例如，Parmentier，M.等(1992)Nature 355，453-455；Spehr，M.等(2003)Science 299，2054-2058；各自在本文中整体引作参考)。
在嗅上皮中，REEP和/或RTP在嗅觉神经元中特异性地表达，这可以通过对比OMP表达(成熟的嗅觉感觉神经元的标志)来看出(见图6B)。为了避免RTP1和RTP2 RNA(它们的编码序列在核苷酸水平是87％相同的)之间的交叉杂交，除了与开放读码框相对应的探针以外，使用非同源的3′UTR区域作为探针。信号是相同的。在嗅觉神经元中没有检测到其它REEP或RTP基因的表达，例外是在较低的水平表达RTP4(见图6B)。最后，脑细胞的一个亚群表达REEP1(见图6C)。
实施例5.REEP1和RTP1可以与OR相互作用
鉴于REEP和/或RTP促进OR的细胞表面表达的能力，假定它们也与OR蛋白相互作用。这可以使用共免疫沉淀测定来评价。将HA-标记的MOR203-1和Flag-标记的REEP1，RTP1或ICAP-1(阴性对照)(见，例如，Zawistowski，J.S.等(2002)Hum Mol Genet 11，389-396；这里整体引作参考)转染进293T细胞。用抗-Flag抗体沉淀细胞提取物后，在室温，在SDS-样品缓冲液中洗脱蛋白，之后进行蛋白印迹分析，以检测OR蛋白。沉淀REEP1或RTP1后，OR蛋白检测为高分子量条带(见图7B，泳道1和2)。使用这些洗脱条件，大多数对照GPCR-β2肾上腺素能受体不形成高分子量寡聚物。类似地，当沉淀HA-MOR203-1蛋白时，REEP1或RTP1蛋白共沉淀，而ICAP-1未检测出(见图7C，泳道1，2和3)。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果表明，REEP1和RTP1与OR复合。
基于蛋白相互作用，假定辅助蛋白的功能性表达可能受OR蛋白的调节。当仅仅将C-末端Flag-标记的RTP1转染进293T细胞时，几乎没有检测出细胞表面信号，表明大多数RTP蛋白在细胞内。相反地，RTP1和OR的共转染，极大地增强了细胞表面RTP1(见图7D)。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果证实了OR和RTP1对于细胞表面表达的相互依赖性，并表明OR和RTP1的有效的细胞表面表达需要二者之间形成相对稳定的受体复合物。当表达C-末端标记的REEP1时，观察到小量细胞表面REEP1。与RTP1不同，OR蛋白的共表达不促进REEP1的细胞表面表达(见图7E)。
实施例6.REEP和/或RTP增强OR功能
气味剂在表达OR的异源细胞培养系统中诱发的信号传递活性差，已经归因于OR的细胞表面表达差。REEP和/或RTP的鉴别，允许直接评价该问题。使用萤光素酶报道基因测定，其中cAMP效应元件(CRE)介导萤光素酶基因表达(见图8A)。因为OR活化导致cAMP的增加，在有和没有REEP和/或RTP存在下，测量其配体丁香酚对小鼠气味受体OREG的活化(见，例如，Kajiya，K.等(2001)J Neurosci 21，6018-6025；Touhara，K.等，(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96，4040-4045；各自在本文中整体引作参考)。如以前报道的，丁香酚增加OREG依赖性萤光素酶活性的水平(见，例如，Katada，S.等(2003)Biochem Biophys Res Commun 305，964-969；在这里整体引作参考)。OREG与REEP和/或RTP的共表达，显著增强了气味剂-依赖性的萤光素酶活性(图8B)。当使用两种其它的OREG配体香草醛或乙基香草醛时，得到类似的结果。因为RTP4也在嗅上皮中以低水平表达，该蛋白与OREG共表达，但是这不产生萤光素酶报道基因活性的显著增加。
取决于辅助蛋白，其它GPCR可以表现出配体特异性的变化(见，例如，McLatchie，L.M.等(1998)Nature 393，333-339；这里整体引作参考)(McLatchie等，1998)。为了研究REEP1，RTP1或RTP2是否会改变OR的配体选择性，测试了OREG和OR-S46以及它们的激动剂和有关的化学物质。当受体与辅助蛋白共表达时，没有观察到相对化学选择性的实质变化(见图8C)。
实施例7.构建功能性测定来鉴别气味剂-受体相互作用
为了便利分析气味剂-OR相互作用，建立了稳定地表达REEP1，RTP1，RTP2和Gαolf(偶联到OR的G蛋白α亚基)的293T细胞系(见，例如，Belluscio，L.等(1998)Neuron 20，69-81；Jones，D.T.和Reed，R.R.(1989).Science 244，790-795；各自在本文中整体引作参考)。为了建立这样的细胞，将含有小鼠REEP1，RTP1，RTP2和Gαolf ORF的线性化的表达载体转染进具有PGK-Pac(嘌呤霉素抗性基因)的293T细胞(见，例如，Watanabe，S.等(1995)BiochemBiophys Res Commun 213，130-137；这里整体引作参考)。在嘌呤霉素抗性克隆中，当转染OREG时，克隆3A表现出对丁香酚的强反应，将其命名为Hana3A。RT-PCR分析表明，Hana3A细胞表达外源REEP1，RTP1，RTP2和Gαolf(见图9)。当在Hana3A细胞中转染OREG或其它OR并免疫染色时，观察到增强的细胞表面表达(见图10)。为了测试Hana3A细胞是否也在萤光素酶测定中增加配体反应，共转染CRE-萤光素酶报道基因以及OREG(HA-标记的)、OR-S46或OR-S50，并分别用它们的配体丁香酚、壬酸和壬二酸刺激细胞(见，例如，Malnic，B.等(1999)Cell 96，713-723；Touhara，K.等(1999)Proc Natl AcadSci USA 96，4040-4045；各自在本文中整体引作参考)。当在293T细胞中表达HA-OREG时，几乎没有观察到萤光素酶诱导。相反地，当使用Hana3A细胞时，在丁香酚刺激后观察到了萤光素酶活性的增强(见图8D)。使用2种其它的OR(OR-S46和OR-S50)，得到了类似的结果。OR-S50基因不在293T细胞中产生萤光素酶反应，而转染进Hana3 A细胞中的相同受体产生了强烈的萤光素酶活性(见图8D)。使用该测定，在293T细胞中单独表达Gαolf，对OR活化具有很少的作用或没有作用。
为了证实有REEP1，RTP1和RTP2存在下增强的OR功能，使用表达Gαolf的293T细胞和Hana3A细胞，测量配体刺激后cAMP的量。当转染OREG并加入丁香酚来刺激OR时，在Hana3A细胞中生成更多的cAMP。相反地，当表达β2肾上腺素能受体并使用异丙肾上腺素时，没有观察到cAMP生产的显著差异(见图8E)。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这进一步支持了辅助蛋白在功能性OR表达中的特定作用。
以前的研究证实，由脂族醇和酸激活的单个嗅觉神经元表达特异性的OR，主要是I类(鱼-样)OR(见，例如，Malnic，B.等(1999)Cell96，713-723；Zhang，X.和Firestein，S.(2002)Nat Neurosci 5，124-133；各自在本文中整体引作参考)。针对脂族醇、醛和酸和一些其它的气味剂的测定组，测试了4种以前使用其它技术(见，例如，Malnic，B.等(1999)Cell 96，713-723；这里整体引作参考)测定的OR(S6/79，S18，S46和S50)。另外，测试了5种″孤儿″I类OR(MOR23-1，MOR31-4，MOR31-6，MOR32-5和MOR32-11)，它们的同源配体尚不清楚。在100uM的阈上浓度，所有这些OR都是气味剂选择性的，仅仅对测试的气味剂的小亚群作出反应(见图11A)。该特异性在更低的、更生理上相关的浓度维持。这些OR中的许多对以微摩尔浓度存在的气味剂作出反应。通过活细胞免疫荧光评价这些OR的细胞表面表达。有些OR(S18，MOR31-4，MOR31-6和MOR32-5)强烈地表达，而其它OR(S6，S50，MOR23-1，MOR32-11)较弱地表达(见图12)。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果表明弱表达足以产生显著的对生理上相关的浓度的气味剂的反应。最后，针对一组139种气味剂，测试了2种另外的孤儿II类OR，MOR203-1和olfr62。MOR203-1对高浓度的壬酸作出反应(见图11B)。Olfr62对香豆素和胡椒醛作出反应(见图11C)。接着，测试了几种有关的芳香族化合物，将2-香豆冉酮鉴别为olfr62的优选的配体(见图11C)。当在该萤光素酶测定中使用这些OR的亲本293T细胞时，观察到对气味剂微弱的反应或没有反应。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果进一步证实REEP和/或RTP在功能性OR表达中的重要性。
实施例8.受体折叠、运输和/或气味剂识别过程中的REEP和/或RTP功能
GPCR的表达是一个复杂的过程，它包括蛋白折叠、翻译后修饰和通过细胞隔室(包括ER和高尔基体)的运输。另外，有证据表明，GPCR向质膜的适当靶向，可能涉及均或异二聚体化(见，例如，Angers，S.等(2002)Annu Rev Pharmacol Toxicol 42，409-435；这里整体引作参考)。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，虽然REEP和/或RTP可在这些OR表达步骤中的任何步骤中发挥功能，图13显示了关于它们可能的相互作用的三种可能性。
首先，REEP和/或RTP促进OR在ER中的正确折叠。将NinaA(一种果蝇的cyclophilin同源物)鉴别为视紫红质的侣伴蛋白，且认为其促进正确折叠(见，例如，Baker，E.K.等(1994)Embo J 13，4886-4895；Shieh，B.H.等(1989)Nature 338，67-70；各自在本文中整体引作参考)。REEP1的植物同源物HVA22是应激诱导的基因，且可以允许植物耐受不利条件(见，例如，Chen，C.N.等(2002)PlantMol Biol 49，633-644；Shen，Q.等(1993)J Biol Chem 268，23652-23660；各自在本文中整体引作参考)。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，虽然不知道HVA22的精确作用，因为许多应激诱导的蛋白(例如热休克蛋白)起侣伴蛋白的作用，可以想象HVA22和类推地可能REEP1会起侣伴蛋白的作用以促进折叠。
其次，REEP1，RTP1和RTP2促进包括OR的特定小囊泡/货物的运输。与该构思相一致，酵母中的REEP1同源物YOP1P已经参与Rab-介导的小囊泡运输(见，例如，Brands，A.和Ho，T.H.(2002)PlantPhysiol 130，1121-1131；Calero，M.(2001)J Biol Chem 276，12100-12112；各自在本文中整体引作参考)。在美丽线虫中，网格蛋白适体亚基UNC-101介导化学感觉受体向嗅纤毛的运输(见，例如，Dwyer，N.D.等，(2001)Neuron 31，277-287；这里整体引作参考)。
再次，REEP1，RTP1和RTP2起OR的共受体的作用。如图7D所示，OR的共表达增强RTP1细胞表面表达。OR可含有ER停留信号，其通过与RTP(或REEP1)的结合而受到掩蔽，该机理类似于与GABA(B)R2的结合对GABA(B)R1受体的细胞表面表达的调节(见，例如，Jones，K.A.等(1998)Nature 396，674-679；Kaupmann，K.等(1998)Nature 396，683-687；White，J.H.等(1998)Nature 396，679-682；各自在本文中整体引作参考)。REEP和RTP可以具有不同的或互补的作用，这是与缺少任何氨基酸序列相似性或特定序列基序相一致的假说。
本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，对于REEP1，RTP1和RTP2，上述的三种作用是合理的；但是，不排除其它可能的功能。尽管当与REEP1，RTP1或RTP2一起表达时，没有观察到OREG或OR-S46的配体特异性的变化，可能它们确实在调控一些OR的识别谱中起作用。例如，不同的RAMP成员会改变降钙素受体样受体(CRLR)(GPCR的一个成员)的配体特异性。与RAMP1一起表达的CRLR起CGRP受体的作用，而与RAMP2一起表达的CRLR起肾上腺髓质素受体的作用(见，例如，McLatchie，L.M.等(1998)Nature 393，333-339；这里整体引作参考)。
本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，许多GPCR，包括V1R信息素受体(见，例如，Dulac，C和Axel，R.(1995)Cell 83，195-206；这里整体引作参考)，T2R味觉受体(见，例如，Adler等(2000)Cell 100，693-702；Matsunami，H.，Montmayeur，J.P.和Buck，L.B.(2000)Nature 404，601-604；各自在本文中整体引作参考)，α2C肾上腺素能受体(见，例如，Hurt，C.M.等(2000)J Biol Chem 275，35424-35431；这里整体引作参考)和促甲状腺激素释放激素受体(见，例如，Yu，R.和Hinkle，P.M.(1997)Mol Pharmacol 51，785-793；这里整体引作参考)，似乎需要辅因子来进行它们的细胞表面表达。因而，REEP和RTP成员可调节这样的GPCR的运输。原位杂交分析已经证实，REEP3，REEP5，RTP1和RTP2都由VNO神经元表达。另外，REEP成员在脑细胞亚群中有差别地表达(M.M.和H.M.，未公开的观察结果)。在这样的情况下可以应用策略，使用SAGE和/或数字差异显示，建立在特定细胞类型中表达的基因的列表，并筛选促进受体的细胞表面表达的基因。
实施例9.REEP和/或RTP能实现对气味受体-气味剂相互作用的研究
已经建立了允许快速鉴别OR的配体的表达系统。用十二种OR，测试了该系统。测试的OR中的4种(S6/S79,S18,S46和S50)在响应脂族气味剂的单一嗅觉神经元中表达(见，例如，Malnic，B.等(1999)Cell 96，713-723；这里整体引作参考)。OR-S50的反应谱(但不是OR-S18的反应谱)与以前的报道一致(见，例如，Malnic，B.等(1999)Cell 96，713-723；这里整体引作参考)。在以前的研究中，嗅觉神经元S6和S79表达相同的OR(OR-S6/S79)，且二者都对壬二酸作出响应，尽管仅仅嗅觉神经元S79对2种气味剂(庚酸和辛酸)作出响应(见，例如，Malnic，B.等(1999)Cell 96，713-723；这里整体引作参考)。在本发明的过程中进行的实验中，OR-S6/S79对壬二酸作出响应，但不对庚酸或辛酸作出响应。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果支持嗅觉神经元S6响应谱。差异可能是由于当从单一的嗅觉神经元记录时响应的变异。当使用钙成像针对同一组气味剂记录表达相同OR的多种单一嗅觉神经元时，它们的响应谱是类似但不同的(见，例如，Bozza，T.等(2002)J Neurosci 22，3033-3043；这里整体引作参考)。
鉴别出了7种新OR，其对试验组中的不同气味剂起响应。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果证实了该系统解码OR的配体特异性的适用性。OR对不同气味剂的响应谱，与″组合受体码″的构思相一致，其中一种OR对多种相关的气味剂作出响应，且一种气味剂会激活多种受体(见，例如，Kajiya，K.等(2001)J Neurosci 21，6018-6025；Malnic，B.等Cell 96，713-723；各自在本文中整体引作参考)。
在本发明的过程中进行的实验中，不仅3种I类OR(S46，MOR23-1，MOR31-4)，而且MOR203-1(一种II类OR)，也对壬酸起响应。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果表明，非常不同的OR可以对相同的化学物质起响应，因为MOR203-1和其它壬酸OR(MOR23-1，MOR31-4和S46)仅仅29-32％相同。Olfr62是位于IVA基因座附近或该处的参与异戊酸感觉的密切相关的OR之一(见，例如，Griff，I.C和Reed，R.R.(1995)Cell 83，407-414；Zhang，X.和Firestein，S.(2002)Nat Neurosci5，124-133；各自在本文中整体引作参考)。在本发明的过程中进行的实验中，olfr62不对异戊酸起响应，但是对香豆素和其它相关的芳香族化合物起响应(见图11C)。还测试了位于IVA基因座附近的8种其它的OR，但是它们都不对异戊酸起响应。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果表明，这些OR不参与异戊酸探测。
本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，功能性OR表达系统以及对小鼠和人基因组中几乎所有OR的注解(见，例如，Glusman，G.等(2001)Genome Res 11，685-702；Young，J.M.等(2002)Hum Mol Genet 11，535-546；Zhang，X.和Firestein，S.(2002)Nat Neurosci 5，124-133；Zozulya，S.等(2001)Genome Biol 2，18；各自在本文中整体引作参考)，提供了以综合的方式研究哺乳动物OR-气味剂相互作用的平台。
实施例10.单细胞长SAGE分析
如所述(见，例如，Brady，G.和Iscove，N.N.(1993)MethodsEnzymol 225，611-623；Dulac，C和Axel，R.(1995)Cell 83，195-206；Matsunami，H.和Buck，L.B.(1997)Cell 90，775-784；各自在本文中整体引作参考)，经改进后，进行单细胞RT-PCR。简而言之，用分散酶(Invitrogen)和胶原酶(Invitrogen)离解成年小鼠嗅觉组织。使用显微操作器，在倒置显微镜下挑取单细胞，并转移进4.75ul裂解混合物(1xPCR缓冲液(Roche)，1.5mM MgCl2，50uM dNTP，200ng/mg锚定引物(生物素-TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGA(T)24)，0.3U/ul Prime RNA酶抑制剂(Eppendorf)和0.4U/ul rRNasin(Promega)。将含有裂解的细胞的PCR试管加热至65℃1min，在4℃冷却，加入0.25ul RT混合物(170U/ul Superscript II(Invitrogen)，35U/ul Prime RNA酶抑制剂和45U/ul rRNasin.)，并在37℃温育10min，然后在65℃温育10min。向每个试管中加入5ul TdT混合物(1xPCR缓冲液(Roche)，1.5mM MgCl2，3mM dATP，1.25U/ul TdT(Roche)，0.05U RNA酶H(Roche))，并在37℃温育20min，然后在65℃温育10min。将5ul产物加入50ul PCR混合物(1xEX Taq缓冲液(Takara)，0.25mM dNTP，20ng/ul锚定引物，2.5UEX Taq HS聚合酶(Takara))，在95℃温育2min，37℃ 5min，72℃ 20min，然后是28个循环：95℃30sec、67℃ 1min、72℃ 6min加6秒延伸(每个循环)，然后72℃ 10min。使用长SAGE方案，分析扩增的PCR产物的含量(见，例如，Saha，S.等(2002)Nat Biotechnol 20，508-512；这里整体引作参考)。简而言之，用NlaIII(NEB)切割单细胞PCR产物。生物素化的DNA结合到链霉抗生物素磁珠(Dynal)后，连接连接物。用MmeI(NEB)切割连接的DNA。连接切割的标记，形成双标记，并通过PCR扩增。用NlaIII切割PCR产物，连接双标记，形成多联体。将它们连接进pZero-1载体(Invitrogen)，并转化。挑选单菌落，并测序。使用SAGE2002软件和NCBI Blast搜索，分析标记序列。
实施例11.载体构建
使用HotstarTaq DNA聚合酶(Qiagen)或KOD DNA聚合酶(Toyobo/Novagen)，从嗅上皮cDNA扩增cDNA，并亚克隆进pCI表达载体(Promega)。从C57BL6(MOR203-1和S46)，129(S18)或DBA2(olfr62，S6/S79，S50，MOR23-1，MOR31-4，MOR31-6，MOR32-5和MOR32-11)的基因组DNA，扩增OR开放读码框，并亚克隆进含Rho-标记的pCI。
实施例12.细胞培养和免疫细胞化学
将293T细胞维持在含有10％胎牛血清的极限必需培养基(M10)中。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行转染。在活细胞染色中，转染后16小时，在含有抗视紫红质抗体4D2(见，例如，Laird，D.W.和Molday，R.S.(1988)Invest Ophthalmol Vis Sci 29，419-428；这里整体引作参考)和15mM NaN3的M10中，在4℃温育细胞1小时。洗涤后，与Cy3-缀合的抗小鼠IgG(JacksonImmunologicals)一起温育细胞，洗涤并封固。对于FACS分析，使用4D2和PE-缀合的抗小鼠IgG(Jackson Immunologicals)来监测Rho标记的受体表达。使用抗HA兔抗体(Sigma)和Alexa 488缀合的抗兔IgG(Molecular Probes)来对HA-β2肾上腺素能受体染色。为了建立Hana3a细胞，使用lug/ml嘌呤霉素进行选择。挑选96个菌落，并通过使用OREG的萤光素酶测定，进行测定。
实施例13.REEP和RTP的分析
为了预测REEPs和RTP的信号肽和跨膜区域，分别使用SignalP(见，例如，Nielsen，H.等(1997)Protein Eng 10，1-6；这里整体引作参考)和TMHMM。为了建立种系发生树，使用ClustalW。
实施例14.RNA印迹和原位杂交
使用Trizol试剂(Invitrogen)或Aurum Total RNA(Biorad)，从不同的组织提取总RNA。在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳RNA，并转移到HybondN膜(Amersham)上。Dig-标记的探针与膜在Dig easyhyb溶液(Roche)中在65℃杂交。洗涤后，应用抗-Dig AP(Roche)，并洗涤膜。用CDP-Star(Roche)检测信号。对所有3种探针，使用相同的膜。如所述(见，例如，Matsunami，H.和Buck，L.B.(1997)Cell 90，775-784；Matsunami，H.等(2000)Nature 404，601-604；Schaeren-Wiemers，N.和Gerfm-Moser，A.(1993)Histochemistry100，431-440；各自在本文中整体引作参考)，进行原位杂交。简而言之，使Dig-标记的RNA探针与3周龄CD-1小鼠的新鲜冷冻切片杂交。洗涤后，使Dig探针与抗-Dig AP反应，并使用NBT-BCIP检测信号。
实施例15.免疫沉淀
用OR、REEP1和/或RTP1 cDNA，转染在100mm皿中的293T细胞。转染后16小时，在裂解缓冲液(50mM Tris(7.4)，150mM NaCl，1％NP-40，0.5mM PMSF，2mM Benzamidene，0.5ug/ml亮肽素，1.4ug/ml胃酶抑素A，2.4ug/ml糜蛋白酶抑制素，15ug/ml抑肽酶，1mM正钒酸钠)中裂解细胞。用抗-Flag M2亲和凝胶(Sigma)或抗-HA亲和基质(Roche)在4℃温育裂解物2小时，并用裂解缓冲液洗涤。随后，通过与SDS样品缓冲液一起在室温温育2小时，洗脱结合的蛋白。根据Mini-Protean 3 Cell(Bio-Rad)说明书，进行SDS-PAGE和蛋白印迹。使用ECL(Amersham)，检测膜上的蛋白。
实施例16.萤光素酶测定
使用Dual-Glo系统(Promega)进行萤光素酶测定。使用CRE-萤光素酶(Stratagene)来测量受体活性。将组成活性的SV40启动子驱动的Renilla萤光素酶(pRL-SV40：Promega)用作内部对照。将细胞涂布到聚-D-赖氨酸包被的96孔平板(BIOCOAT，Beckton Dickinson)上。转染后8小时(对于图8B和8C所示的实验)或12小时(对于图8D和图11所示的实验)后，将培养基替换为CD293化学成分确定的培养基(Invitrogen)，并在37℃温育平板1小时。将培养基替换为溶解在CD293中的50ul气味剂溶液，并在37℃温育10小时(对于图8B和8C所示的实验)或4小时(对于图8D和图11所示的实验)。遵循关于测量萤光素酶和Renilla萤光素酶活性的生产商的说明书。使用Wallac Victor 1420(Perkin-Elmer)测量发光。将标准化的萤光素酶活性计算为：[Luc(N)-Luc(0)]/RL(N)，其中Luc(N)＝某个孔中的发光计数，Luc(0)＝每种OR在没有气味剂时的发光计数，RL(N)＝每个孔中的Renilla萤光素酶的发光计数。对于cAMP测定，将细胞涂布到24-孔平板上。将OREG或OREG/Golf cDNA分别转染进Hana3a或HEK293-T细胞。转染后14小时，在CD293中温育细胞2小时，并暴露于丁香酚或异丙肾上腺素(在含有10mM Hepes和50OuM IBMX的MEM中)5min。使用cAMP-Screen Direct System(Applied Biosystems)来测量cAMP水平。使用Prism软件(Graphpad)进行数据分析。
实施例17.化学试剂
除了辛酸购自Calbiochem外，所有气味剂都购自Sigma。在实施例19中，提供了发现MOR203-1和olfr62的同源配体中使用的化学试剂。
实施例18.Genbank登录号
小鼠和人REEP1-6和RTP1-4的genbank登录号为：AY562225-AY562244。
实施例19.补充材料
在MOR203-1和olfr62的初步配体筛选中使用的化学试剂如下：1(+)-香芹酮，2L-Canvone，3(-)-小茴香酮，4柠檬醛，5(1R)-(-)-小茴香酮，6(+)-茴香酮，7迷迭香油，8(-)-Rose oxide，9(+)-Rose oxide，10(-)-樟脑，11(S)-(-)-柠檬烯，12(R)-(+)-1-苯基乙醇，13(S)-(+)-2-苯丁酸，14(R)-(-)-2-苯丁酸，152-己酮，161-戊醇，171-庚醇，18(±)-2-丁醇，19 1-丙醇，20 1-己醇，21(-)-薄荷醇，22(R)-(-)-2-庚醇，23(-)-α-松油醇，24(+)-薄荷醇，25 2-甲基-2-庚醇，26(S)-(+)-2-辛醇，27(S)-(+)-2-丁醇，28(S)-(+)-2-庚醇，29(R)-(-)-2-辛醇或P(+)-2辛醇，30 1-癸醇，31(-)-β-香茅醇，32(S)-(-)-1-苯基乙醇，33丙醛，34十一醛，35辛醛，36反式-肉桂醛，37壬醛，38庚醛，39正癸醛，40己酸，41己酸，42庚酸(葡萄花酸)，43戊酸，44丙酸，45丁酸，46壬酸，47丙酸甲酯，48丁酸乙酯，49丁酸丁酯，50丙酸叔丁酯，51丁酸甲酯，52丁酸丙酯，53乙酸戊酯，54二甲基吡嗪，55异丁胺，56香叶醇，57 2-戊酮，58 2-丁酮，59(1S)-(-)-α-蒎烯，60 1，4-桉油素，61苯乙醚，62丁基甲基醚，63(R)-(+)-长叶薄荷酮，64苯，65苯甲醇，66愈创木酚，67异戊基胺，68 g-己内酯，69 g-己内酯，70 octen，71庚酸烯丙酯，72 a-戊基肉桂醛，73己酸戊酯，74丁酸戊酯，75茴香脑，76茴香醛，77二苯甲酮，78醋酸苄酯，79水杨酸苄酯，80庚酸丁酯，81樟脑((+)-樟脑)，82Cedryl acetate，83肉桂醇，84肉桂醛，85(R)-(+)-香茅醛，86(S)-(-)-香茅醛，87香茅醇，88香豆素，89环己酮，90 p-百里香素，91 5，5-二甲基-1，3-环己烷二酮(Dimedone)，92乙基戊基酮(3-辛酮)，93桉叶素，94异丁酸庚酯，95醋酸己酯，96 a-己基肉桂醛，97醋酸异冰片酯，98芳樟醇，99 Lyral(a-戊基肉桂醛二甲基缩醛)，100羟基香茅醛，101异丁酸对甲苯酯，102异丁酸邻甲苯酯，103苯乙酸对甲苯酯，104 2-甲氧基-3-甲基-吡嗪，105 2-甲氧基吡嗪，106水杨酸甲酯，107桂叶烯，108 w-十五内酯，109醋酸异戊二烯酯，110 2-苯基乙醇，111 2-苯乙基醋酸酯，112胡椒醛，113吡嗪，114洋擦木油，115麝香草酚，116三乙胺，117 2-庚酮，118甲基丁香酚，119丁香酚，120丁香酚甲基醚，121丁醛，122己醛，123 1-戊醇，124戊醛，125壬二酸二氯化物，126壬二酸，127异戊酸，128癸酸，129香草酸，130 1-辛醇，131 4-乙基苯酚，132庚醛，133 1-壬醇，134壬醛，135乙基香草醛，136香草醛，137苯乙酮，138 2-乙基苯酚，139辛醛。
与香豆素和胡椒醛(为olfr62使用的)有关的化学试剂是：140苯甲醛，141胡椒醇，142 4-羟基香豆素，143 4-二氢色原酮，144 2-香豆冉酮。
实施例20.人气味受体的活化模式
使用Hana3A细胞(表达小鼠REEP1，RTP1，RTP2和Gαolf的293T细胞)。使用CRE-萤光素酶(Stratagene)来测量气味受体活性。测试下面的人气味受体对响应不同气味剂引起的表达模式：36，35，11，57，58，9，3，42，81，82，66，13，87，33，44，43，77，75，64，59，12，62，60，120，90，95，160和106。使用下面的气味剂来测试人气味受体表达模式：吡啶，2，2′-(二硫二亚甲基)二呋喃，1-癸醇，1-己醇，(-)-小茴香酮，(+)-小茴香酮，香叶醇，2-戊酮，水杨酸苄酯，(+)-薄荷醇，(-)-薄荷醇，苯，十一醛，丁酸甲酯，异丁酸庚酯，异丁酸对甲苯酯，丁酸戊酯，丁酸乙酯，醋酸己酯，乙酸戊酯，醋酸胡椒基酯，(-)-b-香茅醇，香茅醇，丁香酚甲基醚，甲基丁香酚，a-戊基肉桂醛，a-戊基肉桂醛二甲基缩醛，肉桂醛，a-己基肉桂醛，羟基香茅醛，柠檬醛，(R)-(+)-香茅醛，(S)-(-)-香茅醛，苯乙酸对甲苯酯，苯乙酸烯丙酯，  丙酸，壬二酸二氯化物，异戊酸，(R)-(-)-2-苯丁酸，(S)-(+)-2-苯丁酸，庚酸，辛酸，戊酸，己酸和丁酸丁酯。将组成活性的SV40启动子驱动的Renilla萤光素酶(pRL-SV40：Promega)用作内部对照。使用Dual-Glo系统(Promega)进行萤光素酶测定。将细胞涂布到聚-D-赖氨酸包被的96孔平板(BIOCOAT，Beckton Dickinson)上。转染后12-16小时，将培养基替换为CD293化学成分确定的培养基(hrvitrogen)，并在37℃温育平板1小时。将培养基替换为50ul溶解在CD293中的气味剂溶液，并在37℃温育4小时。遵循关于测量萤光素酶和Renilla萤光素酶活性的生产商的说明书。使用Wallac Victor 1420(Perkin-Elmer)测量发光。将标准化的萤光素酶活性计算为：[Luc(N)-Luc(0)]/RL(N)，其中Luc(N)＝某个孔中的发光计数，Luc(0)＝每种OR在没有气味剂时的发光计数，且RL(N)＝每个孔中的Renilla萤光素酶的发光计数。图34显示了气味剂暴露引起的人气味受体的活化模式。
实施例21.Hana3A和293T细胞中的V1RE11的细胞表面表达
将编码推定的信息素受体(V1RE11)的cDNA转染进Hana3A细胞(表达REEP1，RTP1，RTP2和Gαolf的HEK293T细胞)或293T细胞。V1RE11是小鼠的推定的信息素受体，且其氨基酸序列与气味受体完全不同。Hana3A细胞支持V1RE11的细胞表面表达。本发明不限于特定机理。实际上，对机理的理解不是实践本发明所必需的。尽管如此，这些结果表明，REEP1、RTP1和RTP2可以支持气味受体以外的受体的功能性表达。
实施例22.RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E的增强OLFR62细胞表面表达和活性的能力
本实施例描述了RTP1变体RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E的产生和它们的增强OLFR62细胞表面表达和活性的能力。通过删除RTP1的部分，产生了RTP1的变体。图35示意地显示了与RTP1相对比的RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E的氨基酸片段。pCI是对照载体。图36显示了RTP1-A的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：41)，图37显示了RTP1-B的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：42)，图38显示了RTP1-C的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：43)，图39显示了RTP1-D的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：44)，图40显示了RTP1-E的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：45)。
图41证实了Hana3A和293T细胞中的OLFR62的细胞表面表达。将编码RTP1，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D，RTP1-E和对照pCI的cDNA转染进Hana3A细胞或293T细胞。在表达RTP1-D的Hana3A细胞和293T细胞中观察到增强的细胞表面染色。
图42示意地显示了用于监测OLFR62活性的萤光素酶测定。使用cAMP效应元件(CRE)和萤光素酶来监测OLFR62的活化。OLFR62的活化会增加cAMP，后者通过CRE增强萤光素酶报道基因的表达。
图43证实了通过表达RTP1，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D，RTP1-E和对照pCI的Hana3A细胞和293T细胞中的萤光素酶表达指示的OLFR62活性。在表达RTP1-D的293T细胞和Hana3A细胞中，观察到增加的OLFR62活性的增强。
实施例23.RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3的增强OLFR62细胞表面表达和活性的能力
本实施例描述了RTP1变体RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3的产生和它们的增强OLFR62细胞表面表达和活性的能力。通过删除RTP1-A和RTP1-D的部分，产生了RTP1的变体。具体而言，将引物对放置在与希望的删除片段相对应的特定位置，并利用KOD聚合酶通过PCR扩增。图44示意地显示了分别与RTP1-A和RTP1-D相对比的RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3的氨基酸片段。图45显示了RTP1-A1的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：46)和RTP1-A1的人氨基酸序列(SEQ ID NO：47)。图46显示了RTP1-D1的鼠氨基酸序列(SEQID NO：48)。图47显示了RTP-D2的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：49)。图48显示了RTP-D3的鼠氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。
图49证实了293T细胞中的OLFR62的细胞表面表达。将编码RTP1，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3和对照pCI的cDNA转染进293T细胞。在表达RTP1-A1，RTP1-D1和RTP1-D3的293T细胞中观察到增强的细胞表面染色。
图50显示了通过表达RTP1，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3和对照pCI的293T细胞中的萤光素酶表达指示的OLFR62，OREG，S6和23-1活性。在表达RTP1-A1的293T细胞中，观察到增加的OLFR62，OREG，S6和23-1活性的增强。
图51显示了通过表达RTP1，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2和RTP1-D3和对照pCI的Hana3A细胞中的萤光素酶表达指示的OLFR62，OREG，S6和23-1活性。
图52显示了在用RTP1，RTP1-A1或对照pCI共转染的293T细胞中的OLFR62，OREG，MOR203-1，S6和23-1的细胞表面表达。将编码RTP1，RTP1-A1和对照pCI的GDNA转染进细胞。在表达RTP1-A1的细胞中观察到增加的细胞表面染色。
实施例24.RTP1和RTP4嵌合体
本实施例描述了用嵌合PCR产生的RTP1和RTP4嵌合体。更具体地，在RTP1和RTP4序列的连接点，设计复合的嵌合体引物。对于每种嵌合体，首先扩增2对引物(例如，正向引物和复合的引物，复合的引物和反向引物)。接着，将2种PCR产物用作随后的megaprimer PCR中的模板，利用原始的正向和反向引物，得到希望的嵌合体。图53示意地显示了RTP1-A1-A(嵌合体1)，RTP1-A1-D2(嵌合体2)，RTP1-A1-D1(嵌合体3)，RTP4-A1-A(嵌合体4)，RTP14-A1-D2(嵌合体5)和RTP4-A1-D1(嵌合体6)的氨基酸片段。
图54显示了在表达RTP1，RTP4，嵌合体1，嵌合体2，嵌合体3，嵌合体4，嵌合体5，嵌合体6和对照pCI的细胞中的OR的细胞表面表达。将编码RTP1，RTP4，RTP1-A1，嵌合体1，嵌合体2，嵌合体3，嵌合体4，嵌合体5，嵌合体6，和对照pCI的cDNA转染进293T细胞。
图55显示了通过表达RTP1，RTP4，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D2，嵌合体1，嵌合体2，嵌合体3，嵌合体4，嵌合体5，嵌合体6和对照pCI的293T细胞中的萤光素酶表达而指示的OLFR62，OREG，S6和23-1活性。
图56显示了使用抗-RTP1对RTP1，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-A1，RTP1-D，嵌合体4，嵌合体5，RTP1-D3，RTP1-D1，嵌合体6和RTP4的检测。
在上面的说明书中提及的所有出版物和专利都在这里引作参考。尽管已经参照特定的优选的实施方案描述了本发明，应当理解，不应当将要求保护的本发明不适当地限制为这样的特定的实施方案。实际上，意图将相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的多种改进，包含在下面的权利要求书的范围内。

Claims (79)

1.鉴别气味受体配体的方法，包括：
a)提供
i)包含气味受体的细胞或其细胞膜，其中所述的细胞表达REEP1，RTP1，RTP1-A，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP1-D3或RTP2，和
ii)测试化合物；
b)将所述测试化合物暴露于所述细胞系；和
c)检测所述气味受体的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述的检测包括检测报道试剂。
3.权利要求1的方法，其中所述的细胞是293T细胞系。
4.权利要求1的方法，其中所述的气味受体是人气味受体。
5.权利要求1的方法，其中所述的测试化合物是气味分子。
6.权利要求2的方法，其中所述的报道试剂受cAMP效应元件的调节。
7.权利要求1的方法，其中所述的细胞包含Gαolf。
8.权利要求1的方法，其中所述的气味受体是鼠气味受体。
9.权利要求1的方法，其中所述的气味受体是合成的气味受体。
10.权利要求1的方法，其中所述的气味受体包括S6/79，S18，S46，S50，MOR23-1，MOR31-4，MOR31-6，MOR32-5和/或MOR32-11。
11.权利要求2的方法，其中所述的报道试剂是发光剂。
12.权利要求11的方法，其中所述的发光剂是萤光素酶。
13.权利要求1的方法，还包括下述步骤：
d)基于所述的活性，检测气味受体配体是否存在。
14.权利要求1的方法，其中所述的细胞选自异源细胞系和天然细胞系。
15.表达气味受体的细胞系，其中所述的表达定位于细胞表面，其中所述的细胞系包含异源基因，后者包括REEP1，RTP1，RTP2，RTP1-A，RTP1-A1，RTP1-D1和RTP1-D3中的一种或多种。
16.权利要求15的细胞系，其中所述的细胞系是293T细胞系。
17.权利要求15的细胞系，其中所述的气味受体是人气味受体。
18.权利要求15的细胞系，其中所述的气味受体标记有报道试剂。
19.权利要求18的细胞系，其中所述的报道试剂是发光报道试剂。
20.权利要求19的细胞系，其中所述的发光报道试剂包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，c-myc，6-组氨酸(6X-His)，绿色荧光蛋白(GFP)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，甲型流感病毒血球凝集素(HA)，β-半乳糖苷酶或GAL4。
21.权利要求15的细胞系，其中所述的细胞系还包含Gαolf表达。
22.权利要求15的细胞系，其中所述的气味受体是鼠气味受体。
23.权利要求15的细胞系，其中所述的气味受体是合成的气味受体。
24.权利要求15的细胞系，其中所述的气味受体包括S6/79，S18，S46，S50，MOR23-1，MOR31-4，MOR31-6，MOR32-5和MOR32-11。
25.分离的和纯化的核酸，其包含编码选自下述的蛋白的序列：SEQ ID NO：21，27，33，34，37，38，41，42，43，44，45，46，47，48，49和50，以及与SEQ ID NO：21，27，33，34，37，38，41，42，43，44，45，46，47，48，49和50至少80％一致的其变体。
26.权利要求25的核酸序列，其中所述的序列可操作地连接到异源启动子。
27.权利要求25的核酸序列，其中所述的序列包含在载体内。
28.权利要求27的核酸序列，其中所述的载体在宿主细胞中表达。
29.分离的和纯化的核酸序列，其能在高严格性条件下，与包含SEQ ID NO：1，7，13，14，17和/或18的核酸杂交。
30.权利要求29的核酸序列，其中所述的序列可操作地连接到异源启动子。
31.权利要求29的核酸序列，其中所述的序列包含在载体内。
32.权利要求31的核酸序列，其中所述的载体在宿主细胞中表达。
33.权利要求32的核酸，其中所述的宿主细胞位于生物中，其中所述的生物是非人动物。
34.包含至少15个核苷酸的分离的多核苷酸序列，其能在高严格性条件下与权利要求29的分离的核苷酸序列杂交。
35.由选自下述的核酸编码的分离的多肽：SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18以及与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少80％一致的其变体。
36.权利要求35的分离的多肽，其中所述的蛋白与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少90％一致。
37.权利要求35的分离的多肽，其中所述的蛋白与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18至少95％一致。
38.权利要求35的分离的多肽，其中所述的蛋白与SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18是100％一致。
39.组合物，其包含分离的核酸，后者能通过选自SEQ ID NO：1，7，13，14，17和18的核酸的至少一部分与它们的互补序列的结合，抑制REEP或RTP多肽的表达。
40.检测受试对象中变体REEP1多肽的方法，包括：
a)提供来自受试对象的生物样品，其中所述的生物样品包含REEP1多肽；和
b)检测所述生物样品中是否存在变体REEP1多肽。
41.权利要求40的方法，其中所述的生物样品选自血液样品，组织样品，尿样品和羊水样品。
42.权利要求40的方法，其中所述的受试对象选自胚胎，胎儿，新生动物和幼小动物。
43.权利要求42的方法，其中所述的动物是人。
44.权利要求40的方法，其中所述的检测包括差异抗体结合。
45.权利要求40的方法，其中所述的检测包括蛋白印迹。
46.权利要求40的方法，其中所述的检测包括检测REEP1核酸序列。
47.检测受试对象中的变体RTP多肽的方法，包括：
a)提供来自受试对象的生物样品，其中所述的生物样品包含RTP多肽；和
b)检测所述生物样品中是否存在变体RTP多肽，其中所述的变体RTP多肽选自变体RTP1多肽和变体RTP2多肽。
48.权利要求47的方法，其中所述的生物样品选自血液样品，组织样品，尿样品和羊水样品。
49.权利要求47的方法，其中所述的受试对象选自胚胎，胎儿，新生动物和幼小动物。
50.权利要求47的方法，其中所述的动物是人。
51.权利要求47的方法，其中所述的检测包括差异抗体结合。
52.权利要求47的方法，其中所述的检测包括蛋白印迹。
53.权利要求47的方法，其中所述的变体RTP1多肽选自RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2和RTP1-D3。
54.试剂盒，其包含足以检测生物样品中是否存在变体REEP1多肽的试剂。
55.权利要求54的试剂盒，还包含关于使用所述试剂盒来检测生物样品中是否存在变体REEP多肽的说明书。
56.权利要求54的试剂盒，其中所述的说明书包含美国食品和药品管理局要求的体外诊断试剂盒说明书。
57.权利要求54的试剂盒，其中所述的试剂包括一种或多种抗体。
58.权利要求54的试剂盒，其中所述的生物样品选自血液样品，组织样品，尿样品和羊水样品。
59.权利要求54的试剂盒，其中配置所述的试剂，以检测REEP1核酸序列。
60.试剂盒，其包含足以检测生物样品中是否存在变体RTP多肽的试剂，其中所述的变体RTP多肽选自变体RTP1多肽和变体RTP2多肽。
61.权利要求60的试剂盒，还包含关于使用所述试剂盒来检测生物样品中是否存在变体RTP多肽的说明书。
62.权利要求60的试剂盒，其中所述的变体RTP1多肽选自RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2和RTP1-D3。
63.权利要求61的试剂盒，其中所述的说明书包含美国食品和药品管理局要求的体外诊断试剂盒说明书。
64.权利要求60的试剂盒，其中所述的试剂包括一种或多种抗体。
65.权利要求60的试剂盒，其中所述的生物样品选自血液样品，组织样品，尿样品和羊水样品。
66.权利要求60的试剂盒，其中配置所述的试剂，以检测选自RTP1核酸序列和RTP2核酸序列的核酸序列。
67.筛选对REEP1特异性的化合物的方法，包括：
a)提供：
i.表达REEP1多肽的样品；
ii.测试化合物；和
b)将所述样品暴露于所述测试化合物，并检测生物效应。
68.权利要求67的方法，其中所述的样品包含细胞。
69.权利要求67的方法，其中所述的样品包含组织。
70.权利要求67的方法，其中所述的样品见于受试对象中。
71.权利要求67的方法，其中所述的生物效应包括REEP1活性的变化。
72.权利要求67的方法，其中所述的生物效应包括REEP1的表达的变化。
73.筛选对RTP特异性的化合物的方法，包括：
a)提供：
i.表达RTP1或RTP2多肽的样品；
ii.测试化合物；和
b)将所述样品暴露于所述测试化合物，并检测生物效应。
74.权利要求73的方法，其中所述的RTP多肽选自RTP1，RTP2，RTP1-A，RTP1-B，RTP1-C，RTP1-D和RTP1-E，RTP1-A1，RTP1-D1，RTP-D2和RTP1-D3。
75.权利要求73的方法，其中所述的样品包含细胞。
76.权利要求73的方法，其中所述的样品包含组织。
77.权利要求73的方法，其中所述的样品见于受试对象中。
78.权利要求73的方法，其中所述的生物效应包括RTP活性的变化。
79.权利要求73的方法，其中所述的生物效应包括RTP的表达的变化。
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