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CN101044404A - 用于不同类型细胞检测和定量的方法和装置以及生物光盘在该检测和定量中的应用 - Google Patents

用于不同类型细胞检测和定量的方法和装置以及生物光盘在该检测和定量中的应用 Download PDF

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CN101044404A
CN101044404A CNA2004800104965A CN200480010496A CN101044404A CN 101044404 A CN101044404 A CN 101044404A CN A2004800104965 A CNA2004800104965 A CN A2004800104965A CN 200480010496 A CN200480010496 A CN 200480010496A CN 101044404 A CN101044404 A CN 101044404A
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CN
China
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cells
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disc
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bio
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CNA2004800104965A
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J·H·库布斯
J·F·戈登
B·C·潘
J·R·I·厄西亚
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Nagaoka Co Ltd
Burstein Technologies Inc
Original Assignee
Nagaoka Co Ltd
Burstein Technologies Inc
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Publication date
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Abstract

公开了进行包括白细胞的细胞分类计数的方法和装置，以及生物光盘在这种细胞计数中的应用。该生物光盘包括基本上为圆形的基质，它具有中心和外缘，以及与此基质结合的活性层；在中心和外缘之间存在靶区；以及与活性层结合的大量捕捉抗体，由此使这些抗体固定在靶区的活性层上。

Description

用于不同类型细胞检测和定量的方法和装置以及生物光盘在该检测和定量中的应用
相关申请的交叉参考
本申请要求获得美国临时申请No.60/451,587的优先权，该临时申请是2003年3月3日提交的，将其整体附在这里作为参考。
发明背景
1、发明领域
本发明大体上涉及细胞测定，特别涉及在生物光盘上进行的细胞测定。更明确的是，本发明涉及包括白细胞的细胞分类计数的方法和装置，以及生物光盘在进行这种细胞计数中的应用，下面所述根据最佳实施模式进行的特殊实施方式对这些都不构成限制。
2、相关技术的讨论
大量研究和诊断工作需要从细胞混合物中分离特定细胞，并进行分析。特别是此来源可为血液、脑脊液、骨髓、肿瘤均浆、淋巴组织等。
在诊断、治疗和确定患者健康状况的随访中应用血细胞计数。全血细胞计数(CBC)是一组试验，包括血红蛋白、红细胞压积、红细胞平均血红蛋白量、红细胞平均血红蛋白浓度、红细胞平均容量、血小板计数和白细胞计数。血细胞计数是对全血每立方毫米的红细胞和白细胞进行计数。
白细胞计数(WBC，白细胞)是标准血样中白细胞的总数。正常健康人中，白细胞计数一般为4000-10800个/微升(μl)。诸如锻炼、紧张和疾病可影响这些值。WBC升高可提示感染、白血病或组织损伤。如果白细胞下降到1000个/微升以下，发生感染的危险则增大。
白细胞分类试验所收集的信息超过白细胞计数本身所能获得的信息。白细胞分类计数用于评价新发可疑感染或发热(即使CBC正常)、怀疑存在与异常相关的疾病、异常白细胞计数、疑似白血病、其他异常，诸如嗜酸细胞增多症、单核细胞增多症和嗜碱粒细胞增多症。在重度白血病情况下可能反复检测白细胞或白细胞分类(例如在药物治疗后)。在治疗过程中，例如化疗或放疗，血细胞计数在确定该治疗消灭癌细胞同时是否还消耗了健康血细胞是非常重要的。
通过计算机化细胞计数仪器可测定白细胞分类计数。此机器测定总计数和五种主要类型白细胞的百分数。在正常个体中，大部分为中性粒细胞(50％)，其次是淋巴细胞(20-40％)，接着是单核细胞(2-9％)，然后是少量嗜酸粒细胞(1-4％)和嗜碱粒细胞(0.5-2％)。
在淋巴细胞种类内，还有淋巴细胞和亚型细胞。例如，淋巴细胞可宽泛地分为T细胞(源于胸腺的淋巴细胞)和B细胞(相当于法氏囊的淋巴细胞)，它们主要分别负责细胞介导免疫和体液免疫。尽管形态学特征已用于白细胞内部的分类，但仅靠形态学是不足以鉴别淋巴细胞亚型的许多功能。为了区别不同功能的淋巴细胞，已经开发了许多技术，包括玫瑰花结法、免疫荧光显微镜检查、酶组化检查和最近的单克隆抗体分析。通过表面标记而区别T细胞，表面标记包括它们表面的两种糖蛋白CD4和CD8(CD4+T细胞和CD8+T细胞)。CD4+辅助T细胞与抗体介导免疫有关。它们与B细胞呈递的抗原结合。结果是促进分泌抗原物质抗体的血浆细胞克隆的发展。T细胞对于细胞介导免疫也是必需的。CD4+细胞与抗原呈递细胞(APC)呈递的抗原结合，抗原呈递细胞例如为吞噬性巨噬细胞和树突状细胞。然后这种T细胞释放淋巴因子，此淋巴因子可将其他细胞吸引至该区域。结果是发生炎症，试图屏蔽(wall off)和破坏抗原物质的细胞和分子积聚。
CD8+、细胞毒/抑制型细胞分泌分子，这些分子破坏它们所结合的细胞。如果靶细胞感染病毒，则这种功能非常重要，因为在该细胞可释放能感染其他细胞的大量新病毒前，它通常已被破坏。
HIV和AIDS
人免疫缺陷病毒是一种逆转录病毒，它对CD4+T细胞具有高度亲和力，因此CD4+T细胞是该病毒的有效靶细胞。获得性免疫缺陷综合症(AIDS)生动而悲剧性地说明CD4+T细胞在免疫中的重要性。人免疫缺陷病毒(HIV)与CD4分子结合，由此侵入并感染CD4+T细胞。随着疾病的进展，CD4+T细胞的数量下降到正常范围约1000/微升(μl)以下。一种解释是患者CD8+T细胞不间断的工作以破坏受感染的CD4+T细胞。
当血液中CD4+T细胞的数目低于400/微升，患者引发免疫反应的能力急剧下降。不仅患者对侵入机体的病原体变得超易感，而且对正常寄生于人体组织而没有危害的微生物，尤其是细菌也变得超易感。最终患者死于机会性感染，诸如念珠菌病、巨细胞病毒感染、单纯疱疹病毒感染、卡氏肺囊虫病、肺炎、弓形体病、肺结核等。
CD4+T细胞和CD8+T细胞数目以及CD4+T细胞/CD8+T细胞比率的估计用于评价免疫受损疾病患者的免疫状况。例如，AIDS患者显示出CD4+T细胞在免疫中的重要性。随着疾病的进展，CD4+T细胞数目下降到正常范围约1000个/μl以下。因为患者CD8+T细胞破坏感染的CD4+T细胞。未受感染的CD4+T细胞可能经受凋亡。因此，CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率成为该疾病进展的诊断标志。美国公共卫生局建议所有感染者每3-6个月监测一次CD4+T细胞水平(美国600个实验室中每年进行4千万次检测)。
除了CD4和CD8外，还有很多其他细胞表面抗原(例如CD3、CD16、CD19、CD45、CD56)，它们可用于鉴定淋巴细胞的亚型。通过抗体技术检测这些细胞表面抗原的能力为诊断病理学增加了新的内容，而且各种技术可用于造血免疫疾病(例如AIDS、白血病和淋巴瘤)免疫表型的研究。常规微量免疫测定法诸如放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)、荧光免疫测定法(FIA)，它们应用同位素、酶或荧光物质测定相应分析物的存在与否。
白血病免疫表型鉴定
白血病中的表面标志有助于鉴别用于诊断和判断预后的肿瘤谱系。综合性白血病表型鉴定从回顾临床病史和形态学开始，并为每个病例选择一组标志。在大部分病例中，谱系可被区分为T细胞、B细胞或髓细胞，而且可进行诊断或鉴别诊断。
白血病表型鉴定的目的是鉴别瘤形成过程的细胞类型。这种表型鉴定应当描述细胞谱系和成熟水平的概况，以此有助于白血病或淋巴瘤的分类。另外，这种表型鉴定应当利于判定此细胞群是正常还是异常，而且也利于在标本中检测前面所述细胞群，以监测疾病的缓解、发展或复发。
在血液或骨髓标本中进行白血病免疫表型鉴定，但是也可应用其他体液或组织。可应用经RBC溶解法或诸如菲可泛影钠的密度梯度分离法获得的白细胞。可能的话，在处理前检查白细胞总计数和分类，并对细胞浓度做相应地调节。
淋巴瘤免疫表型鉴定
淋巴瘤中的表面标志有助于鉴别用于诊断和判断预后的肿瘤谱系。综合性白血病/淋巴瘤表型鉴定从回顾临床病史和形态学开始，并为每个病例选择一组标志。在大部分病例中，谱系可被区分为T细胞、B细胞或髓细胞，并进行诊断或鉴别诊断。
淋巴瘤表型鉴定的目的是鉴别瘤形成过程的细胞类型。这种表型鉴定应当描述细胞谱系和成熟水平的概况，以此有助于淋巴瘤的分类。另外，这种表型鉴定应当利于判定此细胞群是正常还是异常，而且也利于在标本中检测前面所述细胞群，以监测疾病的缓解、发展或复发。
检查全血细胞计数(包括白细胞计数)。血细胞计数是该疾病对治疗反应的重要指标。这些计数对于掌握药物治疗或放射疗法的效果也是重要的。血液中正常白细胞计数约为4000-11000/立方毫米。如果WBC总计数超过11000/mm3，它称为白细胞增多，这是机体对感染的一种正常反应。血细胞计数有助于确定药物是否起作用。通常通过昂贵的电子计算器做细胞计数，例如FACS扫描仪，进行这种检测需要专业技术。每种细胞类型的模型显示是否存在淋巴瘤和淋巴瘤的类型。
单克隆抗体板
尽管在某些情况下应用单色免疫荧光法就已足够，但许多实验室应用多色免疫荧光法。常规包括的抗体为CD2、CD3、CD5、CD10、CD11c、CD14、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD45、CD103、FMC7、重链、κ链和λ链。如果临床或形态学特征提示“T”或“NK”淋巴细胞疾病，则还将检查下面附加的联合抗体：CD3/CD4/CD8、CD7/CD5/HLA-DR、CD25/CD2/CD3、CD16/CD56/CD19、CD57/CD8/CD3、TCRα-β/δ-γ/CD3。
通过抗体技术检测细胞相关抗原的能力为诊断病理学增加了新的内容。各种技术可用于造血免疫疾病免疫表型的研究。但是，用于许多疾病的全局检测方法中，需要进一步发展应用抗体抗原反应的免疫测定方法，这些疾病包括基于病毒的疾病，诸如获得性免疫缺陷综合症和T细胞白血病，以及各种癌症。本发明的测定方法和生物光盘系统可用于实现这种免疫测定，本领域专业技术人员都会清楚地认识到这一点。
常用微量免疫测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)和荧光免疫测定法(FIA)，它们应用同位素、酶或荧光物质，以检测各自相应抗体或抗原的存在与否，这些抗体或抗原与同位素、酶或荧光物质发生特异反应。但是，上述方法存在局限性和缺点。RIA需要特殊设备、预防、有限的半衰期和各种其他因素。酶和荧光物质用作标记物的方法通过测定着色和发光而测定，这些方法需要敏感复杂的仪器以测定热或荧光反应，而且还需要数个冲洗步骤除去过量、未结合、未反应的试剂。另外，将上述检测方法应用于细胞，特别是淋巴细胞和癌细胞及类似标本，需要改进高效制备、检测和分析的技术。
根据特定用于细胞表面抗原的荧光抗体而发展的有力工具是荧光激活细胞分选技术(FACS)。这是非常可靠、快速而敏感的方法。流式细胞术是最实用的方法，它是自动并可定量的。标本对流式细胞分析最重要的需求是，该标本是在单分散悬浮液中，并用荧光标记物标记所需细胞。但是，它是价格很高的实验，而且整个系统需要临床分析实验室中训练有素的技术员和昂贵的仪器进行处理。单克隆抗体用作不连续的探针，流式细胞术用于大量细胞的客观定量分析。
另外，根本的缺点是曾被分析的细胞不能再用于重复分析或其他研究，例如罕见细胞的显微镜检查。已经开发了许多可替代的技术，它们与流式细胞术相比有优势，也有缺点，而且全都存在各自特殊的问题。
表面标记分析是重要的实验室方法，它在白血病、淋巴瘤和免疫缺陷疾病的研究中特别有用。基于抗体的微量排列技术当然是最新的技术，特别是在临床诊断中，它用于标本中特异抗原的鉴别，这些标本包括血液和组织标本。大多数诊断性实验要求仅仅测定有限组的分析物(诸如在癌症、白血病、淋巴瘤、甲状腺疾病中)。因此，微型化技术仅需要很小量的血样，而且节省实验室人员的时间和花费，而且在单次实验中同时测定所有临床相关参数，由于其性价比、工作效率和简易性，这些对于医院实验室和卫生所机构来说可能很有吸引力。
我们开发了一种简便、价廉的系统，用于细胞的分析、测定和定量，特别是用于血细胞，还包括感染血液和诸如CSF的其他生物液体的寄生虫和病原体，该系统可替代现有技术用于细胞计数的系统和方法。还开发了相关信息和信号处理方法和软件，以鉴别各种血细胞、寄生虫和病原体。
与现有方法和系统相比，我们开发了一种简便、微型、超敏感、价廉的细胞分析系统。这种系统应用生物光盘，相关检测组件，以及信息和信号处理方法和软件。
发明总结
微量技术很有价值，特别是在鉴定细胞类型、寄生虫、病原体和其他生物物质的临床诊断中。本发明采用微量技术在生物光盘上进行全血的白细胞分类计数检测。另外，本发明涉及血细胞成像、白细胞分类计数测定和相关处理方法和软件。
可采用两种方法进行本实验或测定。第一种方法基于生物光盘上特殊沟中血细胞的光成像原理。将7微升左右全血注射进光盘上特殊设计的沟中。用细胞识别软件分析影像，该软件可鉴别这些不同的白细胞亚型，并产生白细胞分类计数。第二种方法基于特异细胞捕捉，它应用针对特异细胞的细胞特异抗体，在这种特殊情况中为针对于淋巴细胞(CD4、CD2、CD19)、单核细胞(CD14)、嗜酸粒细胞(CD15)等的抗体。在生物光盘内的固体表面安装/附着这些白细胞亚型特异抗体，该生物光盘包括一种流动室。
为了提高细胞类型鉴定和定量的特异性，可用特异抗体涂敷的微粒或小珠标记捕捉的细胞，这些特异抗体或者是针对所研究细胞类型的，或者是针对珠-细胞复合物中不需要或污染细胞的。此方法可区分捕捉区中的特异性靶细胞和污染细胞。下面结合附图18-24对小珠在鉴定细胞中的应用做进一步详细描述。
使用生物光盘驱动组件旋转此光盘，读取和处理此光盘上存储的编码信息，并分析此生物光盘流动室中的细胞捕捉区。此生物光盘驱动器具有转动该生物光盘的马达，控制光盘旋转速率的控制器，处理光盘反馈信号的处理器，以及分析被处理信号的分析器。旋转速率是可变的，而且通过旋转速度和旋转时间均可紧密地控制旋转速率。还可应用生物光盘将信息写在生物光盘上，这既可在流动室和靶区的实验材料被驱动器的读取光束询问，并被分析器分析前进行，也可在其后进行。该生物光盘可包括编码信息，它用于控制光盘的旋转；提供处理信息，该信息是特别针对于所要实施的细胞免疫测定类型的；以及有监测器上显示与生物驱动相关的结果。
通常细胞分类计数方案，特别是白细胞分类计数方案被开发为CD、CD-R、DVD或DVD-R格式，这些格式的修改版本，以及它们的替代格式。驱动器的读取或询问光束检测分析标本中不同的细胞和珠-细胞复合物，并产生影像，可用细胞分类计数软件分析所产生的影像。
为完成这些繁琐费力的细胞计数测定，显微镜方法或复杂的细胞计数器是必需的。本发明方法应用生物光盘及其组件。可通过细胞识别软件程序产生和分析在分析室中游离的各种细胞类型和珠-细胞复合物的光学影像或者通过特异抗体捕捉方法捕捉的那些细胞的光学影像，此程序通过光扫描特性可鉴别血液或其他体液中的各种细胞成分。本方法在分析前不需要对标本进行任何处理，例如为细胞染色、RBC消除和其他繁杂的方案。这些方法包括显微镜分析或细胞检测，它使用一种光盘读取器，该读取器具有顶部检测器、底部检测器、事件计数器或者细胞计数器，下面结合附图对它们进行详细描述。
为了进一步提高本发明细胞分类计数方法的准确度和精确度，可标记不同的细胞群。例如，这些标记可包括微球体、荧光标记抗体和酶缀合抗体。例如，与标本和/或指示分子的标记相关其他方面的详细描述公开在共同转让的同时待审美国专利申请No.10/121,281中，其名称为“Multi-Parameter Assays Including Analysis Discs andMethods Relating Thereto”，它是2002年4月11日提交的，将其整体附在这里作为参考。
本发明或其不同的方面可易于在许多光盘、测定和系统中实现，或者适应于这些光盘、测定和系统，它们公开于下列共同转让和同时待审的专利申请中：美国专利申请No.09/378,878，名称为“Methodsand Apparatus for Analyzing Operational and Non-operationalData Acquired from Optical Discs”，提交于1999年8月23日；美国临时专利申请No.60/150,288，名称为“Methods and Apparatusfor Optical Disc Data Acquisition Using PhysicalSynchronization Markers”，提交于1999你8月23日；美国专利申请No.09/421,870，名称为“Trackable Optical Discs withConcurrently Readable Analyte Material”，提交于1999年10月26日；美国专利申请No.09/643,106，名称为“Methods and Apparatusfor Optical Disc Data Acquisition Using PhysicalSynchronization Markers”，提交于2000年8月21日；美国专利申请No.09/999,274，名称为“Optical Biodiscs with ReflectiveLayers”，提交于2001年11月15日；美国专利申请No.09/988,728，名称为“Methods and Apparatus for Detecting and QuantifyingLymphocytes with Optical Biodiscs”，提交于2001年11月16日；美国专利申请No.09/988,850，名称为“Methods and Apparatus forBlood Typing with Optical Bio-discs”，提交于2001年11月19日；美国专利申请No.09/989,684，名称为“Apparatus and Methodsfor Separating Agglutinants and Disperse Particles”，提交于2001年11月20日；美国专利申请No.09/997,741，名称为“Dual BeadAssays Including Optical Biodiscs and Methods RelatingThereto”，提交于2001年11月27日；美国专利申请No.09/997,895，名称为“Apparatus and Methods for Separating Components ofParticulate Suspension”，提交于2001年11月30日；美国专利申请No.10/005,313，名称为“Optical Discs for MeasuringAnalytes”，提交于2001年12月7日；美国专利申请No.10/006,371，名称为“Methods for Detecting Analytes Using Optical Discs andOptical Disc Readers”，提交于2001年12月10日；美国专利申请No.10/006,620，名称为“Multiple Data Layer Optical Discs forDetecting Analytes”，提交于2001年12月10日；美国专利申请No.10/006,619，名称为“Optical Disc Assemblies for PerformingAssays”，提交于2001年12月10日；美国专利申请No.10/020,140，名称为“Detection System For Disk-Based Laboratory and ImprovedOptical Bio-Disc Including Same”，提交于2001年12月14日；美国专利申请No.10/035,836，名称为“Surface Assembly forImmobilizing DNA Capture Probes and Bead-Based Assay IncludingOptical Bio-Discs and Methods Relating Thereto”，提交于2001年12月21日；美国专利申请No.10/038,297，名称为“Dual BeadAssays Including Covalent Linkages for Improved Specificity andRelated Optical Analysis Discs”，提交于2002年1月4日；美国专利申请No.10/043,688，名称为“Optical Disc Analysis SystemIncluding Related Methods for Biological and Medical Imaging”，提交于2002年1月10日；美国临时申请No.60/348,767，名称为“Optical Disc Analysis System Including Related SignalProcessing Methods and Software”，提交于2002年1月14日；美国专利申请No.10/086,941，名称为“Methods for DNA ConjugationOnto Solid Phase Including Related Optical Biodiscs and DiscDrive Systems”，提交于2002年2月26日；美国专利申请No.10/087,549，名称为“Methods for Decreasing Non-Specific Bindingof Beads in Dual Bead Assays Including Related Optical Biodiscsand Disc Drive Systems”，提交于2002年2月28日；以及美国专利申请No.10/099,256，名称为“Dual Bead Assays Using CleavableSpacers and/or Ligation to Improve Specificity and SensitivityIncluding Related Methods and Apparatus”，提交于2002年3月14日。
所有这些申请整体附在这里作为参考。它们完全重复在这里，因此提供了支持性的背景技术和公开。
附图简述
通过下面对本发明优选实施方式的描述，可清楚本发明的其它目的，以及它具有的其他特征和由此带来的优势，这些实施方式显示在附图中，始终用相同的参考数字表示相同的组件，其中：
附图1是用图表示的本发明生物光盘系统；
附图2是本发明所用的反射生物光盘的分解透视图；
附图3是附图2所示光盘的上平面图；
附图4是附图2所示光盘的透视图，并通过剖面图显示该光盘的不同层；
附图5是本发明所用的透射生物光盘的分解透视图；
附图6是附图5所示光盘的透视图，并通过剖面图显示该光盘半反射层的功能性方面；
附图7是显示金薄膜的厚度和透射之间关系的图解；
附图8是附图5所示光盘的上平面图；
附图9是附图5所示光盘的透视图，并通过剖面图显示该光盘的不同层，它包括附图6所示的半反射层类型；
附图10是更详细描述附图1系统的透视方框图；
附图11是部分横切面图，该图与附图2、3和4所示反射生物光盘的半径垂直，它显示其中形成的流动沟；
附图12是部分横切面图，该图与附图5、8和9所示透射生物光盘的半径垂直，它显示其中形成的流动沟和上部检测器；
附图13是附图2、3和4所示反射生物光盘的部分纵切面图，它显示其中形成的抖动槽；
附图14是附图5、8和9所示透射生物光盘的部分纵切面图，它显示其中形成的抖动槽和上部检测器；
附图15是与附图11相似的图，它显示反射光盘的整个厚度及其初始折射性能；
附图16是与附图12相似的图，它显示透射光盘的整个厚度及其初始折射性能；
附图17是一种流程图，它显示应用梯度细胞分离方法分离白细胞，以及应用本发明的方法分析血样；
附图18是用小珠标记细胞的图解；
附图19本发明实施方式的图解，它显示应用小珠，以防止不需要细胞与捕捉剂在生物光盘上结合；
附图20A和20B是本发明另一种实施方式的图解，它显示鉴别标本中不同类型细胞的方法步骤，该方法应用不同小珠特异性标记此生物光盘上固定的靶细胞；
附图21是应用小珠捕捉所研究的微生物，并用生物光盘检测其存在与否的图解；
附图22是应用小珠标记不需要细胞的图解；
附图23A是结合在复合物中的1微米指示器小珠和5微米细胞的图解，该复合物位于本发明生物光盘的磁道上；
附图23B是源自附图23A复合物的一系列特征扫描图，它应用了本发明光驱动器的检测信号；
附图24是未粘附小珠、未标记细胞和小珠-细胞复合物或标记细胞的显微图；以及
附图25A和25B是本发明另一种实施方式的图解，它显示从靶细胞中区分不需要细胞的方法步骤，该方法是应用酶鉴别不需要细胞。
本发明描述
本发明涉及光盘驱动系统、生物光盘以及细胞分类和定量测定。更特别的是，本发明涉及用于细胞定量的生物标本中各种细胞群的分类方法，例如包括白细胞，而且还涉及生物光盘在进行这种细胞定量中的应用，下面所述根据最佳实施模式进行的特殊实施方式对这些都不构成限制。下面对本发明这些方面的每一个都做进一步的详细描述。
驱动系统和相关光盘
附图1是本发明生物光盘110的透视图，该光盘用于进行此处公开的细胞分类计数。与该生物光盘110一起显示的是光盘驱动器112和监视器114。
附图2是生物光盘110一种实施方式的主要结构部件的分解透视图。附图2是可用于本发明的生物光盘110反射区(此后称为“反射光盘”)的实例。主要结构部件包括盖部分116、粘合体118和基质120。盖部分116包括一个或多个入口122以及一个或多个出口124。盖部分116可由聚碳酸酯形成，而且优选在其底部涂敷反射面146(如附图4中更详细的描述)，可从附图2的透视图看到此底部。在优选实施方式中，触发器标记126包括在反射层142的表面上(如附图4中更详细的描述)。触发器标记126可包括在生物光盘所有3层中的透明窗口，不透明区，或者用信息编码的反射或半反射区，它将数据传送至处理器166，如附图10所示，此处理器转而与询问或入射光束152的操作功能相互作用，如附图6和10。附图2所示的第二种部件为粘合体118，其中具有流体回路128或U型沟。冲压或切削薄膜，除去塑料膜而形成所示形状，由此形成流体回路128。每个流体回路128包括流动沟130和返回沟132。附图2所示的某些流体回路128包括混合室134。举例说明了两种不同类型的混合室134。第一种是对称混合室136，它是对着流动沟130对称形成的。第二种是偏置混合室138。如图所示，此偏置混合室138是在流动沟130的一边形成的。附图2所述的第三种部件是基质120，它包括靶区或捕捉区140。此基质120优选由聚碳酸酯构成，并具有涂敷在其上面的反射层142，见附图4。通过除去所示形状的反射层142或者任意所需形状的反射层而形成靶区140。可替代的是，通过屏蔽技术可形成靶区140，此屏蔽技术包括在应用反射层142前屏蔽靶区140区域。此反射层142可由金属形成，诸如铝或金。
附图3是附图2所述生物光盘110的上平面图，其在盖部分116上的反射层142显示为透明的，以露出位于光盘内部的流体回路128、靶区140和触发器标记126。
附图4是按照本发明一种实施方式的反射区型生物光盘110放大的透视图。此图包括其各层的一部分，切开它们是为了显示各种成分、层、基质、涂层或膜的部分截面图。附图4显示基质120涂敷着反射层142。在反射层142上敷有活性层144。在优选实施方式中，该活性层144可由聚苯乙烯构成。可替代的是，可应用聚碳酸酯、金、活化玻璃、改性玻璃或者改性聚苯乙烯，例如聚苯乙烯-共-马来酸酐。另外还可用水凝胶。可替代的是，此实施方式中所述的其他，塑料粘合体118敷在活性层144上。塑料粘合体118的暴露面显示切削或冲压的U形形状，该形状构成流体回路128。该生物光盘反射区实施方式中最后的成分结构层是盖部分116。盖部分116包括其底部上的反射面146。此反射面146可由金属构成，诸如铝或金。
附图5是本发明透射型生物光盘110的主要结构部件的放大透视图。该透射型生物光盘110的主要结构部件同样包括盖部分116、粘合体118和基质120层。该盖部分116包括一个或多个入口122以及一个或多个出口124。此盖部分116可由聚碳酸酯层构成。任选的触发器标记126可包括在薄的半反射层143表面上，附图6和9对其进行了最佳的描述。触发器标记126可包括在生物光盘所有三层中的透明窗，不透明区，或者编码有信息的反射或半反射区，它将数据传送至处理器166，见附图10，该处理器转而与询问光束152的操作功能相互作用，询问光束见附图6和10。
附图5所示的第二种部件是粘合体118，其中具有流体回路128或U形沟。通过冲压或切削薄膜，除去塑料膜，而形成所示形状，由此形成流体回路128。每个流体回路128包括流动沟130和返回沟132。附图5所示的某些流体回路128包括混合室134。描述了两种不同类型的混合室134。第一种为对称混合室136，它对着流动沟130对称地形成。第二种为偏置混合室138。如图所示，此偏置混合室138在流动沟130的一边形成。
附图5所示的第三种部件是基质120，它可包括靶区或捕捉区140。基质120优选由聚碳酸酯构成，而且具有薄的半反射层143，该层敷在其上面，见附图6。与附图5和6所示光盘110的基质120相关的半反射层143明显薄于附图2、3和4所示反射光盘110的基质120上的反射层142。较薄的半反射层143使询问光束152的某些透射通过附图12所示透射光盘的结构层。该薄的半反射层143可由金属构成，诸如铝或金。
附图6是附图5所示生物光盘110透射实施方式的基质120和半反射层143放大的透视图。该薄的半反射层143可由金属构成，诸如铝或金。在优选实施方式中，附图5和6所示透射光盘的薄半反射层143厚度大约为100-300，而且不超过400。这种半反射层143较薄可使部分入射或询问光束152穿透并通过半反射层143，而被顶部检测器158检测到，见附图10，同时某些光线被反射或沿着入射光程返回。如下所示，表1列出金薄膜的反射和透射特性，它与该薄膜的厚度相关。金薄膜层的厚度大于800时，它完全反射。而光透射过金薄膜的阈密度约为400。
                        表1
                 金薄膜反射和透射(绝对值)
  厚度(埃)   厚度(nm)     反射系数     透射系数
  0   0     0.0505     0.9495
  50   5     0.1683     0.7709
  100   10     0.3981     0.5169
  150   15     0.5873     0.3264
  200   20     0.7142     0.2057
  250   25     0.7959     0.1314
  300   30     0.8488     0.0851
  350   35     0.8836     0.0557
  400   40     0.9067     0.0368
  450   45     0.9222     0.0244
  500   50     0.9328     0.0163
  550   55     0.9399     0.0109
  600   60     0.9448     0.0073
  650   65     0.9482     0.0049
  700   70     0.9505     0.0033
  750   75     0.9520     0.0022
  800   80     0.9531     0.0015
除了表1外，附图7提供了薄的半反射层143反射和透射性能反比关系的图解，此是基于金的厚度。附图7所示图中所用的反射和透射值为绝对值。
附图8是附图5和6所示透射型生物光盘110的上平面图，其透明盖部分116可露出流体沟、触发器标记126和靶区140，它们均位于该光盘的内部。
附图9是本发明透射光盘实施方式的生物光盘110放大的透视图。该光盘110显示为各层切开的一部分，以显示各成分、层、基质、涂层或膜的部分截面图。附图9显示透射光盘的格式，它具有透明盖部分116，基质120上薄的半反射层143，以及触发器标记126。触发器标记126包括不透明的材料，它置于盖的上面部分。可替代的是，触发器标记126可由透明而不反射的窗构成，它刻蚀在光盘的薄反射层143上，或者可由任何标记构成，该标记可吸收或不反射来自触发器检测器160的信号，见附图10。附图9还显示，靶区140是按照所示形状或可替代的任何所需形状标记指定的区域而形成的。可在基质120或基质120底下部分(该光盘下)的薄半反射层143上进行标记，以显示靶区140。可替代的是，可通过屏蔽技术形成靶区140，该屏蔽技术包括除了靶区140外，屏蔽整个薄半反射层143。在此实施方式中，通过将印记经丝网印制在薄半反射层143上而形成靶区140。将活性层144敷在此薄半反射层143上。在优选实施方式中，该活性层144是厚度为40-200μm的2％聚苯乙烯层。可替代的是，也可使用聚碳酸酯、金、活化玻璃、改性玻璃或改性聚苯乙烯，诸如聚苯乙烯-共-马来酸酐。另外，还可使用水凝胶。如此实施方式所述，将塑料粘合体118敷在活性层144上。此塑料粘合体118显露的部分表明切削或冲压U形形状，它们形成流体回路128。本发明生物光盘110透射实施方式的最后成分结构层是透明而不反射的盖部分116，它包括入口122和出口124。
附图10是透视方框图，它描述光组件148，产生入射光束或询问光束152的光源150，返回光束154，以及透射光束156。在附图4所示的反射生物光盘情况中，返回光束154是从该生物光盘110盖部分116的反射面146被反射。在这种生物光盘110的反射实施方式中，用底部检测器157检测反射光束154，并分析信号剂的存在与否。另一方面，在此透射生物光盘格式中，通过顶部检测器158检测透射光束156，而且也可分析信号剂的存在与否。在此透射实施方式中，光检测器可用作顶部检测器158。
附图10还显示了硬件触发器结构，它包括此光盘上的触发器标记126和触发器检测器160。反射生物光盘(附图4)和透射生物光盘(附图9)中均应用此硬件触发结构。仅在询问光束152在各自靶区140上时，此触发结构才允许处理器166收集数据。而且，在透射生物光盘系统中，还可应用软件触发器。软件触发器应用底部检测器，当询问光束152一照在各自靶区140的边缘上时，软件触发器则以信号通知处理器166收集数据。附图10还显示了驱动马达162和控制器164，它控制生物光盘110的旋转。附图10还显示了处理器166和分析器168，它们可任选地处理返回光束154和与透射生物光盘相关的透射光束156。
附图11是本发明生物光盘110反射光盘实施方式的部分横截面图。附图11显示基质120和反射层142。如上所述，反射层142可由诸如铝、金或其他适宜的反射材料构成。在此实施方式中，基质120的上表面是光滑的。附图11还显示活性层144，它敷在反射层142上。如附图11所示，除去反射层142的一块或一部分区域而在所需位置形成靶区140，或者可替代的是，在敷反射层142之前屏蔽所需区域而形成该靶区140。附图11还显示，塑料粘合体118敷在活性层144上。附图11还显示盖部分116及其结合的反射面146。因此，当将盖部分116敷在包括所需切削形状的塑料粘合体118上时，可形成流动沟130。如附图11中箭头所示，入射光束152的光程起始是从光盘110下面导向基质120。然后入射光束聚焦在邻近反射层142的一点。因为此聚焦发生在靶区140，此处没有反射层142，所以入射继续沿着光程通过活性层144，并进入流动沟130。然后入射光束152继续向上，横贯流动沟，最后入射在反射面146上。在此点，入射光束152沿着入射光程返回或反射回来，因此形成返回光束154。
附图12本发明生物光盘110透射实施方式的部分截面图。附图12显示透射光盘格式，它具有透明盖部分116和在基质120上薄的半反射层143。附图12还显示活性层144，它敷在薄的半反射层143上。在优选实施方式中，透射光盘薄的半反射层143由一种金属构成，诸如铝或金，其厚度约为100-300埃，而且不超过400埃。这种薄的半反射层143使光源150来的一部分入射或询问光束152，见附图10，穿透并向上通过该光盘，它们将被顶部检测器158检测，同时某些光线反射回去，其光程与入射光束相同，但方向相反。在这种安排中，返回或反射光束154从半反射层143反射。因此在这种方式中，返回光束154不进入流动沟130。反射光或返回光束154可根据预记录的信息磁道用于跟踪入射光束152，该信息磁道是形成在半反射层143中或其上，这些将在附图13和14中进行更详细描述。在附图12所示的光盘实施方式中，设定的靶区140可有可无。通过在基质120上薄的半反射层143上进行直接标记而形成靶区140。可应用丝网法或任何相当的方法进行这些标记。在可替代的实施方式中，不用任何物理标记来确定靶区，有效的流动沟130用作有限的靶区，其研究特征得到检查。
附图13是横切本发明生物光盘110反射光盘实施方式磁道的截面图。此图是沿着光盘的半径和流动沟进行纵切形成的。附图13包括基质120和反射层142。在此实施方式中，基质120包括一系列凹槽170。此凹槽170为螺旋形，它从该光盘的中心伸展至外缘。设计凹槽170是为了使询问光束152可沿着此光盘上的螺旋凹槽170行进。这种类型的凹槽170称为“抖动凹槽”。具有波动或波浪状侧壁的底部形成凹槽170，隆起或抬起的部分将螺旋状的相邻凹槽170分隔开。在此实施方式中反射层142敷在凹槽170上，如图所示，反射层实际上是保角的。附图13还显示活性层144敷在反射层142上。如附图13所示，在所需部位除去一块或一部分反射层142而形成靶区140，或者在敷反射层142之前就屏蔽所需区域而形成靶区140。附图13还显示，塑料粘合体118敷在活性层144上。附图13还显示盖部分116及其相联的反射面146。因此，当将盖部分116敷在包括所需切削形状的塑料粘合体118上时，就形成流动沟130。
附图14是通过本发明生物光盘110透射光盘实施方式磁道的截面图，如附图12所示。此图是沿着光盘的半径和流动沟进行纵切形成的。附图14显示基质120和薄半反射层143。这种薄半反射层143使光源150来的入射或询问光束152穿透通过该光盘，并被顶部检测器158检测，同时某些光线以返回光束154的形式反射回去。通过最小量的反射光确定该薄半反射层143的厚度，此反射光是光盘读取器所需要的，以保持其跟踪能力。此实施方式中的基质120象附图13中所述一样，包括一系列凹槽170。此实施方式中的凹槽170也优选为螺旋形式，它从光盘的中心附近伸展至外缘。设计凹槽170是为了使询问光束152可沿着此螺旋行进。附图14还显示了活性层144，它敷在薄半反射层143上。附图14还显示，塑料粘合体118敷在活性层144上。附图14还显示盖部分116，它没有反射面146。因此，当此盖敷在包括所需切削形状的塑料粘合体118上时，则形成流动沟130，而且在基本上不反射的情况下允许一部分入射光束152通过。
附图15与附图11类似，它显示反射光盘的总厚度及其起始折射性能。附图16与附图12类似，它显示透射光盘的总厚度及其起始折射性能。附图15和16中看不到凹槽170，因为这些截面是沿着凹槽170切的。附图15和16显示存在狭窄的流动沟130，它在这些实施方式中与凹槽170垂直。附图13、14、15和16显示各个反射和透射光盘的总厚度。在这些特征中，显示出入射光束152起始与具有折射性能的基质120相互作用，如图所示基质120改变入射光束的光程，使该光束152聚焦在反射层142上或者薄半反射层143上。
从全血中分离研究细胞
附图17形象化的流程图显示血样的制备分析，以应用上述生物光盘系统进行簇指定(CD)标记测定。在步骤1中，将血液(4-8ml)直接采集至4或8ml Becton Dickinson CPT VacutainerTM及抗凝剂中，此抗凝剂诸如EDTA、酸性枸橼酸盐葡萄糖(ACD)或肝素。本发明另一种实施方式相当的步骤中，将抗凝剂中3ml血液叠加至含分离梯度176的试管172中，此分离梯度176诸如为Histopaque-1077(Sigma Diagnostics，St.Louis，密苏里州)。不管怎样，优选在采集的2小时内使用血样174。室温下，在防生物危害离心机中以1500-1800RCF(2800rpm)，将叠加了血样174的含分离梯度176的试管172离心25分钟，此离心机带有水平马达和摆桶。离心后，除去血浆层178(步骤2)，在单个核细胞(MNC)部分180上留下大约2mm血浆。收集MNC层180，用磷酸缓冲盐水(PBS)冲洗。在室温下以300RCF(1200rpm)离心10分钟，除去残留的血小板，使细胞成团。除去上清液，通过轻轻敲打试管使MNC团180再悬浮在PBS中。用PBS再悬浮最后的细胞团180(步骤3)，并稀释，根据生物光盘110流动沟130的厚度使细胞计数达10000-30000/μl。可替代的是，应用生物活性剂可从全血中分离T淋巴细胞，此生物活性剂可使不需要细胞凝集和沉淀。生物活性剂的非限制性实例为PrepaCyte(BioE，St.Paul，明尼苏达州)。PrepaCyte通过选择性地除去粒细胞、血小板、单核细胞、B细胞(达80％)、自然杀伤(NK)细胞(达80％)，可从全血中分离T淋巴细胞。分离T淋巴细胞方法应用于基于光盘的细胞测定，与这些方法相关的其他方面的更多详细描述，例如公开于共同转让的美国临时专利申请No.60/382,327，名称为“Methods for Isolationof Lymphocytes for Use in Differential Cell Counting and Useof Optical Bio-disc for Performing Same”，它提交于2002年5月22日，将它整个附在这里作为参考。
细胞鉴别、检测和定量
借助涂敷单一抗体的表面进行细胞捕捉，这(几乎)导致含有这种特定标记的所有细胞被捕捉。如果目标是捕捉特殊的细胞类型，例如T辅助细胞，那么应用单一标记可能是不够的。因此诸如流式细胞术的技术应用多种标记，而且含有所有选择标记的细胞才被计数。T辅助细胞和单核细胞均带有CD4抗体，因此通过第二种标记来区分它们，此第二种标记诸如为CD3(只有CD4细胞含有)或CD19(只有单核细胞含有)。这给应用单一抗体进行表面捕捉的方法带来特有的难题，因为可能无法避免捕捉到单核细胞。
尽管避免次级细胞群与抗体涂敷表面结合可能是困难的，但通过用与第二种抗体结合的信号剂可对它们进行标记，由此可区别它们。例如，这种信号剂可为小珠或染料，它吸收预定波长的光。此预定波长优选为光盘读取器112的入射光束152的波长，或其附近的波长。因此，尽管两种细胞群都被捕捉在生物光盘的表面上，但是可通过上面附图10所述的测定系统对它们进行鉴别。
作为实例，将CD4抗体沉积在盘110表面上。它正常情况下捕捉CD4+单核细胞和CD4+T辅助细胞两种亚群。但是，在标本制备过程中，引入IR吸收小珠，它涂敷了CD19抗体，这样造成这些小珠涂在单核细胞上，因为单核细胞是CD19+细胞，而T辅助细胞不是。这样有两种作用。第一，通过位阻，它减小了单核细胞与CD4捕捉区结合的可能性。第二，结合在盘捕捉区上的其余单核细胞对于IR激光束来说，它比CD4+T辅助细胞更暗，因此可在单核细胞和T辅助细胞间进行鉴别。
特别是，当应用硬件计数(根据应用阈值的S曲线识别)通过本发明生物光盘系统进行计数时，所得单核细胞吸收应当足以将它们的S曲线振幅降低至此阈值以下。同样，如果用IR染料鉴别此单核细胞，则它们较暗，而且可被单独计数。关于硬件计数软件和S曲线识别的详细描述公开于共同转让同时待审和相关的美国临时专利申请No.60/356,982、60/372,007和60/408,227，它们的名称为“Bio-Disc andBio-Drive Analyser System Including Methods Relating Thereto”，分别提交于2002年2月13日、2002年4月11日和2002年9月4日。将它们整个附在这里作为参考，即使完全重复。
可应用双标记的这些方法，即将可辨别的目标或物质粘附在细胞表面，或者涂敷这些细胞表面以减小上述结合可能性，这些方法可与许多类型的细胞测定系统联合使用。例如，CD8抗体捕捉NK细胞，可用CD56标记此NK细胞(在此情况下，它是非独有的)；或者可对粒细胞进行特殊标记，以便在涂敷CD45抗体的捕捉区或靶区140将它们与淋巴细胞区分开。不需要应用染料，这样仅涂敷相关的细胞：它们还可被非特异性地吸收至细胞内部结构中，诸如细胞核。如果通过固定法使它们稳定，并以已知的浓度将它们预混合在标本中，则这些细胞可用作捕捉区上的校准器单元。
原则上也可应用多重标记。例如，一种信号剂可为特异抗体上的染料，该抗体与细胞上的标记结合。第二种信号剂可为另一种特异抗体上的微粒或小珠，该抗体可与另一种标记结合。如果存在第二种标记，这些小珠将与细胞结合，而且阻止该细胞与捕捉区的捕捉剂结合。如果仅具有第一种标记，那么这些细胞发生结合，但可与细胞上的单个标记区分开。
阳性鉴别也是可能的。例如，当用本发明光盘读取器成像时，粘附IR小珠的细胞或者用IR染料染色的细胞暗于其他细胞，这些细胞可直接被计数。例如，用于即时细胞计数的分离式检测器配置中，可应用合计信号(A+B)检测较暗细胞，而不是应用差信号(A-B)。涉及用于即时细胞计数的分离式检测器和S曲线识别的详细描述公开于共同转让同时待审的美国专利申请No.10/279,677，其名称为“Segmented Area Detector for Biodrive and Methods RelatingThereto”，提交于2002年10月24日，将其整个附在这里作为参考。下面对应用多重细胞标记，从含有不同类型细胞的标本中鉴别一种或多种细胞作进一步详细描述。
应用微粒鉴别和分离靶细胞
应用上述光盘系统，通过成像分析确定淋巴细胞亚群的免疫表型和定量，可能需要次级闸门或参数，以提高细胞鉴别的准确度。本发明涉及应用指示器或信号剂，它们诸如为物理性质不同的小珠或微粒，具有或不具有功能化表面，它可与至少一种信号抗体缀合，该信号抗体可与靶细胞或不需要细胞特异性结合，由此形成珠-细胞复合物，该复合物可被光盘读取器检测到。此信号抗体可通过交联剂与指示器或信号剂缀合。交联剂包括受体-配体相互作用或者结合剂-亲和剂相互作用。例如，结合剂可为链酶亲和素或中性链亲和素。例如，亲和剂可为生物素。可替代的是，本领域专业技术人员都会清楚具有改性功能化表面的小珠可用于将信号抗体共价缀合到小珠表面上，并促使该小珠或指示器剂紧密粘附于研究细胞。还可能应用不同物理性质的小珠分离和/或鉴别靶细胞，这些物理性质诸如为大小、颜色、纹理、反射性、吸光率、质量、荧光性、磷光和/或磁性。此过程可通过不同的特征更好地鉴别靶细胞，此不同的特征至少是粘附于该细胞表面的一种类型指示剂或小珠，下面将结合附图20A和20B对这些进行描述。
两种或多种特异细胞类型在细胞膜上具有与其他亚群或细胞类型相同的抗原表位，诸如T细胞和单核细胞在细胞膜上具有CD4抗原，所有成熟T细胞上具有CD3，以及所有白细胞上具有CD45，此时则发生错误。这样导致仅靠应用共同捕捉抗体，而未应用标记或标志以及未应用测定细胞形态学和大小的能力来鉴别细胞类型出现困难，此捕捉抗体诸如为抗CD4或抗CD5。
如下所述，通过将小珠用作指示剂标记细胞，可以将靶CD4+T细胞与不需要的CD+单核细胞鉴别开，它们是用抗CD4抗体捕捉剂捕捉的。通过标志或标记单核细胞上的抗原性表位，而不是CD4表位，可达到此目的。例如，可用粘附CD14抗体的小珠标记单核细胞，此CD14抗体对于单核细胞来说是特异性的。一旦用抗CD14小珠标记这些单核细胞，则可用生物光盘系统进行成像分析，将一种或多种小珠与其CD14表面抗原结合的CD4+单核细胞(如以下描述的图23)与无小珠的CD4+T细胞鉴别开，这是因为在CD4+T细胞表面没有CD14抗原。因此，如附图18所示，可鉴别MNC或血样中的CD4 T细胞和单核细胞。
附图18显示了淋巴细胞200和单核细胞202，它们的表面上均具有CD4抗原。单核细胞表面上还具有CD14抗原，而淋巴细胞没有。因此，通过应用粘附信号抗体206的小珠204对单核细胞进行标记，可将其与淋巴细胞鉴别开，此处信号抗体206为抗CD14抗体。此小珠优选足够大，以便可被光盘读取器112的询问光束152(附图10)检测到，但小于所标记的细胞。此小珠直径大小优选约为0.5-5μm。因此当将指示器复合物208置于含有CD4+淋巴细胞200和CD4+单核细胞202的细胞悬浮液中时，指示器复合物208仅与单核细胞202结合。当将这些CD4+细胞捕捉在粘附抗CD4捕捉抗体的捕捉位点140上，并用光盘读取器112(附图1)分析时，可通过所得特征扫描图鉴别这些细胞，下面结合附图23A和23B对此进行描述。
附图19显示了本发明的实施方式，该实施方式描述应用小珠分离或除去血样中不需要细胞。应用小珠封阻不需要细胞表面的抗原，以此阻止这些封阻细胞与光盘上的捕捉探针结合，通过这样除去不需要细胞或污染细胞。在附图19所示的实施例中，处理标本210，以便进行分析，该标本中含有各种类型的细胞212，包括CD4+细胞、CD8+细胞和自然杀伤(NK)细胞。所有这些细胞212在其表面均具有CD3标记。CD4+和CD8+细胞是所研究的靶细胞216，而NK细胞214是不需要细胞。应用共同抗体抗CD3捕捉靶细胞。NK细胞在其表面含有CD56抗原，而标本中的其他细胞没有。如图所示，将抗体涂敷小珠208与标本210混合。此小珠208涂敷了抗CD56抗体。然后将小珠208与NK细胞214表面的CD56抗原结合，花结或包绕NK细胞。然后将含有CD4+、CD8+和花结的NK细胞214的测定溶液装入所述生物光盘110的流体室130中。然后CD4+和CD8+靶细胞216与光盘表面的抗CD3捕捉剂217结合。NK细胞214表面的小珠通过封阻NK细胞上的CD3抗原表位，而阻止NK细胞214与抗CD3捕捉抗体217结合。然后按照所述可通过冲洗或离心除去未结合的NK细胞。然后应用生物光盘系统(附图10)分析已捕捉的细胞，即扫描通过靶区的入射光束152(附图10)，该入射光束与捕捉细胞相互作用，并分析返回光束154，以确定标本中靶细胞的相对量。可替代的是，如果使用透射型光盘，那么分析该透射光束156(附图10)可确定捕捉细胞的数目。附图19所示的生物光盘包括上面附图2至9所述的光盘成分，它们包括流动沟130、盖部分116、反射面156、粘合体118、活性层144、反射层142和基质120。如上所述，也可使用透射型生物光盘(附图8和9)，其中除去反射层146，而层142是半反射性的，它可使入射光束152通过该光盘，如附图10、12和16所述，应用顶部检测器158可对透射光束156进行检测和分析。
在上面附图19所述方法的替代实施方式中，将更大、更重和/或磁性小珠粘附在不需要细胞上。例如，靶细胞可为CD4+T细胞，而不需要细胞为CD4+单核细胞。此实施例中所用的捕捉抗体可为抗CD4抗原。因为这两种类型的细胞在其细胞表面均具有CD4抗原，而单核细胞具有特有的CD14表面标记，所以应用磁性小珠可从标本中除去单核细胞，此磁性小珠的质量大于相同大小且涂敷抗CD14抗体的非磁性小珠。质量越大，通过离心可越容易除去不需要的小珠。在将标本装入光盘之前或之后，可将这些小珠与标本溶液混合。然后使这些小珠与单核细胞上的表面CD14抗原结合。因为磁性颗粒相对较重，应用生物光盘驱动器112，通过离心可将这些单核细胞从研究细胞中分离出来，或者结合磁性分离器或磁光光盘系统，应用小珠的磁性分离这些单核细胞。例如，与磁光光盘系统相关的其他方面的详细描述公开于共同转让同时待审的美国专利申请No.10/099,256，名称为“Dual BeadAssays Using Cleavable Spacers and/or Ligation to ImproveSpecificity and Sensitivity Including Related Methods andApparatus”，提交于2002年3月14日；美国专利申请No.10/099,266，名称为“Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methodsto Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and RelatedBio-Discs，Methods，and System Apparatus for Detecting MedicalTargets”，提交于2002年3月14日；和美国专利申请No.10/307,263，名称为“Magneto-Optical Bio-Discs and Systems Including RelatedMethods”，提交于2002年11月27日，将它们整个附在这里作为参考。
接着附图20A和20B显示了本发明一种可替代实施方式的非限制性实施例，它是与附图19结合起来描述的。在此实施方式中，应用具有不同物理性质的小珠，通过共同表面标记，鉴别一种或多种靶区或捕捉区中捕捉的不同细胞类型。如附图20A所示，应用移液器218，将含有研究细胞216的标本210装入生物光盘110。在此实施例中，白细胞是研究细胞，它们可被光盘表面上的抗CD45捕捉抗体217捕捉。捕捉抗体217与共同CD45白细胞表面抗原结合。按照附图20B，然后用移液器218，将不同组的小珠220装入光盘110中。每组小珠具有不同物理特性和粘附其上的不同抗体，优选可用光盘读取器112鉴别其物理特性。粘附于每组小珠的抗体与研究细胞上的特异抗原具有亲和力，例如一组透明小珠221具有标记淋巴细胞224的CD3、CD19或CD56的抗体，一组不透明小珠223具有粘附其上以标记单核细胞222的CD14的抗体，以及一组半透明小珠225具有标记嗜酸性粒细胞226的CD116的抗体。给予足够时间使小珠与它们各自靶细胞结合，然后通过离心或冲洗将未结合小珠227除去。然后应用光盘读取器，根据结合其上小珠的物理特性，可对不同类型细胞进行定量。因为在此实施例中应用透射型光盘，按照所述，应用生物光盘系统(附图10)分析小珠-细胞复合物，其过程是，扫描穿过靶区的与小珠-细胞复合物相互作用的入射光束152(附图10)；应用光检测器检测透射光束156；分析被检测光束，确定标本中各种类型靶细胞的相对量。在上述分析中也可应用反射型光盘。
可替代的是，一组或多组小珠或指示器可与同一类型细胞上的不同表面抗原结合。然后通过测定这些细胞上是否结合一种或多种类型指示器，而对这类细胞进行定量，并与其他类型细胞进行鉴别。因为鉴别单一类型细胞应用了多种参数，所以这样为检测增加了特异性。与应用光盘检测和定量不同类型细胞的方法相关的其他方面的详细描述，例如公开于共同转让的美国临时专利申请No.60/382,944，名称为“Methods and Apparatus for Use in Detection and Quantitationof Cell Populations and Use of Optical Bio-Disc for PerformingSame”，提交于2002年5月24日，将它整个附在这里作为参考。
还可应用微粒或小珠标志或标记组织细胞及诸如病毒和细菌等微生物，以便于鉴别、分类和定量。附图21的实施例显示应用捕捉小珠204标记大肠杆菌234，该捕捉小珠204具有至少一种生物素232和缀合其上的捕捉抗体206。抗体206对大肠杆菌上的抗原具有特异亲和力。如图所述，当将这些小珠与含有大肠杆菌的标本混合时，则形成小珠-细菌复合物237。然后应用链酶亲和素236，将复合物237和未结合小珠204捕捉在光盘的捕捉区上。然后按照上面所述分析小珠-细菌复合物是否存在及其量。
下一个附图是附图22，它显示应用具有抗体的小珠标记不需要细胞，该抗体与不需要细胞上的抗原具有亲和力。因此不标记靶细胞，而用上述生物光盘系统对它们进行分离或定量。
附图23A是结合在小珠-细胞复合物中的1微米指示器小珠和5微米细胞的图解，该复合物对着本发明生物光盘的A-E磁道。
下面附图23B显示A-E磁道的一系列特征扫描图，它们是应用本发明光盘驱动器的检测信号而由附图23A的小珠和细胞形成。这些图形代表所检测的透射光束156。如图所示，1微米指示器小珠190的特征与5微米细胞192的特征明显不同，以致于可检测小珠-细胞复合物，并将它与单个细胞区分开。当所检测返回光束通过小珠或细胞时，扫描信号明显偏离该返回光束被称为一个事件。来自这些指示器和细胞比较接近的事件表明小珠-细胞复合物的存在与否。如图所示，这些指示器和细胞的扫描图彼此相似，表明它们是在一个复合物中。
可替代的是，可使用其他检测方法，以鉴别和定量细胞悬浮液中的不同类型细胞。例如，指示器小珠可是荧光或磷光的。可在荧光或磷光型光盘读取器中进行这些指示器的检测。例如，其他信号检测方法描述于共同转让同时待审的美国专利申请No.10/008,156，名称为“Disc Drive System and Methods for Use with Bio-Discs”，提交于2001年11月9日，特意将其附在这里作为参考；2001年2月20日提交的美国临时申请Nos.60/270,095和2001年5月18日提交的美国临时申请Nos.60/292,108；以及上面提到的美国专利申请No.10/043,688，名称为“Optical Disc Analysis System IncludingRelated Methods For Biological and Medical Imaging”，提交于2002年1月10日。
附图24显示未粘附小珠238、单个细胞240和小珠-细胞复合物242的显微照片。在此实验中所用的小珠是4.5μm磁性小珠，它涂敷了抗CD2抗体。因此用这些小珠标志或标记具有CD2抗原的细胞，形成小珠-细胞复合物，而非CD2+细胞仍保持为单个细胞。下面结合实施例8对此实验进行详细描述。
应用不溶解酶产物鉴别靶细胞
附图25A和25B显示本发明方法的另一种实施方式的图解，该实施方式是应用酶反应的可检测沉淀物，将不需要细胞与靶细胞鉴别开。附图25显示流体回路130内靶区140的放大图。对于本公开，本领域专业技术人员将会清楚地认识到，不论是反射型光盘还是透射型光盘都可用于此分析。在附图25A和25B所示的实施例中，将CD4捕捉抗体244沉积在生物光盘110的靶区或捕捉区140上(步骤I)。在下一步的步骤II中，将含有单个核细胞(MNC)的标本引入靶区。然后含有CD4表面抗原的细胞在此靶区将与CD4捕捉抗体244结合。这些细胞包括CD4+T细胞和单核细胞。然后按照上面附图19-21所述，将未结合细胞冲洗掉，或者离心出靶区。如步骤III所示，除去未结合细胞后，将含有酶248的溶液引入靶区，其中此酶与CD14抗体246缀合。如图所示，因为只有单核细胞含有CD14抗原，所以缀合抗体的酶只与结合于靶区的单核细胞结合。然后冲洗此靶区，除去未结合酶或指示剂，并在步骤IV中将酶底物引入此靶区。一旦此底物与酶接触，则发生酶-底物反应250，该反应产生可检测的产物252，如步骤V所示。此可检测产物252优选为不溶解产物，它在细胞表面形成沉淀物254，如步骤VI所示。然后用电磁射线256的询问光束扫描靶区，而且根据所用光盘类型，分析返回光束或透射光束，以确定沉淀物标志细胞是否存在。然后对标志或标记细胞以及未标志或未标记细胞进行定量。如附图25B所示，这需要进行CD4+T细胞和单核细胞的特异性检测、鉴别和定量。可用于此实施方式的酶包括，但不限于辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。例如，可与这些酶结合使用的底物可选自TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)、DAB(3，3′-二氨基联苯胺)、ABTS(2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)、NBT(氮蓝四唑)、CN/DAB(4-氯萘酚/3，3′-二氨基联苯胺，四氢氯化物)、(4-CN)4-氯-1-萘酚和其他相容的底物，这些底物可使酶发生催化反应，而产生可被光盘读取器检测的产物。实验详细描述
虽然通过附图已对本发明进行了详细地描述，但在下面仍用某些实施例对本发明做进一步描述。
                      实施例1
附图17显示标本制备、生物光盘应用和提供结果的流程图。下面实施例的细节，诸如处理步骤的单个持续时间、旋转速率及其它细节，都比附图17所述更为特别。然而，本实施例的基本步骤与上面所述类似。
A.包括基质制备和化学物质沉积的光盘生产
在此实施例中，用空气喷枪除去所有尘粒，而清洁反射光盘或透射光盘基质120(分别为附图2和5)。应用旋转涂布器，用异丙醇将该光盘清洗两遍。将2％聚苯乙烯旋转涂敷在光盘上，获得整体都很厚的涂层。
然后沉积化学物质。一种实施方式包括三步沉积方案，它孵育：链酶亲和素，孵育30分钟；b生物素化的第一种抗体，孵育60分钟；以及第二种捕捉抗体，孵育30分钟。可在第一种物种(例如羊)中产生第一种抗体，它是针对于第二种物种(例如小鼠)的免疫球蛋白(例如IgG、IgE、IgM)。在第二种物种中产生第二种捕捉抗体，它针对于特异性细胞表面抗原(例如CD4、CD8)。在室温下的潮湿室中进行这些步骤，并在沉积之间应用冲洗和干燥步骤。
将1μl含链酶亲和素的磷酸缓冲盐水，其比率为1mg/ml，加在每个窗口上，并孵育30分钟。用蒸馏水将多余的链酶亲和素冲洗掉，并干燥光盘。结合等量生物素化的抗小鼠IgG(在PBS中，浓度125μg/ml)和活化右旋糖酐醛(200μg/ml)。将右旋糖酐醛(DCHO)-生物素化抗小鼠IgG加在每个捕捉窗口的链酶亲和素上，并在冰箱中孵育60分钟或过夜。冲洗掉多余的试剂，旋转干燥此光盘。
B.光盘装配
装配该光盘，它使用粘合层，此粘合层厚度例如可为25、50或100微米(附图2和5中的沟层118)，并具有冲压部分，诸如U形或“e-rad”沟以产生流体沟；还使用透明盖116(附图5，用于具有顶部检测器的透射光盘)或者具有反射层142的盖116，此反射层位于捕捉区上(附图2，用于具有底部检测器的反射光盘)。
在一种实施方式中，该光盘为前向抖动装置FDL21：13707或FDL21：1270 CD-R盘，它涂敷了300nm金作为编码信息层。在反射光盘上，通过已知的平版印刷技术，在反射层上蚀刻出椭圆形观察窗，大小为2×1mm。在某些透射光盘的设计中，未蚀刻出单独的观察窗，而且整个光盘都是可利用的。在这种特殊的实施例中，由Fraylock粘合剂DBL 201 Rev C 3M94661形成沟层。此盖为透明光盘，它具有48个标本入口，每个入口的直径为0.040英寸，等距排列在26mm的半径上。应用CD4/CD8计数软件扫描和读取数据盘，速度为4X，抽样率为2.67MHz。
C.光盘漏检
因为分析的是血液，所以可对该光盘进行漏检，首先确保原位带有标本的光盘在旋转过程中没有一个室被漏掉。用封阻剂填充每个沟，此封阻剂诸如为StabilGuard和PBS-Tween。封阻持续至少1小时。光盘以5000rpm旋转5分钟，以进行漏检和检查光盘稳定性。漏检后，将光盘置于真空室中24小时。真空放置24小时后，将光盘放在真空袋中，并在使用前一直贮存在冰箱中。
D.标本采集、制备和应用于光盘
下面涉及标本处理步骤，它们一般显示在附图17A中。例如应用Becton Dickinson CPT Vacutainer，通过密度梯度离心方法纯化单个核细胞(MNC)。直接将血液(4-8ml)采集至4或8ml含EDTA的CPT Vacutainer中。室温下，在防生物危害的离心机中，以1500-1800×g，将这些试管离心25分钟，该离心机具有水平马达和吊桶。优选在采集的2小时内使用血液。离心后，除去单个核细胞部分上的血浆，在MNC层上仅保留约2mm血浆。收集MNC，并用PBS冲洗。室温下以300×g将细胞离心10分钟，使其成团。除去上清液，通过轻拍试管将含有MNC的小团再悬浮于PBS中。室温下以300×g再进行一次冲洗，持续10分钟，以除去血小板。再悬浮最终的细胞团，使细胞计数为10000个/μl。将18μl MNC引入一个或多个分析室或沟，在室温下孵育15分钟，该光盘保持静止。封闭这些沟。然后用光盘驱动器以3000rpm将光盘旋转3-4分钟。优选在4X速度和2.67MHz的抽样率下用软件扫描读取该光盘。
如果不能立即处理血样，那么将CPT试管轻轻颠倒数次，则可将第一次离心后的单个核细胞再悬浮于血浆中，而且可将它在室温下贮存达24小时。在24小时内，可按照上述方法收集血浆中的细胞，并进行冲洗。
E.CD4/CD8测定格式
本实施例的测定法是同属固体均相细胞捕捉测定法，它用于血样中CD4+和CD8+T淋巴细胞群的绝对数和CD4+和CD8+淋巴细胞比率的快速测定。该试验是在包含于CD-ROM的小室内进行的，此试验测定7μl单个核细胞(MNC)中被捕捉区的特异性抗体捕捉的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+和CD45+的细胞数，此单核细胞是从全血中分离的。此试验依据的原理是光盘上特殊位置的定位细胞捕捉。通过捕捉化学物质的定位应用，在光盘上建立几种特异性细胞捕捉区，这些捕捉化学物质的定位应用基于特殊血细胞表面抗原的单克隆抗体或多克隆抗体。一旦将MNC血液(30000个/μl)充满小室，表达CD4、CD8、CD2、CD3和CD45抗原的细胞则被捕捉在该光盘的捕捉区中。还在条形码内加入规定的阴性对照区。
F.盘上分析
将上面步骤D中制备的MNC细胞(18μl，于PBS中)注射入光盘室中，并封闭此室的入口和出口。在室温下将该光盘孵育15分钟，然后用光驱中的780nm激光进行扫描，并用顶部检测器对上述捕捉区进行成像。
编码在光盘上的软件可指令驱动器自动执行下列过程：(a)离心光盘，旋转除去一个或多个阶段的过量未结合细胞，(b)成像特异性捕捉窗口，和(c)处理数据，包括对每个捕捉区的特异性捕捉细胞进行计数和产生CD4/CD8的比率(或者通过程序确定此比率)。
在处理步骤中，该软件读取每个捕捉区的影像，并在遇到细胞时对它们进行标记。例如，测定CD4+和CD8+细胞的数目后，该软件计算CD4+/CD8+细胞的比率，并显示CD4+、CD8+、CD3+和CD45+捕捉区中每微升全血的细胞绝对数和CD4+/CD8+比率。从把光盘插入光驱到获得计数和比率，整个过程的时间约为12分钟。
G.所用试剂
链酶亲和素(Sigma，cat.# S-4762)：加入去离子水，形成5mg/ml溶液，等分并贮存在-30℃。使用时，加入Tris缓冲液，使终浓度为1mg/ml。
阳性对照品：CD45(Sigma，Lot # 038H4892，cat # C7556)。贮存于2-8℃。
次级捕捉抗体：生物素化抗小鼠IgG(产生于羊，Vectorlaboratories，lot # L0602，Catalog # BA-9200)原液1.5mg/ml，它在蒸馏水中制备。0.1M PBS中的b-IgG工作液125μg/ml。贮存于2-8℃。在-30℃可长期贮存。
活化右旋糖酐醛(Pierce，lot # 97111761，cat # 1856167)。PBS中的原液5mg/ml，贮存于2-8℃。
初级捕捉抗体：CD4(DAKO，cat # M0716)、CD8(DAKO，cat #M0707)、CD2(DAKO，cat # M720)、CD45(DAKO，cat # M0701)、CD14(DAKO，cat # M825)和CD3(DAKO，# M7193)。贮存于2-8℃。
阴性对照品：小鼠IgG1(DAKO，cat # X0931)。贮存于2-8℃。
磷酸缓冲盐水(PBS)，pH7.4(Life Technologies/GIBCO BRL，cat.# 10010-023)或者同等物。贮存于室温。
异丙醇，90-100％。
H.RBC溶解方案
氯化铵溶解缓冲液
应当将1x氯化铵溶解缓冲液的原料贮存于2-8℃。它由0.155MNH4Cl、10mM KHCO3和0.1mM乙二胺四乙酸二钠组成；pH7.3-7.4。贮存于2-8℃。使用前再取至室温下。
步骤
1、在每100μl血液中加入2ml溶解缓冲液(优选在防生物危害的通风橱中进行此步骤)。
2、在室温下涡动和孵育15分钟。
3、应用防生物危害通风橱中的离心机，在室温下以500×g将血液离心5分钟。
4、除去上清液，用含2％FCS或FBS的PBS冲洗细胞。离心细胞。
5、计算白细胞总数，使WBC终浓度为10000个/μl，以用于标本注射。
                       实施例2
                 单个核细胞分离步骤
应用Becton & Dickinson Vacutainer CPT(4ml的BD目录#362760，8ml的BD目录# 362761)细胞制备试管，它含有枸橼酸钠。按照所有防生物危害预防措施，在防生物危害通风橱中完成这些步骤。步骤如下：
1、将血液直接采集至4或8ml含EDTA的CPT Vacutainer中。如果血样已经是抗凝的，则首先倒掉Vacutainer中的EDTA，然后再将6-8ml血样倒入CPT试管中。
2、室温下，在防生物危害离心机中以1500-1800×g将此试管离心25分钟，此离心机具有水平马达和吊桶。为了获得最好的结果，应当在采集的两小时内离心血液。而离心晚于2小时的血液，可使MNC数目减少，RBC污染增多。
3、离心后，保留MNC层上约2mm的血浆，其他除去。收集，并将发白的单个核细胞层转移至15ml锥形离心试管中。
4、将10-15mlPBS加入MNC层中，通过颠倒离心试管数次，轻轻混合这些细胞。
5、室温下在防生物危害离心机中以200×g进行离心10分钟，以此冲洗细胞。
6、除去上清液。轻拍试管而再悬浮这些细胞。
7、在10ml PBS中再冲洗一遍。室温下以200-300×g离心10分钟，以除去血小板。
8、除去上清液，将小团再悬浮在50μl PBS中。
9、测定该标本中的细胞计数。进行CBC，或者将2μl细胞稀释至18μl台盼蓝，轻轻混合，并应用血细胞计数器进行细胞计数。使标本的终细胞计数为10000个/μl，以进行分析。
10、如果不能立即处理细胞，则通过将CPT试管轻轻颠倒数次，而将第一次离心后(上面步骤2)的单个核细胞再悬浮于分离血浆中，室温下贮存至多24小时。24小时内，收集血浆中的细胞，如上所述继续进行冲洗。
总细胞计数/μl＝25小平方中的细胞数目×100。
                      实施例3
         应用Histopaque-1077分离全血中的MNC
将1ml Histopaque-1077放在15ml离心试管中，轻轻地将1ml全血放在其上。然后室温下以400×g离心30分钟。用巴氏滴管(pasture pipette)小心地抽吸混合物，并将不透明界面转移至离心试管中。然后，将10ml PBS加入离心试管中。然后以250×g将此溶液离心10分钟。倒出上清液，将细胞团再悬浮于10.0ml PBS中，并以250×g将其旋转10分钟。然后将小团再悬浮于10ml PBS中，并以250×g进行旋转，以此将细胞再冲洗一遍。将终细胞团再悬浮于0.5ml PBS中。
                      实施例4
              用Dynal小珠分离CD4+细胞
A.材料
1、冷PBS/2％FBS，pH7.4
2、PBS/0.5％BSA，pH7.4
3、CD4阳性Dynal分离盒
4、Dynal MPC、Dynal混合器、离心机、聚丙烯试管
B.步骤
进行CBC，并测定每个细胞所需要的小珠数量(4-10个小珠/细胞)。将1ml冷PBS/2％FBS加入所需量的小珠中(1×107个小珠/72μl)，并再悬浮。将试管放在Dynal MPC中30秒，移去上清液。将冲洗的小珠再悬浮至起始容积。将所需量的小珠加入细胞中。在设定为11的Dynal混合器中于2-8℃下孵育20分钟。分离Dynal MPC中的花结细胞2分钟。移去上清液。在PBS/2％FBS中将这些花结细胞冲洗4遍。在200-400μl PBS/2％FBS中再悬浮此花结细胞。每100μl细胞悬浮液中加入10μl Detach-a-Bead。在设定为11的Dynal混合器中于室温下孵育60分钟。分离Dynal MPC中的小珠2分钟。转移上清液并保存。在500μl PBS/2％FBS中将小珠冲洗2-3遍，获得残余细胞。在400μl PBS/0.5％BSA中冲洗收集的细胞。
运行CBC，测定分离细胞的浓度。
                      实施例5
        光盘制备和化学物质沉积(应用链酶亲和素)
A.包括基质制备和化学物质沉积的光盘生产
在此实施例中，用空气喷枪除去尘粒，以清洁透射光盘基质。将此光盘安装在旋转涂布器中，并用稳定的异丙醇流将其清洗两遍。然后，将聚苯乙烯溶液均匀地涂敷在光盘上，该聚苯乙烯溶液是将2％聚苯乙烯溶解在310ml甲苯和65ml异丙醇中获得的。
对于链酶亲和素沉积，在PBS中将链酶亲和素原液稀释至1mg/ml。应用手工针式沉积，将约1μl链酶亲和素沉积在光盘的每个捕捉区中。在潮湿室中将光盘孵育30分钟。然后，用去离子水洗去捕捉区多余的未结合链酶亲和素，并将该光盘旋转干燥。
对于第二抗体沉积，将活化右旋糖酐醛(PBS中，200μg/ml)的新鲜溶液与等量Vector IgG(PBS中，125μg/ml)结合。应用手工针式沉积，将约1μl IgG+DCHO复合物沉积在光盘的每个捕捉区中(放置于链酶亲和素层上面)。在潮湿室中将光盘孵育60分钟。用去离子水洗去多余抗体，并将该光盘旋转干燥。
对于第一抗体，在PBS中将DAKO CD4稀释至50μg/ml，在PBS中将DAKO CD8稀释至25μg/ml，在PBS中将DAKO CD45稀释至145μg/ml。应用手工针式敷料器，将约1μl各种第一抗体沉积在结合的第二抗体上面。然后在潮湿室中将光盘孵育30分钟。用PBS冲洗捕捉区，将多余未结合的抗体除去，并将光盘旋转干燥。
B.光盘装配
所用盖光盘为透明光盘，它具有粘附其上的Fraylock粘合剂沟层。在此粘合剂上冲压出4个U形沟，它们成为流体回路。将此盖放在透射光盘基质上，使流动沟处于捕捉区上面。然后，通过光盘将它们压8遍，确保这些光盘保持在一起。
C.光盘漏检、封阻
用StableGuard填充每个流动沟，孵育1小时。在孵育期间，在旋转涂布器中以5000rpm将光盘旋转5分钟。旋转后，对光盘沟进行漏检。然后从这些沟中吸出StableGuard，并将光盘置于真空室的真空中过夜。第二天早晨，将光盘放在真空袋中，贮存于4℃下。
                   实施例6
       生物光盘CD4/CD8比率与FAC CD4/CD8比率比较
A.用CPT试管制备临床血样
将3ml临床EDTA血样(No.29、30、31、32、33、34和35)倒入单个CPT试管中，该试管中的枸橼酸钠已除去。在室温下以1500×g将这些试管离心25分钟。离心后，抽去上部血浆，即0.5cm内的不透明MNC层。将剩余不透明MNC层移至洁净15ml试管中，并在每个试管中加入12ml PBS。
冲洗
然后以250×g将细胞悬浮液离心10分钟。抽去上清液，并将细胞再悬浮于14ml PBS中。再以250×g将悬浮液离心10分钟。抽去上清液，用200-175μl PBS再悬浮每个细胞小团。用血细胞计数器对这些细胞进行计数，以此确定每个标本的细胞浓度。将每个标本的细胞终浓度调节至30000个/μl。
B.生物光盘CD4/CD8比率与FAC CD4/CD8比率比较
应用25um粘合剂沟，按照与实施例5相似的方法制备光盘(No.27a、27b、27c、27d、27e、27f和28)。
按照下面表2所示，将每个标本注射至相应的每个光盘中。30分钟后，以3000rpm将该光盘离心5分钟。然后拍摄化学区上所捕捉细胞的光学显微照片，对这些细胞进行计数。还对每个临床标本进行FAC分析。此实验的结果显示在表2中。
                     表2
    生物光盘CD4/CD8比率与FAC CD4/CD8比率比较
    盘号   标本号    光盘CD4/CD8    FAC CD4/CD8
    27a   29    2.39    2.43
    27b   30    1.47    1.67
    27c   31    0.8    0.98
    27d   32    1.84    2.16
    27e   33    0.96    1.14
    27f   34    1.59    1.49
    28   35    1.03    1.04
                     实施例7
              光盘制备和化学物质沉积
在此实施例中，用空气喷枪除去尘粒，以清洁透射光盘基质。将此光盘安装在旋转涂布器中，并用稳定的异丙醇流将其清洗两遍。然后，将聚苯乙烯溶液均匀地涂敷在光盘上，该聚苯乙烯溶液是将2％聚苯乙烯溶解在310ml甲苯和65ml异丙醇中获得的。
对于第二抗体沉积，将活化右旋糖酐醛(PBS中，200μg/ml)的新鲜溶液与等量Vector IgG(PBS中，125μg/ml)结合。应用手工针式沉积，将约1μl IgG+DCHO复合物沉积在光盘的每个捕捉区中。在潮湿室中将光盘孵育60分钟。用去离子水洗去多余抗体，并将该光盘旋转干燥。
对于第一抗体，在PBS中将DAKO CD4稀释至50μg/ml，在PBS中将DAKO CD8稀释至25μg/ml，在PBS中将DAKO CD45稀释至145μg/ml。应用手工针式敷料器，将约1μl各种第一抗体沉积在吸收的第二抗体上面。在潮湿室中孵育30分钟。用PBS洗去多余抗体，并将光盘旋转干燥。
                     实施例8
     应用涂敷抗体的小珠鉴别靶细胞和不需要细胞
在此实施例中，按照实施例3所述制备透射光盘。
A.应用铵溶解缓冲液制备临床标本
将20ml 1×氯化铵溶解缓冲液加入1ml ACD血样中。涡动此标本，在室温下将其孵育15分钟。然后，室温下以500×g将这些标本离心5分钟。然后除去上清液，并用3ml含2％BSA的PBS冲洗。然后以500×g将这些冲洗细胞离心5分钟。离心后，去除上清液，将这些细胞再悬浮于1ml含2％BAS的PBS中。此悬浮液中细胞终浓度为5500个/μl。
B.细胞标记和分析
用含0.1％BSA的PBS将小珠的原液冲洗3遍，以此制备Dynal磁性抗CD2[DynabeadsCD2(Prod No.111.02)]小珠。将72μl小珠悬浮液与上面A节中制备的细胞混合。然后在室温下将细胞/小珠悬浮液孵育20分钟，使小珠与标本中不需要的CD2+NK细胞结合。孵育后，将此悬浮液装入上面制备的光盘中。然后在室温下将含有悬浮液的光盘孵育15分钟，使标本中的CD4+细胞(T-淋巴细胞和NK细胞)与光盘捕捉区内的抗CD4捕捉剂结合。然后以1000rpm将光盘旋转5分钟，除去未结合细胞。然后拍摄捕捉区的显微照片。这些显微照片显示在附图24中。因为只有NK细胞表面具有CD2标记，所以可在捕捉区内将NK细胞242与T-淋巴细胞240鉴别开，因为如附图24所示，NK细胞242被小珠标记，而T-淋巴细胞240没有标记。
最后总结
本发明或其不同的方面可易于在许多光盘、测定和系统中实现，或者适应于这些光盘、测定和系统，它们公开于下列共同转让和同时待审的专利申请中：美国专利申请No.10/099,266，名称为“Use ofRestriction Enzymes and Other Chemical Methods to DecreaseNon-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related Bio-Discs，Methods，and System Apparatus for Detecting Medical Targets”，提交于2002年3月14日；美国专利申请No.10/121,281，名称为“Multi-Parameter Assays Including Analysis Discs and MethodsRelating Thereto”，提交于2002年4月11日；美国专利申请No.10/150,575，名称为“Variable Sampling Control for RenderingPixelization of Analysis Results in a Bio-Disc Assembly andApparatus Relating Thereto”，提交于2002年5月16日；美国专利申请No.10/150,702，名称为“Surface Assembly For ImmobilizingDNA Capture Probes in Genetic Assays Using Enzymatic Reactionsto Generate Signals in Optical Bio-Discs and Methods RelatingThereto”，提交于2002年5月16日；美国专利申请No.10/194,418，名称为“Optical Disc System and Related Detecting and DecodingMethods for Analysis of Microscopic Structures”，提交于2002年7月12日；美国专利申请No.10/194,396，名称为“Multi-PurposeOptical Analysis Disc for Conducting Assays and VariousReporting Agents for Use Therewith”，提交于2002年7月12日；美国专利申请No.10/199,973，名称为“Transmissive Optical DiscAssemblies for Performing Physical Measurements and MethodsRelating Thereto”，提交于2002年7月19日；美国专利申请No.10/201,591，名称为“Optical Analysis Disc and Related DriveAssembly for Performing Interactive Centrifugation”，提交于2002年7月22日；美国专利申请No.10/205,011，名称为“Methodand Apparatus for Bonded Fluidic Circuit for Optical Bio-Disc”，提交于2002年7月24日；美国专利申请No.10/205,005，名称为“Magnetic Assisted Detection of Magnetic Beads Using OpticalDisc Drives”，提交于2002年7月24日；美国专利申请No.10/230,959，名称为“Methods for Qualitative and QuantitativeAnalysis of Cells and Related Optical Bio-Disc Systems”，提交于2002年8月29日；美国专利申请No.10/233,322，名称为“Capture Layer Assemblies for Cellular Assays IncludingRelated Optical Analysis Discs and Methods”，提交于2002年8月30日；美国专利申请No.10/236,857，名称为“Nuclear MorphologyBased Identification and Quantification of White Blood CellTypes Using Optical Bio-Disc Systems”，提交于2002年9月6日；美国专利申请No.10/241,512，名称为“Methods for DifferentialCell Counts Including Related Apparatus and Software forPerforming Same”，提交于2002年9月11日；美国专利申请No.10/279,677，名称为“Segmented Area Detector for Biodrive andMethods RelatingThereto”，提交于2002年10月24日；美国专利申请No.10/293,214，名称为“Optical Bio-Discs and FluidicCircuits for Analysis of Cells and Methods Relating Thereto”，提交于2002年11月13日；美国专利申请No.10/298,263，名称为“Methods and Apparatus for Blood Typing with OpticalBio-Discs”，提交于2002年11月15日；美国专利申请No.10/341,326，名称为“Method and Apparatus for Visualizing Data”，提交于2003年1月13日；美国专利申请No.10/345,122，名称为“Methods and Apparatus for Extracting Data From an OpticalAnalysis Disc”，提交于2003年1月14日；美国专利申请No.10/347,155，名称为“Optical Discs Including Equi-Radial and/orSpiral Analysis Zones and Related Disc Drive Systems andMethods”，提交于2003年1月15日；美国专利申请No.10/347,119，名称为“Bio-Safe Dispenser and Optical Analysis Disc Assembly”，提交于2003年1月17日；美国专利申请No.10/348,049，名称为“Multi-Purpose Optical Analysis Disc for Conducting Assays andRelated Methods for Attaching Capture Agents”，提交于2003年1月21日；美国专利申请No.10/348,196，名称为“Processes forManufacturing Optical Analysis Discs with Molded MicrofluidicStructures and Discs Made According Thereto”，提交于2003年1月21日；美国专利申请No.10/351,604，名称为“Methods forTriggering Through Disc Grooves and Related Optical AnalysisDiscs and System”，提交于2003年1月23日；美国专利申请No.10/351,280，名称为“Bio-Safety Features for Optical AnalysisDiscs and Disc System Including Same”，提交于2003年1月23日；美国专利申请No.10/351,244，名称为“Manufacturing Processesfor Making Optical Analysis Discs Including SuccessivePatterning Operations and Optical Discs Thereby Manufactured”，提交于2003年1月24日；美国专利申请No.10/353,777，名称为“Processes for Manufacturing Optical Analysis Discs withMolded Microfluidic Structures and Discs Made AccordingThereto”，提交于2003年1月27日；美国专利申请No.10/353,839，名称为“Method and Apparatus for Logical Triggering”，提交于2003年1月28日；美国专利申请No.10/356,666，名称为“MethodsFor Synthesis of Bio-Active Nanoparticles and Nanocapsules ForUse in Optical Bio-Disc Assays and Disc Assembly IncludingSame”，提交于2003年1月30日；美国专利申请No.10/370,272，名称为“Methods and an Apparatus for Multi-Use Mapping of anOptical Bio-Disc”，提交于2003年2月19日和美国临时申请No.60/60/479,803，名称为“Fluidic Circuits for Sample PreparationIncluding Bio-Discs and Methods Relating Thereto”，提交于2003年6月19日。
将本说明书中提及的所有专利、专利申请和其他公布整个附在这里作为参考，即使完全重复。
尽管某些优选实施方式已对本发明进行了详细描述，但应当认识到不是要将本发明限制在这些明确的实施方式中。例如，除了血细胞，上述方法可用于鉴别靶细胞。其他靶可包括，但不限于病毒、组织细胞、细菌、植物细胞和微生物。更确切的说，本公开描述了实施本发明的最佳方式，借助本公开，在不违背本发明范围和精神的前提下，本领域专业技术人员可对本发明进行一些修改和改变。因此，通过下面的权利要求表明本发明的范围，而不是用前面的说明书。符合本权利要求同等含义和范围的所有变化、修改和改变均被认为符合它们的范围。

Claims (54)

1、一种在不同类型细胞中检测和定量研究细胞类型的方法，该方法包括以下步骤：
提供含有靶细胞的试验标本，该靶细胞具有共同表面标记，它包括具有第一种表面标记的第一种细胞类型和具有第二种表面标记的第二种细胞类型；
提供一种生物光盘，该生物光盘包括实质圆形的基质，它具有中心和外缘，处于中心和外缘之间的靶区，靶区内有大量捕捉抗体结合于此实质圆形的基质，以便这些大量捕捉抗体固定在靶区中，这些大量捕捉抗体与所述靶细胞共同表面标记具有亲和力；
将试验标本沉积在靶区上；
使试验标本中的靶细胞与所述大量捕捉抗体通过所述共同表面标记结合，所述靶细胞包括第一种细胞类型和第二种细胞类型；
冲洗靶区以除去未结合细胞；
提供指示剂，它具有结合其上的信号抗体，该信号抗体与第一种表面标记具有特异性亲和力；
将指示剂沉积在所述靶区上；
使所述信号抗体与靶区中第一种细胞类型的第一种表面标记结合，以此标记第一种细胞类型；
冲洗靶区以除去未结合的指示剂；
用一束电磁射线扫描所述靶区，测定经标记的第一种细胞类型细胞和未经标记的第二种细胞类型细胞的数目。
2、权利要求1的方法，其中所述指示剂为一种小珠，它具有可检测的物理性质。
3、权利要求2的方法，其中所述可检测的物理性质选自颜色、大小、纹理、反射性、吸光度、质量、荧光性、磷光性和磁性。
4、权利要求1的方法，其中所述指示剂为酶。
5、权利要求4的方法，它还包括的步骤是：将一种酶底物沉积在该靶区上，此酶底物可与所说酶反应，产生可检测的信号。
6、权利要求5的方法，其中所说酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
7、权利要求6的方法，其中酶底物选自TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)、DAB(3，3′-二氨基联苯胺)、ABTS(2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)、NBT(氮蓝四唑)、CN/DAB(4-氯萘酚/3，3′-二氨基联苯胺，四氢氯化物)、4-CN(4-氯-1-萘酚)。
8、权利要求7的方法，其中可检测信号为沉淀物，它粘附于所述第一种类型细胞。
9、一种生产生物光盘的方法，此生物光盘用于检测标本中的不同细胞类型，该方法包括以下步骤：
提供具有中心和外缘的基质；
在基质的信息层上编码信息，所编码的信息可被一种光盘驱动器组件读取以控制光盘的旋转；
在中心和外缘之间的基质上形成靶区；
在靶区中应用一种活性层；
以及在靶区内沉积大量捕捉抗体，至少某些捕捉抗体粘附于活性层，因此固定在靶区内。
10、权利要求9的方法，它还包括的步骤是：形成一种流动沟，它与靶区流体相通。
11、权利要求10的方法，其中大量捕捉抗体与不同类型细胞中的共同表面抗原具有亲和力。
12、权利要求11的方法，它还包括的步骤是：形成一种小室，它与流动沟流体相通，该小室具有入口。
13、一种应用生物光盘检测和定量一种或多种类型细胞的方法，该生物光盘是按照权利要求12生产的，此方法包括以下步骤：
通过入口将具有不同类型细胞的试验标本装入所述流动室，使试验标本与靶区内的所述大量捕捉抗体接触，所述不同类型细胞具有共同表面抗原；
使大量捕捉抗体与共同表面抗原结合，将这些不同类型细胞固定在靶区中；
以预定的速度和时间旋转生物光盘，以从靶区中除去未结合细胞；
提供至少一组信号抗体，其中每个抗体已粘附于指示剂，该指示剂对于此组是唯一的，每组信号抗体与靶区中所述不同类型细胞中的一种细胞类型具有亲和力；
通过入口将至少一组信号抗体装入流动沟中，使信号抗体与靶区内的不同类型细胞接触；
使至少一组信号抗体与其各自的细胞类型结合，由此标记各自的细胞类型；
冲洗靶区以除去未结合的信号抗体；
用一束电磁射线扫描靶区；
以及分析靶区返回的光束，由此测定未标记细胞的数目和经至少一组信号抗体所标记的细胞的数目。
14、一种检测和定量试验标本中细胞类型的方法，该标本具有不同类型的细胞，此方法包括以下步骤：
提供一种生物光盘，该光盘包括实质为圆形的基质，它具有中心和外缘，在中心和外缘之间具有靶区，大量捕捉抗体结合于靶区内的基质上，以使这些大量捕捉抗体固定在靶区上，这些大量捕捉抗体对于不同类型细胞之间的共同抗原具有亲和力；
将试验标本沉积在靶区上；
使大量捕捉抗体与共同抗原结合，致使所述不同类型细胞固定在靶区中；
冲洗靶区以除去未结合细胞；
提供至少一组信号抗体，其中每个抗体已粘附在该组独特的指示剂上，每组信号抗体对固定在靶区中的不同类型细胞中的一种具有亲和力；
使至少一组信号抗体与其各自的细胞类型结合，以此标记各自细胞类型；
冲洗靶区以除去未结合的信号抗体；
以及用一束电磁射线扫描靶区，以此测定未标记细胞的数目和经至少一组信号抗体所标记的细胞的数目。
15、一种检测标本中不同细胞类型中一种细胞类型的生物光盘，它包括：
一种实质圆形的基质，它具有中心和外缘；
一种与基质相结合的活性层；
处于中心和外缘之间的靶区；
大量捕捉抗体，它们与活性层结合，这样使所述抗体固定在靶区中的活性层上。
16、一种按照权利要求15的生物光盘，其中活性层选自硝化纤维素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯-共-马来酸酐和金。
17、一种按照权利要求16的生物光盘，其中基质包括与其联系的编码信息，该编码信息可被光盘驱动组件读取以控制该生物光盘的旋转。
18、一种按照权利要求17的生物光盘，它还包括在基质表面上形成的反射层。
19、一种按照权利要求18的生物光盘，它包括一种与靶区流体相通的流动沟和一种与流体沟流体相通的入口。
20、一种按照权利要求19的生物光盘，它包括一种酶，其中当暴露于酶底物时，该酶产生一种信号，该信号可被电磁射线的入射光束检测。
21、一种按照权利要求19的生物光盘，其中大量捕捉抗体对细胞上的共同表面标记具有亲和力。
22、一种应用权利要求21的生物光盘对研究细胞类型进行鉴别和定量的方法，该方法包括以下步骤：
提供含有研究细胞类型和非靶细胞类型的标本，这两种细胞类型均具有所说共同表面标记，非靶细胞类型还具有唯一的表面标记；
提供粘附于抗体的标记剂，它对非靶细胞类型上的唯一表面标记具有亲和力；
将标记剂与该标本混合；
使标记剂与非靶细胞类型上的所说唯一表面标记结合，以此阻断非靶细胞类型上的所说共同表面标记，防止非靶细胞类型与靶区中的大量捕捉抗体结合；
通过入口将该标本装入流动沟，使该标本与靶区中的捕捉抗体接触；
使捕捉抗体与研究细胞类型上的共同表面标记结合；
以预定的速度和时间旋转该生物光盘以除去靶区中未结合的非靶细胞；
以及用一束电磁射线扫描靶区，测定靶区中研究细胞类型的数目。
23、一种按照权利要求22的方法，其中该标本是包括淋巴细胞和单核细胞的单个核细胞。
24、一种按照权利要求23的方法，其中共同表面标记为CD4抗原。
25、一种按照权利要求24的方法，其中唯一表面标记为CD14抗原。
26、一种鉴别和定量不同细胞类型的方法，该方法应用按照权利要求12生产的生物光盘，它包括以下步骤：
提供含有不同细胞类型的标本，这些细胞类型具有所说共同表面抗原，它们包括具有第一种表面标记的第一种细胞类型、具有第二种表面标记的第二种细胞类型和具有第三种表面标记的第三种细胞类型；
通过入口将该标本装入流动沟，使该标本与靶区内的大量捕捉抗体接触；
使大量捕捉抗体与共同表面抗原结合，将这些不同细胞类型固定在靶区中；
以预定的速度和时间旋转生物光盘除去靶区中未结合的细胞；
提供含有不同类型指示剂的标记溶液，这些不同类型指示剂包括已粘附于第一种信号抗体的第一种指示剂，该信号抗体对第一种表面标记具有亲和力；已粘附于第二种信号抗体的第二种指示剂，该信号抗体对第二种表面标记具有亲和力；已粘附于第三种信号抗体的第三种指示剂，该信号抗体对第三种表面标记具有亲和力；
通过入口将该标志溶液装入流动沟中，使指示剂与固定在靶区中的细胞接触；
使第一种信号抗体与靶区中第一种细胞类型上的第一种表面标记结合，以此用第一种指示剂记记第一种细胞类型；
使第二种信号抗体与靶区中第二种细胞类型上的第二种表面标记结合，以此用第二种指示剂标记第二种细胞类型；
使第三种信号抗体与靶区中第三种细胞类型上的第三种表面标记结合，以此用第三种指示剂标记第三种细胞类型；
以预定的速度和时间旋转该生物光盘以除去靶区中未结合的指示剂；
以及用一束电磁射线扫描靶区，以此测定第一种指示剂标记的细胞数目、第二种指示剂标记的细胞数目和第三种指示剂标记的细胞数目。
27、一种按照权利要求26的方法，其中该标本为单个核细胞。
28、一种按照权利要求27的方法，其中共同表面抗原为CD45抗原。
29、一种按照权利要求28的方法，其中大量捕捉抗体为抗CD45抗体。
30、一种按照权利要求29的方法，其中第一种细胞类型为淋巴细胞。
31、一种按照权利要求30的方法，其中第一种细胞类型上的第一种表面标记选自CD3、CD19和CD56抗原。
32、一种按照权利要求31的方法，其中第一种信号抗体选自抗CD3抗体、抗CD19抗体和抗CD56抗体。
33、一种按照权利要求29的方法，其中第二种细胞类型为单核细胞。
34、一种按照权利要求33的方法，其中第二种细胞类型上的第二种表面标记为CD14抗原。
35、一种按照权利要求34的方法，其中第二种信号抗体为抗CD14抗体。
36、一种按照权利要求29的方法，其中第三种细胞类型为嗜酸粒细胞。
37、一种按照权利要求36的方法，其中第三种细胞类型上的第三种表面标记为CD116抗原。
38、一种按照权利要求37的方法，其中第三种信号抗体为抗CD116抗体。
39、一种检测和定量试验标本中靶细胞的方法，此方法包括以下步骤：
提供一种生物光盘，该光盘包括实质为圆形的基质，它具有中心和外缘，与该基质结合的活性层，在中心和外缘之间具有靶区，至少一种捕捉抗体结合于该活性层，这样使该捕捉抗体固定在靶区的活性层上，该捕捉抗体对所说靶细胞具有亲和力；
将试验标本沉积在靶区上；
使试验标本中的任何靶细胞均可与所说捕捉抗体结合；
冲洗靶区以除去未结合细胞；
提供大量信号抗体，每个信号抗体具有与结合剂结合的一种亲和剂；
使该信号抗体与具有可被信号抗体识别的抗原的任何靶细胞结合，以此标记这些靶细胞；
冲洗靶区以除去未结合的信号抗体；
提供大量指示剂，每种指示剂具有一种和多种结合剂；
使所说指示剂与靶区中结合了靶细胞的所有信号抗体结合；
冲洗靶区以除去未结合的指示剂；
以及用一束电磁射线扫描靶区，并分析返回光束，以此测定经标记的细胞和未标记的细胞的数目。
40、一种按照权利要求39的方法，其中指示剂为一种小珠，它具有可被生物光盘读取器检测的物理性能。
41、一种按照权利要求40的方法，其中物理性能选自颜色、大小、纹理、反射性、吸光率、质量、荧光性、磷光性和磁性。
42、一种按照权利要求39的方法，其中指示剂为酶。
43、一种按照权利要求42的方法，它还包括的步骤是：将至少一种酶底物沉积在靶区上，该酶底物可与所说酶反应以产生可检测的信号。
44、一种按照权利要求39的方法，其中亲和剂为生物素。
45、一种按照权利要求42的方法，其中该酶缀合有一种结合剂，该结合剂可与所说亲和剂结合。
46、一种按照权利要求45的方法，其中结合剂选自链酶亲和素和中性链亲和素。
47、一种按照权利要求42的方法，其中酶选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
48、一种按照权利要求43的方法，其中酶底物选自TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)、DAB(3，3′-二氨基联苯胺)、ABTS(2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)、NBT(氮蓝四唑)、CN/DAB(4-氯萘酚/3，3′-二氨基联苯胺，四氢氯化物)和4-CN(4-氯-1-萘酚)。
49、一种按照权利要求48的方法，其中可被检测的信号为沉淀物，它粘附于靶细胞。
50、一种按照权利要求39的方法，其中靶细胞选自白细胞、癌细胞、细菌、病毒、单细胞生物、组织的细胞和器官的细胞。
51、一种检测和定量靶细胞的方法，此方法包括以下步骤：
提供一种生物光盘，该光盘包括实质为圆形的基质，它具有中心和外缘，在中心和外缘之间具有靶区，一种亲和剂结合于靶区内的基质，这样使该亲和剂固定在靶区中；
提供含有靶细胞的标本，该靶细胞具有表面标记；
将指示剂与标本混合，该指示剂已粘附了捕捉抗体和结合剂，该捕捉抗体对表面标记具有亲和力，该结合剂对亲和剂具有亲和力；
使捕捉抗体与靶细胞上的表面标记结合，以此用指示剂标记靶细胞；
将含标记靶细胞的标本沉积在靶区上；
使粘附指示剂的结合剂与亲和剂结合，以此将靶细胞固定在靶区中；
冲洗靶区以除去未结合细胞；
以及用一束电磁射线扫描靶区，以此测定经指示剂标记的细胞的数目。
52、一种按照权利要求51的方法，其中靶细胞选自白细胞、癌细胞、细菌、病毒、单细胞生物、组织的细胞和器官的细胞。
53、一种按照权利要求52的方法，其中亲和剂为生物素。
54、一种按照权利要求52的方法，其中结合剂选自链酶亲和素和中性链亲和素。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20070926