CN101027401A - 在细胞内制备低分子量有机化合物的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备低分子量有机化合物(例如一株植物或者细菌的次级代谢物)的方法，该方法使用一个微生物细胞使产量增加，细胞中含有一个参与生物合成方法制备出低分子量有机糖苷配基化合物的基因，和一个具有使生成的糖苷配基糖基化能力的糖基转移酶基因。

Description

在细胞内制备低分子量有机化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种制备一种低分子量有机化合物(例如一种植物或者细菌次级代谢物)的方法，该方法使用一种细胞(例如一株植物或者微生物细胞)使产量增加，细胞中含有一个参与生物合成方法制备出低分子量有机糖苷配基化合物的基因，和一个具有使生成的糖苷配基糖基化能力的糖基转移酶基因。

背景技术

植物和微生物合成大量的自然界物质，尤其是细菌次级代谢物，这些物质多种多样且通常还不清楚它们的功能。与主要代谢物(例如氨基酸、糖、脂肪酸)相比较，这些主要代谢物涉及到基本功能例如新陈代谢、生长、维持和生存，对于这些基本功能次级代谢物不是必须的。众所周知，许多来自于植物的次级代谢物用做驱虫剂或者自然杀虫剂，用于防御食草动物攻击或者作为性引诱剂传递给昆虫(Grisebach，1988，In：EuropeanConference on Biotechnology，Scientific，technical and industrialchallenges，Verona，Italy，7-8 November 1998，pages 23-27)，然而真菌的次级代谢物通常作为植物毒素(Osboum，2001，Proceedings of theNational Academy of the USA 98：14187-14188)。

来自于100多种不同植物物种的不同次级代谢物被证实具有很强的抗菌活性(Cowan，1999，Clinical Microbiology Reviews 12：564-582)，并且来自于普通粮食作物的大量次级代谢物不仅是造成味到、颜色的原因，而且还被认为具有促进健康活性(Eastwood，2001，Quarterly Journalof Medicine 94：45-48：Drewnowski & Gomez-Cameros，2000，AmericanJournal of Clinical Nutrition 72：1424-1435)。因此，在一些不同的领域，例如作为药物、食品添加剂、香料、颜料和杀虫剂，这些自然界物质具有经济上的重要性。

次级代谢物通常少量积累，并且有时仅存在于特定的细胞内，因此，他们的提取会非常困难且效率低。尽管有机化学合成在进步，但大量的次级代谢物结构非常复杂，以经济学的标准，它们在现实中是不可能合成的。然而，与人工合成的产物相比，通常消费者更愿意接受自然产物。因此，这些物质的工业产品和它们的功能类似物通常依赖于从植物中自然提取。

次级代谢物，从结构上来讲通常属于低分子量有机化合物。

通过生物技术可以使次级代谢物的工业产品或者其他自然界的和非自然界的低分子量有机化合物的形成更加容易。自然产品的生物合成，通过基因转换，植物或微生物可以制备出不同于先前存在于植物或有机体中的化合物。

糖基转移酶被定义为：它是一种转移残余糖(如半乳糖、戊醛糖、鼠李糖、葡萄糖、树胶醛醣、葡(萄)糖醛酸、等等)到受体分子的酶。受体分子可以是其他的糖、蛋白质、油脂和其他的有机培养基，受体分子被称为糖苷配基(苷元，如果糖是葡萄糖)。糖苷配基被定义为配糖物(糖苷)中非糖部分。糖苷被定义为具有葡基基团(来源于糖或者多聚糖分子的有机化学基团)的有机分子，与葡基基团之间有诸如氧、氮或者硫等原子相连。

这些被糖基化的分子参加不同微生物方法和过程。葡基的部分转移能够改变受体的生物活性、溶解性、稳定性、味道、气味和传递性能，例如在一株植物和微生物细胞和整个植物中的性能改变。

本专利描述了大量的糖基转移酶，这些糖基转移酶可以使化合物糖基化，例如植物和真菌(Paqudtte，S等等，Phytochemistry 62(2003)399-413)的次级代谢物。

WO01/07631，WO01/40491和(Arend，J等，Biotech.& Bioeng(2001)78：126-131)描述的是一部分糖基转移酶，这些糖基转移酶具有使大量不同结构的相关次级代谢物和其他类似结构的低分子量有机化合物糖基化的能力。

因此，当处理的时候，技术人员可利用大量的能够使许多不同次级代谢物和其它结构相关的低分子量有机化合物糖基化的不同糖基转移酶。

Tattersall，DB等等，Science(2001)293：1826-8，描述络氨酸衍生的生氰配糖蜀黍苷(一种次级代谢物)的全部合成方法，它被从两色蜀黍蜀黍属植物(Sorghum bicolor)转移到模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)植物。该合成的全部方法包括涉及生物合成方法(CYP79A1和CYP71E1)中的两个基因，和一个能够使最后的中间产物(对-羟基苯羟基乙腈，p-hydroxymandelonitrile)糖基化成为糖苷蜀黍苷的糖基转移酶(sbHMNGT)(见图1)。证明转基因的拟南芥植物具有每克净重能够生成4毫克蜀黍苷的能力。

Arend，J等，Biotech.& Bioeng(2001)78：126-131和WO01/07631，描述了来自于蛇根木(Rauvolfia serpentina)植物的糖基转移酶的无性繁殖。克隆的糖基转移酶被引入到大肠杆菌(E.coli)中，当葡萄糖对苯二酚、香草醛和对-羟基苯乙酮被加入到改变的大肠杆菌细胞的培养基中，则相应的糖苷、对苯二酚葡糖苷、香草醛-D-糖苷和云杉苷被合成出来。他们也被从细胞中释放到周围的培养基中。

Moehs，CP等，Journal(1997)11：227-236描述了编码为茄啶糖基转移酶(SGT)的cDNA从番茄中分离出来。根据甾族生物碱糖基配苷比其相应的糖基化形式具有更高的毒性，cDNA从一个酵母库中使用应激性方法被选择出来，根据分离基因重组生成SGT，克隆SGT的活性通过离体实验来检验。

US6372461描述了一种通过使用大肠杆菌细胞制取次级代谢物香草醛的方法，在大肠杆菌细胞内引入参与生物合成方法的基因，该合成方法从葡萄糖开始，到生成香草醛酸。当培养基中含有葡萄糖时，基因重组大肠杆菌能够生成香草醛酸。产生的香草醛酸从发酵的培养基中重新获得，且在芳醛脱氢酶的存在下分解为香草醛。

发明内容

通过本发明要解决的问题是，提供一种新的特殊的低分子量有机化合物的制备方法，所述方法提供了获得更高产量化合物的可能性。

其中，该解决方案是基于本发明者的调查研究和比较，下面是两种培养的微生物。

(i)一个包含一种基因的微生物，该基因参与生物合成方法，导致一个低分子量糖苷配基化合物的生成；并且

(ii)相同的微生物，但是还要引入一个糖基转移酶基因，该基因具有糖基化所生成的糖苷配基的能力，得到糖苷配基相应的糖基化形式。

本发明者发现在培养发酵过程中，与在没有糖基转移酶的条件下，由微生物生成相应的糖苷配基的糖基化形式的数量相比，含有糖基转移酶的微生物具有生成更大数量的糖苷配基的糖基化形式的能力。参见这里说明性的实施例。

(a)上述类型(ii)中的大肠杆菌产出更大量的香草醛糖苷，当它与没有糖基转移酶存在条件下在相应的大肠杆菌细胞中生成相应的香草醛苷元的数量相比时(上述类型(i)的大肠杆菌)。

(b)上述类型(ii)中的酵母细胞产出更大量的香草醛糖苷，当它与没有糖基转移酶存在条件下在相应的酵母细胞中生成相应的香草醛苷元的数量相比时(上述类型(i)的酵母细胞)。

(c)上述类型(ii)中的酵母细胞产出更大量的原儿茶酸-β-D-糖苷(PAG)，当与相应的酵母细胞在没有糖基转移酶条件下生成的相应原儿茶酸(PA)苷元的数量相比时(上述类型(i)的酵母细胞)。

(d)上述类型(ii)中的酵母细胞产出更大量的蜀黍苷，当与相应的酵母细胞在没有糖基转移酶条件下产生的对-羟基苯乙醇腈(蜀黍苷的苷元，见图1)的数量相比时(上述类型(i)的酵母细胞)。

(e)上述类型(ii)中的酵母细胞产出更大量的被糖基化的化合物(例如对-葡糖氧基-苯基乙醇，对-葡糖氧基-苯乙腈、对-葡糖氧基-苯甲醛或者葡基对-羟基安息香酸盐)，这些化合物通过蜀黍苷生物合成方法，当与相应的酵母细胞在没有糖基转移酶条件下产生的糖苷配基的数量相比时(上述类型(i)的酵母细胞)。

因此，上述类型(ii)中的微生物细胞会被用于得到很高产量的相应糖苷配基的糖基化形式。而且，它还被用于一个制备高产量糖基配苷的过程中，仅仅是通过先合成糖苷配基的被糖基化的形式，然后重新获得它，并且根据实验方案的标准(例如使用酶催化的β-葡糖苷酶或者通过充分的化学水解)去糖基化。

因此，本发明的第一方面内容涉及生成低分子量有机化合物的一种方法，包括以下步骤：

a)发酵一种微生物细胞或者一种纤维状的真菌细胞，细胞包含一个参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因，和一个异源糖基转移酶基因编码的一个糖基转移酶，它具有使生成的糖苷配基糖基化的能力，在适当的条件下，所述细胞产生糖苷配基和相应的糖苷配基的糖基化形式；并且

b)重新获得糖苷配基化合物的糖基化形式

(i)所述低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-3000g/mol，并且

(ii)所述糖基转移酶具有把糖接合至糖苷配基化合物的功能，其中糖是从半乳糖、葡(萄)糖胺、N-乙酰基葡(萄)糖胺、戊醛糖、葡(萄)糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖中选取出来的。

本发明的第二方面内容涉及一个微生物细胞或者纤维状真菌细胞，包括一个参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因，和一个异源糖基转移酶基因编码的一个糖基转移酶，它具有使产物糖基配苷糖基化的能力，在细胞中，当在适当的培养基中发酵，生成糖苷配基和相应的糖苷配基的糖基化的形式，并且其中糖基转移酶具有把糖接合至糖苷配基化合物的功能，其中糖是从半乳糖、葡(萄)糖胺、N-乙酰基葡(萄)糖胺、戊醛糖、葡(萄)糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖中选取出来的。

如上所说，上面所描述的方法的基本的原则是生成高产量高效益的糖苷配基(糖苷配基的过剩生产)。

因此，本发明的第三方面内容涉及一种生成低分子量有机糖苷配基化合物的一种方法，包括以下步骤：

a)生长一种细胞，细胞包含一个参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因，和一个糖基转移酶基因编码的一个糖基转移酶，它具有使生成的糖苷配基糖基化能力，在适当的条件下，所述细胞产生糖苷配基和相应的糖苷配基的糖基化形式；

b)糖苷配基的糖基化形式的去糖基化；并且

c)重新获得糖苷配基化合物；

(i)所述低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-3000，并且

(ii)所述糖基转移酶具有把糖接合至糖苷配基化合物的能力。

在本方法中使用糖基转移酶的优点是，可能会进一步运用已知糖基转移酶的不同特征。例如，众所周知，一些糖基转移酶具对映体特异性(参见例如，Jones，P等，J.of Biological Chemistry(1999)，274：35483-35491和WO03/023035)。结果是，例如，如果想生成一个特殊的结构对映体，例如一个糖苷配基，那么能够选择使用糖基转移酶这样一个对映体。

本发明的第四个方面内容涉及一个方法，该方法是为了选择一种增加低分子量有机糖苷配基的糖基化形式的产量的细胞，包含的步骤如下：

a)生长一种细胞，细胞包含一个参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因，和一个糖基转移酶基因编码的一个糖基转移酶，它具有使生成的糖苷配基糖基化能力，在适当的条件下，所述细胞产生糖苷配基和相应的糖苷配基的糖基化形式；

b)处理所述细胞，通过改变参与生物合成方法生成低分子量有机糖苷配基的至少一个基因和/或具有使生成的糖苷配基糖基化的糖基转移酶基因的表达水平，以构建一个具有不同基因表达水平的基因细胞库；并且

c)选择一个细胞，与步骤a)中的细胞相比，生成更高产量糖苷配基的糖基化形式；

(i)所述低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-3000，并且

(ii)所述糖基转移酶具有把糖变成糖苷配基化合物的能力。

实施例8中描述了如何使用这种方法，使得模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana plant)具备每克净重量可以生成更多的糖苷蜀黍苷的能力。步骤a)中的起始细胞是模式植物拟南芥转基因细胞，这在文献Tattersall，DB等，Science(2001)293：1826-8中描述过。上述的模式植物拟南芥转基因细胞包括生氰糖苷蜀黍苷的合成的全部方法。转基因模式植物拟南芥植物已经证实具从每克净重量中生成4mg蜀黍苷的能力。当执行完实施例8中所描述的选择方法后，按照步骤c)选择一个模式植物拟南芥转基因细胞，每克净重量能够生成6mg蜀黍苷。

不限定于理论，我们相信这种转基因植物是第一次被提供出来，这种转基因植物能够从一个低分子量有机糖苷配基化合物的糖基化形式的每克净重量中生成大于4mg产物。

因此，本发明的第五方面内容涉及一个转基因植物，它具有从一个低分子量有机糖苷配基化合物的糖基化形式的每克净重量中生成5mg产物的能力，

(i)所述低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-3000。定义

在讨论具体的实施例之前，提供一个涉及本发明中主要方面内容的具体术语的定义。

术语“糖苷配基”(aglycon)表示糖苷配基相应的糖基化形式的非糖部分。它也会定义为能够与糖接合的受体化合物。在大量的相关的实施例中，糖苷配基是一个适合被糖基化的具有羟基基团的醇。例如对-羟基苯乙醇腈(见图1)，它具有一个羟基基团，在葡萄糖的存在下能够变成(糖基化)蜀黍苷。(所述蜀黍苷是糖苷配基对-羟基苯乙醇腈相应的糖基化形式)。在这个实施例中，其中的糖如果是葡萄糖，“糖苷配基(aglycon)”的术语会是“苷元(aglucone)”。此外，当糖是葡萄糖，术语使用“葡萄糖基化(glucosylated)”，代替术语“糖基化(glycosylated)”。

除了羟基，一个糖苷配基也会在不同的基团被糖基化，尤其是其他亲核基团，例如羧酸、SH-、氮、胺、亚胺或C-C基团。

术语“参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因(gene encoding a product involved in thebiosynthesis  pathway leading to a low molecular weight aglyconcompound)”根据本专利，应该被理解为一个参与生成一个低分子量糖苷配基化合物的生物合成方法的产物的编码基因。基因编码的产物通常是多肽。然而如果影响基因表达，这个产物也会是RNA分子。编码的产物会直接参与生物合成方法或者间接参与，例如经过其他的前驱物或是媒介。重要的问题是，正如这里所描述的，有独立的精确的机理的支持，对于该细胞，基因能够合成加倍量的糖苷配基化合物。本专利描述大量这类基因的适当的实施例，只是为了说明一个实施例，来自于两色蜀黍蜀黍属植物的CYP71E1，从对-羟基苯基乙腈开始，它参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基化合物对-羟基苯乙醇腈(参见图1和Tattersall，DB等，Science(2001)293：1826-8)。其他的实施例描述的是参与生物合成方法的基因，通过生物合成方法生成低分子量糖苷配基化合物香草醛，正如在实施例中所描述的。

术语“糖苷(glycoside)”表示一个能水解出糖和非糖(糖苷配基)残余物的化合物，例如糖苷水解出葡萄糖，半乳糖苷水解出半乳糖。

术语“糖基转移酶(glycosyltransferase)”表示一个具有把糖接合至糖苷配基的能力的糖基转移酶。所述糖，可以是例如半乳糖的D和L型异构体、葡(萄)糖胺、N-乙酰基葡(萄)糖胺、戊醛糖、葡(萄)糖醛酸、鼠李糖、树胶醛醣、甘露糖或葡萄糖。替代的糖可以是糖类衍生物，例如肌糖、D-橄榄糖、玫红糖和其他可利用的，如核苷酸二磷酸。另一种糖，例如单糖、二糖或三糖。在多聚糖或糖的低聚体的情况下，糖被一个一个的连接起来，例如包括使用一个或多个糖基转移酶。另外，一系列适合的糖可以参见US2003/0130205A1中的图表[0029]到[0036]。如果糖是葡萄糖，糖基转移酶“glycosyltransferase”的术语会是葡糖基转移酶“glucosyltransferase”。

第三方面内容的步骤a)中的术语“生长一种细胞(growing a cell)”应该被广泛理解为在一个允许细胞生长的适当的环境(温度、养料等)中生长一种的细胞。例如，如果细胞是植物细胞，意味着生长的植物细胞是生长在一株成熟的植物。如果细胞是微生物，例如微生物细胞在适当的培养基中发酵，在培养基中微生物适合生长。

本发明第一方面内容步骤b)“重新获得糖苷配基化合物的糖基化形式(recovering the glycosylated form of the aglycon compound)”中的术语“重新获得(recovering)”和第三方面内容步骤c)“重新获得糖苷配基化合物(recovering the aglycon compound)”中提到的术语“重新获得(recovering)”，应该被广泛的理解为从细胞中重新获得化合物，或者从浮在培养基上层液中重新得到，在培养基中细胞被发酵，为了得到比前一个“重新获得”步骤中更纯的产物。重新获得步骤包括或多或少的详细的净化步骤。可选择的是，从某种程度来讲，重新获得步骤后，化合物含有至少4％(w/w)的成分，更优选的至少10％(w/w)的化合物，甚至可以达到至少20％(w/w)的化合物，最优选的化合物至少达到50％(w/w)。技术人员意识到适当的净化方案(如使用足够的净化柱)可以得到所期待的纯度。优选的重新获得步骤后，至少会重新获得10mg化合物，更优选的至少会重新获得1g化合物，更优选的至少会重新获得10g化合物，最优选的至少会重新获得500g化合物，优选的可以重新获得10mg到100kg化合物。下面描述的是本发明的具体实施方式，仅通过实施例的方式说明图

附图说明

图1：表示络氨酸衍生的生氰糖苷蜀黍苷(次级代谢物)的合成方法。合成方法包括参与生物合成方法(CYP79A1和CYP71E1)的两个基因和能够使最后的中间产物(对-羟基苯乙醇腈)糖基化、得到糖苷蜀黍苷的糖基转移酶(sbHMNGT)。

具体实施方式

细胞

发明第三个方面内容步骤a)中适合生长的细胞是任何适当的细胞，例如任意真核状态的或者原核的细胞。更优选的从植物细胞、纤维状真菌细胞和微生物细胞中选取的。

如上所述，使用所述细胞的一个主要优点是能得到更高产量(加倍产量)的糖苷配基的糖基化形式，通过适当的糖苷配基的糖基化形式的去糖基化步骤，得到更高产量(加倍产量)的糖苷配基。

因此在生长过程中，一种优选的细胞是在糖基转移酶的存在下，与在没有糖基转移酶的条件下细胞生产的相应的糖苷配基的糖基化形式的数量相比，它具有生成更多数量的糖苷配基的糖基化形式的能力。

当细胞是微生物细胞时，细胞被表示为微生物细胞，在培养发酵的过程中，在糖基转移酶的存在条件下，与在没有糖基转移酶的条件下相同微生物细胞生产的相应的糖苷配基的糖基化形式的数量相比，微生物细胞具有生成更多数量的糖苷配基的糖基化形式的能力。

更可取的细胞(尤其是微生物细胞)，当包含糖基转移酶时，应该生产的糖苷配基的糖基化形式的数量至少是在没有糖基转移酶的条件下相同微生物细胞生产的相应的糖苷配基的糖基化形式的数量1.1倍，更优选的生产至少1.25倍数量的糖苷配基的糖基化形式，更优选的生产至少1.5倍数量的糖苷配基的糖基化形式，最优选的生产至少2倍数量的糖苷配基的糖基化形式。

本发明的主要优点涉及能够加倍生产糖苷配基的糖基化形式，因此技术人员也应该这样理解涉及糖苷配基的糖基化形式更高产量的术语。因此，糖苷配基的糖基化形式的更高产量是在细胞中积累起来的，在这个细胞中重新获得，例如细胞溶解后得到。替代的，糖苷配基的糖基化形式可以从细胞中分泌出来，并且在培养基中积累，当细胞是微生物细胞时，后者是尤其相关的。

根据本发明，提供的含有植物细胞的植物也可以是上述植物产生的种子。

本发明的优选实施方式中，上述植物是从下面这些植物种选择出来的，这些植物包括：谷物(玉蜀黍玉蜀黍属)、芸苔(蓝型油菜，芜菁芸苔属)、紫花苜蓿(苜蓿属植物家莴苣)、稻米(水稻)、黑麦(黑麦草)、高粱属的植物(高粱属双色植物，高粱属)、向日葵(向日葵一年生缎花属)、小麦(夏季小麦和其他种类)、黑小麦、黑麦(黑麦)、大豆(橹豆)、烟草(烟草叶)、马铃薯(茄属植物块茎)、花生(落花生地下部分)、棉花(棉花hirsutum)、甜马铃薯(impomoea甘薯)、木薯(manihot可食用部分)、咖啡(cofea)、椰子(椰子坚果)、菠萝(金边凤梨)、柑橘类的植物(柑橘类的植物)、可可豆(可可豆)、茶树(山茶)、香蕉(芭蕉种)、avacado(美国鳄梨鳄梨属)、无花果(ficus carica)、番石榴(番石榴属)、芒果(芒果)、橄榄树(油橄榄木犀属)、番木瓜果(番木瓜)、腰果(都子)、澳大利亚坚果(澳大利亚坚果木菠萝)、杏树(第一的扁桃形结构)、苹果(苹果属)、梨树(梨属)、李子和浆果树(李属)、虎耳草科酷栗属的植物(黑醋栗等等)、葡萄属、耶路撒冷朝鲜蓟(半日花属)、非谷类草(草族)、糖和草料甜菜根(beta vulgaris)、菊苣、燕麦、大麦、蔬菜和观赏植物。

更优选的，本发明的植物是农作物植物(例如谷类和豆类植物、玉米、小麦、马铃薯、木薯、稻米、高粱属植物、粟、木薯、大麦、豌豆、甜菜根、甜藤条、大豆、油菜籽、向日葵和其他的根、块茎、或种子农作物)。其他重要的植物会是果树、农作物树、森林中的树、或者是用做香料或者调药的植物(薄荷属、丁香、蒿属植物、百里香属、熏衣草种、葱属植物、金丝桃属植物、长春花、长春蔓种、罂粟属、洋地黄种、rawolfia、香草种、petrusilium、桉树种、茶树、picea、松果体、冷杉属、刺柏属)。对于本发明园艺植物会包括莴苣、菊苣，植物芸苔包括卷心菜、椰菜、茎花、胡萝卜、康乃馨和天竺葵。

本发明会被应用到烟草、葫芦、胡萝卜、草莓、向日葵、番茄、胡椒粉、菊花。

提供有用的种籽的谷类植物包括油菜籽植物和豆科植物。有用的种籽包括谷物种籽，例如玉米、小麦、大麦、nee、高粱属的植物、黑麦等等，油菜籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、紫花苜蓿、棕榈、椰子等等，豆科植物包括豆和碗豆，豆包括瓜尔豆、蝉豆、胡芦巴豆、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆。

本发明的另一个具体的实施方式中，上述植物可以从以下植物中选择：玉米、稻米、小麦、甜菜根、甜藤条、烟草、油菜籽、马铃薯和大豆。

模式植物拟南芥的整体基因组的序列已被排列(Paquette，S.等，Phytochemistry62(2003)399-413)。因此，对于该植物已经具备了详细的了解，所以在工作中优选该植物细胞。

因此，一种优选的植物细胞是拟南芥细胞，尤其是模式植物拟南芥细胞。

纤维状真菌包括细分为真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)所有的纤维状形式(如Hawksworth等所定义的。1995，supra)。纤维状真菌的特征是一种植物菌丝体，包括甲壳质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂的多聚糖，植物生长是菌丝的伸长，碳的分解代谢依赖氧气。相反的，通过发酵的植物生长，例如酿酒酵母是通过单细胞叶状体的发芽来生长，碳的分解代谢具有发酵力。

在一个更优选的实施方式中，纤维状真菌细胞是一类的细胞，但是没有限制，支顶孢属(Acremonium)、曲霉菌(Aspergillus)、镰刀霉(Fusarium)、腐殖菌(Humicola)、白霉(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌(Neruospora)、青霉菌(Penicillium)、Thielavia、颗粒霉(Tolypocladium)和栅状霉(Trichoderma)或者进化变体或者同物异名。

优选的微生物细胞适用于本专利所述的方法，微生物细胞从包含酵母细胞和原核细胞的团体中选出。

优选的酵母细胞从包含子囊菌(Ascomycetes)、胆子菌(Basidiomycetes)和半知菌类(fungi imperfecti)的团体中选出，更适宜的酵目细胞从包含子囊菌的团体中选出。

优选的子囊菌酵母细胞从包含阿舒囊霉菌(Ashbya)、Botryoascus、隐球菌属(Debaryomyces)、汉森酵母属(Hansehula)、克鲁弗氏酵母属(Kluveromyces)、油脂酵母属(Lipomyces)、酵母属(Saccharomycesspp.)(例如酿酒酵母[Saccharomyces cerevisiae]、毕赤酵母属[Pichiaspp.]、人体酵母属[Schizosaccharomyces spp.])中选择出来。

优选的酵母细胞选自由酵母属，例如酿酒酵母和毕赤酵母属组成的组。

本专利所述方法中，非常优选的细胞是原核细胞，优选的原核细胞是从包括芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、棍棒形菌(Corynebacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、乳酸菌(lactic acidbacteria)和尤其是大肠杆菌(E.coli)的团体中选择出来的。

优选的芽孢杆菌是枯草杆菌(B.subtilis)，芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens或B.licheniformis)。

优选的链霉菌是S.setonii。

优选的棍棒形菌是谷氨酸菌(C.glutamicum)。

优选的假单胞菌是假单胞菌或荧光假单胞菌(P.fluorescens)。

优选的细胞是没有活性的细胞，并且至少一些基因编码的一个β-糖苷酶，它使生成的加倍量的糖苷配基化合物的糖基化形式去糖基化，正如这里所描述的。另外，与仅能进行糖基化反应的细胞相比较，优选的细胞包括透性酶或其他转移蛋白，它能够使细胞释放或分泌糖苷到培养基，或是到内部的空间。

如前面所述，将包含载体的DNA转移到细胞中是技术人员的日常工作。适当的载体可以被构造，含有适当的调控序列，包括启动序列、终止序列、多聚腺苷序列、增强序列、标记基因和其他适当的序列。对于进一步描述，例如Sambrook等(1989)Molecular cloning：实验室操作手册，ColdSpring实验室，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等(eds.)。“Current protocols in Molecular Biology”.John Wiley和Sons，1995：Harwood，C.R，和Cutting，S.M.(eds)“Molecular BiologicalMethods for Bscillus”。John Wiley和Sons，1990。

关于适当植物细胞载体的实施例和适当植物转移技术参考WO02/103022。关于纤维状真菌细胞参考EP869167。

优选的，所述细胞是在细胞中表达异源糖基转移酶基因的细胞，尤其是微生物细胞或者纤维状真菌细胞，它们表达异源糖基转移酶基因。

在这个关系中，根据本技术，术语“异源糖基转移酶基因heterologousglycosyltransferase gene”应该被理解为被引入细胞中的糖基转移酶基因，在引入之前，不表达糖基转移酶基因。

替代的说法，糖基转移酶基因是由细胞自然生成且内生长的的糖基转移酶基因。

糖基转移酶

如上所述，本发明描述了能够使加倍量的低分子量有机化合物糖基化的大量糖基转移酶，例如植物和真菌的次级代谢物。根据被排序基因组植物模式植物拟南芥DNA的序列异源体，我们可以相信目前含有大约100种不同的糖基转移酶。这些糖基转移酶和其他大量的糖基转移酶在Paquette，S.等，Phytochemistry62(2003)399-413文献中分析总结。本文的图1是提供大量适当糖基转移酶名称的所谓多有机体关系树。

WO01/07631，WO01/40491和(Arend，J等，Biotech.& Bioeng(2001)78：126-131)描述了至少一些能够使大量不同结构次级代谢物和其他结构低分子量有机化合物糖基化的糖基转移酶。

另一方面，大量糖基转移酶的适当序列可以在Carbohydrate-ActiveenZYmes(CAZY)数据库中找到。在CAZY数据库中，链接本发明文件档案的网站是http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html。

在CAZY数据库中，从实际的所有包括动物、昆虫、植物和微生物种类中可以找到适当的糖基转移酶序列。

因此，技术人员在处理时，他可以利用大量具有使许多不同次级代谢物和其他低分子量有机化合物糖基化能力的不同糖基转移酶。这个事实通过一些具体说明性的实施例进一步描述。

虽然糖基转移酶通常被认为与具体的酶作用物相关，如果引入酶，则表明其他的酶作用物能在有效的标准下被处理，表明阿布属(Arabidopsis)中的高粱属植物，通过反应CYP79A1的表达，生成大量对-羟基苯基葡(萄)糖苷酯，反应通常不会生成阿布属(Arabidopsis)糖苷酯(Bak等等，2000，Plant Physiology 123：1437-1448)。新的糖苷酯是由对-羟基苯基乙醛肟(p-hydroxyphenylacetaldoxime)生成的，络氨酸通过CYP79A1反应得到对-羟基苯基乙醛肟，随后引导到先于糖苷酯存在下的生物合成方法和相关的糖基转移酶中。

而且，糖基转移酶，杨梅合酶(arbutin synthase)，从药植物萝芙木属(热带有毒植物)分离，表明与天然的对苯二酚相比，它对于其他酶作用物有相当大的活性(Arend等等，2001，Biotechnology andBioengineering76：126-131)。当一些酶作用物，例如香草醛或对-羟基乙酰苯，放入已经被设计好的大肠杆菌中培养，表达植物糖基转移酶，酶作用物被转化成相应的糖苷、香草醛-β-D-糖苷和云衫苷。这两个产物随后从细菌中释放出来，两者都具有经济效益。

这些实施例表明葡糖基转移酶能够对酶作用物起作用，其中的酶作用物在新陈代谢反应中是不存在的，导致新的自然产物的葡糖苷的形成。

如上所述，技术人员在处理时，他可以利用许多具有使大量不同次级代谢物和其他低分子量有机化合物糖基化能力的不同糖基转移酶。此外，他利用已知的常规方法，很容易确定使加倍量的低分子量有机化合物糖基化的更适合的糖基转移酶。下面是一些适当方法的实施例。

许多已知的DNA转移酶序列被用于产生适当的PCR引子克隆新的糖基转移酶，此方法包含的步骤如下：

(a)准备一个cDNA库，来自于一个细胞(如植物组织细胞)，表达葡糖基转移酶，

(b)使用相关的已知DNA糖基转移酶序列，产生适当的PCR引子，放大cDNA库中的部份的葡糖基转移酶cDNA，

(c)使用步骤(b)中得到的DNA作为探测器筛选DNA库，DNA库是由细胞表达的葡糖基转移酶构建的，并且

(e)确定和净化载体DNA，它包含一个开放的读码框，编码一个有用的葡糖基转移酶。

替代的，适当的葡糖基转移酶可以通过使用所谓的表达克隆方案确定，适当表达的克隆方案包含以下步骤：

(a)准备一个cDNA库，来自于一个细胞(如植物组织细胞)，表达葡糖基转移酶，

(b)在生长的表达细胞中，通过使用一个表达载体把cDNA库引入表达细胞，载体使cDNA表达(转录和转译)；

(c)在培养基中生长细胞，所述培养基包含有毒的加倍量的低分子量有机糖苷配基化合物(如一个特殊的单独的细胞能够生长，细胞包含一个表达的葡糖基转移酶，葡糖基转移酶有使加倍量的糖苷配基糖基化的能力)；

(d)分离一个或多个生长的细胞，并且确定一个可以表达有用的葡糖基转移酶的细胞。

如文献Moehs，CP等，Plant Journal(1997)11：227-236所述，这个表达克隆方案可以通过使用酵母细胞来实现。本发明证明，对于细菌糖苷配基的糖基化形式比相应的糖苷配基的毒性小，因此，表达克隆方案可以通过细菌细胞来实现，例如大肠杆菌。

因此，本发明的一个独立方面内容，涉及为得到有用的糖基转移酶的表达克隆方法，包含的步骤如下：

(a)准备一个cDNA库，来自于一个细胞(如植物组织细胞)，表达葡糖基转移酶，

(b)在生长的有用的表达细胞中，通过使用一个表达载体把cDNA库引入表达细胞，载体使cDNA表达(转录和转译)；

(c)在培养基中生长细胞，所述培养基包含有毒的加倍量的低分子量有机糖苷配基化合物(如一个特殊的单独的细胞能够生长，细胞包含一个表达的葡糖基转移酶，葡糖基转移酶有使加倍量的糖苷配基糖基化的能力)；

(d)分离一个或多个生长的细胞，并且确定一个可以表达有用的葡糖基转移酶的细胞。

优选的，步骤(b)中的细菌表达细胞是大肠杆菌细胞。

上述表达克隆方案的一个优点，是它能直接得到使加倍量的糖苷配基糖基化能力的葡糖基转移酶。

优选的，糖基转移酶具有把糖接合至糖苷配基化合物的能力，其中糖是从含有半乳糖、葡(萄)糖胺、N-乙酰基葡(萄)糖胺、戊醛糖、葡(萄)糖醛酸、鼠李糖、树胶醛醣、甘露糖和葡萄糖的集团中选取的。

在另一个可取的实施方式中，糖基转移酶是NDG-糖基转移酶。这种糖基转移酶被确定存在于植物、动物、真菌、细菌和病毒中。这种糖基转移酶的特征是，通过使用NDP-活性的糖moeties作为供者分子并且在C-端点附近含有一个转变的UGT-定义序结构。

在一个更可取的实施方式中，糖基转移酶是一个UDPG-葡糖基转移酶(UGT)。UGT糖基转移酶被确定存在于植物、动物、真菌、细菌和病毒中。这些糖基转移酶的特征是通过使用UDP-活性的糖moeties作为供者分子并且在C-端点附近含有一个转变的UGT-定义序结构。为了进一步描述相关UDPG-葡糖基转移酶的定义，参见(Paquette，S.等，Phytochemistry62(2003)399-413)。

优选的，所述糖基转移酶能够把单糖或二糖接合至糖苷配基。最优选的糖基转移酶可以把单糖接合至糖苷配基。

在一个优选的实施方式中，糖基转移酶(glycosyltransferase)是葡糖基转移酶(glucosyltransferase)。

下面描述的是一些适当糖基转移酶的实施例。

WO01/40491描述来自于两色蜀黍蜀黍属植物的糖基转移酶的克隆，糖基转移酶被命名为sbHMNGT。WO01/40491中所描述的这个和相关同源的糖基转移酶具有使至少下面列举的低分子量有机糖苷配基化合物糖基化的能力，(参见WO01/40491的表3)。

氰醇

1)苯乙醇腈

2)对-羟基苯乙醇腈

3)丙酮氰醇

苯甲基衍生物

4)对苯二酚

5)苯甲基酒精

6)对-羟基苯甲基乙醇

7)安息香酸

8)对-羟基安息香酸

9)对-羟基安息香醛

10)龙胆酸

11)咖啡酸

12)2-羟基苯乙烯酸

13)白藜芦醇(均二苯代乙烯)

14)水杨酸

15)对-羟基苯基乙醇酸

16)香草醛酸

17)香草醛

18)2-羟基甲氧基苯甲基乙醇

黄酮类化合物

19)栎精、橡黄素(黄酮醇)

20)氰素(花色素)

21)鸡豆黄素(异黄酮)

22)4，5，7-三羟黄烷酮(黄烷酮)

23)芹菜配基(黄酮)

己醇衍生物

24)1-己醇

25)反式己-1-醇

26)顺式己-1-醇

27)3-甲基己-1-醇

28)3-甲基己-1-醇

29)吲哚乙酸(植物激素)

30)香叶醇(类单萜)

31)番茄碱(生物碱)

32)橙花醇

33)对-香茅醇

Arend，J等，Biotech.& Bioeng(2001)78：126-131描述来自于植物蛇根木糖基转移酶的克隆。它具有使至少下面列举的低分子量有机酚糖苷配基化合物糖基化能力，(参见表1)：

对苯二酚、香草醛、水杨甙、间苯二酚、麝香草酚、苯酚、甲基香草醛、对-羟基乙酰苯、香草酸、对-甲氧基苯酚、3，4-二甲氧基苯酚、松柏基、邻-香豆酸、对-香豆酸。

WO01/59140描述来自于模式植物拟南芥的糖基转移酶，它具有使得至少下面列举的低分子量有机糖苷配基化合物糖基化的能力：咖啡酸、毛地黄黄酮、栎素类、邻苯二酚类、syadinin。

WO02/103022描述来自于模式植物拟南芥的糖基转移酶，它具有使得至少下面列举的低分子量有机糖苷配基化合物糖基化的能力：安息香酸酯酶作用物，尤其是对-羟基安息香酸。

WO03/02035描述来自于模式植物拟南芥的糖基转移酶，它具有使得至少下面列举的低分子量有机糖苷配基植物生长素化合物糖基化的能力：脱落酸。

下面描述的是用于测试糖基转移酶活性的适当的实验。实验描述的是葡糖基转移酶(glucosyltransferase)。然而，当糖不是葡萄糖时，则应该使用充足的糖(例如半乳糖)代替葡萄糖。

在测试实验中，测试糖基转移酶把加倍量的糖苷配基转化成葡萄糖的能力的实施例包括以下步骤：

a)培养¹⁴C_UDP-葡萄糖、糖苷配基和UDP葡萄糖的反应混合物：糖苷配基-糖基转移酶在30℃，反应2分钟到2小时；

b)终止反应，并且

c)化学鉴定和量化生成的糖苷。

典型的反应混合物的体积为5-2000μl，但是优选20μl，包含10-200mM TrisHCL(pH7.9)；1-5μM¹⁴C_UDP-葡萄糖(约11.0GBq mmol-1)；0-300μMUDP-葡萄糖；0-20mM糖苷配基；25mMγ-葡糖酸内酯；0-2μg/μlBSA和0-10ng/μlUDP-葡萄糖：糖苷配基-糖基转移酶。可能会被适当加入的β-葡(萄)糖苷酶抑制剂不同于γ-葡糖酸内酯和蛋白质稳定剂，不同于BSA。通过酸化反应混合物可能会终止反应，例如加入1/10体积的10％的乙酸。

可以使用多种方法化学鉴定和量化在反应混合物中生成的糖苷，包括NMR波谱、TLC分析、HPLC分析或者GLC分析与多种其他波谱分析适当的混合使用。

通过NIVIR波谱分析反应混合物，通常总体积为0.5-1ml，培养2小时，含有0-10mM的糖苷配基，例如2mM对-羟基-苯乙醇腈或者6.5mM香叶醇，3mM UDP-葡萄糖，2.5μg葡糖基转移酶(gluceryltransferease)，0.5mg BSA。例如使用乙酸乙酯提取糖苷，且在NMR分析之前冻干。

对于使用TLC分析方法，反应混合物要提供给硅凝胶板(Silica Gel)60F254(Merck)，在溶剂中干燥和培养，例如乙酸乙酯∶丙酮∶二氯甲烷∶甲醇∶H₂O(40∶30∶12∶10∶8v/v)。在室温条件下，干燥硅凝胶板1小时，用PhosphorImager扫描前暴露在贮藏磷成像板上。基于放射性同位素示踪的UIDP-葡萄糖的特殊的放射性，反应生成的糖苷被量化。放射性也能被液态闪烁计数器测定(LSC分析)。在某些情况下，糖基是由憎水糖苷配基形成的，例如苯乙醇腈，糖苷可以被萃取到乙酸乙酯相，因此能够从未包含在内的¹⁴C_UDP-葡萄糖中分离出来。在每250μl乙酸乙酯萃取液中加入2ml闪烁转化液，使用液态闪烁计数器进行分析。在体积分馏过程中，那些含有糖基转移酶(gluceryltransferease)活性的馏份可以使用加倍量的糖苷配基酶作用物和生成糖苷的乙酸乙酯萃取剂来鉴定。

所述糖基转移酶基因是引入到细胞中的，为了在细胞内细胞表达一个异源糖基转移酶基因，尤其是微生物细胞或者纤维状真菌细胞，它们表达一个异源糖基转移酶基因。

替代的说法，糖基转移酶基因是在细胞内自然产生且内生长的。

此外，引入使糖基转移酶加快表达或增加产量的基因，例如基因编码调控的蛋白质、蛋白酶抑制剂、蛋白酶基因的抑制剂、提高水平或者前驱物的基因、尤其相关的NDP-糖、参与NDP-新陈代谢的基因、透酶和其他的传递酶、降低糖苷配基新陈代谢的基因等等。

参与生物合成方法的基因

如上所述，根据本发明，术语“参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因”“gene encoding a productinvolved in the biosynthesis pathway leading to a low molecularweight aglycon compound”应该理解为一个编码参与生物合成方法、生成低分子量糖苷配基化合物的产物的基因。

本专利描述了大量适当基因的实施例，并且数量呈指数倍数增加，因为大量不同植物和微生物的整体基因组在不断的被公布。

实施例可以参考文献“Biochemistry & Molecular Biology ofPlants”，由Bob B.Buchanan等人编辑，ISBN 0-943088-37-2，第24章：“自然界产物(次级代谢物)”描述了参与生物合成方法生成低分子量糖苷配基化合物的大量不同适当基因的实施例。

其中的一个实施例在两色蜀黍蜀黍属植物的CYP71E1中说明，从参与生物合成反应对-羟基苯基乙腈开始，生成低分子量糖苷配基化合物对-羟基苯乙醇腈(参见图1和Tattersall，DB等，Science(2001)293：1826-8)。

另一个实施例描述参与生物合成方法生成低分子量糖苷配基化合物香草醛的基因，另一个实施例在Szczebara等，Nature Biotechnology(2003)，21：143-149中描述。本技术描述了具有从单一的碳源生成氢化可的松的重组酵母细胞。在生物合成方法中，酵母细胞包含八个重组的引入基因。

如上所述，技术人员在处理时可以利用大量不同生物合成方法基因。另一方面，他使用已知的惯用方法可以容易的鉴别更适合生物合成方法的基因。例如，使用众多的生物合成方法的基因序列制备适当的PCR引子，再克隆出新的适当生物合成方法的基因。该方法包含以下步骤：

(a)从一个细胞(例如植物组织细胞)准备一个cDNA库，所述细胞表达有用的生物合成方法的基因，

(b)使用相应的已知的生物合成方法的基因序列，制备适当的PCR引子，以放大部分编码cDNA库的cDNA的生物合成方法基因，

(c)使用步骤(b)得到的DNA作为探测器筛选DNA库，DNA库是由表达有用的生物合成方法基因的细胞准备的，并且

(e)确定和净化载体DNA，包含一个开放的读码框，编码一个有用的生物合成方法基因。

正如前面所解释的，所述用在此方法中的细胞包含，编码参与生物合成方法的产物的基因。所述细胞可包含多个编码参与生物合成方法的产物的基因。

在Tattersall，DB等，Science(2001)2931：826-8中描述的适当的实施例是转基因模式植物拟南芥的细胞。它包含两个生物合成方法基因CYP79A1和CYP71E1，因此从络氨酸制备出糖苷配基化合物对-羟基苯乙醇腈(见图1)。

另一个实施例是大肠杆菌细胞，它包含足够的生物合成方法基因，由葡萄糖制备糖苷配基香草醛。

所述编码参与生物合成方法的产物的基因可被引入细胞中以制备一个细胞，所述细胞中细胞表达一个编码参与生物合成方法的产物的异源基因，尤其是一个微生物细胞或纤维状真菌细胞，这些细胞能表达一个编码参与生物合成方法的产物的异源基因，正如这里所描述的。

替代的，参与生物合成方法的基因编码产物由细胞自然生成，并且是内生长的基因。

低分子量有机糖苷配基化合物

如前所述，此处所描述的低分子量糖苷配基化合物的分子量为50-3000，优选的，低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-2000，更优选的，低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-1000，最优选的，低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-750，分子量是在原子质量单元中每摩尔的质量。

另一方面，低分子量有机糖苷配基化合物优先从下面列举的化合物中选出，他们包含或多或少的饱和的烷基、环烷基、环烷基烷基、Arallyl-(它含有7-9个碳原子，其中的一个或多个氢原子与苯环相连，碳原子被至少含有1-8个碳原子的烷基、1-8烷氧基、卤素原子或硝基选择性取代)和芳基，含有1-50个碳原子、0-20个杂原子并且被选择性的取代，尤其是含有1-56个碳原子和/或0-20个杂原子且被羟基、氨基、硫、羧基或者硝基取代；更优选的，从下面列举的化合物中选出，包含或多或少的饱和的烷基、环烷基、环烷基烷基、Arallyl-和芳基，含有1-32个碳原子、0-10个杂原子并且被选择性的取代，尤其是含有1-56个碳原子和/或0-20个杂原子且被羟基、氨基、硫、羧基或者硝基取代。

在一个优选的实施方式中，低分子量有机糖苷配基化合物是醇，尤其是芳香醇。所述醇应该被理解为涉及糖基化的技术目标的糖苷配基。因此该处被定义为醇的糖苷配基是一个化合物，其中包含一个羟基(-OH)官能团，通过使用所述糖基转移酶可以使羟基糖基化。优选的芳香醇类的糖苷配基化合物意不限定的一个实施例是香草醇或者对-羟基苯乙醇腈。

醇也包含例如某些酮、乙醛和其他化合物，和醇例如烯醇、furanosider、pyrandosider、内酰胺和内酯等达到平衡。

如上所述，优选的有机糖苷配基化合物是含有羟基、氨基、亚胺基、硫醇基、亚硫酸酯、硫酸酯、磷酸酯或膦酸酯或羧基官能团的化合物，这些官能团可以通过使用所述糖基转移酶被糖基化。化合物中也会含有相应的硼和硒基团，化合物含有的基团与上述的基团达到平衡。上文已经讨论的带有羟基的糖苷配基。

在一个优选的实施方式中，有机糖苷配基化合物包含一个羧基官能团，使用所述糖基转移酶使这个官能团糖基化形成一个酯糖苷。这种糖苷配基化合物的非限定的实施例是香草酸或对-羟基安息香酸。

在一个优选的实施方式中，低分子量有机糖苷配基化合物是药物化合物或者是药物化合物的一个化学中间体，适当的药物化合物通常是由动物、植物、纤维状真菌或微生物自然产生的。

一个优选的药物化合物是从一系列包含布地缩松(budesonide)、雷洛昔芬(raloxifine)、三苯氧胺(tamoxifine)、多巴胺(dopamine)、类固醇(steroids)化合物中选取的。

适当优选的药物化合物的进一步描述参见US2003/0130205A1和US2003/011976A1。

在一个优选的实施方式中，低分子量有机糖苷配基化合物是从一系列包含维他命、氨基酸、脂肪酸、缩氨酸低聚体、低聚糖、核苷酸低聚物、PNA、LNA和官能团等价物的糖苷配基化合物中选取出来的，对于这类糖苷配基化合物，化合物分子量会大于3000。

植物被作为自然界中优秀的有机化学家，我们知道由200，000不同的自然产物来自于植物，这些产物使植物阻止草食动物和昆虫，吸引授粉者，与其他植物交流并且时常适应气候变化。如上所述，这些化合物多数被称作次级代谢物。

术语“次级代谢物(secondary metabolite)”涉及植物和微生物合成大量的自然物质，尤其是次级代谢物，多种多样，但其功能通常还未明了。与涉及生物体基本功能例如新陈代谢、生长、维持和生存的主要代谢物对比(如氨基酸、糖、脂肪酸)，次级代谢物对于这些基本功能不是必须的。根据本专利，所述术语次级代谢物按照这个标准描述来理解。

在一个优选的实施方式中，低分子量有机糖苷配基化合物是次级代谢物化合物，优选的植物次级代谢物化合物。

具体的一类次级代谢物化合物的实施例如下：

类萜化合物

生物碱

苯基丙酸类

苯基衍生物

己醇衍生物

类黄酮

香豆素，1，2-二苯乙烯

氰醇

植物性硫配糖体(Glucosinolates)

固醇

皂角苷糖苷配基

类固醇

激素

除草剂

上述的一系列化合物中更可取的一类次级代谢物化合物是：

类萜化合物

生物碱

苯基丙酸类

苯基衍生物

己醇衍生物

类黄酮

香豆素，1，2-二苯乙烯

氰醇

植物性硫配糖体(Glucosinolates)

优选的单独的低分子量有机糖苷配基化合物的实施例是从下面列举的化合物中选取，其中包括：

苯乙醇腈、对-羟基苯乙醇腈、丙酮氰醇、对苯二酚、苯甲基乙醇、对-羟基苯甲基乙醇、安息香酸、对-羟基安息香酸、对-羟基苯甲醛、龙胆酸、咖啡酸、2-羟基苯乙烯酸、1，2-二苯乙烯、水杨酸、对-羟基苯基乙醇酸、香草酸、香草醛、2-羟基甲氧基苯甲基乙醇、栎精、花色素、鸡豆黄素(异黄酮)、4，5，7-三羟黄烷酮(黄烷酮)、芹菜配基(黄酮)、1-己醇、反式己-1-醇、顺式己-1-醇、3-甲基己-1-醇、3-甲基己-1-醇、吲哚乙酸(植物激素)、香叶醇(类单萜)、番茄碱(生物碱)、橙花醇、对-香茅醇、水杨甙、间苯二酚、麝香草酚、苯酚、甲基香草醛、对-羟基乙酰苯、对-甲氧基苯酚、3，4-二甲氧基苯酚、松柏基、邻-香豆酸、对-香豆酸、咖啡酸、毛地黄黄酮、栎素类、邻苯二酚类、cyadinin、对-羟基安息香酸、脱落酸(植物生长素)、2，4，5-三氯苯酚(TCP)、五氯苯酚、4-硝基苯酚、3，5-二溴-4-氢苯甲酸、四环素、原儿茶酸、2-苯基乙醇和2，2-二-(4-氯苯基)-乙酸。

生长细胞/生长一个细胞/生长一种细胞

正如这里描述的方法，细胞应该在这种条件下生长，在细胞内生成糖苷配基和相应的糖苷配基的糖基化形式，涉及细胞生长的一个重要方面是细胞内必须存在充分的中间体化合物。对于这个实施例，这就意味着如果细胞例如是大肠杆菌，细胞内包含充足的基因参与生物合成方法，例如由葡萄糖生成糖苷配基化合物香草醛，那么，大肠杆菌应该在细胞内存在葡萄糖的条件下被发酵。

如果细胞例如是植物细胞，包含充足的基因参与生物合成方法，例如由络氨酸生成糖苷配基化合物，那么，植物细胞应该在生长的植物内存在适当数量的络氨酸的条件下生长。

技术人员知道并且确保怎样生长一个特殊的加倍量细胞。生成低分子量有机糖苷配基化合物的方法

如上所述，本发明的第三个方面内容涉及生成低分子量有机糖苷配基化合物的方法，包括如下步骤：

a)生长一个细胞，它含有一个参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因，和一个能够使生成的糖苷配基糖基化糖基转移酶基因编码，在适当的条件下，在细胞内生成糖苷配基和相应的糖苷配基糖基化形式；

b)糖苷配基的糖基化形式的去糖基化；并且

c)重新获得糖苷配基化合物；

(i)其中低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-3000

(ii)其中糖基转移酶具有把糖接合至糖苷配基化合物的能力。

上面所述所有实施方式也是本方面第三方面内容的实施方式，该方法必不可少的一步是步骤b)。这个步骤在下面进一步阐述，其中包含一些非限定的实施例，来证明这个去糖基化步骤的许多技术优越性。

虽然糖苷是经常期望的自然界产物，但是人们试图使用转基因糖基转移酶生成糖苷，使用它们生成相应的苷元可以获得更大的商业价值(例如Arend等，2001，Biotechnology and Bioengineering76：126-131)。一个实施例是香草醛，具有重要商业价值的自然香味剂。香草醛是含酚化合物，它在兰花香草属的果实中积累，以糖基化了的形式存在，糖基香草醛。为了得到预期的自然香味，糖基香草醛必须被去糖基化。可以通过果实的发酵(加工)得到，果实也就是所谓的香草豆，其中内生长的β-葡(萄)糖苷酶是具有活性的。

本发明第三方面内容的方法的步骤b)，自然界产物糖基化的中间体要通过一个去糖基化步骤。根据本专利中已知方法或者通过使用例如带有β-葡(萄)糖苷酶活性的酶，通过化学水解完成这个步骤。技术人员知道许多适当的β-葡(萄)糖苷酶，首先通过重新获得糖苷配基的糖基化形式得到，例如通过在适当的溶剂中提取糖基化的中间体，溶剂如甲醇，或者从有机体或植分泌物中收集糖基化的中间体，其次，糖基化的中间体被纯化并且在体外(离体)暴露给β-葡(萄)糖苷酶或者通过充分的化学水解。

替代的，稳定的糖基化的中间体独自存在植物体内，并且在细胞或组织内积累，细胞和组织使其免于内生长的β-葡(萄)糖苷酶的活性，在这种被保护的空间，糖基化的中间体不再暴露给酶的活性，活性能进一步产生代谢变化，达到它的去糖基化的平衡。糖苷也被改变，例如通过乙酰化作用或其他改性方法，在这种情况下免于受到β-葡(萄)糖苷酶作用。而且它能被及时的保护，如果预期的自然产物保持其糖基化的形式直到植物体内发生变化，会导致酶活性的大幅度的降低，否则就会使它的去糖基化形式进入新陈代谢过程。

对于本发明，优选的使预期糖苷配基的糖基化反应与随后的去糖基化反应是分开的，因为糖苷配基会经过进一步的新陈代谢过程。如上所述，这种分开可以是时间上的也可以是空间上的，更优选的空间上的。

在本发明第三方面内容的最后一步c)中，预期的糖苷配基被重新获得。

涉及有机分子的生物技术生产，本方法提出至少三个问题。第一，会增加有机分子的产量，所述有机分子是稳定的、且构成生产有机体(production organism)的各别生物合成方法的最终产物。第二，会增加有机分子的产量，所述有机分子不是各别生物合成方法的最终产物，且会进一步被生产有机体新陈代谢。第三，会增加对生产有机体有毒的有机分子的产量。

关于毒性，在实施例1和2中已经描述了，在糖基化的过程中，微生物中一个异源UDPG-葡糖基转移酶的存在能够增加对香草醛的抗毒性。显然这个规则不限定于香草醛，而是能够使用于任何有毒的物质，通过异源UDPG-葡糖基转移酶的作用，有毒物质可以被转化成低毒的糖苷，例如红豆衫醇(taxol)。

这种方法在增加对于预期的有机分子的耐受性是非常有帮助的，所述有机分子是它的生物合成方法的最终产物，因此会在生产有机体中积累到一定的浓度，可能会限定它的生成。然而，这种方法也能够降低其他物质的毒性，该物质在结构上和生物合成上与预期的分子不相关。这种物质可能是预期生物合成方法的副产物或者是生长的培养基的污染物。

对于木质纤维素的乙醇工业化发酵中，有报道说(Delgenes等，1996，Enzyme Microb Technol，19：220)香草醛在水解副产物中是最强的抑制剂，当它在培养基中浓度为5g/l时作为最强的生长抑制剂(Pfeifer等，1984，biotechnol lett6：541)。因此，通过微生物表达一个异源UDPG-葡糖基转移酶的木质纤维素的发酵不仅能增加乙醇的产量，而且在能潜在的引出一种方法，在重新获得且无毒香草醛糖苷的去糖基化后，同时生成有经济价值的香草醛的相似物。

这里所描述的方法对于许多有机分子的生物技术产物有直接的重要性，因为这样可以增加有机分子的产量，所述有机分子是稳定的、且构成生产有机体(production organism)的各别生物合成方法的最终产物。这种适当的方法在实施例3和4中被描述，例如在微生物体系中以香草醛的生产为例。然而，很显然在本文中对于那些技术人员，这些规则不是限定于来自于阿魏酸的香草醛的产物，实际上还能够适用于任何生物合成方法，生成预期的有机分子是最终产物，来对抗至少一种抑制剂。

当预期的有机分子是生物合成方法的最终产品，在许多情况下，它本身就是生成速度的一个限制因素，这是由于在生物合成方法中酶的产物抑制作用，因此导致降低生成速度。对于这个预期的生物合成方法，它不是得到高标准的预期最终产物，而是会生成一个中间产物，或者积累或者直接进入其他新陈代谢过程，随后消失。

本方法在生物合成方法中，通过引入附加的步骤来克服产物抑制作用，因此这个抑制性产物被移走且不再对酶起抑制作用。当生物合成不再受产物抑制作用的影响，则初始基质以及它们的转变：先是预期的产物，再是它们的糖基化衍生物，都会充分的增加。根据本方法，糖基化的衍生物然后被提取，再转变回预期的苷元，通过例如β-葡(萄)糖苷酶的活性。

预期的有机分子，却，不一定是生产有机体的生物合成方法的最终产物。在这些情况下，它会被进一步新陈代谢，并且最终会失去经济回收意义。实施例5和6证明了怎样通过本方法营救这种中间产物。在实施例中，通过一个异源UDPG-葡糖基转移酶的葡糖基化作用营救乙醛肟，对于那些技术人员本文中的规则是通用的，它可以用于能被糖基化的预期产物的任何中间产物。在这个实施例中提到的一个预期的分子，乙醛肟不是产物有机体的自然产物，但是在其他的实施例中预期的有机分子也是自然产生的物质。

高粱属植物的细胞色素P450酶合成体CYP79催化氨基酸络氨酸转变成乙醛肟、对-羟基苯基苯乙醇腈(Bak等，2000，Plant Physiol 123：1437)。试图把高粱属植物CYP79基因转变为其他植物或者微生物，会生成非常少量的肟，因为它是有毒的，故被进一步新陈代谢成至少两种目前还未证明的物质，X和Y，它们可能是腈和醇的衍生物(Halkier等，1995，A rchBiochem Biophys322：369；Bak等，2000，Plant Physiol 123：1437)。在植物中，例如烟草和阿布属(Arabidopsis)，经过一个肟类的UDPG-葡糖基转移酶的作用，肟也被葡糖基化为对-羟基苯基-(乙缩醛二乙醇肟糖苷，Acetaldoxime glucoside)。

预期的有机分子的糖基化形式转变为生产有机体中的最终产物是本领域的通用规则。除了产量上的优点外，这个规则在预期有机分子的净化或者提取过程中，也会有一些效益。在实施例7中证实，预期分子在糖基化作用后，其溶解度发生了变化。

如果预期的分子从生产有机体的其他现有物质或者生长的培养基中分离困难，则也可以利用这个规则。糖基化的形式被输出到另一个空间，而不是污染的分子，因此易于净化处理。替代的，它可以被生长的培养基分泌出来，其中污染的分子被独自留在有机体中，而且净化过程可以利用预期分子的糖基化形式具有新的化学特征，包括不仅是溶解性而且还有色谱性能等等。

选择增加生物合成流量的转基因有机体的方法

实施例6描述了如何使用本发明第三方面内容的方法，使用该方法在微生物中制备商用产品对-羟基苯基乙醛肟。通过传递高粱属植物CYP79基因和肟类特异性的UDPG-葡糖基转移酶(参见图1)到微生物内。导致对-羟基苯基-(乙缩醛二乙醇肟糖苷)的生成，对-羟基苯基-(乙缩醛二乙醇肟糖苷)是稳定的、无毒的。此外，这个糖苷可以被提取出来，并且由于在体外β-葡萄糖苷酶的活性存在它可被转变为预期的对-羟基苯基乙醛肟。

使用这种途径，本方法不仅可以生成预期分子，可能是肟，还允许转基因微生物的选择，转基因微生物是高粱属植物CYP79的活泼形式，由于酶的有毒产物立即通过糖基化过程去除毒性，所以具有很高的基因表达水平。如果肟类UDPG-葡糖基转移酶不存在，自然的选择会优先选择包藏CYP79基因的微生物，所述的CYP79基因表达水平低，变异形式活性小。

上面讨论的实施例，描述了怎样利用本方法通过选择得到更有效的产物生物体。这个规则不是限定上述的实施例，显然也适用于其他许多生物合成方法和产物生物体。

因此，如上所述，本发明的第四方面内容涉及选择一个细胞的方法，该细胞具有使低分子量有机糖苷配基化合物的糖基化形式增加，包括以下步骤：

a)生长一个细胞，它含有一个参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因，和一个能够使生成的糖苷配基糖基化的糖基转移酶基因编码，在适当的条件下，在细胞内生成糖苷配基和相应的糖苷配基糖基化形式；

b)处理所述细胞，通过改变参与生物合成方法生成低分子量有机糖苷配基的至少一个基因和/或具有使生成的糖苷配基糖基化的糖基转移酶基因的表达水平，以构建一个具有不同基因表达水平的基因细胞库，并且

c)选择一个细胞，于步骤a)相比，生成更高产量的糖苷配基的糖基化形式；

(i)所述低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-3000，并且

(ii)所述糖基转移酶具有使糖转变为糖苷配基化合物的能力。

这里的术语“细胞库(library of cells)”也可以解释为“细胞群(population of cells)”，细胞库包含至少两种不同细胞。

术语“不同的基因表达水平(different expression levels of thegenes)”是一个含有个体细胞的库，这些细胞可以增加或降低基因表达水平。优选的，这个库主要包含增加基因表达水平的个体细胞。

其中，细胞是在植物体内，植物库包含不同的植物，优选的，植物库包含10²种植物，优选的，植物库包含10³种植物，更优选的，植物库包含10⁵种植物，最优选的，植物库包含10⁶种植物。

当细胞是一个微生物时，细胞库相对可以容易增加，因此，当细胞是一个微生物时细胞库包含10⁵个细胞，优选的，包含10⁷个细胞，更优选的，包含10⁸个细胞，最优选的，包含10⁹个细胞。

用这种方法选出的细胞，是优选的细胞，使用于本发明的第一方面内容中的生成低分子量有机化合物，或者使用于本发明的第三方面内容中生成低分子量有机糖苷配基化合物，或者使用于这些方法的相关的实施方式制备低分子量有机化合物。

因此，本发明的一个实施方式涉及的方法，正如上述第四方面所述内容，首先选取细胞，其后这个细胞被用于本发明的第一方面内容描述的生成低分子量有机化合物的方法，或者被用于本发明的第三方面内容描述的生成低分子量有机糖苷配基化合物的方法，或者涉及使用这些方法制备低分子量有机化合物的不同实施方式。

通过使用大量不同的方案处理上述步骤b)中的细胞是本领域技术人员熟知的。引发突变的实施例包括通过UV处理，充分的化学处理使DNA变异，随机引发突变例如相关基因的特异性启动子，细胞改组以建立一个改组细胞的细胞库等等。

步骤c)选择的细胞，优选的，与步骤a)中的细胞相比，能够生成1.25倍量的糖苷配基的糖基化形式；优选的，步骤c)选择的细胞，与步骤a)中的细胞相比，能够生成1.5倍量的糖苷配基的糖基化形式；更优选的，步骤c)选择的细胞，与步骤a)中的细胞相比，能够生成2倍量的糖苷配基的糖基化形式；最优选的，步骤c)选择的细胞，与步骤a)中的细胞相比，能够生成3倍量的糖苷配基的糖基化形式。

根据本技术可以用多种方法选择，例如使用微量滴定实验方法，实验中包含一个特定细胞样品，测试糖苷配基糖基化形式的数量，根据常识，技术人员可使用许多其它的方法。

实施例8描述怎样使用这种方法使得模式植物拟南芥具有从每克净重中生产出更大产量蜀黍苷的能力。步骤a)中的起始细胞是模式植物拟南芥转基因细胞，在文献Tattersall，DB等，Science(2001)293：1826-8中描述。如上所述，对于生氰的糖苷蜀黍苷的合成，模式植物拟南芥转基因细胞包含全部的合成方法，证明转基因模式植物拟南芥植物具有从每克净重量中生成4mg蜀黍苷的能力。使用实施例8所描述的方法，由步骤c)选出一个模式植物拟南芥转基因细胞，从每克净重中能够生产出大于6mg的蜀黍苷。

不限于理论，相信这是第一次提供一个植物，该植物具有从每克低分子量有机糖苷配基化合物的糖基化形式的净重量中生成4mg产品的能力。

因此，正如本发明的第五方面内容涉及一种植物，该植物具有由每克低分子量有机糖苷配基化合物的糖基化形式的净重量中生成5mg产品的能力。

(i)所述低分子量有机糖苷配基化合物的分子量为50-3000。

优选的，植物具有由每克低分子量有机糖苷配基化合物的糖基化形式的净重量中生成6mg产品的能力，更优选的，植物具有由每克低分子量有机糖苷配基化合物的糖基化形式的净重量中生成8mg产品的能力。更优选的，植物具有由每克低分子量有机糖苷配基化合物的糖基化形式的净重量中生成5mg-40mg产品的能力。

优选的，植物是转基因植物。

实施例：

通常的分子生物学方法

如果上述DNA不按上述方法处理及转化，则使用分子生物学的标准方法来实施(Sambrook等，(1989)Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等(eds)“Current protocols in Molecular Biology”.John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.and Cutting，S.M.(eds)“Molecular BiologicalMethods for Bacillus”.John Wiley and Sons，1990)。

处理DNA的酶的使用是根据提供者的说明书进行。

实施例1：在微生物表达一个UDPG-葡糖基转移酶过程中，分析增强对香草醛的抗毒性。

香草醛敏感性受大量的微生物控制，微生物包括大肠杆菌菌株DH5-α，TOP10，JM109和KO1418；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株DSM50091，DSM50108和DSM50124；枯草杆菌(Bacillus subitilis菌株DSM704；和棒状杆菌(Corynebacterium)glutamicum菌株DSM20300。微生物也包括菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、S.uvarum、S.bayamus、S.paradoxus、S.kudriavzevii、S.mikatae、S.cariocanus、S.servazzii、S.castellii、S.kluyverii、Kluyveromyces lactis、Zygosaccharomyces fermentatii、Torulaxporadelbruekii、Debaromyces orientali和Schizosaccharomyces pombe。

香草醛抑制剂的最小浓度是通过两部分的连续稀释实验控制的(Hufford等，1975，J Pharm Sci 4：789)，而且，香草醛的浓度必须能够抑制大于50％的生长。一旦在不同细菌和酵母菌株中香草醛的敏感度得到控制，为了得到能够表达宽范围香草醛的敏感度的微生物菌株，则从中选取一些不同的细菌和酵母菌株。

选出的菌株被UDPG-葡糖基转移酶基因转化，例如两色蜀黍蜀黍属UDPG-葡糖基转移酶UGT85B1(Jones等，1999，J Biol Chem 274：35483)，模式植物拟南芥UDPG-葡糖基转移酶UGT89B1(Lim等，2002，JBiol Chem277：586)和蛇根木(Rauvolfia serpentina)杨梅酶合酶(arbutinsynthase)(Arend等，2001，Biotechnol Bioeng76：126)。

对于大肠杆菌中的UDPG-葡糖基转移酶表达，使用IPTG-诱导的表达载体pSP19g10L，pKK223-3和pET101D/Topo。此外，通过使用大肠杆菌糖分解的基因促进剂改变大肠杆菌的结构，使用新构造的大肠杆菌表达载体。对于荧光假单胞菌的表达(P.fluorescens)，使用BHR表达带菌pYanni3。对于酵母中的UDPG-葡糖基转移酶的表达，基因是由PCR放大的且引入到质粒中的pJH259，其中，基因由构建的但很强的糖分解的TPII促进剂表达。替代的，TPII促进剂是由PCR放大的MET25促进剂交换生成的，这个过程可由甲硫氨酸抑制。

如上所述，在生长的培养基中UDPG-葡糖基转移酶表达的微生物要进行对香草醛的敏感度分析。由抑制剂的浓度最小或者是能够抑制大于50％生长的抑制剂浓度控制增强对香草醛的抗毒性，意味着转基因UDPG-葡糖基转移酶的活性使得一些或大部分提供的香草醛转变为香草醛糖苷，毒性大大降低。

实施例2：在微生物表达一个UDPG-葡糖基转移酶中糖苷的鉴定。

微生物表达一个异源UDPG-葡糖基转移酶在含有适当浓度的香草醛或乙基香草醛培养基内生长，获得微生物，且其包含的糖苷组分从甲醇或其他适当的溶剂中提取。生成香草醛糖苷或乙基香草醛糖苷且浓度被量化。比较转基因微生物、非转基因微生物和微生物生长在含有香草醛或乙基香草醛的培养基内、微生物生长在不含香草醛或乙基香草醛的培养基内情况下，香草醛糖苷和乙基香草醛糖苷的含量。

UDPG-葡糖基转移酶表达的微生物，且微生物生长在含有香草醛或乙基香草醛的培养基的条件下香草醛糖苷含量增加，这说明糖苷配基被转化且被转基因生物体葡糖基化。

实施例3：在微生物表达一个UDPG-葡糖基转移酶的条件下，增加阿魏酸(feru1ic acid)的吸收量和流通量

能够使阿魏酸转化为香草醛的微生物基因被改变，表达一个异源UDPG-葡糖基转移酶。在这些研究中，使用放线菌Streptomyces setonii菌株ATCC39116，由于它曾经被用于阿魏酸转变为香草醛的工业生产(Muheim& Lerch，1999，Appl Microbiol Biotechnol51：456；Muheim等，1998，EP 0885968A1)。替代的，使用恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)菌株AN103(Narbad & Gasson，1998，Microbiol144：1397；Narbad等，1997，WO97/35999)，或使用Amycolatopsis sp.菌株HR167(Rabenhorst & Hopp，1997，EP 0761817A2)。为了表达两色蜀黍蜀黍属UDPG-葡糖基转移酶UGT85B1、模式植物拟南芥UDPG-葡糖基转移酶UGT89B1或者蛇根木杨梅酶合酶，微生物被转化成为适当的结构。

遗传改变的微生物在包含适当浓度阿魏酸的培养基中生长。阿魏酸的吸收由随后它在培养基的浓度控制，微生物和生长的培养基内的香草醛和香草醛糖苷的浓度分析控制它的新陈代谢转变产物。这些值与在不含有转基因微生物条件下的实验类似分析相比较。

通过微生物表达异源UDPG-葡糖基转移酶阿魏酸吸收量增加，香草醛糖苷积累，这就证明了糖基转移酶能够增加阿魏酸转变为香草醛的转变量，香草醛随后转变为香草醛糖基。

实施例4：微生物表达一个UDPG-葡糖基转移酶，通过生成的香草醛糖苷的去葡糖基化反应增加香草醛的产量。

具有使阿魏酸转变为香草醛的微生物，在一个基因编码一个UDPG-葡糖基转移酶的存在下被转化，且在阿魏酸的存在下生长。为了弥补被微生物吸收和用于香草醛合成的阿魏酸数量，控制其在生长培养基中的浓度衡定。几天后，香草醛从微生物中提取并且定量。此外，香草醛糖苷被提取并且通过体外(离体)β-葡(萄)糖苷酶的活性转变为香草醛，定量分析重新获得的香草醛。

在不含被转化微生物的条件下，进行类似实验，定量分析作为最终合成产品的香草醛和通过体外(离体)β-葡(萄)糖苷酶的活性重新获得的香草醛。

提取香草醛和从UDPG-葡糖基转移酶表达微生物中重新获得的香草醛的总量，与不含转化微生物相比产量高很多，这证明了一个异源UDPG-葡糖基转移酶的存在能够使更多的阿魏酸参与香草醛和其糖基化形式的合成，然后从中重新获得香草醛。因此通过表达一个UDPG-葡糖基转移酶使香草醛的总产量增加。

实施例7：通过糖基化反应使有机分子的纯化更容易

本实施例中应用的细胞是实施例13中所述大肠杆菌细胞，能够生成香草醛糖苷。

在连续的发酵过程中，发酵罐与生长培养基接种，在需氧条件下开始发酵。

最初的12-18小时是细胞生长阶段，12-18小时后，为了生成香草醛糖苷，将葡萄糖输入发酵罐中。在这个发酵阶段生长速度是线性的，可以预料其限定因素是香草醛糖苷的溶解性，众所周知其他相关的糖苷的溶解性在ATP条件下是app.100g/l，随温度升高溶解性会增加。

大约30小时后，浓度达到很高，开始生成产物，分离细胞，在发酵罐中循环使用。

表面悬浮产物或者由于香草醛糖苷的溶解性的限制而浓缩，或者直接经过一个含β-葡(萄)糖苷酶的分离柱。表面悬浮产物再循环进入发酵罐，如果存在其他产物，香草醛溶液在再循环前要通过一个净化柱。可以预料，当净化和再生成其他产物时，本过程需要使用一排净化柱。

经过酶的处理，产物以晶体形式被重新获得。为了减少再循环香草醛的量，温度要低于酶处理过程的温度。

实施例9：大肠杆菌不同菌株的香草醛敏感度

三种不同的大肠杆菌菌株TOP10、JM109和KO1418，在生长的培养基经过一系列的稀释后(稀释因子1，1/100，1/10000和1/1000000)在适当的培养基中生长18个小时，这些细胞悬浮物的液滴放入皮氏培养皿中，内有含有不同浓度的香草醛的固体LB生长培养基，在适当的生长温度下培养24小时(大肠杆菌)，然后为它们拍照。据记载，当稀释因子为1/10000时，在已知微生物中生长的香草醛的百分比(w/v)浓度不能被检测到，当稀释因子为1/100时，浓度也是相当有限的。这个数值构成STV(对香草醛的敏感度)标准，对于不同微生物的STV值参见表9.1

表9.1在固体生长培养基内的不同的大肠杆菌的香草醛敏感度

菌株	基因型	STV
			top10	F-mcrA Delta(mrr-hsdRMS-mcrBC)Phi801acZ Delta-M15 Delta-lacX74recA1 deoR araD139 Delta(ara-leu)7697 gaIU gaIK rpsL(strR)endA1nupG	0.12
JM109	FtraD36 lacIq Delta(lacZ)M15 proA+B+/el4-(McrA-)Delta(lac-proAB)thi gyrA96(NalR)endA1 hsdR17(rK-mK-)relA1 supE44 recA1	0.14
			KO1418	F-Delta(codB-lacI)3 relA1?bglA677::Tn10 spoT1 bgIB676::Lambda-lacZbglGo-67 thi-1	0.18

实施例10：两色蜀黍蜀黍属UGT85B1、模式植物拟南芥UGT89B1和蛇根木杨梅属合酶(AS)基因的PCR放大

Roche Pwo聚合酶和一个DNA热机循环装置，用于全部PCR放大，涉及本发明的低聚核苷酸的说明见表10.1

表10.1研究使用的低聚核苷酸

OHgo JH#	名称	序列(5′-3′)
1	SB_GT_KK_F	ATTAGAATTCATGGGCAGCAACGCGCCGCCGCCG
			2	sB_GT_KK_R	ATTAAAGCTTTTACTGCTTGCCCCCGACCAGCAG
3	SB_GT_pET_F	CACCATGGGCAGCAACGCGCGGCGCCGG
			4	SB_GT_pET_R	TTACTGCTTGCCCCCGACCAGCA
5	SB_GT_S_F1	ATGGGCGGCACGCGCCGCCCT
			6	SB_GT_S_F2	CGCAGCTGCCAGGGAGGCCGG
7	SB_GT_S_F3	GCCTCCGCCGGCCTCGCCGCC
			8	SB_GT_S_F4	CAGACCACCAACTGCAGGCAG
9	SB_GT_S_R1	GAGAGGGAGAGGCCGTCGTCG
			10	AT_GT_KK_F	ATTAGAATTCATGAAAGTGAACGAAGAAAACAAC
11	AT_GT_KK_R	ATTAAAGCTTTTATTTGTTTAGTCCTAAACTAACGAC
			12	AT_GT_pET_F	ATGAAAGTGAACGAAGAAAACAAC
13	AT_GT_pET_R	TTATTTGTTTAGTCCTAAACTAACGAC
			14	AT_GT_S_F1	ATGAAAGTGAACGAGGAAAAC
15	AT_GT_S_F2	GAATCCCTCGTTTCGATTTCT
			16	AT_GT_S_F3	CTTGACGCACGTGAGGATAAC
17	AT_GT_S_F4	CCTGACACGGTGCCTGACCCG
			18	AT_GT_S_R1	CGGAGGGGATTGAAGGGTGGG
19	AS_GT_EC_KK_F	ATTAGAATTCATGGAACATACCCCGCACATT
			20	AS_GT_EC_KK_R	ATTAGAATTCTTATGTACTGGAAATTTTGTTC
21	AS_GT_EC_pET_F	CACCATGGAACATACCCCGCACATT
			22	AS_GT_EC_pET_R	TTATGTACTGGAAATTTTGTTC
23	AS_TG_S_F1	ATGGAGCATACACCTCACAT
			24	AS_GT_S_F2	GACGGCCATGTGCCTGTCTC
25	AS_GT_S_F3	GGGGCAGTCTCCCATAATCA
			26	AS_GT_S_F4	AGGGTCTTAAAGTGGCCCTG
27	AS_GT_S_R1	TACGGGTCTCTATCCTAACA
			28	Pfba_F	ATTAGAATTCAAAAATCACAGGGCAGGGAAAC
29	Pfba_R	ATTAGGCGCGCCTCTAGAGTCTCTTGTCCTGTATCGTCGGG

30	PpfkA_F	ATTAGAATTCTCAGTATAAAAGAGAGCCAGAC
			31	PpfkA_R	ATTAGGCGCGCCTCTAGAGACTACCTCTGAACTTTGGAAT
32	PgapA_F	ATTAGAATTCTTGCTCACATCTCACTTTAATC
			33	PgapA_R	ATTAGGCGCGCCTCTAGAATATTCCACCAGCTATTTGTTA
34	PtpiA_F	ATTAGAATTCCAAAAAGCAAAGCCTTTGTGCC
			35	PtpiA_R	ATTAGGCGCGCCTCTAGATTTAATTCTCCACGCTTATAAG
36	TcysB_F	ATTAGGCGCGCCGGATCCTTTCTTGCGTTATTTTCGGCACC
			37	TcysB_R	ATTAAAGCTTGAAAAACCGCCAGCCAGGCTTT
38	SB_GT_EC_NP_F	ATTATCTAGAATGGGCAGCAACGCGCCGCCGCCG
			39	SB_GT_EC_NP_R	ATTAGGATCCTTACTGCTTGCCCCCGACCAGCAG
40	AT_GT_EC_NP_F	ATTATCTAGAATGAAAGTGAACGAAGAAAACAAC
			41	AT_GT_EC_NP_R	ATTAGGATCCTTACCACCGTTCTATCTCCATCTTC
42	RS_GT_EC_NP_F	ATTATCTAGAATGGAACATACCCCGCACATT
			43	RS_GT_EC_NP_R	ATTAGGATCCTTATGTACTGGAAATTTTGTTC

用于大肠杆菌IPTG控制表达的UGT85B1，UGT89B1和AS。

UGT85B1的放大用于大肠杆菌带菌体pKK223-3，(Amersham-Pharmacia生物技术)，使用低聚核苷酸JH#1和JH#2(见表10.1)，质粒pSP19g10L-UGT85B1(Jones等，1999，J Biol Chem274：35483)作为反应模板，反应条件是：94℃、2分钟、1循环，94℃、30秒、梯度50-60℃、1分钟、72℃、2分钟、30循环，随后是72℃、7分钟、1循环，本反应包括5％DMSO。反应产物是预期链段大小为1.5kb的结合体，用于绑扎到pCR-Blunt II-Topo载体上。包括1.5kb EcoRI引入物的克隆通过引子JH#5-9排序。用一个恰当DNA序列的克隆被识别且命名为pJH400。UGT85B1 ORF通过EcoRI-HindII(在引子的5’-终端中包括这些限制点)从pJH400中释放出来，引入EcoRI-HindII中，消化pKK223-3质粒。用一个恰当的UGT85B1引入的克隆被识别，且命名为pJH401。

UGT85B1的放大用于大肠杆菌载体pET101-D/Topo，实施一个被鉴别的PCR反应，只使用引子JH#3和4。实施相同的PCR过程，恰好1.5kb大小的链段直接引入表达载体pET101-D/Topo中。使用引子JH#5-9为几个克隆的引入排序，一个恰当的克隆名称是pJH402。

UGT89B1的放大用于大肠杆菌载体pKK223-3，使用低聚核苷酸JH#10和JH#11(见表10.1)，基因组模式植物拟南芥DNA(var.Columbia Col-0)作为反应模板。反应条件是94℃、2分钟、1循环，94℃、30秒、梯度50-60℃、1分钟、72℃、2分钟、30循环，随后是72℃、7分钟、1循环。反应产物是个预期链段大小为1.4kb的结合体，用于绑扎到pCR-Blunt II-Topo载体上。包括1.4kb EcoRI引入物的克隆通过引子JH#14-18排序。用一个恰当DNA序列的克隆被识别且命名为pJH462。UGT89B1 ORF通过EcoRI-HindII(在引子的5’-终端中包括这些限制点)从pJH462中释放出来，引入EcoRI-HindII中，消化pKK223-3质粒。用一个恰当的UGT89B1引入的克隆被识别，且命名为pJH463。

UGT89B1的放大用于大肠杆菌载体pET101-D/Topo，实施一个相同的PCR反应，只使用引子JH#12和13。实施相同的PCR过程，恰好1.4kb大小的链段直接引入表达载体pET101-D/Topo中。使用引子JH#14-18为几个克隆的引入排序，一个恰当的克隆名称是pJH406。

AS的放大用于大肠杆菌载体pKK223-3，使用低聚核苷酸JH#10和JH#20(见表10.1)，质粒pQE60-AS(Arend等，2001，Biotechnol Bioeng76：126)作为反应模板。反应条件是94℃、2分钟、1循环，94℃、30秒、梯度48-55℃、1分钟、72℃、2分钟、30循环，随后是72℃、7分钟、1循环。反应产物是个预期链段大小为1.4kb的结合体，用于绑扎到pCR-BluntII-Topo载体上。包括1.4kb EcoRI引入物的克隆通过引子JH#23-27排序。用一个恰当DNA序列的克隆被识别且命名为pJH409。AS ORF通过EcoRI(在两个引子的5’-终端中包括EcoRI点)从pJH409中释放出来，引入EcoRI中，消化pKK223-3质粒。用一个恰当的AS引入的克隆被识另，且命名为pJH410。

AS的放大用于大肠杆菌载体pET101-D/Topo，实施一个相同的PCR反应，只使用引子JH#21和22。实施相同的PCR过程，恰好1.4kb大小的链段直接引入表达载体pET101-D/Topo中。使用引子JH#23-27为几个克隆的引入排序，一个恰当的克隆名称是pJH411。

UGT85B1、UGT89B1和AS用于构造大肠杆菌的表达

当糖基转移酶基因受到四个糖分解的大肠杆菌基因促进剂其中的一个控制时，构造一系列UGT85B1和AS的表达体系，四个基因促进剂是：fba(引子JH#28和29)、pfkA(JH#30和31)、tpiA(JH#32和33)和gapA(JH#34和35)促进剂，并且全部糖基转移酶由大肠杆菌cysB终止剂(引子JH#27和28)序列控制。全部结构都基于下面的方案：促进剂链段由大肠杆菌DN5α基因组DNA的PCR放大，使

BamHI-AscI(这些点在引子中存在)引入pKOL30中(Olesen等，2000，Yeast16：1035)，然后，在生成的结构中，AscI-HindIII(引子中存在此点)引入cysB链段，最后，在生成的结构中，PCR放大的UGT85B1(引子JH#38和39)、UGT89B1(引子JH#40和41)或AS(引子JH#42和43)被引入XbaI-EcoRI(这些点在AscI点内存在，在3’-终端引子中，用于放大的促进剂，在5’-终端引子中，用于放大的终止剂，引子中也用于UGT和AS基因的放大)。

PCR反应条件是，94℃、2分钟、1循环，94℃、30秒，55℃、1分钟(对于促进剂和终止剂链段，也对于UGT链段)或者48℃、1分钟(对于AS链段)，72℃、2分钟、30循环，接着是72℃、7分钟、1循环。对于UGT85B1的放大，包括5％DMSO。反应样品是包含预期链段大小的结合体，如上所述，使用凝胶净化并且用于克隆实验。

生成的质粒为pJH430(fba-UGT85B1)、pJH431(pfkA-UGT85B1)、pJH432(gapAA-UGT85B1)、pJH433(tpiA-UGT85B1)、pJH434(fba-UGT89B1)、pJH435(pfkA-UGT89B1)、pJH436(gapA-UGT89B1)、pJH437(tpiA-UGT89B1)、pJH438(fba-AS)、pJH439(pfkA-AS)、pJH440(gapA-AS)和pJH441(tpiA-AS)。

实施例11：通过UGT或AS基因大肠杆菌的表达，去除香草醛的毒性在标准转变方案中，大肠杆菌菌株TOP10、JM109和KO1418的转化由合成的质粒pJH401、pJH402、pJH411和pJH412和pKK223-3控制，为了抵抗氨比西林(氨苄青霉素)，选择转化株(已经转化的细菌细胞)，每个大肠杆菌菌株的每个质粒的两个转化株参与基因表达实验。大肠杆菌的转化株被接种，从培养皿到2ml液态生长培养基(LB培养基，氨比西林浓度100μg/ml)，37℃条件下生长20小时。在培养基内，预培养物被稀释100倍、10⁴倍和10⁶倍，这些细胞悬浮物的4μl液滴放入皮氏培养皿中，培养皿内有固体LB-氨比西林培养基，固体培养基内含有不同浓度的香草醛(如上所述，基于STV等控制)，没有或有(诱导基因表达)1mM异丙基葡糖硫苷(IPTG)。培养皿在37℃条件下培养24小时之后，控制并且记录在不同浓度的香草醛中的生长，结果总结如表11.1。

E.coli strain％Vanillin	0％	0.08％	0.12％	0.16％	0.2％	IPTGindnction
							JM109[pKK223-3]	++	++	++	-	-	No
++	++	++	-	-	Yes
						JMl09[pJH401]		++	++	++	-	-	No
++	++	++	-	-	Yes
大肠杆菌菌株％香草醛	0％	0.08％	0.12％	0.16％	0.2％	IPTG导入
							JM109[pKK223-3]	++	++	++	-	-	无
++	++	++	-	-	有
						JM109[pJH401]		++	++	++	-	-	无
++	++	++	-	-	有
							JM109[pJH402]	++	++	++	+	-	No
++	++	++	++	-	Yes
						JM109[pJH410]		++	++	++	++	-	No
++	++	++	+	-	Yes
							KO1418[pKK223-3]	++	++	++	-	-	No

表11.1两色蜀黍蜀黍属UGT85B1或蛇根木AS IPTG-诱导的基因表达影响香草醛的毒性与三个不同大肠杆菌菌株的关系，-：不生长；+：弱生长；++：良好生长。

从这些实验中总结出，在一些大肠杆菌菌株和一些类型的IPTG诱导的基因促进剂存在的条件下，两色蜀黍蜀黍属UGT85B1的基因表达是可能的，通过AS基因的表达得到具有去除毒性的香草醛，同时，在大肠杆菌菌株中磷-β-葡(萄)糖苷酶编码bgl基因座失去活性(菌株KO1418)。

运用标准转化方案，在UGT85B1和AS快速合成的表达的实验中，大肠杆菌菌株JM109和KO1418的转化由合成的质粒pJH430、pJH431、pJH432、pJH433、pJH434、pJH435、pJH436、pJH437、pJH438、pJH439、pJH440、pJH441、pKOL30控制。为了抵抗氨比西林(氨苄青霉素)，选择转化株(已经转化的细菌细胞)，每个大肠杆菌菌株的每个质粒的两个转化株参与基因表达实验。大肠杆菌的转化株被接种，从培养皿到2ml液态生长培养基(LB培养基，氨比西林浓度100μg/ml)，37℃条件下生长20小时。在培养基内，预培养物被稀释100倍、10⁴倍和10⁶倍，这些细胞悬浮物的4μl液滴放入皮氏培养皿中，培养皿内有固体LB-氨比西林培养基，固体培养基内含有不同浓度的香草醛(如上所述，基于STV等控制)，培养皿在37℃条件下培养24小时之后，控制并且记录在不同浓度的香草醛中的生长，结果总结如表11.2。受质粒pJH430、pJH431、pJH432和pJH433控制的大肠杆菌菌株JM109和KO1418的结果，总结见表11.2。

E.coli strain％Vanillin	0％	0.08％	0.12％	0.16％
					JM109[pKOL30]	+++	+++	++	-
JM109[pJH430]	+++	+++	+++	++
					JM109[pJH431]	+++	+++	+++	++
JM109[pJH432]	+++	+++	+++	+
					JM109[pJH433]	+++	+++	+++	+
KO1418[pKOL30]	+++	+++	++	+
					KO1418[pJH430]	+++	+++	+++	+++
KO1418[pJH431]	+++	+++	+++	+++
					KO1418[pJH432]	+++	+++	+++	+
KO1418[pJH433]	+++	+++	+++	+++

表11.2  两色蜀黍蜀黍属UGT85B1或蛇根木AS合成的基因表达影响香草醛的毒性与两个不同大肠杆菌菌株的关系，-：不生长；+：弱生长；++：良好生长。

从这些实验中，我们总结出在大肠杆菌菌株JM109中的糖基转移酶的合成的基因表达可以去除香草醛的毒性。

实施例12：在UGTT85B1-，UGT89B1-，或AS-表达的大肠杆菌株条件下生成香草醛糖苷(VG)产物

为了在含有亚致死浓度香草醛的液态生长培养基中获得VG产物，测试多种大肠杆菌菌株表达UGT85B1或AS。测试菌株为JM109和KO1418，它们包含以下质粒中的任意一种：pKK223-3、pJH401、pJH402、pJH406、pJH463、pJH410、pKOL30、pJH430、pJH431、pJH432、pJH433、pJH434、pJH435、pJH436、pJH437、pJH438、pJH439、pJH440和pJH441。

大肠杆菌菌株被接种，在2ml包含氨比西林浓度为100μg/ml的LB培养基中，37℃条件下生长一夜，然后在相同的生长培养基(0.1mlo.n.培养)稀释到50ml。37℃条件下生长2小时，对于那些含有IPTG-诱导的UGT/AS-表达的质粒的菌株，加入IPTG使其浓度达到1mM(0.5ml100mM原料)。细胞悬浮物在28℃下培养1小时后，加入香草醛使其浓度达到0.05％(83μl30％乙醇原料)，然后在28℃下生长24小时。使用离心LC-MS培养，控制生长在表面上VG含量，同时控制细胞颗粒的溶菌液的生长。

在另一组实验中，相同的大肠杆菌菌株生长在相同的条件下，但是不含有香草醛，而是在生长的培养菌中加入¹⁴C-示踪的香草醛之后，28℃条件下培养1-24小时。浮在表面上的样品如同细胞样品一样按规则取出，生成细胞溶菌液，生长的悬浮产物和细胞溶菌液经过TLC(薄层色谱法)检测，正如文献(Jones等，1999，J Biol Chem274：35483)所阐述的。

上述两个分析能够从表达UGT或AS基因的细胞中检测到香草醛糖苷的存在，而在没有表达UGT或AS基因的细胞中不能检测到香草醛糖苷。

实施例13：重新创建一种生物合成方法，为微生物表达的葡糖基转移酶提供香草醛

创建一种微生物方法，使得葡萄糖转化香草醛，三种异源酶活的表达在UDPG-葡糖基转移酶表达的微生物中完成。

第一种酶活性是一个3-dehydroshikimate脱水酶，即3-dehydroshikimate，它从通常的芳香族氨基酸生物合成方法中处理远距离的香草醛前驱体，把它转变为原儿茶酸。3-dehydroshikimate脱水酶(3DHD)基因可以从粗糙链孢菌(Neurospora crassa)(Ruthledge，1984，Gene 32：275)、曲霉(Aspergillus)nidulans(Hawkins等，1985，Curr Genet9：305)、柄孢殼菌(Podospora pauciseta)(GenBank accession#AL627362)和乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(Elsemore & Ornston，1995，J Bacteriol 177：5971)中了解。第二种必须的酶是一个芳香族羧酸还原酶(ACAR)，它能够使原儿茶酸转变为3，4-二羟苯甲醛。ATP-决定的ACAR活性可以从以下提及的菌类中发现：某些放射菌类(诺卡氏菌属Nocardia sp.)(使用诺卡氏菌属的ACAR专利为：Rosazza & Li，2001，US 6262814B1)，粗糙链孢菌(Neurospora crassa)(Gross & Zenk，1969，Eur J Biochem 8：413(使用ACAR酶制备的专利为：Frost，2002；US6372461B1)和一些担子菌类(basidiomycetes)，所谓的“白腐”真菌，它们是木质素的降解剂(例如粗蚕丝(Trametes)，Dichomitus，Bjerkandera和侧茸(Pleurotus)(蚝蘑‘Oyster mushroom’)属(Hage等，1999，ApplMicrobiol Biotechnol 52：834)。短链N-终止的诺卡式菌属(Nocardia)酶的蛋白质序列的数据参见文献(Li & Rosazza，1997，J Bacteriol179：3482)，基因的全部核苷酸序列已被近期公布，参见文献(He等，2004，Appl Env Microbiol 70：1874-1881)。最后酶活性是一个3-邻-甲基化作用，这对于最终转变为香草醛是非常必要的，这个候选的酶是一个草莓S-腺苷甲硫氨酸：呋喃醇邻-甲基转移酶基因(FaOMT)(Wein等，2002，Plant J 31：755)，由于这个酶是3，4-二羟苯甲醛在3-邻位的特殊的甲基化形式。替代的甲基酶包括白杨(Bugos等，1991，Plant Mol Biol17：1203)、杏树(Garcia-Mas等，1995，Plant Phys 108：1341)和香草香荚兰(Pak等，2004，Plant Cell Rep：11)OMTs。为了避免有毒中间产物的积累，在一个功能UGT-表达的微生物菌株中第一个表达的基因是甲基转移酶基因。当检测到这个基因时(例如由3，4-二羟苯甲醛生成香草醛糖苷)，则引入乙醛脱氢酶，等，直到开始内在的3-dehydroshikimate-生成方法达成。

使用Fragraria x ananassa(草莓)cDNA作为模板DNA，由PCR分离草莓FaOMT基因。通过使用QBiogene Fastprep Pro Green kit，从成熟的F.ananassa var.Elanta中分离出cDNA，从合成的RNA制备的cDNA是通过Invitrogen Superscript II逆转录酶合成的。这些cDNA的制备用于使用FaOMT ORF类引子和Pwo聚合酶(Roche Biochemicals)的PCR的放大。合成1.1kb含FaOMT的DNA链段被分离，并引入到可诱导的大肠杆菌表达载体pJH-X1中的Xba I和BamHI点间，合成质粒pJH-X2。

大肠杆菌菌株JH1，相当于含有质粒pJH430(由大肠杆菌fba促进剂表达UGT85B1)的大肠杆菌JM109，由质粒pJH-X2转化。生成的大肠杆菌JH2在加入3，4-二羟苯甲醛的液态LB生长培养基中生长，诱导基因表达。长出的培养菌浮在表面上的部分经过LC-MS检测，识别香草醛糖苷，意味着可以使3，4-二羟苯甲醛转化成香草醛糖苷的生物合成方法的建立。

影响3，4-二羟苯甲醛转化为香草醛过程的一个ACAR基因，用下面方式分离：通过使用Invitrogen Superscript II逆转录酶方法，从白腐真菌平菇(Pleurotus ostreatus)或Trametes gibbosa中提取的全部RNA用来合成cDNA，通过使用Stratagene的cDNA库结构体系，构建一个含噬粒的cDNA库。从这些库中选择的DNA用于分离白腐真菌ACAR基因的5’-区，利用Nocardia ACAR核苷酸序列信息的优点。前置引子与载体序列相同，cDNA的插入点立即逆流而上，相反的引子与Nocardia ACAR基因异源，此基因的被转化氨基酸序列与其他被公认的ACAR基因的被转化氨基酸序列相比，Nocardia ACAR基因能够达到最大程度的进化转变，那些被公认的ACAR基因可以从公开的序列数据库中得到(通过与Nocardia ACAR比较)。许多在不同核苷酸点含有碱基摆动式(例如引子的降解)的这些引子与前置引子一起用于PCR反应，使用cDNA库，从上述描述的任意一种选择DNA，和高保真(High Fidelity Plus)聚合酶(Roche Biocehmicals)。

选择最佳的退火温度和镁离子浓度，提取大约0.8kb的PCR链段。通过亚克隆(克隆内产生的突变型细胞的后代)和核苷酸序列分析，P.ostreatus或T.gibbosa ACAR的链段编码为5’-区。获得的序列信息用于说明内含ACAR前置低聚核苷酸引子，为了放大平菇(P.ostreatus)或者T.gibbosa ACAR基因的3’-终端，这个前置引子与反置引子一起用于末端为3’-终端的cDNA的插入物，所述反置引子与数据库中载体序列相同。基因链段排序后被分离，定义为ACAT基因3’-终端一类低聚核苷酸引子，在最终的PCR反应中，与5’-终端一类引子一起使用，获得长链平菇(P.ostreatus)或T.gibbosa ACAR。本克隆中cDNA的引入要经过DNA排序分析，确定ACAR基因序列后，基因才能被引入到一个影响3，4-二羟苯甲醛到香草醛的转化的ACAR基因上，按照以下方式分离基因：通过使用Invitrogen Superscript II逆转录酶方法，从白腐真菌平菇(Pleurotusostreatus)或Trametes gibbosa中提取的全部RNA用来合成cDNA。使用Stratagene的cDNA库结构体系构建一个噬粒cDNA库。从这些库中选择的DNA用于分离白腐真菌ACAR基因的5’-区，利用Nocardia ACAR核苷酸序列信息的优点。前置引子与载体序列相同，cDNA的插入点立即逆流而上，相反的引子与Nocardia ACAR基因同源，此基因的被转化氨基酸序列与其他被公认的ACAR基因的被转化氨基酸序列相比，Nocardia ACAR基因能够达到最大程度的进化转变，那些被公认的ACAR基因可以从公开的序列数据库中得到(通过与Nocardia ACAR比较)。许多在不同核苷酸点含有碱基摆动式(例如引子的降解)的这些引子与前置引子一起用于PCR反应，使用cDNA库，从上述任意一种选择DNA，和高保真(High Fidelity Plus)聚合酶(Roche Biocehmicals)。选择最佳的退火温度和镁离子浓度，提取大约0.8kb的PCR链段。通过亚克隆和核苷酸序列分析，平菇(P.ostreatus)或T.gibbosa ACAR的链段编码为5’-区。获得的序列信息用于说明内含ACAR前置低聚核苷酸引子，为了放大平菇(P.ostreatus)或者T.gibbosaACAR基因的3’-终端，这个前置引子与反置引子一起用于末端为3’-终端的cDNA的插入物，所述反置引子与数据库中载体序列相同。基因链段排序后被分离，定义为ACAT基因3’-终端一类低聚核苷酸引子，在最终的PCR反应中，与5’-终端一类引子一起使用，获得长链平菇(P.ostreatus)或T.gibbosa ACAR。本克隆中cDNA的引入要经过DNA排序分析，确定ACAR基因序列后，基因被引入到酿酒酵母表达的带菌体pJH413，合成质粒pJH413-X1，引入到大肠杆菌带菌体pJH-X2，合成质粒pJH-X3。

通过质粒pJH-X3作用转化大肠杆菌菌株JH1(表达UGT85B1)，生成的大肠杆菌菌株JH3生长在加入原儿茶酸的液态LB生长培养基中，诱导基因表达。长出的培养菌悬浮物经过LC-MS检测，识别香草醛糖苷，意味着可以使原儿茶酸转化成香草醛糖苷的生物合成方法的建立。

从柄孢殼菌(Podospora pauciseta)中分离一个3DHD基因，方法如下：使用QBiogene Fastprep DNA体系使得基因组DNA从柄孢殼菌(P.pauciseta)中分离出来，使用本基因组DNA作为模板通过PCR放大3DHD基因，这个DNA模板是通过柄孢殼菌(P.pauciseta)3DHD一类引子和Pwo聚合酶(Roche Biochemicals)的反应生成的。生成的1.1kb 3DHD基因链段被引入到大肠杆菌表达带菌体pJH-X3的BamHI和XbaI位置间，生成质粒pJH-Van。大肠杆菌菌株JH1(表达UGT85B1)在质粒pJH-Van的作用下转化。

生成的大肠杆菌菌株JH4生长在液态LB生长培养基中，诱导基因表达。长出的培养菌悬浮物经过LC-MS检测，识别出香草醛糖苷，意味着可以使葡萄糖转化为香草醛糖苷的生物合成方法的成立。

通过质粒pJH-Van作用转化大肠杆菌菌株JM109，生成的菌株JH5包含一个由葡萄糖转化为香草醛产物的生物合成方法，而菌株JH4包含一个生成香草醛的生物合成方法，除此之外，还有糖基转移酶编码UGT85B1基因。菌株JH4和JH5都生长在液态LB生长培养基中，诱导基因表达。如上所述，通过这种方法，可以比较在JH5菌株条件下生成的香草醛和在JH4菌株条件下生成的香草醛糖苷。

发现大肠杆菌菌株包含一个生成香草醛的生物合成方法，除此之外，还有一个糖基转移酶基因(菌株JH4)，与相应的香草醛苷元相比较，它能生成更高产量的香草醛糖苷(以1molar为基准)。

实施例14：在酿酒酵母存在条件下，重新创建一种香草醛的生物合成方法

创建一种微生物方法，使得葡萄糖转化成香草醛，通过分子基因技术得到三种异源酶活，并且在酿酒酵母存在的条件下表达。

第一种酶活性是一个3-dehydroshikimate脱水酶，即3-dehydroshikimate，它从通常的芳香族氨基酸生物合成方法中处理远距离的香草醛前驱体，把它转变为原儿茶酸。3-dehydroshikimate脱水酶(3DHD)基因可以从粗糙链孢菌(Neurospora crassa)(Ruthledge，1984，Gene32：275)、曲霉(Aspergillus)nidulans(Hawkins等，1985，Curr Genet9：305)、Podospora pauciseta(GenBank accession # AL627362)和乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)(Elsemore & Ornston，1995，J Bacteriol177：5971)中了解。第二种必须的酶是一个芳香族羧酸还原酶(ACAR)，它能够使原儿茶酸转变为3，4-二羟苯甲醛。ATP-决定的ACAR活性可以以下提及的菌类中发现：某些放射菌类(诺卡氏菌属)(使用诺卡氏菌属的ACAR专利为：Rosazza & Li，2001，US 6262814B1)，粗糙链孢菌(Neurospora crassa)(Gross & Zenk，1969，Eur J Biochem 8：413(使用ACAR酶制备的专利为：Frost，2002；US6372461B1)和一些担子菌类，所谓的“白腐”真菌，它们是木质素的降解剂(例如粗蚕丝(Trametes)，Dichomitus，Bjerkandera和侧茸(Pleurotus)(蚝蘑‘Oyster mushroom’)属(Hage等，1999，Appl Microbiol Biotechnol 52：834)。短链N-终止的诺卡式菌属(Nocardia)酶的蛋白质序列的数据参见文献(Li & Rosazza，1997，J Bacteriol 179：3482)，基因的全部核苷酸序列近期公布了，参见文献(He等，2004，Appl Env Microbiol70：1874-1881)。最后酶活性是一个3-邻-甲基化物，这对于最终转变为香草醛是非常必要的，这个候选的酶是一个草莓S-腺苷甲硫氨酸：呋喃醇邻-甲基转移酶基因(FaOMT)(Wein等，2002，Plant J31：755)，由于这个酶是3，4-二羟苯甲醛在3-邻位的特殊的甲基化形式。替代的甲基酶包括白杨(Bugos等，1991，Plant Mol Biol17：1203)、杏树(Garcia-Mas等，1995，Plant Phys108：1341)和香草planifoid(Pak等，2004，Plant Cell Rep：11)OMTs。

使用Fragraria x ananassa(草莓)cDNA作为模板DNA，由PCR分离草莓FaOMT基因。通过使用QBiogene Fastprep Pro Green kit，从成熟的F.ananassa var.Elanta中分离出cDNA，从合成的RNA制备的cDNA是通过Invit rogen Superscript II逆转录酶合成的。通过使用引子#1和#2(表14.1)和Pwo聚合酶，这个cDNA的制备用于PCR放大。生成的1.1kb含有FaOMT的DNA链段被分离并且引入到酿酒酵母表达带菌体pJH413的XbaI和BamHI位置间，生成菌株pJH471。pJH471的表达盒(Ptpil-FaOMT-Ttpil)中的NotI-NotI被转移到酵母结合带菌体pYC050中(Hansen等，2003，FEMSYeast Res 4：323-327)，生成质粒pJH494。通过PsiI的限制性消化使10μg质粒pJH494线性化，生成物被用于使酿酒酵母菌株JH1具有耐诺尔丝菌素(nourseothricin)性，生成酵母菌株FSC58。

从Podospora pauciseta中分离一个3DHD基因，方法如下：使用QBiogene Fastprep DNA体系使得基因组DNA从P.pauciseta中分离出来，使用本基因组DNA作为模板通过PCR放大3DHD基因，这个DNA模板是通过P.pauciseta3DHD一类引子#3和#4(表14.1)，和Pwo聚合酶(RocheBiochemicals)的反应生成的。生成的1.1kb 3DHD基因链段被引入到酿酒酵母表达带菌体pJH413的BamHI和XbaI位置间，生成质粒pJH485。pJH485的表达带(Ptpil-FaOMT-Ttpil)中的NotI-NotI被转移到酵母结合带菌体pYC070中(Hansen等，2003，FEMS Yeast Res4：323-327)，生成质粒pJH500。通过Bsu36I的限制性消化使10μg质粒pJH500线性化，生成物被用于使酿酒酵母菌株FSC58具有抗aureobasidin A(中等抗菌谱的抗生素)性，生成酵母菌株FSC67。

合成的全部酵母培养基(50ml，放入在250ml Ehrlenmeyer烧瓶中)与培养一夜以上的50μl酿酒酵母菌株FSC67接种，在相同的培养基中生长，适于生长的培养温度为30℃，150rpm转动。24小时后，获得1ml样品，500μl游离细胞生长的悬浮物被相同体积的100％的甲醇沉淀出来。生成的悬浮物经过Agilent 1100系列HPLC系统中HPLC分析，使用一个ZorbaxSB-C18色谱柱(3.5μm)，洗提概况如下：在一个梯度为0-40％的H₂O(pH值2.3，含有H₂SO₄)-乙腈溶液中处理3分钟，40％乙腈溶液中处理1分钟，梯度为40-80％的乙腈溶液中处理2分钟，梯度为80-90％的乙腈溶液中处理1分钟，随后在90％的乙腈溶液中处理1分钟。原儿茶酸和香草醛酸在250nm和210nm条件下，通过一排二极管检测器被检测出，接下来的洗提时间为：原儿茶酸，5.3分钟；香草醛酸，5.9分钟。实验的结果表明，除了葡萄糖外而没有其他前驱体的条件下，菌株FSC67能够生产0.3g/l的原儿茶酸和0.01g/l的香草醛酸。可以预料FaOMT甲基转移酶对于3，4-二羟苯甲醛酶作用物的作用比对酶作用物原儿茶酸的作用更有效，因此结合羧酸还原酶(ACAR)的菌株FSC67中的酶将会生成更高转化率的原儿茶酸，也会由葡萄糖重新获得更多的香草醛。

影响3，4-二羟苯甲醛转化为香草醛过程的一个ACAR基因，用下面方式分离：通过使用Invitrogen SuperscriptII逆转录酶方法，从白腐真菌Pleurotus ostreatus或Trametes gibbosa中提取的全部RNA用来合成cDNA，通过使用Stratagene的cDNA库结构体系，利用Nocardia ACAR核苷酸序列信息的优点，构建一个含噬粒的cDNA库，前面的引子与载体序列相同，cDNA的插入点立即逆流而上，相反的引子与Nocardia ACAR基因异源，此基因的被转化氨基酸序列与其他被公认的ACAR基因的被转化氨基酸序列相比，Nocardia ACAR基因能够达到最大程度的进化转变，那些被公认的ACAR基因可以从公开的序列数据库中得到(通过与NocardiaACAR比较)。许多在不同核苷酸点含有碱基摆动式(例如引子的降解)的这些引子与前置引子一起用于PCR反应，使用cDNA库，从上述描述的任意一种选择DNA，和高保真(High Fidelity Plus)聚合酶(RocheBiocehmicals)。选择最佳的退火温度和镁离子浓度，提取大约0.8kb的PCR链段。通过亚克隆和核苷酸序列分析，P.ostreatus或T.gibbosa ACAR的片段编码为5’-区。获得的序列信息用于说明内含ACAR前面的低聚核苷酸引子，为了放大P.ostreatus或者T.gibbosa ACAR基因的3’-终端，这个引子与反置引子一起用于末端为3’-终端的cDNA的插入物，反置引子与数据库中载体序列相同。基因链段排序后被分离，定义为ACAT基因3’-终端一类低聚核苷酸引子，在最终的PCR反应中，与5’-终端一类引子一起使用，获得长链P.ostreatus或T.gibbosa ACAR。本克隆中cDNA的引入要经过DNA排序分析，确定ACAR基因序列后，基因被引入酿酒酵母表达的载体pJH413，生成质粒pJH413-X1。NotI-NotI表达的基因带被转化为质粒pYC040(Hansen等，2003，FEMS Yeast Res4：323-327)，因此生成质粒pJH413-X2，使用适当的限制酶使10μg质粒线性化，生成物被用于使酿酒酵母菌株FSC67具有抗潮霉素(hygromycin)B性，生成酵母菌株FSC67-X1。

最后，合成的全部培养基(50ml，放入在250ml Ehrlenmeyer烧瓶中)与培养一夜以上的50μl酿酒酵母菌株FSC67-X1接种，在相同的培养基中生长，适于生长的培养温度为30℃，150rpm转动。0小时、24小时、48小时后，分别获得1ml样品，500μl游离细胞生长的悬浮物被相同体积的100％的甲醇沉淀出来。生成的悬浮物经过HPLC分析。实验发现由葡萄糖作为前驱体，通过酵母菌株FSC67-X1能够生成大量的香草醛，因此得到了一个重新获得香草醛的生物合成方法。

低聚核苷酸ide	5’-3’序列
		#1	ATTATCTAGAATGGGTTCCACCGGCGAGACTCAG
#2	ATTAGGATCCTCAGATCTTCTTAAGAAACTCAATG
		#3	ATTATCTAGAATGCCTTCCAAACTCGCCATCACTTC
#4	ATTAGGATCCTTACAAAGCCGCTGACAGCGACAG

表14.1实施例14中使用的低聚核苷酸

实施例15：使用酿酒酵母生成香草醛糖苷的活体产物

测试一个酿酒酵母菌株表达的AS中的VG产物，该产物在2升发酵罐中通过批量供给而生长，液态生长培养基中含有亚致死浓度的香草醛。测试含有质粒pJH413(JH6[pJH413])的菌株JH6(adh6 adh7)。

质粒pJH413通过如下方法生成：利用低聚核苷酸引子#1和#2(表15.1)，放大杨梅合酶(arbutin synthase)(AS)基因，质粒pQE60-AS(Arend等，2001，Biotechnol Bioeng76：126)作为反应模板。反应条件为94℃、2分钟、1循环，94℃、30秒、温度梯度48-55℃、1分钟、72℃、2分钟、30循环，随后是72℃，7分钟，1循环。反应产物是含有预期尺寸为1.4kb链段的结合体，用于绑扎到pCR-Blunt II-Topo载体上。包括1.5kb EcoRI引入物的克隆通过引子JH#23-27排序(实施例10中的表10.1)。一个恰当DNA序列的克隆被识别，且从本质粒中释放AS ORF，释放出XbaI和BamHI(在PCR放大的引子的5’-终端包括这些位置)，并且被引入到酵母表达载体pJH259(质粒pJH235的衍生物；Hansen等，2003，FEMS Yeast Res 2：137-149)的相应的位置。引入一个恰当AS的克隆被识别，且命名为pJH413。

使用质粒pJH413而转化的菌株JH6在含有2ml SC-ura的培养基中，30℃条件下接种48小时，然后在相同的培养基中，将这个培养菌全部稀释为1.8升，培养菌氧化处理生长24小时后，加入更多的葡萄糖(20g/l)，同时加入5mM香草醛。当时间为48小时时，加入另一部分10g/l的葡萄糖和5mM的香草醛，当时间为72小时时，取出10ml产物，用热的乙醇提取细胞和细胞外的香草醛及其衍生物，提取的产物在真空条件下浓缩10次，浓缩的培养菌提取物经过LC-MS分析。一部分浓缩的培养菌产物使用杏树果β-葡萄糖苷酶处理，然后经过LC-MS分析。包含香草醛β-糖苷、香草醛酸和香草醛醇的培养菌通过LC-Ms分析。

实验结论是，在酿酒酵母存在的条件下，通过香草醛的糖基化反应可以活体形成香草醛糖苷。对于微生物有机体，由于香草醛糖苷的毒性比糖苷配基香草醛的毒性小，则总结出，在酵母存在的条件下，适当UDP-葡萄糖糖基转移酶的表达可以提高香草醛的产量。

低聚核苷酸	5′-3′序列
		#1	ATTATCTAGAATGGAACATACACCTCACATT
#2	ATTAGGATCCTTATGTACTGGAAATTTTGTTC

表15.1实施例15使用的低聚核苷酸

实施例16：在酿酒酵母存在的条件下，通过模式植物拟南芥(Arabidaopsis thaliana)UGT89B1糖基转移酶的表达，生成过量的原儿茶酸

由于柄孢殼菌(Podospora pauciseta)3-dehydroshikimate脱水酶(3DSD)的表达，可以构造生成原儿茶酸的酿酒酵母菌株的结构，由于模式植物拟南芥(Arabidaopsis thaliana)UGT89B1糖基转移酶的表达，酿酒酵母菌株能够生产过剩的原儿茶酸。

为了得到过剩表达的柄孢殼菌(P.pauciseta)3-dehydroshikimate脱水酶，酿酒酵母菌株JH1被线性化的质粒pJH500(如实施例14所阐述)转化，方法如实施例14所述。生成的酵母菌株被标记为FSC59，本菌株被用于UGT89B1酵母表达的质粒pJH468的转化。

质粒pJH468通过如下方法生成：利用低聚核苷酸引子#1和#2(表16.1)，PCR放大UGT89B1基因，基因组模式植物拟南芥(Arabidaopsisthaliana)DNA(Var.Columbia Col-0)作为反应模板。反应条件为94℃、2分钟、1循环，94℃、30秒、温度梯度50-60℃、1分钟、72℃、2分钟、30循环，随后是72℃、7分钟、1循环。反应产物是含有预期尺寸为1.4kb链段的结合体，用于绑扎到pCR-Blunt II-Topo载体上。包括1.4kb EcoRI引入物的克隆通过引子JH#14-18排序(实施例10中的表10.1)。使用一个恰当DNA序列的克隆被识别，且命名为pJH407。从pJH407中释放UGT89B1ORF，释放出XbaI-BamHI(在引子的5’-终端包括这些限定的位置)，并且被引入到被XbaI-BamHI消化的pJH259质粒中。一个恰当UGT89B1引入的克隆被识别，且命名为pJH408。本质粒的URA3选择标记与G418R选择标记交换(来自于质粒pYC030，参见Olesen等，2000，Yeast16：1035)，在“最初复制区”的酵母被FseI的限定性的吸收而移走，然后被去除，因此生成酵母结合质粒pJH468。

通过PsiI的限制性消化使10μg质粒pJH468线性化，生成物被用于使酿酒酵母菌株JFSC59具有耐诺尔丝菌素性，生成酵母菌株FSC60。

合成的全部酵母培养基(50ml，放入在250ml Ehrlenmeyer烧瓶中)与培养一夜以上的50μl酿酒酵母菌株JH1、FSC59和FSC60接种，在相同的培养基中生长，适于生长的培养温度为30℃，150rpm转动。48小时后，获得1ml样品，500μl游离细胞生长的悬浮物被相同体积的100％的甲醇沉淀出来。生成的悬浮物经过Agilent1100系列HPLC系统中HPLC分析，使用一个Zorbax SB-C18色谱柱(3.5μm)，洗提概况如下：在一个梯度为0-40％的H₂O(pH值2.3，含有H₂SO₄)-乙腈溶液中处理3分钟，40％乙腈的溶液中处理1分钟，梯度为40-80％的乙腈溶液中处理2分钟，梯度为80-90％的乙腈溶液中处理1分钟，随后用90％的乙腈溶液中处理1分钟。原儿茶酸(PA)和原儿茶酸-β-D-糖苷(PAG)在250nm和210nm条件下，通过一排二极管检测器检测出，接下来洗提时间为：原儿荼酸，5.4分钟；原儿茶酸-β-D-糖苷，4.7分钟。用LC-MS分析识别出PAG。

实验的结果表明，菌株FSC59能够生产0.43g/l的PA，而菌株FSC60能生产0.28g/l的PA和0.69g/l的PAG。当由菌株FSC60生成的产物经过杏树果β-葡萄糖苷酶处理后，可以增加PA的含量达到0.62g/l，与其中不含有被表达的UGT89B1糖基转移酶的条件下FSC59菌株中的PA相比，相应的FSC60菌株中的PA生成量超过40％。

由此总结出，在酵母存在的条件下，通过模式植物拟南芥(A.thaliana)UGT89B1糖基转移酶的表达，可以生成过量的原儿茶酸

低聚核苷酸	5′-3′序列
		#1	ATTATCTAGAATGAAAGTTAACGAAGAAAACAAC
#2	ATTAGGATCCTTACCACCGTTCTATCTCCATCTTC

表16.1实施例16使用的低聚核苷酸

实施例17：含有双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1的酿酒酵母表达载体的构建

为了使恰当的亚克隆更容易生成酵母表达的载体，使用引子通过PDR放大三个基因，该引子带有包含适当限制位置的DNA链段的附加物。使用引子对SbC79F1S和SbC79R1E放大CYP79A1(使用质粒CYP79A1 PRT101作为模板)，使用引子对SbC71F1S和SbC71R1E放大CYP71E1(使用质粒CYP71E1 pcDNAII作为模板)，最后，使用引子对SbUDPF1S和SbUDPR1E放大UGT85B1(使用质粒pcDNAI I-UGT85B1作为模板)，低聚核苷酸引子见表17.1。

PCR反应遵循下面方法：每个反应使用10ng模板DNA(体积50μl)，当最终浓度为1μM时，使用引子和dNTPs，当MgSO₄最终浓度为2mM时，通过5Upfu聚合酶(Stratagen)放大三个基因，接下来，用于放大基因的PCR反应条件如下：初始95℃，5分钟，其后95℃，45秒，35循环，温度为Tm，30秒和72℃，90秒，最后72℃，10分钟。CYP79A1的Tm为62℃，CYP71E1的Tm为65℃，UGT85B1的Tm为64℃。

三个放大的基因最初被克隆到pCR-Blunt II-Topo(离体基因)，然后转化为大肠杆菌菌株DN5α，用QIAGEN系统(QIAGEN)分离质粒，通过使用适当排序的引子生成的DNA序列来核实三个基因的完整性。

根据产品说明，上述的三个基因在亚克隆到酵母表达的载体之前，通过使用限制酶EcoRI和SpeI从TOPO载体释放出来，然后经过琼脂糖凝胶-电泳和使用QIAeX系统(Qiagen)重新获得DNA。类似的，酵母表达载体被EcoRI和SpeI切掉，且经过SPA处理，同样使用QIAeX系统重新获得DNA。

根据产品说明，在16℃下超过一夜，生成标准T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs)结，其次转化为大肠杆菌菌株DH5α，使用QIAGEN系统分离质粒，通过适当限定酶切掉和凝胶-电泳过程来核实酵母表达结构的完整性。

CYP79A1被克隆到下列质粒载体中(Mumberg等，1995，Gene156：119-122)：p416-GPD(生成p#33A)，p426-GPD(生成p#34A)，p416-TEF(生成p#41A)，p426-TEF(生成p#42A)。CYP71E1被克隆到下列载体中：p413-GPD(生成p#27A)，p423-GPD(生成p#28A)，p413-TEF(生成p#35A)，p413-ADH(生成p#43A)。UGT85B1被克隆到载体p415-GPD(生成p#S31B)中。

表17.1用于克隆的引子的低聚核苷酸序列

名称	引子序列
		SbC79F1S	5’-agcactagtatggcgacaatggaggtagaggcc-3’
SbC79R1E	5’-agcgaattctcagatggagatggacgggtagagg-3’
		SbC71F1S	5’-agcactagtatggccaccaccgccaccccgcagctcc-3’

SbC71R1E	5’-agcgaattcctaggcggcgcggcggttcttgtatttgg-3’
		SbUDPR1E	5′-agcgaattctcactgcttgcccccgaccagcagc-3’
SbUDPF1S	5′-agcactagtatgggcagcaacgcgccgcctcc-3’

实施例18：酿酒酵母菌株表达双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1和包含仿造质粒的菌株的构建

通过电泳(Becker and Guarente，1991，Methods in Enzymology194：182-187)过程，进行酵母菌株BY4741标准酵母的转化(mata his3D1 leu2D0met15D0 ura 3D0)(EUROSCARG)。

通过上文阐述中提及质粒的转化，选择SC-His，Ura，Leu培养基生成下面的酵母菌株(表达三个双色蜀黍蜀黍属基因)。

通过含有质粒p#27A，p#33A和p#S31B的BY4741转化形成Y0109。

通过含有质粒p#28A，p#34A和p#S31B的BY4741转化形成Y0113。

通过含有质粒p#35A，p#41A和p#S31B的BY4741转化形成Y0117。

通过含有质粒p#43A，p#42A和p#S31B的BY4741转化形成Y0121。

通过上文阐述中提及质粒的转化，选择SC-His，Ura，Leu培养基生成下面的酵母菌株(含有仿造质粒)。

通过含有质粒p413-GPD，p416-GPD和p415-GPD的BY4741转化形成Y0084。

通过含有质粒p423-GPD，p426-GPD和p415-GPD的BY4741转化形成Y0085。

通过含有质粒p413-TEF，p416-TEF和p415-GPD的BY4741转化形成Y0086。

通过含有质粒p413-ADH，p426-TEF和p415-GPD的BY4741转化形成Y0087。

通过上文阐述中提及质粒的转化，选择SC-His，Ura，Leu培养基生成下面酵母菌株(表达两个双色蜀黍蜀黍属基因CYP79A1和CYP71E1)。

通过含有质粒p#27A和p#33A的BY4741转化形成Y0091。

通过含有质粒p#28A和p#34A的BY4741转化形成Y0092。

通过含有质粒p#35A和p#41A的BY4741转化形成Y0093。

通过含有质粒p#43A和p#42A的BY4741转化形成Y0094。

通过上文阐述中提及质粒的转化，选择SC-His，Ura，Leu培养基生成下面的酵母菌株(含有仿造质粒)。

通过含有质粒p413-GPD和p416-GPD的BY4741转化形成Y0071。

通过含有质粒p423-GPD和p426-GPD的BY4741转化形成Y0072。

通过含有质粒p413-TEF和p416-TEF的BY4741转化形成Y0073。

通过含有质粒p413-ADH和p426-TEF的BY4741转化形成Y0074。

通过上文阐述中提及质粒的转化，选择SC-His，Ura，Leu培养基生成下面酵母菌株(表达两个双色蜀黍蜀黍属基因CYP79A1和UGT85B1)。

通过含有质粒p#33A和p#S31B的BY4741转化形成Y0103。

通过含有质粒p#34A和p#S31B的BY4741转化形成Y0104。

通过含有质粒p#41A和p#S31B的BY4741转化形成Y0105。

通过含有质粒p#32A和p#S31B的BY4741转化形成Y0106。

通过上文阐述中提及质粒的转化，选择SC-His，Ura，Leu培养基生成下面的酵母菌株(含有仿造质粒)：

通过含有质粒p416-GPD和p415-GPD的BY4741转化形成Y0078。

通过含有质粒p426-GPD和p415-GPD的BY4741转化形成Y0079。

通过含有质粒p416-TEF和p415-GPD的BY4741转化形成Y0080。

通过含有质粒p426-TEF和p415-GPD的BY4741转化形成Y0081。

实施例19：酿酒酵母菌株表达双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1和包含仿造质粒菌株的繁殖

上述酵母菌株在适当的合成生长环境下繁殖，忽略生长环境中缺少用于被转化细胞选择的同种氨基酸。细胞在28℃下生长，体积3ml以175RPM转动，直到生成稳定相。在15ml培养试管中进行液态繁殖。

在葡萄糖发酵之前，长出培养菌的细胞通过离心过滤(4000RPM，10分钟)重新获得，从失去作用的培养基中分离、冲洗，当培养基中合成的葡萄糖达到最低点(SD+)，再通过离心过滤重新获得，最后重新悬浮在3ml适当的SD+培养基中。

最初用SC-His，Ura，Leu选择的菌株重新悬浮在SD+Lys中，最初用SC-His，Ura选择的Met.菌株重新悬浮在SD+Lys，Met中，最初用SC-Ura，Leu选择的Leu.菌株重新悬浮在SD+Lys，Met，His中。

当细胞重新悬浮在SD+培养基中后，液态培养菌保持28℃，175RPM，收集产物，如下所述，接下来用LC-MS分析。

实施例20：酿酒酵母菌株表达双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1和包含仿造质粒菌株的代谢物分析

为了分析通过上述酵母菌株生成的次级代谢物的成分，在SD+培养基中重新悬浮24小时、48小时、72小时和92小时后收集0.5ml样品，如果分析蜀黍苷，则只需要24小时和48小时收集样品。

在使用LC-MS分析样品中的一个特定次级代谢物的总含量(被糖基化的量和未被糖基化分子)之前，样品要经过β-葡萄糖苷酶(Fluka)的处理。

通过离心过滤(4000RPM，10分钟)细胞从培养基中分离，从每个样品中分离333μl液相，然后真空干燥，重新悬浮在50μl50％的甲醇(MeOH)中。甲醇悬浮液经过15000RPM、10分钟的离心过滤后，25μl样品用于LC-MS分析产物特征，使用LC-MS分析前样品在-20℃贮存。

通过在已知数量，特定的参考化合物中加入0.5ml培养基(在SD+培养基中悬浮48小时后制样)制备适当的参考试样，将参考化合物加入培养基后，参考试样立即按照上述方法处理。为了能够对特定次级代谢物定量分析，要制备三倍量的相应参考试样，改变参考试样的浓度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)。最后，对于每种检测到的分子，为了唯一确定保留时间，制备一个仅含特定化合物的参考试样(在50％的甲醇中，浓度为1μg/ml)。

使用Agilent 1100系列 LC(Agilent Technologies，Germany)和Bruker Esquire3000+离子质谱(Bruker Daltonics，Bremen，Germany)联合的LC-MS进行分析，使用XTerra MS C18色谱柱(Waters，Milford，MA，3.5μM，2.1x100mm)，流速0.2ml/min。流动相是：A，0.1％(v/v)HCOOH和50μMNaCl；B，0.1％(v/v)HCOOH和80％(v/v)MeCN。过程梯度为：0-3分钟，平均3％(v/v)B；2-30分钟，线性梯度3-50％B；30-35分钟，线性梯度50％-100％(v/v)B；35-40分钟，平均100％B。质谱被构造成电喷射离子化(ESI)带正电离子模式，每种的[M+Na]+加合物全部离子流和离子轨迹用于化合物定位。在检测糖苷配基的情况下，质谱被构造成大气压力化学离子化(APCI)带正电荷模式，使用Bruker Daltonics Dataanalysisv.3.1软件进行光谱分析(Bruker Daltonik，GmBH)。

对一个特定次级代谢物(糖苷配基或者它的糖基化形式)的量化分析，通过质谱体积峰面积(LC-MS)的积分，并且比较得到值和该样品三种已知量的相应参考试样标准曲线的峰值。

实施例21：通过酿酒酵母菌株表达双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1的葡萄糖发酵，生成对-羟基苯乙醇腈-β-D-糖苷(蜀黍苷)

使用以下时间点，检测通过发酵菌株Y0109，Y0113，Y0117和Y0121生成的蜀黍苷的含量。根据公式[蜀黍苷(ng/ml)]＝6E-17I^2.5218(R＝0.92)回归，计算出蜀黍苷含量，其中I是质谱峰面积，这个公式来自于三个样品的峰值，如上所述。

表21.1酿酒酵母菌株表达双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1中生成的蜀黍苷

蜀黍苷(m/z＝334)的保留时间为13.6分钟

通过使用放射性-标记的络氨酸跟踪实验，证明蜀黍苷(对-羟基苯乙醇腈)苷元不存在，这与先前的技术知识一致，曾有文献阐述蜀黍苷苷元在水溶液中非常不稳定(Halkier and Moller，1989，Plant Journal90：1552-1559)。通过UGT85B1进行糖基化反应，导致实际上这个不稳定的芳香族腈的无限定的过剩生成。在m/z＝334、保留时间为13.6时没有峰，在酵母菌株带有仿造质粒的情况下(菌株Y0084，Y0085，Y0086和Y0087)，发现峰超出背景干扰。在菌株(Y0094，Y0095，Y0096和Y0097)带有CYP79A1和CYP71E1表达的质粒的情况下，m/z＝334、保留时间为13.6时没有峰，我们发现在任何时间点都超出10ng/ml。因此，在使用发酵48小时后的菌株Y0113，945ng/ml的蜀属苷达到94倍的过剩量，这是糖基转移酶UGT85B1表达的结果。

实施例22：通过双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1的表达，用蜀黍苷生物合成方法生成化合物

样品的质谱显示，来自于蜀黍苷生物合成反应生成的中间体的糖基化分子产物的存在，样品是在不同克分子数的基因产品条件下，菌株表达双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP7 1E1和UGR85B1。因此，可以相信通过糖基转移酶(例如UGT85B1)的糖基化中介，能够导致生物合成反应产生的中间体的连续转移，因此特定的糖苷配基过剩生成。在表22.1中列举了不同种类公认的通过蜀黍苷生物合成方法生成的糖基化化合物的数值。量化方法与上文阐述的蜀黍苷的测量方法相同，使用相同的方程式。

表22.1糖基化化合物，不同于酿酒酵母菌株表达的双色蜀黍蜀黍属CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1生成的蜀黍苷。

a)替代的，m/z＝323离子相应的对-葡糖氧基-安息香酸或糖基对-羟基安息香酸酯。对-葡糖氧基-苯基乙醇的保留时间为14.4分钟，对-葡糖氧基-苯基乙腈的保留时间为14.4分钟，对-葡糖氧基-苯甲醛的保留时间为19.7分钟。

实施例23：通过酿酒酵母中双色蜀黍蜀黍属基因CYP79A1、CYP71E1和UGR85B1的表达的蜀黍苷生物合成方法产生的中间体，过量生产化合物

通过使用对-葡糖氧基-苯基乙醇、对-葡糖氧基-安息香酸、糖基对-羟基安息香酸酯、对-葡糖氧基-苯基乙腈和对-葡糖氧基-苯甲醛的权威标准，鉴别蜀黍苷，如上所述，用相同的方法明确鉴别上述得到的糖。

糖苷配基分子的鉴别和定量分析按照如下方法进行：在同一时间点用相同的上述方法，收集含有表达蜀黍苷生物合成基因菌株的生长培养基，或者收集含有携带仿造质粒菌株的生长培养基，其后，不再起作用的培养基用β-葡萄糖苷酶处理(为了从它们的糖苷形式中释放糖苷配基)，此外，为了能够确定特定糖苷配基的含量，制备三倍量的相应参考样品，只改变参考试样的浓度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)。最后，对于每种检测到的分子，为了唯一确定保留时间，制备一个仅含特定化合物的参考试样(在50％的甲醇中，浓度为1μg/ml)。

为了证明通过糖基化反应能够过剩生成，必须比较含有表达UGT85B1和CYP79A1菌株的特定苷元(经过β-葡萄糖苷酶处理后)的产量和含有只表达CYP79A1(某些情况下也可以是CYP71E1)菌株的特定苷元的产量，这个过程证明至少是1.5倍的过量生产。

参考

下述的参考文献是从众多参考文献中选择出来的，与本发明最为相关。

Paquette，S.等，Phytochemistry62(2003)399-413

WO01/07631

WO01/40491

Arend，J等，Biotech.& Bioeng(2001)78：126-131

Tattersall，DB等，Science(2001)293：1826-8

Moehs，CP等，Plant Journal(1997)11：227-236

US6372461

Claims (19)

1、一种生成低分子量有机糖苷配基化合物的方法，包括以下步骤：

a)在适当的微生物适合生长的培养基中发酵一种微生物细胞，微生物细胞包含一个参与生物合成方法，生成一个低分子量糖苷配基有机化合物的产物的编码基因，和一个糖基转移酶基因编码的一个具有使生成的糖苷配基糖基化能力的糖基转移酶，在适当的条件下，其中的细胞产生糖苷配基和相应的糖苷配基的糖基化形式

b)糖苷配基的糖基化形式的去糖基化，并且

c)重新获得糖苷配基化合物

(i)所述低分子量糖苷配基化合物的分子量为50-3000，并且

(ii)所述糖基转移酶能够使糖连接到糖苷配基化合物分子上。

2、根据权利要求1所述的方法，所述在培养发酵过程中含有糖基转移酶的微生物细胞与不含糖基转移酶同一微生物细胞相比较，能够生成更多的糖苷配基的糖基化形式。

3、根据权利要求2所述的方法，所述微生物细胞是一种酵母细胞。

4、根据权利要求3所述的方法，所述酵母细胞是从由酵母属(Saccharomyces spp.)，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，及毕赤酵母属(Picha spp.)所组成的的细胞库中选择出来的。

5、根据权利要求2所述的方法，所述微生物细胞是一种原核细胞。

6、根据权利要求5所述的方法，所述原核细胞是一种大肠杆菌(E.coli)细胞。

7.根据上述任意一项权利要求，所述糖基转移酶基因是一种异源的糖基转移酶基因。

8、根据上述任意一项权利要求，所述糖基转移酶是一种UDPG-糖基转移酶，优选的是一种UDPG-葡糖基转移酶。

9、根据上述任意一项权利要求，所述低分子量有机糖苷配基化合物中包含一种带有羟基、氨基、硫或羧基官能团的有机糖苷配基化合物，这些官能团可以被上述任意一项权利要求所述的糖基转移酶糖基化。

10、根据权利要求9所述的方法，所述低分子量有机糖苷配基化合物中包含一种带有羟基官能团(例如醇)的化合物，该官能团可以被上述任意一项权利要求所述的糖基转移酶糖基化。

11、根据权利要求9或10所述的方法，所述糖苷配基化合物的分子量为50-1000。

12、根据权利要求11所述的方法，所述糖苷配基化合物是次级代谢化合物。

13、根据权利要求12所述的方法，所述次级代谢化合物是植物次级代谢化合物，从下列选取：

类萜化合物

生物碱

苯基丙酸类

苯基衍生物

己醇衍生物

类黄酮

香豆素，1，2-二苯乙烯

氰醇

植物性硫配糖体(Glucosinolates)

14、根据权利要求13所述的方法，所述植物次级代谢物有机糖苷配基化合物是香草醛。

15、根据权利要求14所述的方法，所述微生物细胞是一种酵母细胞。

16、根据权利要求15所述的方法，所述酵母细胞是从由酵母属(Saccharomyces spp.)，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，及毕赤酵母属(Picha spp.)所组成的的细胞库中选择出来的。

17、根据权利要求14所述的方法，所述微生物细胞是一种原核细胞。

18、根据权利要求17所述的方法，所述原核细胞是一种大肠杆菌(E.coli)细胞。

19、根据上述任意一项权利要求，所述权利要求1所述步骤b)去糖基化反应在生长细胞的细胞外进行，且在步骤a)生成的糖苷配基的糖基化形式被或分泌或提取后进行，其中糖基化反应是由一个β-葡萄糖苷酶催化的过程。

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