CN1008188B - 制备新的耐热的转葡糖苷酶方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种制备转葡糖苷酶的方法，该方法包括在合适的营养生长培养基中培养一种Talaromyces duponti菌株并从中分离转葡糖苷酶，还公开了由T.duponti产生的转葡糖苷酶。

Description

本发明涉及从Talaromyces    duponti中制备转葡糖苷酶的一种新方法。该转葡糖苷酶有很强的热稳定性，可用于把麦芽糖转化成6-α-葡糖基麦芽糖和异麦芽糖。

转葡糖苷酶（也称为1，4-α-D-葡聚糖-6-α-D-葡糖基转移酶和转葡糖基酶）已从各种微生物中获得。这是一种酶，它通过断键和成键而从麦芽糖形成三糖6-α-葡糖基麦芽糖和二糖异麦芽糖。这些寡糖不易发酵，因而可应用于食品、软饮料和米酒工业以及新食品的配制。参见例如Nunokawa等人的日本专利56（1981）-27236。他们叙述了一种通过培养Aspergillus    saitol或A.usami菌株生产转葡糖苷酶和葡糖淀粉酶的方法。使培养物滤液流过一个装有树脂的柱，该柱保留转葡糖苷酶，而葡糖淀粉酶进入流出液。用pH5.5的乙酸缓冲液从树脂中移出转葡糖苷酶。同样，内布拉斯加大学（Lincoln，Nebraska）生化和营养系的Pazur等人在“一种真菌转葡糖基酶的分离和作用方式”一文中（Archives    of    Biochemistry    and    Biophysics，93：43-49，1961），叙述了一种获得黑曲霉转葡糖基酶的方法，包括利用色谱法和在DEAE纤维素（二乙氨基乙基纤维素）、淀粉和羧甲基纤维素上吸附而从其它共同生成的糖酶中分离这种酶。

另一方面，Tamura等人在美国专利4，247，637中叙述了一种从Talaromyces    duponti菌株中生产热稳定性葡糖淀粉酶的方法，包括在一种营养培养基中培养该菌株并从中分离酶。培养菌株并过滤除去菌丝体后，使滤液通过活性粘土，在流出液中发现了葡糖淀粉酶。但Tamura等人根本没有认识到Talaromyces    duponti还会分泌出转葡糖苷酶，更不用说分泌出一种热稳定性很强的转葡糖苷酶。

因此，本发明人已发现，在一种适当的营养培养基中培养Talaromyces    duponti细胞能制备出热稳定性的转葡糖苷酶。

本发明提供了一种制备转葡糖苷酶的方法，包括在一种适当的营养生长培养基中培养一种Talaromyces    duponti菌株，并从中分离出转葡糖苷酶。本发明还提供了由T.duponti真菌产生的转葡糖苷酶。

本发明特别涉及真菌T.duponti的转葡糖苷酶。这种酶是通过在一种营养生长培养基中发酵这种微生物而生成的。经发酵而分泌出酶后，可用任何一种液固分离技术例如过滤法或离心倾析法，从发酵液中除去生物量，得到一种含酶溶液。

一般用培养普通霉菌所用的培养基作为T.duponti发酵的营养源。各种碳源都是公知的，可选自淀粉、糖蜜、玉米粉等。氮源也是常见的，典型的例子有大豆、棉籽、胨、玉米浸液、酵母膏等。发酵培养基中还使用了硫酸盐和/或盐酸盐，如硫酸镁、氯化钙、氯化钠和氯化钾。还常常使用磷酸盐，因为它们同样起缓冲剂的作用。另外，发酵培养基的pH值可以用碱（如氢氧化钠或氢氧化钾）和/或酸（如盐酸或乙酸）来调节，最好调节在接近中性的范围。

pH、时间和温度的条件在霉菌培养领域是公知的。pH必须在约 3-9的范围内，最好在约5-8的范围内。培养基很有利的pH是接近中性。发酵时间可以是从约2天至10天内的任何时间，最好是约4天至8天。温度应在约25℃-50℃之间，最好在30℃-45℃之间。最适生长温度是40℃左右。

属于生成转葡糖苷酶的Talaromyces  duponti的任何真菌都可用于本发明。在一个特别优选的实施方案中，所用的T.duponti菌株是保藏在日本千叶县工业科技局发酵研究所（FRI）的T.duponti菌株，其FRI保藏登记号为4566。该菌株已于1986年9月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，其登记号为CCTCC86-108。现已意外地发现，由这种特殊真菌菌株产生的转葡糖苷酶特别嗜热，这可从下面的实例得到证明。也可应用CCTCC86-108的突变株。Cooney和Emerson（Thermophilic  Fungi）及Awao和Mitsugi（Trans.  Mycol.Soc.，Japan，Volume  14）进一步描述了Talaromyces  duponti的鉴定。美国专利4，247，637引证了该菌株及其繁殖过程的另一些细节。

在一种适当的营养培养基中，T.duponti培养物达到所需的细胞群体状态后，用任一种液固分离方法（如过滤或离心后倾析）去除生物量。然后将含酶溶液即滤液或上清液进行浓缩、沉淀或浓缩和沉淀结合处理。例如，溶液可用通常方法如超滤和/或蒸发进行浓缩。然后加入无机盐如硫酸铵或硫酸钠，或加入有机溶剂如甲醇、乙醇或丙酮，从块状或浆状的浓缩物中（或从未经浓缩的溶液中）沉淀出酶。在沉淀出含酶块状物之后，可在一种溶液如水或缓冲过的水中打浆，从中溶解或提取酶，得到含酶提取液。因为是pH选择性洗脱（在下面进一步阐述），所以最好用柠檬酸-磷酸缓冲液（pH8.0）作提取 剂来溶解酶，然后需透析含酶缓冲提取液，最好是透析过夜。

含转葡糖苷酶的溶液，无论是用上述浓缩法、沉淀法，还是用这两种方法的某种组合获得，都再经过提纯处理，如用粘土、色谱法或它们的某种组合进行处理。

例如，进行层析时可使含转葡糖苷酶的溶液在适当的pH下通过二乙胺基乙基纤维素（DEAE纤维素）柱。含转葡糖苷酶的溶液应缓冲至pH约为7-9，最好为8，或者层析柱应平衡至pH约为7-9，最好为8。这最好用柠檬酸钠-磷酸缓冲液（pH约为8.0）来实现。在约7-9（最好为8）的pH下，转葡糖苷酶将存在于流出液部分中，而其他杂质如葡糖淀粉酶则将保留在柱内。以体积至少为DEAE纤维素体积的更多的缓冲液洗柱，还会回收到一些转葡糖苷酶。所得到的是一种基本不含葡糖淀粉酶和其他杂质的转葡糖苷酶溶液。

另一种作法是，在用任一种液固分离技术（如上述技术）从营养生长培养基中除去生物量而得到含转葡糖苷酶的溶液后，可在适当的pH（最好为3-5）下加入粘土（最好是颗粒膨润土），从而从该溶液中分离出转葡糖苷酶。美国专利3，042，584公开了一种粘土处理方法，这种方法可从含有曲霉或根霉的转葡糖苷酶和葡糖淀粉酶的溶液中除去转葡糖苷酶。

转葡糖苷酶与粘土形成一种反应产物，这种反应产物凝聚并沉淀到溶液底部，而葡糖淀粉酶则留在溶液中。这样就可以利用任一种标准固液分离技术从溶液中分离这种反应产物，接着用一种洗脱液从粘土中洗脱出转葡糖苷酶，这种洗脱液的pH在粘土和转葡糖苷酶能形成沉淀的pH范围之外，最好是中性或碱性pH。

得自Talaromyces  duponti的转葡糖苷酶有很强的热稳定性。 例如，在60℃下活性最适pH约为4.5至5.0。纯化的转葡糖苷酶的最适温度是70℃。

在70℃下比较了本发明的T.duponti转葡糖苷酶和黑曲霉转葡糖苷酶的热失活作用。更具体地说，在70℃下仅60分钟后，黑曲霉的转葡糖苷酶完全失活，而T.duponti的转葡糖苷酶仍保留了40%以上的活性。以下实例中的表A、B和C进一步详细叙述了这些嗜热性质。

本发明的转葡糖苷酶可以用来将麦芽糖转化为三糖6-α-葡糖基麦芽糖和二糖异麦芽糖，它们都是不易发酵的糖类。形成这些不易发酵的寡糖时，可将含麦芽糖的溶液与转葡糖苷酶一同保温。生成物中一般将存在有在该体系中同时生成的不易发酵糖即葡萄糖，以及一些剩余的麦芽糖。保温反应在50-70℃下进行1至6天，pH维持在酸性范围。在一个特别优选的实施方案中，保温反应在60℃和pH4.5（0.1M乙酸钠缓冲液）下进行72小时。

下列实例说明本发明的优选实施方案，但并不是要把权利要求限制于本实例所公开的实施方案。

实例

在一个发酵罐中加入10升液体发酵培养基，该培养基中含有5%可溶性Lintner淀粉、2%玉米浸液、0.5%Pharmamedia （由Trader Protein公司供应的一种棉子粉）、0.5%酵母膏（由Difco Laboratories，Detroit，Michigan供应）、0.1%磷酸氢二钾、0.05%硫酸镁、0.01%氯化钙，用1N N_aOH调至pH7.0。

用下列方法制备5个种子培养物：从发酵罐中取出5份100ml的培养基，每份装入一个500ml三角瓶中，然后将这5份培养基都在121℃ 下高压灭菌20分钟使培养基灭菌。然后每个经过灭菌的样品都用Talaromyces  duponti  CCTCC86-108菌株接种，并在旋转摇床上于40℃下摇动6小时。然后将5个样品合并得到约500ml。其余的培养基于121℃下在发酵罐中加热20分钟，然后用500ml  T.duponti  CCTCC86-108菌株接种，于40℃下搅拌7天。发酵结束后，从全发酵液中过滤除去菌丝体，得到无细胞滤液。

在滤液中加入固体硫酸铵达70%饱和度，沉淀出一种浆状物。离心后倾析出上清液而回收沉淀物。然后用200ml  0.05M柠檬酸-磷酸缓冲液（pH8.0）从沉淀中溶解出酶类，并对同一缓冲液透析过夜。使透析后的样品通过已用0.1M柠檬酸钠-磷酸缓冲液（pH8.0）平衡的DEAE纤维素柱。该柱再用体积两倍于DEAE纤维素体积的缓冲液（pH8.0）洗涤。在流出液部分中发现了转葡糖苷酶，而葡糖淀粉酶和其他杂质被柱中的DEAE纤维素保留。将含有转葡糖苷酶的部分合并在一起，对去离子水透析过夜。按B.J.Davis所述方法（Annals  New  York  Acad.  Sci.，121:404，1964）在室温下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳在装有7.5%凝胶的玻璃管（0.5×7cm）中以每管2毫安的电流进行1.5小时，缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液（pH8.3）。所分离出的转葡糖苷酶样品基本上是纯净的。

用纯化的转葡糖苷酶样品进行部分定性和形成6-α-葡糖基麦芽糖。对酶和麦芽糖的保温混合物中的转葡糖苷产物（即6-α-葡糖基麦芽糖）在pH4.5和60℃下进行液相层析定量测量，根据测量结果测定转葡糖苷酶活性。这是Pazur等人所述方法（Archieves  of  Biochemistry  and  Biophysics，93:43-49，1961）的一种修改。 一单位转葡糖苷酶活性定义为：在pH4.5和60℃下，每小时由20%（w/v）麦芽糖溶液生成1微摩尔6-α-葡糖基麦芽糖的酶量。测得滤液中的转葡糖苷酶活性为每毫升20单位。如下所述由麦芽糖生成不易发酵的寡糖;将4.0ml  25%麦芽糖溶液（pH4.5）与1.0ml酶溶液（2.6单位/ml）一起于60℃和pH4.5（用0.1M乙酸钠缓冲）下保温72小时。利用气相色谱法测得碳水化合物组成分布如下：22.6%葡萄糖、46.4%麦芽糖、6.5%异麦芽糖、24.6%  6-α-葡糖基麦芽糖。

然后将这种转葡糖苷酶与黑曲霉的转葡糖苷酶作比较。黑曲霉的数据取自上一自然段提到的Pazur等人的文献。如表A所示，这种酶的活性最适pH在60℃下约为4.5-5.0，而黑曲霉转葡糖苷酶的最适pH在30℃下为3.5。表B显示了温度对转葡糖苷酶活性的影响。这种纯化酶的最适温度为70℃。表C比较了70℃下T.duponti和黑曲霉的转葡糖苷酶的热失活曲线。如该表所示，本发明酶的热稳定性比黑曲霉的转葡糖苷酶高得多。

表B

用以0.1M乙酸钠缓冲至pH4.5的20%（W/V）麦芽糖作底物时，

温度对T.duponti转葡糖苷酶活性的影响

温度（℃）    相对活性（%）

40    12.6

50    24.4

60    48.9

70    100.0

80    64.9

90    0.0

表C

转葡糖苷酶的热稳定性＊

70℃下保温指定时间后转葡糖苷酶的剩余活性

分    15    30    45    60    120

T.duponti

转葡糖苷酶    78.5%    68.8%    62.4%    41.9%    32.3%

（pH4.5）

黑曲霉转葡糖苷酶    17.2%    6.3%    4.7%    3.1%    0%

（pH4.0）

＊转葡糖苷酶的热稳定性试验在70℃下在没有底物的0.1M乙酸缓冲液（pH分别为4.5和4.0）中进行。

Claims (6)

1、一种制备转葡糖苷酶的方法，该方法包括，在一种合适的营养生长培养基中培养一种鉴定为 Talaromyces dupontiCCTCC86-108的 T. duponti菌株，并从中分离转葡糖苷酶。

2、根据权利要求1的方法，其特征在于，按下列步骤从营养生长培养基中分离转葡糖苷酶：

a）从营养生长培养基中去除生物量，获得一种含转葡糖苷酶的溶液;

b）处理该溶液，即，沉淀出含转葡糖苷酶的块状物，随后从中提取转葡糖苷酶，获得一种含转葡糖苷酶的提取物;

c）纯化含转葡糖苷酶的提取物;

d）回收经过纯化基本上去除了葡糖淀粉酶和其它杂质的转葡糖苷酶。

3、根据权利要求2的方法，其特征在于，在步骤（b）之前或之后进行浓缩。

4、根据权利要求2的方法，其特征在于，步骤（c）的纯化是使来自步骤（b）的、经过处理的含转葡糖苷酶提取物，在一个适当的pH下通过一个DEAE柱;步骤（d）是从该柱中回收含转葡糖苷酶的流出液。

5、根据权利要求1的方法，其特征在于：（a）从营养生长培养基中去除生物量，获得一种含转葡糖苷酶的溶液;（b）在一个适当的pH范围内，向含转葡糖苷酶的溶液中加入颗粒性粘土，使转葡糖苷酶与粘土形成一种反应产物，从而从该溶液中分离出转葡糖苷酶;（c）用一种固液分离技术从该溶液中回收粘土/转葡糖苷酶反应产物。

6、根据权利要求5的方法，其特征在于，该方法还包括：（d）用一种具有一定pH范围的洗脱溶液，从所述反应产物中洗脱转葡糖苷酶，所述pH范围在造成步骤（b）的粘土/转葡糖苷酶反应产物的pH范围之外。