CN100409896C - 一种老年性痴呆疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种老年性痴呆疫苗及其制备方法，它包括一个耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的包含Aβ₄₂的中和表位的人工合成的多肽。其制备方法，包括以下步骤：(1)人工合成一条含有Aβ₄₂的中和表位的多肽；(2)将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物，耦联物经孵育老化；(3)将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成老年痴呆Aβ₄₂亚单位疫苗。本发明的疫苗既去除了共有的毒性片断，从而改进疫苗结构，增强免疫原性，又保留了有效抗原决定簇。

Description

一种老年性痴呆疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及用生物技术制备的疫苗及其制备方法，特别是一种老年性痴呆疫苗及其制备方法。

背景技术

老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)是一种神经细胞退行性疾病，临床以进行性记忆和后天获得的知识丧失为特征，直到最后病人丧失生活能力。随着发病人数的增加，AD给家庭和社会带来沉重的负担，是一个重要的社会和医疗卫生问题。关于AD的治疗，目前尚无理想方法，现有的治疗策略主要着眼于缓解症状，并没有阻止AD的病理进程，其临床疗效并不理想。Aβ是老年性痴呆病理变化老年斑的主要成分，其由39～42个氨基酸组成。近年来的研究表明，Aβ的集聚和沉积及其伴随的神经元损害是老年性痴呆病理机制的中心环节，因此，针对Aβ的治疗策略和方法相继被提出。研究表明，1999年Schenk首次报道{Immunization with amyloid-beta attenuatesAlzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse[see comments].Nature，1999Jul 8；400(6740)：173-7}采用免疫学方法对转基因AD模型鼠(PDAPP鼠)治疗；目前，国外的老年性痴呆疫苗已进入IIa临床试验，由于部分试验病人出现了接种后综合症，包括无菌性脑膜炎，实验因此停止(Schenk D.Amyloid-βimmunotherapy forAlzheimer’s disease：the end of the beginning.Nature Reviews，2002，3：824～828)。

用Aβ₄₂的完整片段作为免疫原，存在以下几个问题：(1)Aβ₄₂肽含有Aβ毒性片段(25～35位氨基酸)，其用作免疫原的安全性受到质疑；(2)Aβ的β片层结构是脑内Aβ沉积物和老年斑中Aβ多肽存在的重要形式，而人工合成的Aβ₄₂需经过变构才具有较好的免疫原性；(3)Aβ₄₂肽分子量＜10000，免疫原性差。

发明内容

本发明的目的就是为了克服用Aβ₄₂的完整片段作为免疫原制备老年性痴呆疫苗的上述缺点，提供一种毒性小、免疫原性好的一种老年性痴呆疫苗。本发明的另一个目的是为了提供生产该疫苗的方法。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：一种合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗，它包括至少一条耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的含有Aβ₄₂的中和表位的人工合成的多肽。其中，所述中和表位的人工合成的多肽可以是以下七种之一、或其中之二或更多种：

(1)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ_1～15)

(2)Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala(Aβ_36～42)

(3)Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr(Aβ_4～10)

(4)Glu-Phe-Arg-His(Aβ_3～6)

(5)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(Aβ_1～5)

(6)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu(Aβ_1～11)

(7)Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys(Aβ_22～28)

其中采一种的为单一亚单位疫苗，采两种或两种以上的为多联亚单位疫苗。

其中，载体可以是载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)，或载体多肽多重抗原肽系统(multiple antigens peptide system，MAPs)，寡聚赖氨酸是一个理想的MAPs核心框架，如七聚赖氨酸(heptalysine)，因为七聚赖氨酸本身无抗原性，避免了载体蛋白如BSA带来的过敏反应，使免疫反应特异性更强，安全性更好；同时，由于其本身分子小，位于大分子复合物的核心，不会封闭抗原表位的活性。又如三聚赖氨酸，十二聚赖氨酸等。

为了适宜于注射，疫苗中还应该包括可接受的药用佐剂。如MF₅₉(意大利政府1997年批准用于人体流感疫苗的佐剂)佐剂，铝佐剂等。

本发明制备合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)人工合成至少一条可耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的包含Aβ₄₂的中和表位的人工合成的多肽；

(2)将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物；

(3)将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成老年痴呆Aβ₄₂亚单位疫苗。

其中人工合成多肽的方法一般从C端(羧基端)向N端在(氨基端)合成。以往的多肽合成是在溶液中进行的。现在多数采用固相合成法，选用多肽固态合成仪，在合成柱上合成，从而大大减轻产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，合成柱和添加氨基酸的侧链是被保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成法多采用Fmoc法。

交联可以采用本领域的常用方法，如采用交联剂N-琥珀酰亚胺-M-马来酰亚胺基苯甲酸酯(MBS)交联，采用制备高效液相(HPLC)柱纯化，经质谱仪(MS)分析鉴定。

本发明选择Aβ₄₂的某些片段作为免疫原，这样既去除了共有的毒性片断，从而改进疫苗结构，增强免疫原性，又保留了有效抗原决定簇。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1制备以中和表位1为基础的合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗，包括以下步骤：

(1)利用多肽固态合成仪人工合成中和表位1的多肽

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ_1～15)，过柱纯化到95％以上；

(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；经HPLC色谱纯化到95％以上；以灭菌的0.01mol/L PBS(pH7.4)稀释抗原；

(3)将耦联物配以等体积的MF59佐剂，用旋涡振荡器混匀约30min，制备成疫苗。

实施例2制备以中和表位2为基础的合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗，包括以下步骤：

(1)人工合成中和表位2的多肽

Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala(Aβ_36～42)

(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；

(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。

实施例3制备以中和表位3为基础的合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗，包括以下步骤：

(1)人工合成中和表位3的多肽

Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr

(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；

(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。

实施例4制备以中和表位4为基础的合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗，包括以下步骤：

(1)人工合成中和表位4的多肽

Glu-Phe-Arg-His

(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；

(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。

实施例5制备以中和表位5为基础的合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗，包括以下步骤：

(1)人工合成中和表位5的多肽

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg

(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；

(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。

实施例6制备以中和表位6为基础的合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗，包括以下步骤：

(1)人工合成中和表位6的多肽

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu

(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；

(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。

实施例7制备以中和表位7为基础的合成肽Aβ₄₂亚单位疫苗，包括以下步骤：

(1)人工合成中和表位7的多肽

Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys

(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；

(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。

实施例8制备以Aβ_1-15和Aβ_36-42为基础的合成肽多联疫苗，包括以下步骤：

(1)人工合成中和表位1的多肽

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln

(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育，形成耦联物I；

(3)人工合成中和表位2的多肽

Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala

(4)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育，形成耦联物II；

(5)将耦联物I与II按1∶1或1∶2摩尔比混合。

(6)将混合物配以MF59佐剂制备成疫苗。

实施例9将实施例2的载体由七聚赖氨酸换成牛血清白蛋白，其余其实施例2。

实施例10实施例2及实施例8疫苗接种正常SD大鼠后的行为学观察试验。

1材料与方法

1.1实验动物32只健康的成年3月龄雄性SD大鼠(SPF级，购自第一军医大学实验动物中心，动物质量合格证号码为粤检证字第2001A051号)，体重180-200g。饲养一周后，观察正常，然后随机分为4组：实施例2组(MAP组)，实施例9组(BSA组)，Aβ₄₂全肽组和对照组，每组各8只。

1.2免疫接种大鼠麻醉后固定在台上。消毒大鼠背部中线两侧的皮肤，用1.00ml的皮试针抽取抗原，沿背部中线两侧进行多点(15-20个点)皮下注射。首次接种后2周进行第二次加强注射，以后每隔1个月进行一次加强注射，总共接种4次，每只大鼠皮下接种的总体积为0.40ml。

1.3间接ELISA法检测血清中和脑匀浆中抗Aβ₄₂的滴度

1.4行为学观察整个实验过程中SD大鼠的行动和反应均正常。最后一次接种后一周采用Morris水迷宫方法检测SD大鼠的定位航行和空间探索能力。定位航行实验：测试前一天将SD大鼠在水池中(不含平台)自由游泳2min，使其熟悉迷宫环境。试验共历时5天，每天分上、下午两个时间段(blocks)，每个时间段训练4次，每天共8次(trials)。测试时平台置于EN象限，鼠分别从东、南、西、北(E、S、W、N)四个象限面对池壁放入水池，记录该鼠找到平台所用的时间(逃避潜伏期，escape latenkcky)。大鼠找到平台后或120s找不到平台则由实验人员将其引上平台(潜伏期记为120s)，在平台上休息30s后，再行下一次测试。连续四天，共八个时间段。空间探索实验：于第五天的第五次(紧接第四次)撤除平台，任选一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录2min内大鼠的游泳路线。在整个测试中，水池周围参照物(迷宫外线索)包括实验者的位置不变，同时为消除外界声音干扰，室内持续播放强度适中的白噪音。主要比较各实验组逃避潜伏期和平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比。

2结果

2.1一般情况

喂养过程中所有接种大鼠外观正常，毛发无改变，皮肤无溃疡，行动和行为反射均无异常，饮食、饮水和睡眠均正常，体重均增加。第四次接种后实验组大鼠的抗Aβ₄₂抗体均达到1∶10000以上，而对照组为1∶100。经迅速解剖称重，脑、肝、脾、肾的主要脏器的湿重和HE形态学观察未发现改变。其湿重与对照组比较，无显著性差别。

Western Blotting实验表明实施2和实施例8血清中的抗体确实为特异性的抗Aβ₄₂抗体。

免疫组化实验表明实施例2、实施例8和Aβ₄₂组的血清中抗体能与老年性痴呆病人的脑切片的老年斑特异性结合。

2.2血清和脑匀浆上清液中的抗体滴度

第1次接种后各实验组均未能检测出特异性的抗Aβ₄₂抗体，第2次接种后各实验组血清开始有抗Aβ₄₂抗体产生，且随接种次数的增多，抗体滴度均逐渐增高；第2次所得血清中，MAP组和Aβ₄₂组各有一只滴度为1∶12800；第3次所得血清中，MAP组有3只，BSA组有4只，Aβ₄₂组有6只的滴度为1∶12800。各组大鼠血清和上清液的抗体的平均滴度见表1。

表1疫苗接种后接种SD大鼠的血清和脑匀浆上清液中抗Aβ₄₂抗体的平均滴度

与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与BSA组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与MAP组比较，##P＜0.01；

2.3Morris水迷宫测试结果

各接种组大鼠的逃避潜伏期曲线均呈下降趋势，表明SD鼠经训练后寻找平台的时间均缩短。分别对各接种组的总逃避潜伏期，进行两两比较，均无显著性差别(P＞0.05)；再各自对其前5次逃避潜伏期和后3次逃避潜伏期进行两两比较，同样地均无显著性差别(P＞0.05)。(各接种组的平均逃避潜伏期具体数值参见表2)

表2接种大鼠的平均逃避潜伏期(秒)(S，X±SD)

组间两两比较，均为P＞0.05。

以平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比判断大鼠的空间学习记忆能力，MAP组，BSA组，Aβ₄₂组，对照组的百分比(％)分别为30.40±16.19，31.58±7.75，19.38±9.00，23.80±8.45。两两比较均无显著性差别(P＞0.05)。

从检测的血清和脑匀浆上清液结果来看，Aβ₄₂亚单位(Aβ_36～42)疫苗与Aβ₄₂全肽疫苗一样，能产生高滴度的抗Aβ₄₂抗体，而且在产生高滴度的特异性抗体的前提下，用药组的大鼠的学习和认知行为正常。而我们的实验结果表明脑、肝、脾和肾未发现病理性改变。表明Aβ₄₂亚单位(Aβ_36-42)有潜在的临床价值。

实施例1、3～8的试验表明，实施例1、3～8具有与实施例2、9相似的结果。本发明的多联疫苗可采用任何两、两联合或更多联合的方式，而不限于实施例8；实际上，实验表明，采用两两联合或更多联合的方式制成的多联疫苗，较单一亚单位制成的疫苗效果更佳。

氨基酸列表：

(1)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln

1                  5                   10                   15

(2)Val Gly Gly Val Val Ile Ala

1                  5

(3)Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1                  5

(4)Glu Phe Arg His

1

(5)Asp Ala Glu Phe Arg

1                    5

(6)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu

1                   5                   10

(7)Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys

1                   5

Claims (2)

1. 一种老年性痴呆疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用多肽固态合成仪人工合成含有Aβ₄₂的中和表位的多肽，过柱纯化到95％以上，其中所述含有Aβ₄₂的中和表位的多肽为Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ_1～15)，

(2)利用交联剂MBS将多肽与载体七聚赖氨酸的支链耦联，并经过孵育，经HPLC色谱纯化到95％以上，以灭菌的0.01mol/L pH7.4的PBS稀释抗原，

(3)将耦联物配以等体积的MF59佐剂，用旋涡振荡器混匀约30min，制备成疫苗。

2. 一种根据权利要求1所述的方法制备得到的老年性痴呆疫苗。