CN100406467C - 利用弱极性大孔树脂制备桔梗总皂苷提取物的方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种运用弱极性大孔树脂制备桔梗总皂苷提取物的方法及用途。它是将桔梗药材粉碎或直接用桔梗饮片，加水或10%-30%乙醇，加热回流提取，过滤，合并提取液，浓缩；过滤或离心后通过填充有弱极性大孔树脂的层析柱，先用水洗涤树脂，水洗脱液弃去；再用含水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩，减压或喷雾干燥，得桔梗总皂苷。桔梗总皂苷含量50%-90%重量、桔梗皂苷D含量不低于1.0%重量的桔梗总皂苷提取物用于制备治疗糖尿病以及抗周围神经病变的药物。本发明采用的弱极性大孔树脂对桔梗总皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得总皂苷的含量高，因此，可以显著提高结桔梗总皂苷的提取率，降低生产成本。

Description

利用弱极性大孔树脂制备桔梗总皂苷提取物的方法及用途

技术领域

本发明涉及一种利用弱极性大孔树脂制备桔梗总皂苷提取物的方法及用途。

背景技术

桔梗(Radix platycodonis)系桔梗科Campanulaceae植物桔梗Platycodon grandiflorum的干燥根。其性味苦、辛、平，归肺经，有开宣肺气，祛痰排脓之功效。植物化学研究发现，桔梗中主要含有齐敦果酸型皂苷类成分。现代药理学试验表明，桔梗具有镇咳、祛痰、抗炎、抑制胃酸分泌及抗胃溃疡、镇静、解热、降血脂、降胆固醇、调节机体免疫力、抗菌及抗癌等多种药理作用。

大孔吸附树脂是指由苯乙烯、α-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂二乙烯苯聚合而成的球状颗粒，直径一般在0.3-1.25mm之间。现已广泛应用提取纯化天然植物中的活性成分，如皂苷、黄酮、内脂、生物碱等。根据大孔树脂化学结构不带或带有不同极性的功能基以及树脂的表面性质，通常将大孔树脂分为非极性、弱极性和中极性等类型。其中，弱极性大孔树脂为含酯基的吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分，既可由极性溶剂中吸附非极性物质，又可由非极性溶液中吸附极性物质，因而应用范围更为广泛。

专利CN1566137A及专利CN1397560A分别公开利用非极性大孔树脂D101及HPD-100生产桔梗总皂苷的方法，但是没有具体公开其中桔梗总皂苷的含量。这两种树脂还存在对桔梗总皂苷的吸附量小、解吸率低及制得的桔梗总皂苷的含量低的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用弱极性大孔树脂制备桔梗总皂苷提取物的方法及用途。

它是将桔梗药材粉碎或用桔梗饮片，加6～15倍量水或10％-30％乙醇，加热回流提取2～4次，每次1～3h，过滤，合并提取液，浓缩至0.25～2.0g生药/ml；过滤或离心后通过填充有弱极性大孔树脂AB-8的层析柱，提取液按桔梗总皂苷含量计与干树脂的比例为1∶5～10，上柱流速1～4BV/h，树脂径高比为1∶3～1∶9；用水洗涤树脂3～8BV，洗脱流速为2-4BV/h，水洗脱液弃去；用30～95％乙醇洗脱，流速为2～4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.1～1.25，减压或喷雾干燥，得桔梗总皂苷。

所述的离心的转速为4000～16000转/分钟。弱极性大孔树脂为聚苯乙烯型弱极性大孔树脂。

利用弱极性大孔树脂制备桔梗总皂苷提取物用于制备治疗糖尿病的药物、用于制备抗周围神经病变的药物。

本发明采用的弱极性大孔树脂对桔梗总皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得总皂苷的含量高，因此，可以显著提高桔梗总皂苷的提取率，降低生产成本。

具体实施方式

本发明针对现有工艺缺陷进行了改进，利用弱极性大孔树脂来制备桔梗总皂苷提取物，其中桔梗总皂苷含量50％-90％重量，桔梗皂苷D含量不低于1.0％重量，通过与上述两种树脂的工艺参数进行比较，结果显示弱极性大孔树脂对桔梗总皂苷的吸附量明显优于非极性大孔树脂D101及HPD100，解吸率及获得的桔梗总皂苷的含量也明显高于利用非极性大孔树脂D101及HPD100制得的产品。本发明还同时提供了所制备的桔梗总皂苷提取物治疗糖尿病以及镇痛、抗血栓、抗周围神经病变的药效学数据。

所制备的桔梗总皂苷提取物，桔梗总皂苷含量不低于50％重量(以桔梗皂苷D计)，优选50％-90％重量，更优选50％-70％重量，该总皂苷对由肾上腺素、葡萄糖、链脲佐菌素和四氧嘧啶引起的高血糖均有明显的降低作用，具有降低血糖的作用。同时，能显著改善由链脲佐菌素引起的大鼠胫神经传导障碍，提高运动神经的传导速度(NCV)，明显缩短蝈窝神经的不应期。此外，桔梗总皂苷有较强的镇痛作用及抗血小板聚集及抗血栓形成的作用。可以用于制备治疗糖尿病以及镇痛、抗血栓、抗周围神经病变的药物。

本发明可以用于制备治疗糖尿病以及镇痛、抗血栓、抗周围神经病变的药物中的用途。其特征在于桔梗总皂苷的含量不低于50％(香草醛-冰醋酸，高氯酸显色，UV法，以桔梗皂苷D计，重量百分比)，桔梗皂苷D含量不低于1.0％(HPLC法，重量百分比)。

弱极性大孔树脂AB-8与非极性D101、HPD100型大孔树脂对桔梗总皂苷吸附量、解吸率及所得总皂苷含量的比较：

树脂各5克，用水洗至无醇味，减压抽干，精密称定，置于250ml具磨塞口的三角瓶中，各加入前期制备的样品液150ml(相当于45g生药)，25℃恒温振荡24h，分别取吸附前后的药液，测定总皂苷含量，计算树脂比吸附量(mg/g干树脂)。比吸附量(mg·g^-1干树脂)＝(吸附前总皂苷量-吸附后总皂苷量)/树脂干重。分别将上述饱和吸附的树脂滤出，用30ml水洗，吸干表面水分后，加入70％乙醇50ml解吸(25℃恒温振摇24h)，取解吸后溶液测定，计算乙醇对各树脂的解吸率。解吸率＝(解吸液中总皂苷量/饱和吸附量)×100％。将解吸液浓缩、减压干燥得总皂苷。计算总皂苷的含量。结果如表1。

表1不同类型树脂对桔梗总皂苷的吸附量、解吸率及总皂苷含量的比较

结果显示，利用弱极性大孔树脂AB-8制备桔梗总皂苷，不仅吸附量大，而且解吸率高，所得产品含量高。

桔梗总皂苷的药理作用

1.降糖作用

在低、中、高剂量下，桔梗总皂苷对由肾上腺素、葡萄糖、链脲佐菌素和四氧嘧啶引起的高血糖均有明显的降低作用，量效关系明确。对动物正常血糖无明显影响。

药物桔梗总皂苷为自制，阳性对照为消渴丸(广州中一药业有限公司)；糖脉康胶囊(成都中汇制药有限公司)。脲佐菌素和四氧嘧啶均为Sigma公司产品。

动物小鼠，清洁级，体重18g-22g，50只，雌雄各半，由浙江医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2003-0001。

试验结果

1.1桔梗总皂苷对小鼠正常血糖的影响

取健康正常小鼠70只，雌雄各半，随机分为5组，分别为空白对照组、模型对照组、消渴丸组(2g/kg)，桔梗总皂苷三个剂量组(40、20和10mg/kg)，于7日内每天灌胃给药一次，灌胃体积均为10ml/kg，末次给药前禁食12h，给药2h后，测定血糖。

表2桔梗总皂苷对小鼠正常血糖的影响(X±S)

注：^1*P＜0.05；^2*P＜0.01 ^3*P＜0.001

1.2桔梗总皂苷对葡萄糖引起的小鼠高血糖的影响

取雌雄各半小鼠60只，按体重随机分为5组，分别为空白对照组、模型对照组、消渴丸组，桔梗总皂苷三个剂量组(40、20和10mg/kg)，于7日内每天灌胃给药一次，灌胃体积均为10ml/kg，末次给药前禁食5h，末次给药1h后，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射葡萄糖2g/kg，于注射葡萄糖后1h，将动物处死，取血，用血糖仪测定血糖。结果表明：桔梗总皂苷可明显降低葡萄糖引起的高血糖。见表3。

表3桔梗总皂苷对对葡萄糖引起的小鼠高血糖的影响(X±S)

注：^1*P＜0.05；^2*P＜0.01  ^3*P＜0.001

1.3桔梗总皂苷对肾上腺素引起的小鼠高血糖的影响

分组与给药同实验1.2。不同之处为末次给药(不禁食)1h后，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射肾上腺素250μg/kg，注射肾上腺素后1h，将动物处死，取血，测定血糖。结果表明：桔梗总皂苷可明显降低肾上腺素引起的高血糖。见表4。

表4桔梗总皂苷对肾上腺素引起的小鼠高血糖的影响(X±S)

注：^1*P＜0.05；^2*P＜0.01 ^3*P＜0.001

1.4桔梗总皂苷对链脲佐菌素引起小鼠高血糖的影响

在雄性小鼠90只，随机取10只作为空白对照组，其余小鼠尾静脉注射链脲佐菌素(在4C冰浴中用0.05M柠檬酸pH4.5浴液配制，立即使用)200mg/kg，造成糖尿病模型。注射后72h小鼠眶静脉取血测血糖，删除未造成糖尿病模型者(测前禁食12h，血糖值低于11.11mmol/l)，留用小鼠随机分为5组，每组10只，于7日内按表3所示剂量每天给药一次，未次给药后2h，眶静脉取血，以邻甲苯胺法(超微量法)测血糖。结果表明：桔梗总皂苷中剂量组和高剂量组对链脲佐菌素引起小鼠高血糖具有明显的降低作用，见表5。

表5桔梗总皂苷对链脲佐菌素引起小鼠高血糖的影响(X±S)

注：^*P＜0.05；^**P＜0.01

1.5桔梗总皂苷对四氧嘧啶引起小鼠高血糖的影响

分组与给药同实验1.2。不同之处为末次给药(不禁食)1h后，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射四氧嘧啶，剂量为60mg·kg^-1。约1h后，继续给药，连续3日。末次给药1h后，摘眼球放血，测血糖。结果见表6。

表6桔梗总皂对四氧嘧啶引起小鼠高血糖的影响(X±S)

注：^1*P＜0.05；^2*P＜0.01 ^3*P＜0.001

2.镇痛作用

取小鼠60只，随机分成5组，分别灌服生理盐水、3个剂量的桔梗总皂苷、糖脉康颗粒剂0.2ml·10g-1，连续给药7日，末次给药1h，各组动物腹腔注射0.9％冰醋酸0.1ml·10g^-1，计数20min内小鼠的扭体次数。结果见表7。

表7桔梗总皂苷对醋酸所致小鼠扭体次数的影响

注：^1*P＜0.05；^2*P＜0.01

结果：桔梗总皂苷有较强的镇痛作用。

3.桔梗总皂苷对体外血栓形成的影响

取小鼠60只，随机分成5组，分别灌服生理盐水、3个剂量的桔梗总皂苷、糖脉康颗粒剂1ml·100g^-1，连续给药10日，末次给药1h后，动物以戊巴比妥钠麻醉，打开腹腔，由腔静脉不抗凝精确取血2ml迅速置于塑胶管中，在预先已经预热的血栓形成仪中旋转10min，之后轻轻取出血栓，在滤纸上吸干血水，测血栓长度、湿重，再将血栓置于65℃的烘箱中30min，测其干重。

表8桔梗总皂苷体外抗血栓形成试验结果

注：^1*P＜0.05

结果：桔梗总皂苷能显著的抗血小板聚集及抗血栓形成作用。

4.桔梗总皂苷改善由链脲佐菌素引起的大鼠胫神经传导障碍、提高运动神经传导速度、明显缩短蝈窝神经的不应期的试验

取大鼠，随机分成5组，禁食18h后，用枸橼酸钠缓冲液配制2％链脲佐菌素溶液，除正常组外，其余各组动物分别腹腔注射60mg·kg^-1链脲佐菌，约2h后正常饮食。分别灌服生理盐水、桔梗总皂苷(2个剂量)、糖脉康颗粒剂，容量为1ml·100mg^-1，每天1次，连续4周。

4.1神经电生理指标

ABR(听觉脑干诱发电位)：记录电极(正极)置于大鼠两眼后缘连线中心，无关电极接于同侧耳垂，接地电极置于同侧前肢，将TDH-39型耳机置于右耳道，给予80dB短声刺激引导ABR，观察主波的峰潜伏期，然后衰减刺激强度观察阈值。

SEP(体感诱发电位)：刺激电极置于左前肢掌心正中神经远端。记录电极(负极)置于对侧眼眶后缘和耳廓前缘的中点及头颅正中线旁开1/2的颅骨外，无关电极(正极)置于对侧耳垂。用3.0mA刺激强度引导体感诱发电感应，测峰潜伏期。

4.2NCV(运动神经传导速度)：刺激电极置蝈窝神经附近，记录电极置于腓神经远端，接地电极接于刺激电极和记录电极连线中点，其中刺激电极的负极朝向肢体的近端，记录电极的负极朝向肢体的远端，量刺激与记录电极的负极间的距离，则NCV＝(刺激电极和记录电极的两个负极之间的距离)/峰潜伏期。

4.3不应期：电极位置同NCV，用日制SEN-3201电刺激器，双脉冲刺激，通过调节双脉冲的时间间隔，观察运动神经的不应期反应。

表9

注：^2*P＜0.01

结果表明，桔梗总皂苷能显著改善由链脲佐菌素引起的大鼠胫神经传导障碍，提高运动神经的传导速度(NCV)，明显缩短蝈窝神经的不应期。

结论：该总皂苷对由肾上腺素、葡萄糖、链脲佐菌素和四氧嘧啶引起的高血糖均有明显的降低作用具有降低血糖的作用。同时，能显著改善由链脲佐菌素引起的大鼠胫神经传导障碍，提高运动神经的传导速度(NCV)，明显缩短蝈窝神经的不应期。此外，桔梗总皂苷有较强的镇痛作用及抗血小板聚集及抗血栓形成的作用。

实施例1

取粉碎后的桔梗药材2kg，加6倍量水，加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并提取液，浓缩至0.25g生药/ml；过滤后通过AB-8型大孔树脂，提取液按桔梗总皂苷含量计与干树脂的比例为1∶5，上柱流速1BV/h，树脂径高比为1∶3；用水洗涤树脂3BV，洗脱流速为2BV/h，水洗脱液弃去；用含30％含水乙醇洗脱8BV，流速为2BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.1，减压干燥，得桔梗总皂苷。测得桔梗皂苷含量为50％(香草醛-冰醋酸，高氯酸显色；UV法；以桔梗皂苷D计，重量百分比)，桔梗皂苷D含量为1.0％(HPLC法，重量百分比)。

实施例2

将桔梗饮片1kg，加15倍量30％乙醇，加热回流提取4次，每次3h，过滤，合并提取液，浓缩至2.0g生药/ml；离心后通过AB-8型大孔树脂的层析柱，提取液按桔梗总皂苷含量计与干树脂的比例为1∶10，上柱流速4BV/h，树脂径高比为1∶9；用水洗涤树脂8BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含95％含水乙醇洗脱，流速为4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.25，减压或喷雾干燥，得桔梗总皂苷。测得桔梗皂苷含量为77％(香草醛-冰醋酸，高氯酸显色；UV法；以桔梗皂苷D计，重量百分比)，桔梗皂苷D含量为2.9％(HPLC法，重量百分比)。

实施例3

取粉碎后的桔梗药材5kg，加8倍量水，加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并提取液，浓缩至1.0g生药/ml；离心(4000转/分钟)后通过AB-8型大孔树脂，药液按桔梗总皂苷含量计与干树脂的比例为1∶5，上柱流速2BV/h，树脂径高比为1∶5；用水洗涤树脂3BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含70％水乙醇洗脱3BV，流速为2BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1.1(50℃热测)，减压干燥，得桔梗总皂苷。测得桔梗皂苷含量为72％(香草醛-冰醋酸，高氯酸显色；UV法；以桔梗皂苷D计，重量百分比)，桔梗皂苷D含量为2.1％(HPLC法，重量百分比)。

实施例4

桔梗药材饮片5kg，加10倍量10％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并提取液，浓缩至0.5g生药/ml；过滤后通过D201型大孔树脂，药液按桔梗总皂苷含量计与干树脂的比例为1∶9，上柱流速3BV/h，树脂径高比为1∶7；用水洗涤树脂5BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含30％水乙醇洗脱10BV，流速为4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1.25(50℃热测)，喷雾干燥，得桔梗总皂苷。测得桔梗皂苷含量为66％(香草醛-冰醋酸，高氯酸显色，UV法，以桔梗皂苷D计，重量百分比)，桔梗皂苷D含量为1.1％(HPLC法，重量百分比)。

实施例5

桔梗药材饮片5kg，加15倍量水，加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并提取液，浓缩至0.25g生药/ml；离心(8000转/分钟)后通过HPD450大孔树脂，药液按桔梗总皂苷含量计与干树脂的比例为1∶6，上柱流速4BV/h，树脂径高比为1∶9；用水洗涤树脂2BV，洗脱流速为3BV/h，水洗脱液弃去；用含50％水乙醇洗脱5BV，流速为3BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1.2(50℃热测)，喷雾干燥，得桔梗总皂苷。测得桔梗皂苷含量为70％(香草醛-冰醋酸，高氯酸显色，UV法，以桔梗皂苷D计，重量百分比)，桔梗皂苷D含量为2.2％(HPLC法，重量百分比)。

Claims (2)

1.一种利用弱极性大孔树脂制备桔梗总皂苷提取物的方法，其特征在于：将桔梗药材粉碎或桔梗饮片，加6～15倍量水或10％-30％乙醇，加热回流提取2～4次，每次1～3h，过滤，合并提取液，浓缩至0.25～2.0g生药/ml；过滤或离心后通过填充有弱极性大孔树脂AB-8的层析柱，提取液按桔梗总皂苷含量计与干树脂的比例为1∶5～10，上柱流速1～4BV/h，树脂径高比为1∶3～1∶9；用水洗涤树脂3～8BV，洗脱流速为2-4BV/h，水洗脱液弃去；用30％～95％乙醇洗脱，流速为2～4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.1～1.25，减压或喷雾干燥，得桔梗总皂苷。

2.根据权利要求1所述的一种利用弱极性大孔树脂制备桔梗总皂苷提取物的方法，其特征在于：所述的离心的转速为4000～16000转/分钟。