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CN100362995C - 依赖于cyp2a酶的制药用途 - Google Patents

依赖于cyp2a酶的制药用途 Download PDF

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CN100362995C CNB988131463A CN98813146A CN100362995C CN 100362995 C CN100362995 C CN 100362995C CN B988131463 A CNB988131463 A CN B988131463A CN 98813146 A CN98813146 A CN 98813146A CN 100362995 C CN100362995 C CN 100362995C
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Abstract

一种调节人细胞色素P450同功酶CYP2A6活性的方法，该方法通过选择性抑制CYP2A6来控制个体体内的烟碱代谢或减少如烟草烟雾中的前致癌物形成致癌物。还描述了各种预防性(即预防和治疗)组合物和方法，包括一种改进的口服烟碱组合物以及将烟碱以及CYP2A6酶之抑制剂一起使用的方法。另外，已经发现个体中存在人细胞色素P450酶CYP2A6(在整篇说明书中简称为“CYP2A6”)的突变型等位基因预示着该个体：(ⅰ)成为抽烟者的可能性减少，(ⅱ)如果他/她成为烟草依赖型，则抽较少的烟，和/或(ⅲ)由于与烟害的接触减少以及CYP2A6酶介导的激活烟草烟雾中及其它前致癌物性底物的减少，个体患癌症的可能性较低。本发明提供了预测个体变成烟草依赖型的可能性以及患与CYP2A6底物相关的癌症之可能性的诊断方法，该方法是分析个体中是否存在人细胞色素P450酶CYP2A6的突变型基因型，该突变型基因型范围从重复基因(多拷贝CYP2A6)到单拷贝甚至由无效等位基因或基因缺失引起的无拷贝。

Description

依赖于CYP2A酶的制药用途
发明领域
本发明涉及调节个体体内烟碱代谢的方法和组合物；增强烟碱替代治疗的方法和组合物；诊断烟草风险性依赖性和癌症可能性的方法和组合物，以及治疗或预防癌症的方法。
背景技术
烟碱(尼古丁)是世界上最广泛使用的精神药物之一。世界卫生组织报道说，目前全球有超过10亿的烟民，或者说全球人口中15岁及以上的人有大约1/3是抽烟者。众所周知，吸烟与许多疾病的较高发病率有关，这些疾病包括各种癌症、呼吸道疾病、心血管疾病、肠胃疾病、以及其它许多医学上的并发症(Lee等人，Arch.Intern.Med.，″抽香烟，烟碱成瘾及其药物治疗″153(1)：34-48(1993))。
烟碱是烟草内建立和维持烟草依赖性的主要化合物(Henningfield等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，″静脉内注射和吸入烟碱的滥用倾向和药效学特征″，234(1)：1-12(1985))。具体地说，本领域中已经知道，成瘾的抽烟者调整他们的抽烟行为来维持中枢的烟碱水平(McMorrow MJ，等人，″烟碱在抽烟中的作用：烟碱调节作用的分析″，Psychological Bulletin，93(2)：302-27(1983)；Russell MSH，″烟碱的摄入和抽烟者对它的调节。抽烟和烟碱″，Advances in behavioural biology，Martin WR，等人，NewYork，Plenum Press，31：25-50(1987))。还进一步知道：(i)如果香烟中的烟碱含量减少，则抽烟行为会增加(Benowitz NL，″药物治疗。抽烟和烟碱成瘾的药理学方面″，NewEngl.J.Med.，319(20)：1318-30(1988))，(ii)如果尿液酸化增加了烟碱的排泄，则抽烟行为会增加(Benowitz NL，″生物体液样品在评价烟草消耗中的用途″，NIDA Res.Monogr.，48：6-26(1983))，和(iii)抽烟行为会随同时静脉内给予烟碱或给予烟碱贴剂而减少(Benowitz，NL等人，″人体内的烟碱代谢特点：抽香烟和透皮给予烟碱的比较″，J.Pharmacol.Exp.Ther.，268(1)：296-303(1994)；和Benowitz，NL等人，″静脉内烟碱替代疗法抑制了抽香烟的烟碱摄入″，J.Pharmacol.Exp.Ther.，254(3)：1000-5(1990))。
鉴于烟碱在产生烟草依赖性和调节抽烟行为中的关键作用，因此了解烟碱代谢方式以及在人体内该代谢方式不同的根源是非常重要的。
在人体内，60-85％的烟碱被代谢成没有活性的代谢产物可替宁(cotinine)(Benowitz等人，1994年)。细胞色素P450(CYP)系统参与烟碱的代谢。CYP参与烟碱代谢的证据来自大鼠肝脏研究，其中重建的纯化的CYP和特异性抗体显示可抑制烟碱代谢。特别是，大鼠研究显示苯巴比妥可诱生的CYP(亦即CYP；-2B1，-2B2，-2C6及-3A2)涉及烟碱代谢。在12种接受试验的人CYP形式中，CYP2B6表现出最高的烟碱氧化酶活性，而CYP2E1及CYP2C9显示出中间的活性(Flammang等人，″cDNA表达的人细胞色素P-450的烟碱代谢″，Biochem.Arch.，8：1-8(1992))。cDNA研究涉及到CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6和CYP2E1，并提供了CYP2A6在分离的表达系统的烟碱代谢中可能起的作用(Flammang等人，1992；McCracken等人，″cDNA表达的人细胞色素P450形成的可替宁″，Med.Sci.Res.，20：877-878(1992))。
在待批的国际专利申请S.N.PCT/CA97/00506(1997年7月17日提交，该专利的内容全部纳入本文作参考)中，本发明者指出，遗传上多态的CYP2A6酶是负责该代谢转化的主要酶。在人群中，经体内和体外测得，个体之间肝CYP2A6功能有很大差异(Yamano S，等人，″CYP2A3基因产物催化人肝微粒体中的香豆素7-羟基化反应″，Biochemistry，29：1322-1329(1990)；Cholerton S，等人，″测定人尿液中7-羟基香豆素的新薄层层析-荧光检测方法和荧光光谱法的比较″，Journal of Chromatography，575(2)：325-30(1992)；Rautio A，等人，″健康志愿者中香豆素7-羟基化的个体间差异″，Pharmacogenetics 2(5)：227-33(1992)；和Iscan等人，″土耳其人中香豆素7-羟基化的个体间差异″，Eur.J.Clin.Pharmacol.47(4)：315-318(1994))。
烟草制品是将烟碱输送到血液的载体，而血液能将烟碱迅速运输到脑和其它器官。烟碱产生了许多生理性和行为上的作用，包括改变脑的化学反应和功能，从而导致个体依赖于烟碱。依赖性抽烟者通过调节它们的抽烟行为来调节脑和身体内的烟碱。证据包括，如果香烟中的烟碱含量减少，则抽烟行为会增加(Benowitz 1988)，如果尿液酸化增加了烟碱的排泄，则抽烟行为会增加(Benowitz 1983)，而且抽烟行为会随着同时静脉内给予烟碱或给予烟碱贴剂而减少(Benowitz等人，1994；Benowitz，NL1990)。
尽管本领域已经在了解烟碱代谢的类型和人类该代谢变异的根源方面有了进展，但仍有需要改善的地方。没有引起注意或引起很少注意的一个地方是对抽烟和烟草相关癌症的可能性的诊断(例如在年龄相对年轻的非抽烟者中)。具体地说，希望有这样一种方法，通过该方法容易鉴定出这样的个体：(i)该个体成为抽烟者的可能性减少，(ii)如果他们产生烟草依赖性，则抽得较少，和/或(iii)由于与烟害的接触减少以及烟草烟雾前致癌物的酶介导激活作用减少，个体患癌症的可能性较低。
使用烟草的结果除了产生烟碱依赖性外，不认为烟碱本身是有害的，即不认为它是导致癌症和心脏病和肺病的物质。认为烟草制品中发现的其它产物才是有害的，它们包括燃烧产物如一氧化碳、气体和焦油。
利用烟碱替代疗法(在全文中也称为“NRT”)将烟碱输送给个体，以试图帮助个体戒除烟草制品。最近，在联合国贸易和发展会议1997年9月22-24日召开的试图减少与烟草相关的发病率和致死率的“关于用可供选择的烟碱输送系统减少抽烟的社会和经济方面的协商会议”中，建议的烟碱替代疗法比烟草更容易实行。
抽烟草制品相当于一种将烟碱迅速输送到血流的机制，因为几乎所有从烟草烟雾吸收的烟碱将到达全身循环系统而无需在一开始时通过肝脏。由于这个原因，常规烟碱替代疗法的根据是采用一种全身性输送烟碱的输送系统(例如透皮系统等)。
不幸的是，目前市售的NRT在使用和给药上相当不方便，许多患者都不喜欢。例如，透皮(如透皮、口香糖等)NRT时常伴有皮肤刺激，而口香糖(以及其它颊输送系统)NRT则口味很差。另外，透皮和口香糖NRT受到输送给患者的烟碱水平不一致的干扰。还有，其它的输送NRT系统如吸入器和鼻喷是患者所不能接受的。
值得注意的是，据本发明者了解，口服烟碱替代疗法目前还没有市售。在不希望受任何特定原理或作用方式的束缚的同时，认为其原因如下。经口的烟碱在进入全身循环前必须首先通过肝脏。结果，烟碱发生了大量的代谢。具体地说，约60-85％的口服的烟碱被肝脏代谢掉，因此只有15-40％的口服的烟碱到达全身循环(Benowitz，等人，″烟碱动力学和生物利用度的稳定的同位素研究″Clin.Pharmacol.Ther.，49(3)：270-7(1991)；Svensson，″烟碱的临床药物动力学″Clin.Pharmacokinet.，12(1)30-40(1987)；和Zins，等人，″灌肠、口服和静脉内给予单剂液体后的烟碱酒石酸盐的药物动力学″J.Clin.Pharmacol.，37(5)：426-36(1997))。由于烟碱的首过代谢非常有效，而且使用高浓度的烟碱又不可能不刺激消化系统，因此，口服给药(如丸剂)是一种效果很低的烟碱输送系统。鉴于这个原因，目前还不知道有有效的口服烟碱替代疗法。因此，希望有这样一种疗法，因为它对于患者来说将更为方便，且更容易由医师来精确控制(例如根据体重和在开烟碱贴剂或口香糖处方时很难考虑的有关因素来开出剂量)。
发明概述
发明人已经发现，个体间的烟碱代谢差异原因为CYP2A同功酶的表达差异；CYP2A6已证明为人肝中主要的烟碱代谢酶。发现香豆素(一种CYP2A6的特异性底物)在受试肝脏中可特异地选择性抑制烟碱代谢成可替宁达84％±11％，而添加奥芬那君(CYP2B6抑制剂)可增强该抑制作用。还发现甲氧沙林(Methoxsalen)和反苯环丙胺(tranylcypromine)是强效的CYP2A6抑制剂，因此是烟碱代谢成可替宁的强效抑制剂。数据表明CYP2A6表达差异导致个体间烟碱代谢的差异，而该差异又具有行为上的结果，例如抽较多或较少的香烟。因此，CYP2A6抑制剂可用来调节烟碱代谢，尤其是明显地减少烟碱代谢，从而影响烟草的使用。
广义上来说，本发明涉及诊断、预防和治疗需要减少人细胞色素P450酶CYP2A(简称“CYP2A”)活性的病情的方法。本文所用的术语“CYP2A”指CYP2A的所有同种型，包括但不局限于CYP2A(CYP1)、CYP2A6、CYP2A7、CYP2A12、CYP2A13和CYP2A16。较佳的酶是CYP2A6。
本发明者已经确定，个体中人细胞色素P450酶CYP2A6(在整篇说明书中简称“CYP2A6”)的突变等位基因的存在预示着该个体(i)变成抽烟者的可能性减少，(ii)如果他/她成为烟草依赖型，则抽较少的烟，和/或(iii)由于与烟的接触减少和CYP2A6介导激活烟草烟雾和其它前致癌物底物的情况减少，患癌症的可能性相当低。
在一个实施方案中，本发明提供一种诊断个体依赖烟草的可能性以及与CYP2A6底物有关的癌症的方法，该方法是分析个体含DNA的机体样品(体样)中是否存在人细胞色素P450酶CYP2A6的突变型等位基因。较佳的，该方法包括测定体样的基因型，该样品可以是从体样中的外周白细胞分离出的基因组DNA。另外，该方法还包括测定体样的表型，该样品可以是一种体液，例如血样或血浆。本发明还提供用于该分析的诊断试剂盒。本发明还提供诊断个体成为烟草依赖性的可能性以及与人细胞色素P450酶CYP2A6底物有关的癌症的方法，该方法是给予个体一剂CYP2A6底物，测定个体体样中所述CYP2A6底物或所述CYP2A6底物的代谢物的水平。
本发明特别证实，携带CYP2A6缺陷型等位基因的个体变成抽烟者的可能性较低，如果变成烟草依赖型，也抽较少的香烟。另外，由于已知CYP2A6激活前致癌物(如在烟草烟雾中发现的那些)，因此本发明的诊断方法可用来确定该多态基因座对于个体患癌症的遗传可能性的贡献。
如果诊断试验的结果是个体具有野生型CYP2A6(即个体不含CYP2A6突变型等位基因)，则本发明的诊断方法和试剂盒预示该个体是这样的个体：(i)变成抽烟者的可能性增加，(ii)如果他/她成为烟草依赖型，则抽较多的烟，和/或(iii)由于与烟的接触减少以及酶介导激活前致癌物的减少，他患癌症的可能性较高。一旦鉴定了该个体，就可用待批专利申请No.PCT/CA97/00506(1997年7月17日提交)和美国临时专利申请No.60/067,021(1997年12月1日提交)中详细描述的有效量的CYP2A6抑制剂作预防性处理，这可得出本发明的其它方面。
因此，本发明还提供一种防止抽烟的组合物，或调节抽烟(行为)的组合物，该组合物包含一种CYP2A6抑制剂以及适用于该抑制剂的载体。本发明还提供了预防或调节抽烟的方法，该方法是给予个体CYP2A6抑制剂。同样，本发明还提供预防、治疗癌症或调节致癌物形成的方法，该方法是给予个体CYP2A6抑制剂。本发明还提供用于这些方法的含有CYP2A6抑制剂的组合物。
本发明提供一种增强口服烟碱疗法(如口服给予烟碱酒石酸氢盐)的方法，该方法通过选择性地抑制CYP2A6来抑制烟碱代谢，该方法还任选地选择性抑制CYP2B6。较佳的CYP2A6抑制剂包括香豆素、甲氧沙林和反苯环丙胺。
该方法可用来治疗需要给予烟碱的病情，较佳的是将CYP2A6抑制剂和烟碱的口服配方一同给予，任选地还可给予CYP2B6抑制剂。较佳的CYP2A6抑制剂包括香豆素、甲氧沙林和反苯环丙胺。
本发明者惊奇地发现几种天然产物是酶CYP2A的抑制剂。因此，本发明提供了一种抑制CYP2A的方法，该方法包括给予需要它的个体有效量的该天然产物或该天然产物的提取物，该方法可用来治疗需要调节CYP2A活性的病情。在一个实施方案中，天然的产物是金丝桃或金丝桃提取物。在另一个实施方案中，天然产物是菊苣或叶子花(Bougainvllra spectabillis)或其提取物。
本发明还提供了一种组合物，该组合物包含烟碱和CYP2A6抑制剂的口服配方，还任选地含有CYP2B6抑制剂。较佳的CYP2A6抑制剂包括香豆素、甲氧沙林和反苯环丙胺。
本发明的其它目的、特征和优点可从下文的详细描述中明显看出。本发明的各方面内容可能在下列一个或多个美国临时专利申请中有更完全的描述：60/067,20；60/067,021；60/084,847；和60/107,392，这些文献的内容均全部纳入本文作为参考。然而，还应理解，详细描述和具体的实施例在表明本发明较佳实施方案的同时只是以描述性方式给出，因为本领域技术人员显然能在本发明的精神和范围内对该详细描述作各种变化和改进。
附图简述
在参看了下列附图后，将能更好地了解本发明：
图1描述了一个研究的结果，该结果显示了在杂合型CYP2A6个体和野生型CYP2A6个体中CYP2A6活性随着给予CYP2A6底物后的时间而变的情况；
图2A-2D显示了一些典型的CYP2A6抑制剂的化学结构；
图3描述了禁食的早晨香豆素(C)测试和不禁食的下午香豆素(C)测试之间的相关性；
图4显示了给予100毫克香豆素之个体的血浆内检测到的7-羟基香豆素总浓度的时程；
图5和6描述了实施例1所述研究的结果；
图7描述了实施例8报道的研究中的烟碱平均血浆浓度；
图8描述了实施例8报道的研究中的当前抽烟欲望；
图9描述了实施例9报道的研究中呼气中的一氧化碳平均值；
图10描述了实施例9中血浆烟碱增量与呼气中的一氧化碳增量之比；
图11描述了在实施例9的抽烟期内所抽香烟的平均数；
图12描述了在实施例9的抽烟期内每10分钟内喷几口香烟的平均数；
图13描述了实施例9中前两根香烟之间等待时间的平均值；
图14描述了实施例9中燃烧的烟草的平均克数。
图15描述了CYP2A6抑制剂甲氧沙林和反苯环丙胺对于增加口服烟碱之生物利用度的影响，同时伴随抽烟欲望的减少。
图16描述了金丝桃提取物对于人cDNA表达的CYP2A6之烟碱代谢作用的影响。
图17显示了在小翘连属植物(St.John′s Wort)或安慰剂存在下烟碱平均血浆浓度对时间的曲线。
图18的柱状图显示了在小翘连属植物或安慰剂存在下烟碱的平均血浆浓度。
图19描述了七叶亭对人肝微粒体之烟碱代谢作用的影响。
图20描述了在天然产物中发现的各种化合物的化学结构。
较佳实施方案详述
广义上来说，本发明涉及诊断、预防和治疗需要减少CYP2A活性的疾病的方法。本文所用的术语“CYP2A”指CYP2A的所有同种型，包括但不局限于CYP2A(CYP1)、CYP2A6、CYP2A7、CYP2A12、CYP2A13和CYP2A16。较佳的酶是CYP2A6。
如待批国际专利申请PCT/CA97/00506中所述的(该文内容纳入本文作为参考)，CYP2A6(以及任选的CYP2B6)的抑制作用抑制了烟碱的代谢。具体地说，发现CYP2A6是人肝中主要的烟碱代谢酶，通过抑制CYP2A6，就能抑制肝中的烟碱代谢。
诊断方法
本发明者已经指出，携带CYP2A6突变型等位基因的个体(i)变成抽烟者的可能性减少，(ii)如果他/她成为烟草依赖型，则抽较少的烟，和/或(iii)由于与烟的接触减少以及CYP2A6介导的激活烟草烟雾中的及其它前致癌物底物的减少，他患癌症的可能性相当低。
因此，本发明提供了一种测定个体变成抽烟者之可能性的方法，该方法包括测定个体中CYP2A等位基因的基因型或表型，其中突变型等位基因的存在预示着变成抽烟者的可能性减少。较佳的，该CYP2A酶是CYP2A6。
烟草烟雾含有许多烟草特有的前致癌物亚硝胺，例如N-亚硝基二乙胺和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。这些化合物称为前致癌物(procarcinogen或precarcinogen)，因为它们由身体激活。具体地说，这些烟草烟雾中的前致癌物可被CYP2A6激活(Crespi，等人，″人细胞色素P450IIA3：cDNA序列，该酶在前诱变剂的代谢激活中的作用，与人细胞色素P450IIE1激活亚硝胺相比″，Carcinogenesis11(8)：1293-1300(1990)；Yamazaki，等人，″细胞色素P450 2E1和2A6酶是人肝微粒体中N-亚硝基二烷胺和烟草有关的亚硝胺之代谢激活的主要催化剂″，Carcinogenesis13(10)：1789-94(1992))。因此，具有CYP2A6无效等位基因的个体将烟草烟雾前致癌物生物活化成致癌物的效果可能较差。这是特别有趣的，因为CYP2A6变体等位基因的频率存在人种差异(Nowak等人，1988；Fernandez-Salguero P，等人，″香豆素7-羟基化的遗传多态性：人CYP2A基因的序列和CYP2A6变体等位基因的鉴定″，Am.J.Hum.Genet.，57(3)：651-60(1995)；Yoloi和Kamataki，1998)，并可能与肺癌发病率和组织学的人中差异有关(Groeger等人，1997)。因此，携带CYP2A6缺陷型等位基因的个体产生与烟草有关的癌症以及其它并发症的可能性可能较低，原因有三。1)他们成为抽烟者的可能性较低。2)如果他们成为烟草依赖型，他们抽的量比烟碱代谢未受损害的人要少，因而与烟草相关的前致癌物的接触较少(Law，等人，″抽香烟量、肺癌的生物化学标记和危险性之间的剂量-反应关系″Br.J.Cancer 75(11)：1690-1693(1997))。3)他们可能激活更少的与烟草有关的前致癌物。这三个因素提示CYP2A6缺陷型等位基因携带者患烟草相关性癌症的可能性明显较低。
因此，本发明提供了一种确定个体患癌症之可能性的方法，该方法包括测定个体中CYP2A等位基因的基因型或表型，其中突变型等位基因的存在预示着产生癌症的可能性降低。较佳的，该CYP2A酶是CYP2A6。
本发明的诊断方面包括测定个体是具有野生型还是具有突变型CYP2A6等位基因的表型测定方法和基因型测定方法。表型测定试验可通过一个代谢研究来进行，该试验实际上是一个测定CYP2A6活性的体内酶试验。该试验可以这样进行：给予某一剂量CYP2A6底物(例如烟碱或香豆素)，在给予测试剂量时和随后的一个或多个时间点监测个体中底物和/或其酶促代谢产物的生理水平。通常，是用针对特定组分的熟知试验来测定生物学体液(如血液、血浆或尿液)中的该组分水平，这些试验的例子公开在本文中。下文实施例3提供了一个体内测定表型和酶活性的例子。该表型测定可以根据CYP2A6的正常表达水平，按照烟碱代谢速度的递减次序对个体进行分类，该表达水平通常对应于个体的基因型，纯合型对应于完全活性的CYP2A6，杂合型或纯合型对应于较低活性的等位基因。
该诊断方法还根据分析个体之含DNA的体样中是否存在人细胞色素P450酶CYP2A6的突变型等位基因。在本说明书的整个篇幅中，术语“突变型等位基因”包括CYP2A6活性降低或缺少的任何等位基因，即包括无效等位基因。CYP2A6突变型等位基因的存在可通过常规的基因型或表型试验来确定。
已经鉴定出许多CYP2A6等位基因，其包括但不局限于，野生型等位基因(在本说明书的整个篇幅中称为“CYP2A6*1”)，以及两个缺陷的或无效的突变型等位基因(分别为“CYP2A6*2”和“CYP2A6*3”，(见Fernandez-Salguero，等人，1995)，该文的内容纳入本文作参考)。CYP2A6*2等位基因与野生型等位基因的不同之处在于有单个点突变，该突变导致密码子1609的氨基酸从亮氨酸变为组氨酸。体外和体内研究已经证实该等位基因是无效等位基因。CYP2A6*3等位基因中的突变发生在外显子3、6和8中。最近，鉴定出另一个CYP2A6等位基因，它缺失了整个CYP2A6基因(Nunoya K等人，1988″在个体中发现的人细胞色素P450 2A6(CYP2A6)基因的一种新的缺失型等位基因显示出对香豆素和(+)-顺式-3，5-二甲基-2-(3-吡啶基)噻唑烷-4-酮盐酸盐(SM-12502)的代谢能力差″Pharmacogenetics 1998，8：239-249)。当然，用本发明的表型测定方法和/或基因型测定方法，可能还能在个体中鉴定出编码活性减低的CYP2A6酶的其它突变型等位基因，预计这些个体产生癌症以及抽烟的可能性也较低。
适合本发明的诊断方法(以及下文描述的预防和治疗方法)的个体可以是任何类型的哺乳动物，但较佳的是灵长类动物，更佳的是人。
较佳的，身体样品是体液，如血液或血浆。另外，该身体样品可以是组织。例如参见，Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)，该书的内容被纳入本文作为参考，用来讨论本文所述诊断方法的常用试验技术。
图1描述了具有杂合型CYP2A6活性的一组个体(组I，即该组中每个个体具有一个突变型CYP2A6等位基因和一个有活性的CYP2A6等位基因)以及具有野生型CYP2A6活性的一组个体(组II，即该组中的每个个体具有两个有活性的CYP2A6等位基因)中CYP2A6活性的结果。在给予香豆素(100毫克)后35分钟、45分钟和75分钟时，取两组中每个个体的血浆样品。用香豆素7-羟基化评价CYP2A6的活性。表型试验的结果明显表明，组I个体的CYP2A6活性明显低于组II的个体(在35和45分钟时低于后者的一半)。
或者，该对象是具有与酶活性形式有关的CYP2A6基因型的个体。个体的CYP2A6基因型以及个体中活性CYP2A6酶的存在可用本文描述的技术来测定。例如，已经用香豆素7-羟基化来测定CYP2A6活性(见Cholerton，等人，(1992)和Rautio，等人，(1992))。
本发明认识到CYP2A6是人肝脏中主要的烟碱代谢酶，这提示可以在个体中测定该酶来确定个体产生烟草依赖性的可能性。还可通过测定CYP2A6水平来选择和监测个体中合适的常规烟碱替代疗法(如烟碱贴剂和烟碱口香糖)。如果个体具有高水平的CYP2A6，常规的烟碱替代疗法(例如烟碱口香糖、烟碱贴剂、喷雾剂、肺吸入或其它形式)未必具有非常成功的结果，尽管这些个体是本发明增强性NRT方法的良好候选物。相反，如果个体具有非常低水平的CYP2A6，那么给予高剂量的烟碱可能会导致毒性副作用增加。另外，CYP2A6抑制剂和现有NRT的共同给予预计将减少烟碱动力学并增强NRT的效果(在下文治疗方法章节中有所讨论)。
预防和治疗方法
如上所述，本发明涉及预防和治疗需要减少CYP2A酶活性的状况的方法。具体地说，本发明的预防/治疗方面涉及治疗和预防抽烟，以及在个体体内形成致癌物和癌症。每个方面均涉及给予个体一种CYP2A抑制剂，较佳的是CYP2A6抑制剂。
一方面，本发明提供了一种预防、治疗或调节个体抽烟行为的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种选自下列的物质：(i)抑制CYP2A活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A的基因转录、翻译或这两者的物质；(iii)除去CYP2A编码基因之全部或一部分的物质。较佳的，该CYP2A是CYP2A6。
本说明书整个篇幅中采用的术语“防止抽烟”是指使目前不抽烟的个体(从不抽烟的人或戒烟者)开始抽烟(即从一根香烟发展到有规律的抽烟)的可能性显著减少，以及以前的抽烟者恢复抽烟的可能性显著减少(即防止复发)。
本说明书整个篇幅中采用的术语“调节抽烟”指减少目前抽烟个体的抽烟量，或至少使其不再增加。
术语“治疗抽烟”指终止所有抽烟行为或减少抽烟量(表现为使用烟草制品减少，使用方式减少或与烟草烟雾的接触减少)。接触烟草烟雾的指标可通过分析呼气中的一氧化碳来确定。
另一方面，本发明提供了调节个体体内致癌物形成的方法，该方法包括给予该个体有效量的一种或多种选自下列的物质：(i)抑制CYP2A活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A的基因转录、翻译或这两者的物质；(iii)除去编码CYP2A的基因的全部或一部分的物质。较佳的，该CYP2A是CYP2A6。
本说明书整个篇幅中采用的术语“调节致癌物的形成”指减少个体中致癌物的形成的发生。例如，这可以通过抑制CYP2A6来抑制个体中前致癌物的激活。本说明书整个篇幅中所用的术语“前致癌物”包括至少具有前细胞毒性(procytotoxic)、前诱变性(promutagenic)和前遗传毒性(progenotoxic)之一的任何物质(″前(pro)″指代谢物比母体化合物更具活性)。
另一方面，本发明提供了一种预防个体发生癌症的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种选自下列的物质：(i)抑制CYP2A活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A的基因转录、翻译或这两者的物质；(iii)除去编码CYP2A的基因的全部或一部分的物质。较佳的，该CYP2A是CYP2A6。
本说明书整个篇幅中所用的术语“预防癌症”指使目前未患癌症的个体(即从未患过癌症的人或癌症已经缓解的人)患癌症的可能性显著减少。
本文的术语“抑制剂”和“抑制”具有较广的含义，其包括直接或间接(例如通过反应性中间物、代谢物等)作用于CYP2A从而抑制或调节CYP2A催化底物代谢之能力的物质。间接作用于CYP2A的其它物质包括抑制编码CYP2A的基因转录和/或翻译的那些物质。具体地说，术语“CYP2A6抑制”和“CYP2A6抑制剂”具有较广的含义，其包括下列任何物质：(i)抑制CYP2A6活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A6的基因转录和/或翻译的物质；或(iii)除去编码CYP2A6的基因的物质。特别佳的物质是下面这些物质：改变烟碱代谢成可替宁之动力学的物质、改变抽烟行为的物质、改变不抽烟人群变成抽烟成瘾之可能性的物质、或是改变致癌物形成(致癌物通过CYP2A催化由前致癌物形成)动力学的物质，更佳的是表现出生物学上改变的效应但不产生水平明显的其它生物学效应的物质。
当一种物质能改变烟碱代谢成可替宁的动力学，能改变抽烟行为，能改变不抽烟人群抽烟成瘾的可能性，或能改变致癌物形成(通过CYP2A催化由前致癌物形成)的动力学，而其剂量水平通常低于能有效产生另一生物效应的该物质剂量时，则称该物质将“选择性地”抑制CYP2A活性。例如，下文指出，给予甲氧沙林能起提高烟碱血浆浓度和降低依赖性抽烟者抽烟欲望的作用，其水平是用甲氧沙林治疗牛皮癣的治疗性剂量的四分之一。
本文所用的术语“有效量”指能有效地持续所需时间以达到所需结果的量；这可能指当所需结果是选择性抑制而且选择性是通过不同的CYP2A抑制作用来实现时的有限剂量。较佳的，该物质抑制CYP2A6。
CYP2A6抑制剂
如上所述，本发明一方面涉及一种调节个体内烟碱代谢成可替宁的方法，该方法包括选择性抑制CYP2A6。可使用一种或多种下列物质来抑制CYP2A6：(i)抑制CYP2A6活性的物质；或(ii)抑制编码CYP2A6的基因转录和/或翻译的物质。
可抑制CYP2A6活性的物质包含可特异性结合CYP2A6从而抑制其活性的物质。这些物质的例子包括CYP2A6特异性抗体，例如Pearce，R.等人(″肝微粒体细胞色素P450 2A酶的种间差异和个体间差异：对于香豆素、败坏翘摇素(双香豆素，dicumarol)和睾丸素(testosterene)氧化作用的影响″，Arch.Biochem.Biophys.，298(1)：211-225(1992))所述的单克隆抗体，以及市售的抗体如MAB2A6及单克隆CYP2A6(Gentest Corporation，Woburn，Mass.，USA出售)；Xeno Tech 2A6(XenoTechLLC，Kansas City，KS，USA出售)和多克隆CYP2A6(Research Diagnostics，Inc，Flanders，N.J.，USA出售)。
较佳的CYP2A6抑制剂包括甲氧沙林、补骨脂素、反苯环丙胺、毛果碱、香豆素、色酮、七叶亭、苯乙肼、帕罗西汀、司来吉兰和帕吉林。
抑制CYP2A6活性的物质还包括含有一个羰基氧的内酯结构的物质。此类物质之非限制性例子包括香豆素(默克索引第11版，Budavari，S.编辑，默克公司，1989年，2563号)，呋喃并香豆素，甲氧沙林(默克索引5911号)，欧前胡素(白茅苷，默克索引4839号)，补骨脂素(默克索引7944号)，α-萘黄酮，异茴芹内酯，β-萘黄酮，香苷内酯(香柠檬烯，默克索引1173号)，牛防风定(异白芷内酯)，香豆素四基(racumin)，及(+)-顺-3，5-二甲基-2-(3-吡啶基)-噻唑烷-4-酮(SM-12502)(Nunoya，等人，J Pharmacol.Exp.Ther.，2772：768-774，1996)。抑制CYP2A6且可用于本发明方法及组合物的其它物质包含4′，5，7-三羟黄烷酮(油柑配基)及相关的黄酮类，二乙基二硫代氨基甲酸盐，烟碱(主要用于本发明的筛选方法)，N-亚硝基二烷基胺(例如N-亚硝基二乙胺(默克索引6557号)，N-亚硝基二甲胺(默克索引6558号))，硝基芘，甲萘醌(默克索引5714号)，咪唑抗真菌剂咪康唑(默克索引6101号)，克霉唑(默克索引2412号)，匹鲁卡品(默克索引7395号)，六甲基磷酰胺，4-甲基亚硝基胺-3-吡啶基-1-丁醇，黄曲霉毒素B(默克索引168号)，反苯环丙胺(默克索引9491号)，包括顺式、反式(+)和(-)异构体，三甲沙林、阿拉丙酯、苯乙肼、帕吉林、帕罗西汀、司来吉兰、苯丙胺、安非他酮、丁螺环酮、西酞普兰、去甲基西酞普兰、多塞平、氟西汀、纳曲酮、去甲氟西汀、去甲替林、舍曲林、曲唑酮、非喹连(viaqualine)、苯吡烯胺(齐美定)、色酮、香柠檬烯和4′.5，7-三羟黄烷酮。抑制CYP2A6活性的所有物质均包括化合物的外消旋混合物以及顺、反、(+)和(-)异构体。这些以及其它非限制性的典型抑制剂的化学结构见图2A至2D。选择性和非选择性单胺氧化酶抑制剂(例如阿拉丙酯、苯乙肼、deprenyl、巴吉林、司来吉兰等)是特别佳的。如下所述能抑制CYP2A6的上述化合物的各种异构体均在本发明的考虑范围内。
在本发明的方法和组合物中还可使用这些物质的衍生物和类似物。衍生物和类似物包括在结构上与本文所述的化合物相似并能结合CYP2A6活性部位的化合物。例如，反苯环丙胺、香豆素和甲氧沙林的衍生物包括反苯环丙胺、香豆素和甲氧沙林的药学上可接受的盐、酯和复合物(包括钾盐和钠盐，以及氨基酸、碳水化合物以及脂肪酸复合物)。举例来说，合适的香豆素类似物可根据与香豆素相似的功能来选择，包括抑制CYP2A6将烟碱代谢成可替宁的能力。香豆素之功能性类似物的例子包括7-甲氧基香豆素、7-甲基香豆素和7-乙氧基香豆素以及图2A、2B、2C显示的所有结构。香豆素类似物的选择还可根据它们与香豆素三维结构(即内酯/羰基结构)的相似性来选择。
本发明者惊奇地发现，天然产物和天然产物提取物抑制了人肝微粒体中以及纯的全长人cDNA表达的细胞色素中的CYP2A6活性。因此，本发明的CYP2A6抑制剂包括能抑制CYP2A6的天然产物或天然产物提取物，如金丝桃或金丝桃提取物或菊苣或叶子花或其提取物。
本文所用的术语“金丝桃”与贯叶金丝桃(Hypericum perforatum)，小翘连属植物(St.John′s Wort)，羊角芹和贯叶连翘同义。本文所用的术语“金丝桃或金丝桃提取物”包括贯叶金丝桃全植物或能抑制CYP2A活性的衍生物、提取物、分离或纯化的组分。它包括植物的天然组分以及合成的类似物。一种较佳的金丝桃提取物是甲醇提取物。
可用于本发明的方法和组合物的金丝桃衍生物包括金丝桃素、假金丝桃素、栎精、金丝桃苷、槲皮甙、异槲皮甙、芸香苷、樟脑醇(campherol)、藤黄菌素、13-II8-biopigenin、1，3，6，7-四羟基呫吨酮、矢车菊苷配质、贯叶金丝桃素、精油、酚碳酸(如氯原酸)、呫吨酮、苯基丙烷类、黄酮醇衍生物、双黄酮(biflavone)、原花色素、呫吨酮类、间苯三酚类、萘骈二蒽酮类以及香精的油组成。还包括衍生物的药学上可接受的盐、酯和复合物(包括钾盐和钠盐，以及氨基酸、糖类和脂肪酸复合物)。合适的金丝桃衍生物可根据其抑制CYP2A 50％以上和/或Ki小于300μM的能力来选择。
本文所用的术语“菊苣或叶子花或其提取物”包括菊苣或叶子花的全植物或能抑制CYP2A活性的其衍生物、提取物、分离的或纯化的组分。这包括植物的天然组分以及合成的类似物。一种较佳的菊苣或叶子花提取物是七叶亭、七叶灵或七叶灵单水合物。
图20中以及纳入本文作参考的美国临时申请60/084,847中显示了可用于本发明的其它天然产物提取物。
上面所列的可抑制CYP2A6的物质仅供举例说明之用而不应视为对本发明范围的限制。其它可抑制CYP2A6活性的物质可用本文所述的筛选方法来鉴别。
可抑制编码CYP2A6的基因转录及/或翻译的物质包括编码CYP2A6基因(基因库保藏号HSU22027)或其部份(例如在核苷酸790(ATG)任一侧约20个核苷酸，及剪接位点1237，2115，2499，3207，4257，4873，5577及6308)的核酸序列，它与正常转录方向颠倒，亦即反义CYP2A6核酸分子。此种反义核酸分子可用化学方法来合成，采用的是天然的核苷酸或设计成可提高分子生物稳定性或增高与CYP2A6mRNA或CYP2A6基因形成的双链体之物理稳定性的各种修饰的核苷酸。该反义序列可用生物学方法制得，用表达载体以重组质粒，嗜菌粒或减毒病毒形式引入细胞内，在该细胞内反义序列在高度有效的调节区之控制下产生，其活性可由引入载体的细胞类型决定。
含反义序列的核酸分子可用常规技术例如转化、转染、感染及物理技术(如电穿孔及微量注射)引入对象的细胞内。化学方法例如DNA共同沉淀及合并入脂质体也可用来输送反义序列。这些分子也可以气溶胶或灌洗形式输送。用来转移核酸分子的适当的载体或克隆载体为本领域所知。适当的载体的例子包括逆转录病毒载体，腺病毒载体及DNA病毒载体。
物质选择性抑制CYP2A6从而调节烟碱代谢成可替宁的能力可通过本文所述筛选抑制剂的方法来加以确证。
本发明的一个实施方案中，CYP2A6抑制剂选自香豆素，甲氧沙林，反苯环丙胺、其衍生物及其类似物中的至少一个(参见图2A)。初步体外筛选及临床研究已经确定甲氧沙林是强效的CYP2A6抑制剂。
在本发明方法中，通过使用基因转移方法(如用等位基因置换、插入失活及缺失形成进行定向基因诱变)干扰编码CYP2A6的基因的转录，也可选择性地抑制CYP2A6。例如，使用非复制或条件复制质粒进行等位基因交换已经广泛用于真核细胞的诱变。等位基因交换可用于产生CYP2A6基因缺失。作出上述改变的典型方法在Sambrook等人(1989)的文献中有所描述。
CYP2B6抑制剂
CYP2B6抑制剂也可与CYP2A6抑制剂合用来增强抑制效果。CYP2B6抑制剂包含下列一种或多种物质：(i)抑制CYP2B6活性的物质；或(ii)抑制CYP2B6编码基因转录及/或翻译的物质。CYP2B6抑制剂也可单独用于个体以抑制烟碱代谢。
抑制CYP2B6活性的物质包括特异性结合CYP2B6从而抑制其活性的物质。这些物质的例子包括对CYP2B6具有特异性的抗体，例如市售的抗体如抗CYP2B6(Gentest Corporation，Woburn，Mass.，USA出售)。
抑制CYP2B6活性的物质也包括选自以下所列物质：苯基乙基胺类，二苯基巴比妥酸盐类，二乙基取代巴比妥酸盐类，及乙内酰脲类。特别是，苯海拉明及其衍生物，包括奥芬那君(默克索引6831号)及奥芬那君的衍生物或类似物以及其它抗组胺类，抗胆碱能物质如胆碱类及其类似物和衍生物可作为CYP2B6抑制剂用于本发明的各方法及组合物的实施方案。抗体，如多克隆CYP2B1/2，多克隆CYP2B1及多克隆CYP2B6(Gentest Corporation，Woburn，Mass.，USA出售)也特异性结合CYP2B6，故也可抑制CYP2B6的活性。
可用于本发明方法及组合物的奥芬那君衍生物包括奥芬那君的药学上可接受的盐、酯及复合物(包括钾盐及钠盐，及氨基酸，碳水化合物及脂肪酸配合物)。在一个实施方案中，奥芬那君的适当类似物可根据其与奥芬那君功能的相似性(包括抑制CYP2B6的能力)来选择。奥芬那君类似物还可根据其与奥芬那君的三维空间结构相似性来选择。
抑制CYP2B6编码基因转录/或翻译的物质包括编码CYP2B6基因的核酸序列(参见图2B，基因库保藏号HSP452B6有关CYP2B6的mRNA序列)，或其部份(例如在核苷酸9(ATG)任一侧的区域，以及核苷酸位111，274，424，585，762，904，1092及1234)的核酸序列，它与正常转录方向相反，亦即为反义CYP2B6核酸分子。这种反义核酸分子可用本文所述常规方法产生并引入细胞。
在本发明的方法中，也可用本文讨论的常规基因转移方法干扰CYP2B6编码基因的转录来选择性抑制CYP2B6。
在本发明的较佳实施方案中，使用的CYP2B6抑制剂是奥芬那君及奥芬那君衍生物或类似物。
可用对酶表位特异的抗体将CYP2A6或CYP2B6抑制剂导向酶。例如可用双特异性抗体来导向抑制剂。该双特异性抗体含有对CYP2A6或CYP2B6中至少一个表位有特异性的抗体的可变区，以及可结合至抑制剂的第二抗体的可变区。可用本领域已知的方法，例如Staerz，等人(″用杂交瘤生产能使效应T-细胞活性集中的双特异性单克隆抗体″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(5)：1453-7(1986))及Staerz等人(今日免疫学，7：241(1986))所揭示的内容，通过形成杂交瘤来制得双特异性抗体。还可使用常规方法，如Staerz等人(″能为T细胞攻击提供靶位点的杂交抗体″，自然，314(6012)：628-31(1985))和Perez等人(″用连接抗靶细胞抗体的抗-T3使细胞毒性T细胞具有特异性靶向″，自然，316(6026)：354-6(1985))所述的方法以化学方法，或通过重组免疫球蛋白基因构建物的表达来构建双特异性抗体。
烟碱替代疗法
单单含有烟碱的口服烟碱替代疗法的效果是很低的，因为肝中广泛的烟碱代谢显著降低了烟碱的全身性利用率。然而，给予烟碱和CYP2A抑制剂将提高该口服烟碱疗法的生物利用度和效果。
本发明还包括一种烟碱替代疗法，该方法包括同时给予需要治疗的个体(a)口服用烟碱和(b)一种或多种选自下列的物质：(i)抑制CYP2A活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A的基因转录、翻译或这两者的物质；(iii)除去CYP2A编码基因之全部或一部分的物质。
较佳的，该抑制剂是CYP2A6抑制剂，如甲氧沙林或反苯环丙胺。
本文所用的术语“同时给予”个体两种物质指，提供两种物质的每一种，使得它们在个体中同时具有生物活性。给药的确切细节将取决于两种物质在相互存在时的药物动力学，如果药物动力学合适的话，可包括在相隔数小时内给予两种物质，或者甚至在给予一物质后24小时内给予另一物质。根据本文提供的CYP2A6底物和抑制剂的生物活性来设计合适的给药方案，这对于本领域技术人员来说是常规的。在具体的实施方案中，两种物质将基本上同时给予，即相隔数分钟，或是在含有这两种物质的一个组合物内。另一方面，起缺失或除去CYP2A6编码基因作用的CYP2A6抑制剂可以在给予烟碱或前致癌物(否则它会被CYP2A6转变成致癌物)之前数月或甚至数年给予，两次给药的效果可能仍然是同时发生的。
抑制剂的筛选
除了上文列出的CYP2A抑制剂外，可用于本发明方法的物质还包括：改变烟碱代谢成可替宁之动力学的其它物质、改变抽烟行为的物质、改变不抽烟人群抽烟成瘾可能性的物质、改变致癌物形成(通过CYP2A催化由前致癌物形成)动力学的物质。所有这些物质所具有的共同的能力是能减少个体中的CYP2A酶活性。因此，本文提供了一种筛选个体中抑制CYP2A酶的物质的方法，该方法包括检测一种物质，它可选择性地(i)抑制CYP2A6活性，(ii)抑制CYP2A6编码基因的转录和/或翻译，或(iii)缺失或除去CYP2A6编码基因。
本文鉴定出的特定物质或其类似物或衍生物的抑制活性可通过在如下文所述以及本文实施例列举的实验模型系统以及临床研究中进行测试来加以确认。另外，上述物质或用本文所述筛选方法新鉴定出的物质的特异性或选择性还可如下文所述的那样来加以鉴定或确认。尽管本发明没有要求任何特定的测试，但是通过如下文所述那样测试物质，很容易确定特定物质(如上文或图2A-2D没有具体指出的物质)作为CYP2A6抑制剂的用途。
体外抑制
选择用于本发明方法的候选抑制剂的初步筛选方法包括：
(a)在试验物质存在下，在CYP2A6可将底物转化为反应产物的条件下使CYP2A6底物与CYP2A6来源反应；
(b)测定反应产物、未反应的底物或未反应的CYP2A6；
(c)将该试验的结果与没有该物质存在时的对照比较，从而确定该测试物质是否抑制CYP2A6，从而能抑制CYP2A酶。
可用于鉴定用于本发明方法的物质的体外测试以及下文之体内测试的CYP2A6底物包含烟碱，香豆素，其类似物及其衍生物。烟碱及香豆素的相应反应产物分别为可替宁及7-羟基香豆素。
用于本发明方法的CYP2A6可得自天然、重组或商业来源。例如CYP2A6可通过重组方法(如Nesnow，S等人，″N-亚硝基二乙胺和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮诱导表达人细胞色素P450 2A6的C3H/10T1/2CL8细胞发生形态转化″，MutationResearch，324：93-102(1994)所述的方法)获得。表达CYP2A6的细胞或肝脏微粒体也可用于本方法。
能形成反应产物的条件可根据诸如测试物质及底物的性质及数量来加以选择。将测试物质存在及不存在下采用该底物的结果与用甲氧沙林或反苯环丙胺作为对照获得的表现为阳性抑制测试的结果比较。
反应产物，未反应酶底物及未反应的CYP2A6可用常规分离技术进行分离，例如盐析，层析，电泳，凝胶过滤，分级分离，吸收，聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝集或上述方法的组合。
若要加速反应产物未反应的底物或未反应CYP2A6的测定，则可利用抗反应产物或该物质的抗体，或标记的CYP2A6或底物，或标记的物质。抗体、CYP2A6、底物或物质可以用可检测的标记(如放射性标记，或被特异性标记的抗体识别的抗原，荧光化合物，酶，标记抗原的特异性抗体，及化学发光化合物)加以标记。
用于本发明方法的底物可以是不溶解的。例如可与适当的载体结合。适当载体的例子为琼脂糖，纤维素，葡聚糖，葡聚糖凝胶(Sephadex)，琼脂糖凝胶(Sepharose)，羧甲基纤维素，聚苯乙烯，滤纸，离子交换树脂，塑料膜，塑料管，玻璃珠，聚胺-甲基乙烯基醚-马来酸共聚物，氨基酸共聚物，乙烯-马来酸共聚物，尼龙，丝绸等。载体例如可呈管形，试验板形，珠形，盘形，球形等。不溶性CYP2A6、底物或物质可使用已知的化学或物理方法(例如溴化氰偶联法)由该物质与合适的不溶性载体反应而制成。
体内抑制
然后可对通过上述体外筛选测试的物质进行体内测试，以确认它们用于本发明方法的合适性。合适的体内测试方法包括下列步骤：
(a)给予个体口服剂型的亚治疗剂量的烟碱(例如1.0、2.0或4.0毫克，以主剂(base)表示)以及测试物质；
(b)收集个体在给予烟碱之前和给予烟碱之后(例如(a)后30、60和90分钟)的血浆样品；
(c)用常规的分析技术(例如HPLC、气相色谱等)测定血浆烟碱浓度，和
(d)将血浆烟碱浓度与对照(即给予烟碱而不给予测试物质)比较，评价测试物质是否在一个或多个时间点(较佳的在较后的时间点)导致血浆烟碱浓度有统计学意义的增加。
基因水平效应物
可以采用类似的方法来筛选在个体体内通过抑制CYP2A6编码基因转录和/或翻译来调节烟碱代谢成为可替宁的物质。这种物质的筛选方法包括下列步骤：
(a)在试验物质存在下培养包含某核酸分子的宿主细胞，该核酸分子含有编码CYP2A6的核酸序列，以及该核酸序列转录或翻译所需的元件及任选的报道基因；及
(b)将无测试物质存在下转染了核酸分子的对照细胞的CYP2A6的表达水平，或报道基因编码蛋白的表达水平进行比较。
适用于本发明方法的宿主细胞可通过用包含编码CYP2A6之核酸序列的核酸分子转染合适宿主来制得。编码CYP2A6的核酸序列可按照本领域已知步骤根据CYP2A6基因序列(序列见Genbank登录号HUS22027，纳入本文作参考)来构建。合适的转录和翻译元件可从各种来源衍生获得，这些来源包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫的基因。转录和翻译元件的适当选择取决于所选的宿主细胞，这很容易由本领域普通技术人员来实现。这些元件的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，根据所选的宿主细胞和采用的载体，表达载体中还可以插入其它基因元件，例如复制起始位点、额外的DNA限制性位点、增强子以及赋予转录可诱导性的序列。还应理解，所需的转录和翻译元件可以由天然的CYP2A6基因和/或其侧接序列来提供。
报道基因的例子是编码某蛋白的基因，该蛋白例如是β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、火萤萤光素酶或某种免疫球蛋白或其部分如免疫球蛋白(较佳的是IgG)的Fc部分。报道基因的转录通过报道蛋白(如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或火萤萤光素酶)的浓度变化来监测。这样就能显示和测定CYP2A6的表达，尤其是确定该物质对CYP2A6表达的影响。
合适的宿主细胞包括各种原核和真核宿主细胞，其包括细菌、哺乳动物、酵母或其它真菌、病毒、植物或昆虫细胞。
用来转染宿主细胞的方法是本领域中所熟知的(例如参见Sambrook等人(1989))。例如，NanjiM，等人(″编码人CYP2A6的cDNA在杆状病毒系统中的表达″，Biochem.Soc.Trans.，22(1994))描述了在杆状病毒系统中表达编码人CYP2A6的cDNA；Nesnow，S.，等人(1994)和Tiano HF，等人(″C3H/10T1/2细胞中人细胞色素P450 2A6的逆转录病毒介导的表达通过4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)赋予可转化性″，Carcinogensis，14：1421-7(1993))描述了逆转录病毒载体的CYP2A6在可转化的C3H/10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞中的表达；和Salonpaa P，等人(″哺乳动物细胞中逆转录病毒-介导人CYP2A6稳定表达″，Eur J.Pharmacol.，248：95-102(1993))描述了用LXSN载体和PA317包装细胞制备含有CYP2A6的双嗜性重组逆转录病毒。
市售的宿主细胞也可用于本发明的方法。例如，购自Gentest Corporation的h2A3(现在称为h2A6)和h2B6细胞系也适用于本发明的筛选方法。
然后，宜对通过体外筛选测试用来改变CYP2A6表达的物质进行体内测试，以确认它们用于本发明方法的适合程度，其与CYP2A酶活性抑制剂的体内测试相似。
上述方法可以用来鉴定脑和肝脏中烟碱代谢成可替宁的负调节剂，从而来影响需要调节烟碱代谢的病情。通过对该物质对于烟碱代谢成可替宁之动力学、抽烟行为、不抽烟人群抽烟成瘾之可能性、和/或CYP2A催化前致癌物形成致癌物之动力学的影响作群体研究，可以进一步确认该物质的适用性和/或证实这些效应的选择性。考虑到本文提供的指导以及下文实施例描述的典型研究后，对于临床医师来说，这些研究均是常规的手段。
组合物
此处详细叙述的可抑制CYP活性的物质，或用本发明方法鉴定的物质可搀混于药物组合物中。因此，本发明提供一种用于治疗需要减少CYP2A酶活性的病情的药物组合物，该组合物包括有效量的一种或多种可选择性抑制CYP2A6的物质，及/或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。一方面，本发明提供一种用于预防抽烟、治疗抽烟、调节抽烟行为、调节致癌物形成、预防癌症和/或治疗癌症的药物组合物。本发明还提供一种采用该组合物的治疗方法。另外，本发明的治疗方法和组合物还可以和其它活性化合物一起使用，这些活性化合物包括易发生CYP2A6介导的代谢从而导致其它活性化合物的效果受到抑制或减少的其它活性化合物。
需要调节烟碱代谢成可替宁的病情包含烟碱使用障碍，亦即依赖性及非依赖性烟草使用，及烟碱诱生障碍，亦即戒断症状。病情可能随各种类型的烟草(例如香烟，咀嚼烟草，鼻烟，烟斗及雪茄)的使用而产生，也可随处方药物(例如烟碱口香糖，烟碱贴片，喷雾剂，肺吸入剂及/或其它剂型)的使用而产生。特别是，本发明的药物组合物及治疗方法可用于消除对象的抽烟欲望，从而改变抽烟行为。本发明的药物组合物及治疗方法也可与其它可改变抽烟行为的中枢作用的药物组合物(例如安菲他酮(亦名卫伯亭(Wellbutrin)的各种剂型)合用，以便减少中枢神经活性组合物剂量或提高其用于治疗烟草依赖性的效果。
通过调节个体中烟碱代谢的本发明组合物及治疗方法是非常有效的。本方法及组合物可维持抽烟的行为成分，通过减少烟碱代谢成可替宁而改变行为。给予本发明组合物后，烟碱代谢减少的人会改变抽烟习惯及与烟害的接触，因为他对烟碱的需求量改变了。本发明方法及组合物与使用现有技术的方法(特别是使用禁止烟碱的方法)相比，显示出减少的类型，戒烟更为持久，且与烟草烟雾的接触减少。
抽烟行为成分对某些组个体特别重要，因此本发明方法及组合物在改变及维持行为成分方面特别适用于减少那些个体的抽烟量。例如，已发现行为成分对女性抽烟有意义。本发明可对个体及/或组群产生行为学习效果。
本发明的组合物及治疗方法还特别适合调节含高水平CYP2A6的个体或群体中的烟碱代谢。例如，北美白种人具有高水平的CYP2A6。含高水平CYP2A6的个体或群体可使用我们的CYP2A6测定方法来加以鉴别。
本发明的组合物及方法还具有治疗期个体化和弹性化的优点。该组合物及治疗方法特别适合严重依赖性个体、过去治疗失败的个体、无法接受目前完全禁烟方法的个体、治疗/预防复发、或和其它方法(例如烟碱贴片)协同治疗的个体。预期本发明组合物及治疗方法可降低需要的烟碱贴剂及所有其它形式烟碱替代疗法的剂量，且将延长治疗作用持续时间和/或加强其在治疗烟草依赖性上的效果。
可治疗患有烟碱使用障碍和烟碱诱生障碍之个体时本发明方法和组合物也可用来治疗和预防下列疾病或病情，它们包括与烟碱有关的疾病如例如阿片相关病症；增生性疾病；认知、神经或精神障碍；及个体的其它药物依赖性。这些潜在的疾病及病情例子包括恶性病，精神病，精神分裂，帕金森氏病，焦虑不安，抑郁，酗酒，阿片依赖性，记忆缺损、溃疡性结肠炎、胆碱能缺乏等。
本发明的方法和组合物还可用来预防和治疗患有需要减少CYP2A6或CYP2B6之病情的个体。例如，已经知道CYP2A6能代谢几种前致癌物，例如NNK(Crespi CL，等人，″一种烟草烟雾衍生的亚硝胺，4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，由包括多态人细胞色素P4502D6在内的多种人细胞色素P450激活″，Carcinogenesis，12(7)：1197-201(1991))、黄曲霉毒素B1(Yun CH等人，″人肝微粒体细胞色素P-450 2A6的纯化和特性分析″，Molec.Pharmacol.，40(5)：679-85(1991))；六甲基磷酰胺(Ding X，等人，″Fe(II)-金属硫蛋白中金属硫醇盐簇合物形成的Mossbauer研究″，Eur.J Biochem.，171(3)：711-4(1988))，和亚硝基二甲胺(Davies RL，等人，″通过筛选和药物代谢基因转染从而增加激活前诱变剂能力使人细胞系发育″，Carcinogenesis，10：885-891(1989)；Fernandez-Salguero，等人，(1995))。因此，CYP2A6的抑制剂可用来预防(例如抑制CYP2A6底物，从而减少遗传毒性、细胞毒性和/或诱变性)和治疗恶性疾病以及上述的病情和疾病(没有限制)。
配方和剂量
本发明的药物组合物含有本文详细描述的抑制CYP2A的物质或用本发明的方法鉴定出的物质。该活性物质可以单独给予，但是通常是和药物载体(见下文)等一同给予，这可根据所选的给药途径和标准医药实践来选择。
给药剂量随用途及已知因素(例如特定物质的药效学特性及其给药方式及途径；接受者的年龄、健康情况及体重；病情性质及程度；伴随治疗种类，治疗频度及期望效果)而异。
某些情况下，除了增加化合物剂量，某些化合物产生的抑制动力学还可通过在治疗方案中添加第二种可抑制CYP2A6抑制剂代谢的某物质(例如酶)的抑制剂而改变或增进。通过添加该第二抑制剂，CYP2A6抑制剂的量可维持，因而延长了维持较高烟碱血浆浓度的有利效果。使用此第二种抑制剂极为有利，因为它通过维持基本恒定的烟碱浓度且局部作用于CYP2A6抑制剂的动力学而有助于个体的治疗。使用该方法，可避免大剂量的作用于中枢的活性化合物。
同理，个体预先暴露于抑制性物质偶尔会导致抑制效果可能超过药物在血浆内存在的时间，或可能对个体具有持续效果而与抑制剂在血浆中的半衰期无关。预先以抑制性物质培育或暴露引起的现象能帮助延长必须给予该物质剂量的给药间隔时间，减少长期给药剂量或增强CYP2A6抑制作用。此外，个体预先暴露于一种抑制性物质，会随后降低第二种抑制剂的需要剂量。
选择性抑制CYP2A6的物质的适当剂量与个体体内的CYP2A6量有关。该量又取决于个体在CYP2A6基因座上有两个突变型等位基因，有一个突变型等位基因还是没有突变型等位基因。在实施例1中，我们确认这种变异可存在于群体的遗传物质中。因此，本发明的一个方面是提供一种测定CYP2A6基因座有两个突变等位基因，一个突变等位基因或没有突变等位基因的个体中CYP2A6活性的方法，该方法包括下列步骤：
(a)测定得自个体的含脱氧核糖核酸体样(即″含DNA的体样″)，以确定个体在CYP2A6基因座有两个突变型等位基因，一个突变型等位基因还是没有突变型等位基因；
(b)确定个体中CYP2A6存在的量；和
(c)将步骤(a)的测定结果与步骤(b)的CYP2A6数量关联起来，以确定(i)选择性抑制CYP2A6活性，或(ii)选择性抑制CYP2A6编码基因的转录及/或翻译的物质对于该个体的合适剂量。
个体接受者可为任一种哺乳动物，但较佳为人类。通常接受者为含有与酶活性形式相关的CYP2A6基因型的个体。个体的CYP2A6基因型及个体中活性CYP2A6酶的存在可用本文所述的方法来确定。例如，香豆素7-羟化反应可用于测定CYP2A6活性(Cholerton等人，1992；及Rautio等人，1992)。如前文讨论，本发明方法及组合物宜用于含高水平CYP2A6的个体或群体，或用于抽烟行为成分有意义的个体。
为了用来治疗需要调节烟碱代谢成可替宁的病情，根据一般指南，活性成分(如香豆素或甲氧沙林)的每日口服剂量约为0.01至80毫克/公斤体重，较佳的为0.01至20，更佳的为0.05至3毫克/千克体重。一般剂量为0.03至50毫克香豆素、甲氧沙林或反苯环丙胺/公斤体重/日，每日给药一次或分多次给药，较佳为每日至多四次；或用缓释形式可有效地获得所需结果。根据特殊的给药方案，香豆素或甲氧沙林或反苯环丙胺每日给予1至4次，持续所需长度的时间。虽然可使用标准间隔剂量给药，但本发明组合物可于高风险抽烟时间前(例如清晨及工作日结束前)间歇给药。
本文详细描述的或用本发明方法鉴定的一种以上的物质可用来调节烟碱代谢成可替宁。在这些情况下，这些物质能以和药剂联合使用的常规方法来给药，或者作为单独分开的剂型同时或并行给药，或作为各组分治疗剂的物理组合物以单独或组合的剂型给药。该活性剂可以单独给药，但通常是和根据本文所述的所选给药途径和标准医药实践来选择的药物载体一同给药。
本发明的物质可经口、经外用、直肠、胃肠外、局部、吸入或脑内使用。在本发明的一个实施方案中，该物质可通过局部使用适当鼻内赋形剂以鼻内形式给药，或使用本领域普通技术人员已知的透皮贴剂形式通过透皮途径给药。为了以透皮输药形式给药，给药剂量在整个给药方案期间是连续而非间歇的。该物质也可经由控释或缓释胶囊系统及其它药物输送技术给药。
例如，对于以片剂或胶囊剂形式的口服给药，可将活性物质与药学上可接受的无毒、口服、惰性载体(如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纤维素，硬脂酸镁，磷酸二钙，硫酸钙，甘露糖醇，山梨糖醇等)合用；对于液体剂型的经口给药，口服活性物质可与任一种药学上可接受的口服、无毒惰性载体(如乙醇，甘油，水等)合并。如果需要，也可将合适的粘合剂，润滑剂，崩解剂，及着色剂搀混于剂型中。合适的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖类如葡葡糖或β-乳糖，玉米增甜剂，天然及合成的树胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡类等。可用于这些剂型的合适的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等。崩解剂的例子包括淀粉，甲基纤维素，琼脂，皂土，黄原胶等。
明胶胶囊含有活性物质及粉状载体，例如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似的载体及稀释剂可用于制造压制片。片剂及胶囊剂可制成持续释放型产品，从而在一段时间内连续释放活性组分。压制片可加糖衣或膜衣，以遮盖令人不愉快的口味并保护片剂不接触空气，或加肠衣来选择性地在胃肠道内崩解。口服给药用的液体剂型含有着色剂及调味剂来提高患者的接受程度。
水，合适的油，盐水，葡萄糖水溶液及相关糖溶液及二醇类(如丙二醇及聚乙二醇类)可用作胃肠外溶液的载体。这些溶液宜含有活性组分的水溶性盐，合适的稳定剂，及缓冲物质(如果需要)。合适的稳定剂包括抗氧化剂如硫酸氢钠，亚硫酸钠，或抗坏血酸(可单独或合并使用)，柠檬酸及其盐以及EDTA钠。胃肠外给药溶液可含有防腐剂，例如苯扎氯铵，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，及氯丁醇。
本文详细描述的以及用本发明方法鉴别的物质也可以脂质体输药系统形式给药，例如小的单层囊，大的单层囊及多层囊。脂质体可由各种磷脂(如胆固醇，硬脂基胺或磷脂酰胆碱)形成。
本文详细描述的以及用本发明方法鉴别的物质也可与可溶性聚合物偶合，这些聚合物为可定向的药物载体。这些聚合物的例子包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺-酚，聚羟乙基天冬酰胺酚，或被棕榈酰基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。这些物质也可与用于控制药物释放的可生物降解的聚合物偶合。合适的聚合物包括聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸及聚乙醇酸的共聚物，聚ε-己内酯，聚羟丁酸，聚原酸酯类，聚缩醛类，聚二氢吡喃类，聚氰基丙烯酸酯类，水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。这些物质也可固定于刚性聚合物及其它结构例如富勒土或布基珠(Buckeyballs)。
适合给药的药物组合物每单位含约1毫克至1500毫克活性物质。在这些药物组合物中，活性成分通常占组合物总重量的约0.5-95％重量比。
合适的药物载体及药物制剂的制法在《雷明顿医药科学》Mack PublishingCompany中有所描述，这是本领域的标准参考文献。
与口服烟碱一同给药
在一个特定的实施方案中，已经发现CYP2A6的特异性抑制剂(较佳的是甲氧沙林和/或反苯环丙胺)是特别有效的CYP2A6的抑制剂以及烟碱口服配方代谢的抑制剂，因此它增强了口服烟碱替代疗法的效果。换句话说，已经发现这些抑制剂可有效地抑制烟碱代谢，从而增加了烟碱的血浆浓度，尤其是在烟碱为口服摄入时，其增强了口服烟碱替代疗法。
因此，本发明提供一种用来增强口服烟碱替代疗法的作用的组合物，该组合物包含CYP2A6抑制剂以及配制成用来口服摄入的烟碱。在该方法中，本文详细描述的和/或用上述筛选方法鉴定的物质与烟碱一起形成活性组分，通常是和合适的药物稀释剂、赋形剂或载体搀混在一起给药，这些稀释剂、赋形剂或载体可以根据打算采用的给药形式(即口服片剂、胶囊剂、酏剂、糖浆等)按照常规医药实践作适当选择。
本领域技术人员应认识到，本发明范围内的口服配方可以是这样的形式：(i)包含CYP2A6抑制剂和烟碱的单个组合物，或(ii)一个试剂盒，该试剂盒包括独立给药的分别含有CYP2A6抑制剂和烟碱的组合物。对于独立给药的组合物，最好是基本上同时给药。当较佳的CYP2A6抑制剂甲氧沙林和/或反苯环丙胺与烟碱的口服配方一同给药时，烟碱血浆浓度比不给予CYP2A6抑制剂而口服摄入烟碱时的血浆浓度要高。
抑制剂的组合
CYP2A6抑制剂(如香豆素、甲氧沙林)与CYP2B6抑制剂(例如奥芬那君)的组合可增强对烟碱代谢成可替宁的抑制作用。因此，本发明的较佳实施方案提供了一种治疗需要调节烟碱代谢成可替宁之病情的方法，该方法包括给予有效量的CYP2A6抑制剂及有效量的CYP2B6抑制剂，以选择性抑制烟碱代谢成可替宁。在本发明的较佳实施方案中，CYP2A6抑制剂为甲氧沙林或其类似物或衍生物，CYP2B6抑制剂为奥芬那君或其类似物或衍生物。抑制剂可同时、分开或依序给予。较佳的，抑制剂基本上同时给药。各自选择CYP2A6抑制剂和CYP2B6抑制剂的剂量，使各单独的抑制剂不会产生完全的效果。有效剂量大约为足以增强对烟碱代谢成可替宁之抑制作用的最低剂量。在一个方案中，抑制剂的组合可以与烟碱来源(较佳的是配制成口服给药的烟碱)基本上同时给药。含有CYP2A6和CYP2B6抑制剂组合的药物组合物可以象本文所述的含有CYP2A6抑制剂的组合物那样进行制备和给药。该药物组合物宜含有甲氧沙林或其类似物或衍生物，以及奥芬那君或其类似物或衍生物，浓度分别为1至1500毫克，及25至400毫克。
下面将参照下列实施例来描述本发明的实施方案，这些实施例不应被理解成限制了本发明的范围。
实施例
实施例1
流行病学研究
我们检查了126位烟草依赖性白种抽烟者及143位曾经抽过烟但未上瘾的白种个体(例如暴露对照组)中CYP2A6基因突变的流行率。目的有两个。第一是确定CYP2A6活性不足(例如无效CYP2A6等位基因是纯合的)的个体的发生率。第二是确定由于具有无效CYP2A6等位基因而减慢的CYP2A6介导的烟碱代谢是否会减少变成依赖性吸烟者的机会。
在本实施例中，进行研究来评价一组个体中的CYP2A6基因型以及CYP2A6对个体之抽烟行为的影响。
对象是不相关的健康个体，每位个体有4位白种祖父母、外祖父母，将他们分成三组。第一组只包含烟草依赖性(TD，DSM-IV(″DSM″＝美国精神病协会的诊断统计手册))对象，其中包括76位19至52岁的男性(平均值(标准偏差)为31.1岁(8.5岁))，以及57位20至70岁的女性(平均值(标准偏差)为31.4岁(10.2岁))。第二组包括酒精和烟草依赖性(AT，DSM-IV)对象，其中包括60位17至61岁的男性(平均值(标准偏差)为37.2岁(9.94岁))以及10位19至66岁的女性(平均值(标准偏差)为41.4岁(11.89岁))。第三组为暴露对照组，由从不是烟草依赖性(NTD)的对象组成，他们以前抽过烟，但是从未上瘾。该组包括86位19至59岁的男性(平均值(标准偏差)：29.2岁(8.6岁))和77位19至58岁的女性(平均值(标准偏差)为27.4岁(8.4岁))。所有对象均完成一份药物问卷和烟草模式(Heatherton，等人，″烟碱依赖性的Fagerstrom测试：Fagerstrom耐受性问卷的修订版″，Br.J.Addict.，86(9)：1119-1127(1991))。所有对象均没有其它的精神药物依赖性(包括酒精依赖性(除AT组外))。
如Fernandez-Salguero，等人(1995)中所述的那样，在从外周白细胞分离的基因组DNA上测定每个对象的CYP2A6基因型。简言之，该试验包括CYP2A6基因特异性嵌套式PCR扩增，然后进行RFLP分析。
材料及方法
用于PCR基因型试验的引物：
      试验  名称     序列(5′-3′)
CYP2A6*2(V<sub>1</sub>)及CYP2A6*3(V<sub>2</sub>)   F4R4E3FE3R     CCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTTAGGCCGCCCCTTCCTTTCCGCCATCCTGCCCCCAGGCGTGGTATTCAGCAACGGGTCGTGGGTGTTTTCCTTC
CYP2A6基因型
由血样提取DNA并用常规提取方法定量。如Fernandez-Salguero等(1995)所述的那样，用嵌套式PCR及RFLP测定CYP2A6基因型。第一次扩增为CYP2A6基因特异性的，用来提高CYP2A6基因的特异性(相对于其它CYP2A基因)。第二次扩增中使用外显子3，因为CYP2A6*2及CYP2A6*3突变型等位基因含有导致CYP2A6基因该区域氨基酸变化的核苷酸变化。
第一次扩增用XL-PCR试剂盒(Parkin-Elmer Co.，Norwalk，Connecticut)进行。使用0.2μM引物F4和R4、200μM dNTP、0.8mM乙酸镁和2单位rTth1 DNA聚合酶的100微升反应混合物及400至600毫微克基因组DNA。扩增在MJ DNA Engine(MJResearch，Inc.，Watertown，Massachusetts)中93℃进行1分钟，于66℃进行6分30秒，循环31轮。
第二次扩增在下述反应混合物中进行，该混合物含有0.5μM引物E3F和E3R，200μM dNTP，1.5mM MgCl2，2.5U Taq DNA聚合酶(Gibco BRL，Life Technologies，Burlington，Ontario)及2.5微升第一次扩增产物作为反应的模板。反应条件如下：94℃3分钟，接着为94℃1分钟，60℃1分钟和72℃1分钟循环31轮。
第二次扩增获得长度为201bp的PCR产物，用Xcm I(New England Biolabs)及Dde I(New England Biolabs和Pharmacia Biotech)将其消化，以便分别检测CYP2A6*2及CYP2A6*3突变(酶切表明存在突变)。通过实验确定酶和PCR产物的浓度，总体积以及消化时间，以便用最少的时间和酶获得最大的酶切效率。Xcm I消化反应在37℃、30微升反应混合物中进行2小时，该混合物含有1X NEBuffer3(100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT pH7.9，25℃)，dH2O，及2UXcm I。Dde I消化系在37℃、30微升含One-Phor-All(OPA)缓冲液(Pharmacia Biotech)及2U Dde I的反应混合物中进行2小时。在溴化乙锭染色的3％琼脂糖凝胶上分析消化产物。
经全部对象同意获得血样。阳性对照由P.Fernandez-Salguero和H.Raunio博士赠与。阴性对照是用水代替基因组DNA。每一基因型反应携带了从以前的反应中随机选出的四份样品，用于检查再现性。
进行卡方测试比较组间CYP2A6基因型和等位基因的分布(SAS)。用F-测试(检查不相同的变异[SAS])，然后是双样品t-测试(SAS)，比较抽烟者中的抽烟方式。显著性水平为5％。
与烟碱代谢活跃的个体(即具有CYP2A6*1/CYP2A6*1基因型的个体)相比，假定烟碱代谢减弱的个体(即携带至少一个CYP2A6缺陷或突变型等位基因的个体)将因烟碱浓度较高而产生较大的嫌恶效应，从而不会变成抽烟者或抽较少的烟。具体地说，假设烟草依赖性人群中携带CYP2A6缺陷型等位基因的个体将是很少的。
参考研究结果，在全部的依赖性抽烟者(TD+AT)中，携带一个或两个CYP2A6缺陷型等位基因的个体的频率低于暴露对照组(NTD)：13.3％对20.2％，p＝0.076，χ-平方；让步比为1.66，C.I.为0.95-2.89-见图5。而且，依赖性抽烟者(TD+AT)中的CYP2A6*2和CYP2A6*3等位基因的频率比暴露对照组(NTD)低：CYP2A6*2：3.0％对3.1％，CYP2A6*3：4.4％对7.7％-见图5。
我们进一步假设，在抽烟组中，烟碱代谢机制有缺陷的那些个体(即携带至少一个CYP2A6缺陷型或突变型等位基因的人)将抽较少的香烟。
进一步参考研究结果，在TD组中，与杂合的携带单个CYP2A6缺陷型等位基因(即CYP2A6*2和CYP2A6*3的一个或两个)的抽烟者相比，CYP2A6活性等位基因纯合的那些对象每天和每周所抽的香烟明显更多：每天的香烟数为23比19，t测试P＝0.02，每周香烟数为125比161，t测试P＝0.009-见图6。
如上所述，烟碱在建立和维持烟草依赖性方面是很重要的；烟碱药物动力学的差异对个体是否成为抽烟者有很大的影响。本研究获得的数据表明，与从不是烟草依赖性(NTD)的对照群体相比，烟草依赖性群体(TD+AT)中携带一个或两个CYP2A6缺陷型等位基因的个体数量较少。尽管不希望受任何特定理论或作用方式的束缚，这可能是由于携带CYP2A6缺陷型等位基因的个体在抽烟时具有较高的烟碱水平并对烟碱有较大的嫌恶效应所引起的。结果，个体可能不再继续抽烟，因此对烟草成瘾(烟草依赖性)的可能性较小。因此，本研究获得的数据表明，携带一个或两个CYP2A6缺陷型或突变型等位基因的个体在尝试抽烟后出现烟草依赖性的可能性比具有两个活性CYP2A6等位基因的个体小。
另外，如上所述，众所周知依赖性抽烟者调节它们的抽烟行为是为了维持血液和脑中的烟碱浓度，因此，不同的烟碱代谢能在改变抽烟方式方面起作用。携带单个CYP2A6缺陷型等位基因的依赖性抽烟者所抽的香烟明显少于纯合野生型抽烟者的这一观察结果表明，CYP2A6介导的烟碱代谢是依赖性抽烟者抽烟量的一个有意义的决定因素。换句话说，单个基因(即CYP2A6基因)的杂合性影响着这一复杂的药物摄取行为。
本文公开的CYP2A6基因型对于烟草依赖性和抽烟行为的临床意义是普遍的。携带CYP2A6缺陷型等位基因的个体产生癌症的可能性较低，因为他们变成烟草依赖型抽烟者的可能性较低。如果他们确实变成了依赖性抽烟者，本研究获得的数据也证明他们抽的烟比活性CYP2A6等位基因纯合的那些人要少。已有明显的证据表明抽烟量与患肺癌可能性较高有关(Law，等人，1997)-图6。
另外，烟草的烟雾中含有许多烟草特有的前致癌物亚硝胺类，例如N-亚硝基二烷胺类-例如N-亚硝基二乙胺(默克索引第6557号)、N-亚硝基二甲胺(默克索引第6558号)和4-甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(Crespi，等人，1990；Yamazaki，等人，1992)。由于这些前致癌物可被CYP2A6激活，因此携带CYP2A6缺陷型等位基因的个体不能有效地将烟草烟雾中的前致癌物生物激活成致癌物，这一点是有利的。
因此总之，本实施例研究得到的数据表明单个遗传上多态的基因CYP2A6基因与个体是否变成抽烟者有关，并且在某些情况下预示了该个体是否会变成抽烟者。而且，如果个体变成仅对烟草有依赖性，则CYP2A6基因变体会改变他/她抽香烟的数目。因此，CYP2A6基因型直接影响成为烟草依赖性的可能性，改变消费烟草的数量，并在烟草相关癌症易感性上起一定作用。
本发明的一个预计的应用是在遗传上鉴定个体成为抽烟者和患有关癌症的可能性。鉴定出高可能性和低可能性的个体后，就能进行有目的的预防、治疗和教育。具体地说，这将涉及鉴定个体(i)成为抽烟者(若该个体是非抽烟者)、(ii)消费烟草较多(若该个体是抽烟者)以及(iii)产生CYP2A6相关癌症之可能性的高低。
实施例2
香豆素表型测试和CYP2A6基因型测试
A.香豆素测试
香豆素是一种人CYP2A6的选择性和特异性的底物，它可用来：(1)鉴定治疗上可能排斥CYP2A6抑制剂使用的个体；(2)基于CYP2A6活性的初浓度进行剂量微调；和(3)鉴别无法由治疗获益的个体或因抑制剂或CYP2A6底物本身可能有中毒风险的个体进行风险评估。香豆素试验包括两类：
(1)仅可取得尿液的香豆素试验
香豆素5毫克配成胶囊剂或其它剂型，在排空膀胱残量后经口给予空腹病人。收集最初2小时尿液及随后6小时的尿液。如前例所述，用HPLC法测定代谢产物的尿液浓度从而测得香豆素代谢产物7-羟基香豆素(游离型及结合型)的尿液排泄量。CYP2A6的相对活性表示为分开及合并的取样期间7-羟基香豆素的排泄总量，该活性用香豆素排出百分比(最初2小时排出量/8小时内排出量)×100表示。该排泄百分数范围为不具有CYP2A6活性的个体的低于20％至高活性个体的高于80％。本试验可同等有效可靠地应用于抽烟者及非抽烟者，可在一日内任何时间使用而抽烟条件或当日时间对结果并无显著影响。试验证明，对象重现性高，线性r＞0.9。参考图3有关研究结果，抽烟者及非抽烟者在不相连的二日之各日上午及下午接受香豆素。结果表明，对象重现性高，试验结果可靠。
(2)可取血浆样品时的香豆素试验
在一些临床情况下容易取得血样或这是其它临床试验的一部分所需的。在这种情况下，开发了以血浆为基的CYP2A6活性试验，并应用于具有已知基因型的个体。个体口服5.0毫克香豆素，45分钟后采血样至肝素化(或含其它抗凝血剂)试管。离心该样品并分离血浆。用HPLC分析血浆，定量测定7-羟基香豆素(与β-葡糖苷酸酶培育脱偶联后的总量)。为了使用5.0毫克香豆素，分析灵敏度必须高。当无法获得如此高的灵敏度时，香豆素剂量可增至50毫克。
尿液及血浆中的7-羟基香豆素的HPLC分析：
(1)样品制备：
用0.2毫升β-葡糖苷酸酶乙酸盐缓冲溶液(15毫克/毫升乙酸盐缓冲液，0.2M，pH5.0)37℃水解尿液或血浆样品(0.5毫升)30分钟。然后以2毫升乙醚涡旋5分钟进行萃取，3000rpm离心10分钟。将乙醚萃取物(1.2毫升)移转至另一干净试管，氮气下脱水。残余物用HPLC流动相溶解(参见下文)，并注入HPLC。
(2)HPLC分析
HPLC系统包括Hewlett Packard 1050 HPLC系统(泵，自动进样器及紫外光检测器)及HP339611积分器。色谱分离用HP Spherisorb-ODS2柱(125×4毫米内径，5微米)进行。用乙腈∶水∶乙酸为150∶850∶2(v/v/v)为流动相，以1.0毫升/分钟流速洗脱样品，用紫外光检测器在324nm的波长下监测7-羟基香豆素，在280nm下监测香豆素。用外标法对样品作定量测定。
用不同时间点(例如20，30，45及75分钟)血浆内的7-羟基香豆素浓度或该时间血浆中香豆素/7-羟基香豆素之比表示CYP2A6活性。
较佳的使用方式为口服给予香豆素后20或30分钟取一次血浆样品，定量测定香豆素和7-羟基香豆素，用香豆素对7-羟基香豆素之比作为CYP2A6活性指标。
结果：
空白尿液或血浆样品未显示对7-羟基香豆素或香豆素的干扰峰。该方法的灵敏度为1毫微克/毫升尿液或血浆。日内或日间变异小于10％。该分析在1至4000毫微克/毫升内呈线性。
图4显示了接受香豆素的受试者血浆中测得的7-羟基香豆素总浓度的时程。图4示出了基于对应CYP2A6基因型的各种时程。
B.CYP2A6基因型试验
至于CYP2A6基因型试验，可使用实施例1描述的材料和筛选方法筛选DNA样品中可降低个体内CYP2A6活性的突变型等位基因。
实施例3
体内表型试验
在经口给予CYP2A6基因型已知的10位抽烟者和9位不抽烟者(12位男性，7位女性)后，比较烟碱和香豆素的血浆动力学。烟碱剂量为4.0毫克(以碱基(base)表示)，香豆素的剂量为50毫克。如上所述测定烟碱、可替宁、香豆素和7-羟基香豆素的血浆浓度。
通过测定香豆素的代谢产物7-羟基香豆素(7-羟基香豆素[μM]*1/*1＝5.6±2.9；*1/*2或*1/*3-3.8±1.1，p＝0.04)，发现香豆素使*1/*1(野生型纯合子，n＝13)以及杂合子(*1/*2；*1/*3，n＝4)和纯合子(*2/*2，n＝2)在45分钟时有最优的分离。用烟碱在90分钟时发现有最优的分离(烟碱[nM]*1/*1＝24±15；*1/*2或*1/*3＝29±12；*2/*2＝52±3；*2/*2对*1/*2或*1/*3，p＝0.01；*2/*2对*1/*1，p＝0.0001)。用香豆素/7-羟基香豆素或烟碱/可替宁比值未能改善分离。
在*1/*2或*1/*3中，可替宁(烟碱代谢物)最初的产生明显慢得多，但是后来在*1/*2或*1/*3中样品中的可替宁实际上是较高的，这提示CYP2A6在烟碱代谢中起着作用。与*1/*1相比，*1/*2或*1/*3中的7-羟基香豆素的出现对时间的曲线之斜率以及曲线下的面积明显较小，而烟碱的则较大，这表明它们的生物利用度、吸收速率和代谢是不同的。7-羟基香豆素和烟碱的曲线下面积成逆相关(p＝0.08(Spearman等级)，n＝18)。鉴定出一个*1/*1个体具有高出4倍的7-羟基香豆素产生，一个*2/*2个体具有高的香豆素代谢和低的烟碱代谢，这提示存在没有被目前的PCR方法检测出的CYP2A6基因变体。
这些数据表明CYP2A6基因型是体内烟碱处置时程的一个重要决定因素。这些数据还表明CYP2A6的体内试验反映了个体的表型，该表型测定提供了关于该个体基因型的信息。
实施例4
CYP2A6表达的组织定位
它是确定CYP2A6酶是否在发生烟草相关癌症的组织(例如肺和膀胱)中表达。为了测定CYP2A6是否在发生烟草相关癌症的组织中表达，用Northern印迹分析测定各个人组织中的CYP2A6mRNA分布。简言之，将来自各种组织的mRNA装载到凝胶上，电泳分离。然后将mRNA转移到膜上，用放射活性CYP2A6 cDNA探针探测。发现CYP2A6在子宫、卵巢、结肠、小肠、睾丸、膀胱、心、胃、前列腺、骨骼肌、胰和肺中表达。这些数据提示，除了肝脏中CYP2A6激活的致癌物能在各组织中引起癌症外，前致癌物还能在许多人组织中原位激活。
实施例5
患癌症之危险性的流行病学研究
无效的CYP2A6等位基因除了具有减少烟碱依赖性比例以及减少人变成(烟草)依赖性后抽烟数量的作用外，CYP2A6还能激活在烟草烟雾中发现的前致癌物。为了确定CYP2A6激活前致癌物对于癌症比例是否有明显的作用(不论其在抽烟中起何作用)，对患有烟草相关癌症的非抽烟者个体进行研究。使这些个体被动接触烟草烟雾中的前致癌物，从而能在该组中独立于该酶对抽烟行为的作用而测试CYP2A6无效等位基因在激活前致癌物中所起的作用。发现患有膀胱癌(烟草相关癌症)的非抽烟者有14.3％携带了CYP2A6无效等位基因。相反，在不患膀胱癌的非抽烟者对照群体中，无效等位基因携带者的频率为24.1％。这表明携带CYP2A6无效等位基因的个体患烟草相关癌症的可能性较小，原因是他们将前致癌物激活成致癌物的作用减少。
实施例6
甲氧沙林(一种CYP2A6抑制剂)对于NNK(一种前致癌物)激活成为其代谢产物NNAL和NNAL葡糖苷酸的影响
在11位(6位女性，5位男性)烟草依赖性抽烟者中研究CYP2A6抑制剂甲氧沙林对于烟碱代谢和NNAL生成的影响。召集的对象每天必须抽至少15根香烟，并且在总共四天研究中需要每天抽相同数目的香烟。在评价期间，取血分析烟碱和可替宁的血浆浓度，并进行CYP2A6基因型测定。还测定呼气中的一氧化碳。
将四天测试分为一天安慰剂日(不给予药物)(第1天)，三天为甲氧沙林处理日(经口10毫克，一天三次)(第2，3，4天)，每天在早上8:00，下午3:00和晚上10:00服药。在每个研究日期间完成一个抽烟日志。该日志要求对象记下从早上8:00到下午3:00到晚上10:00以及晚上10:00到早上8:00所抽的香烟数。第1个研究日和第2个研究日可以分开，但是第2、3和4天需要连续。
在第1天(安慰剂)和第4天(治疗)，从清醒开始收集24小时尿液。在下午2:00，取血分析烟碱和可替宁，测定呼气中的一氧化碳。在第4天，第二次取血样分析甲氧沙林。24小时分析尿液样品的NNAL、NNAL葡糖苷酸、肌酸酐和可替宁。
甲氧沙林使血浆烟碱浓度增加17％(23.0至27毫微克/毫升)；使呼吸中的CO减少11％(从22.5到20.5ppm)，并使血浆烟碱浓度与呼出的CO之比(烟草烟雾暴露指数)升高30％(1.1至1.43，p＝0.033)。烟雾暴露指数减少较大表明：1)尽管被告知不要改变他们的抽烟行为，但是由于CYP2A6受到抑制，烟碱的消除减慢，抽烟者还是减少了他们的抽烟强度；2)这些剂量的甲氧沙林是有效的CYP2A6抑制剂；和3)甲氧沙林和其它CYP2A6抑制剂减少了NNAL或相关物质的产生以及其它致癌物的体内激活。
实施例7
CYP2A6无效等位基因对导致肺癌的烟草烟雾暴露的影响
在肺癌的流行病学研究中测定CYP2A6无效等位基因对于前致癌物激活的影响。测定227位患有肺癌的个体之DNA样品中的等位基因频率。在诊断肺癌和切除肿瘤及周围的肺组织后，抽提出DNA，测定CYP2A6的基因型。该群体主要是抽烟者或以前曾是抽烟者。在那些可以得到详细抽烟史的人中，我们能够在检出肺癌前抽烟的香烟包-年(pack-year)数(每天20根持续1年＝1包香烟-年)作为前致癌物暴露的衡量标准。具有野生型/野生型CYP2A6活性的那些个体在检测到肺癌前平均只需抽45包一年。相反，具有CYP2A6无效等位基因而激活较少前致癌物的那些个体在检测到肺癌前需要更多地接触前致癌物(例如抽54包一年)。因此，CYP2A6活性较少的那些个体激活较少的烟草烟雾中的前致癌物，因而在检测到肺癌前需要更多的接触。
还发现在肺癌人群中具有CYP2A6V1等位基因的个体数目相对于非肺癌对照人群来说是减少的，这与前致癌物激活作用减少而提供了相对抗癌保护作用一致。患肺癌的非抽烟者和抽烟者相对于其各自对照均发现有这样的情况。
另外，肿瘤组织中具有ras致癌基因突变的所有个体均具有全活性野生型的CYP2A6，这暗示在CYP2A6活性减少的那些个体(例如CYP2A6无效等位基因的携带者)中发生该致癌基因突变的可能性也将较少。Ras致癌基因突变预示着，与没有ras致癌基因突变的那些肿瘤相比，其治疗效果更差，肿瘤生长更快。这提示具有CYP2A6无效等位基因的个体具有突变的ras致癌基因的可能性较小，具有较佳治疗预后的可能性较大。
这些数据表明评价CYP2A6等位基因可用来估计癌症危险性(无效等位基因与肺癌危险性减少相关)，CYP2A6的抑制将减少前致癌物的激活，从而减少患癌症的危险。
实施例8
CYP2A6抑制对口服烟碱生物利用度的影响
进行体内研究来测定CYP2A6抑制对于口服烟碱之生物利用度的影响。具体地说，本研究比较了烟碱与30毫克甲氧沙林、10毫克反苯环丙胺以及安慰剂(即只有烟碱)共同口服治疗对于口服的4毫克烟碱(以碱基表示；实际给予的是烟碱酒石酸氢盐)的生物利用度的动力学影响，以及三种共同处理的急性安全性和可接受性。另外，获得了这些共同治疗后对烟碱嗜欲的影响的初步信息。
本研究的对象是遵照如下所列出的指定戒断方案的抽烟者。有12个对象。
使抽烟者伴随口服4毫克烟碱经口接受安慰剂以及两种分开的共同处理30(甲氧沙林30毫克和反苯环丙胺10毫克)。在4小时的测试期间，收集血液和尿液样品进行动力学测定，收集生理性和主观性量度。使治疗次序随机、均衡，给予药物是单盲的，即对象不清楚他们服用的是何种药物。
所有对象具有下列特征：
(a)年龄至少为21岁；
(b)目前每天至少抽25根香烟；
(c)目前是DSMIV烟草依赖型；
(d)具有Fagerstrm的烟碱依赖性测试(FTND)评分至少为3所表示的烟碱依赖性；
(e)不经常使用香烟以外的烟草形式；
(f)能戒抽香烟以及咖啡碱长达12小时；
(g)同意并能在研究日根据一致的方案维持使用任何治疗性药物。
所有对象均不具有以下特征：
(a)已知对甲氧沙林或化学上相似的化合物过敏；
(b)已知有过度的光敏性；
(c)目前在使用任何抗抑郁药、拟交感神经药、CNS抑制药、降血压剂或抗帕金森氏病的药物(因为可能会与反苯环丙胺发生不利的相互作用)；
(d)体重小于51公斤(对于低于该体重以下建议不要使用30毫克甲氧沙林)；
(e)处于怀孕或哺乳期；
(f)有怀孕的可能(女性与男性伴侣有性行为，并且没有使用非常有效的避孕措施，这些措施定义为任一方经手术绝育，用口服避孕药，避孕屏障和杀精子剂，或避孕套和杀精子剂)；
(g)有肝损、血质不调(反苯环丙胺的禁忌症(counterindication))；
(h)提示有心脏病或高血压的症状；
(i)有需要进一步研究和治疗的或是任一建议的研究药物之禁忌症的其它医学或精神上的病情；
(j)目前希望或尝试在系列研究的预计期间戒烟的；和
(k)有可能会干扰研究方案的顺应性或研究测量值成功收集的任何其它病情。
针对在早上和在下午测试的对象分两种研究方案。在这两个方案中，每个对象从每一研究日前的午夜起禁止抽烟、吃食物、喝饮料(水除外)以及任何不定期使用的药物，但继续本程序所允许的按方案定期服用的药物(例如口服避孕药，每日服用的维生素)。
早晨方案的对象继续这种禁食直至在早上大约8点到达测试地点。下午方案的对象在早上9点前食用正常量的早餐，包括至多一杯含咖啡碱的饮料和一根香烟。然后从早上9点至下午大约1点，该下午方案的对象重新开始禁食方案直至到达测试地点。
在进行基线测定前，取呼吸中的CO样品(Ecolyzer)以评价抽烟戒断的顺应性(预计小于10ppm)。表3中列出了随后的每日方案。所有测定以早上9点或下午2点为时间零点，此时经口给予烟碱胶囊和一种共同处理剂。每个SMS循环包括测定心率、血压和主观情况。在+1:00小时取血样，然后食用标准的早餐或午餐(但没有咖啡碱)。
表3
   经过时间         行为
   -00:45       准备对象
   -00:30       取血样(8毫升)-#1
   -00:15       SMS循环#1
   00:00       经口服用所有胶囊
   00:30       取血样(8毫升)-#2
   00:50       SMS循环#2
   01:00       取血样(8毫升)-#3
   01:30       取血样(8毫升)-#4
   01:50       SMS循环#3
   02:00       取血样(8毫升)-#5
   2:50       SMS循环#4
   03:00       取血样(8毫升)-#6
对对象作医学评价，允许在不早于+2:00小时离开，且在+3:00小时完成所有测定后才允许离开。对象直至允许离开后才允许抽烟。在某些情况下该方案延长多达20分钟，这在四天内一致，以便使三个对象在同一天测试。
每位对象在一周内不连续的两天进行测试，持续3周，并且始终维持早上或下午的方案。
从Sigma化学公司的药物中心获得灭菌的烟碱酒石酸氢盐。报道的纯度大于99.5％，用HPLC确认。在精确度为1微克以内的精密天平上测定烟碱酒石酸氢盐粉末，称量出含有4毫克烟碱碱基的各部分，然后装入胶囊。将胶囊填充至烟碱粉末的标称重量容许为+2％。
在加拿大，甲氧沙林以两种形式市售，一种的生物利用度相当低(商品名为Oxsoralen)，两种的生物利用度大约为两倍(Oxsoralen-Ultra和Ultra MOP)。UltraMOP(Canderm Pharmacal Ltd.)的包装说明书建议体重为51公斤或更重的患者的日常剂量为30毫克至50毫克。为了使所有对象使用固定的30毫克剂量，限制对象的最小体重为51公斤；对于较重的对象不作剂量调整。
10毫克甲氧沙林胶囊和10毫克反苯环丙胺片剂(Parmate)以其市售形式使用。由于这是随机化的单盲研究，因此对象能识别胶囊形式以及每日之间不同的剂量，但是他们不知道哪种形式代表哪种药物。
用乳糖片剂作为安慰剂。
对于前4天，每天的药物供应除4毫克烟碱外还包括一个或三个胶囊(如表4所示)。研究者不知道分布，以保持随机的分布。
烟碱和其它胶囊同时服用。
在给药后向调查者提供一份关于每个对象处理随机化模式的分开的、复印的参照副本。
表4
   活性药物，胶囊形式         给予的剂量
  安慰剂   1×香豆素体积的安慰剂
  甲氧沙林，30毫克   3×甲氧沙林，10毫克
  反苯环丙胺，10毫克   1×反苯环丙胺，10毫克
用留置静脉导管在表3所示经过时间时每次收集8毫升血样。分析这些样品的烟碱、可替宁和抑制剂的浓度。
收集两个分开的尿液样品，在给予胶囊前的基线以及三小时内的合并的样品。分析每份尿液样品的烟碱和可替宁含量。
通过HPLC方法用UV检测器测定血浆和尿液烟碱和可替宁(还有尿液中的结合物)。具体地说，将1毫升样品、50微升(2微克/毫升)内部标准品(N-乙基去甲基烟碱)和1毫升三氯乙酸(10％)吸移到每一试管内(12毫升)。盖上试管，涡旋混合数秒，然后30000g离心5分钟。将澄清的上清液倾析到第二个试管内。在此不含蛋白质的血浆提取物中加入0.5毫升的5M氢氧化钾溶液和6毫升二氯甲烷。然后盖上第二个试管，在水平振荡器中搅动30分钟，然后离心分离各相。吸出水相(顶层)，在有机相中加入3.0毫升0.5N盐酸溶液，涡旋混合30秒。离心分离各相，将水相转移到含0.5毫升5M氢氧化钾溶液的清洁试管内，然后加入5毫升二氯甲烷，涡旋混合30秒。离心分离各相，吸出水层(顶层)，在其余溶液中加入200微升甲醇制盐酸(10毫摩尔HCl在甲醇中)，缓缓混合。然后在40℃水浴中氮气下蒸发有机溶剂。用200微升甲醇制盐酸洗涤试管壁，并蒸发溶液。将残余物溶于100微升30％甲醇中，将其中的90微升注入HPLC柱中。
用SupelcoTM5-8347LC-8-DB(150×4.6毫米，5微米)进行色谱分离。用含有0.34M磷酸二氢钾、1-庚烷磺酸盐(671毫克)和三乙胺(5毫升)的0.34M柠檬酸缓冲液∶乙腈800∶45(v/v)作为流动相，以1.3毫升/分钟的流速洗脱样品，用UV监测器在λ＝260nm下进行监测。
烟碱测定的灵敏度小于1毫微克/毫升，可替宁测定的灵敏度小于5毫微克/毫升。适当的时候，在用β-葡糖苷酸酶水解后测定尿液中的结合物。
用上述试验测定血浆烟碱浓度，图7中示出的结果为所有对象的平均值。
用Hewlett/Packard78352C成年患者监测器传感并直接记录到计算机中的心血管测定值包括心率和血压(就座时)。
用形象化模拟计分法要求每位对象在0至100的等级上评价他/她在给予药物之前和之后不同时间点的当前抽烟欲望(附录A)。
为了确定临床动力学差异并描述动力学参数，主要的应变量是3小时梯形法则的烟碱AUC。
图7示出了口服药物之前以及三小时后(在此期间不准抽烟)测得的血浆烟碱平均浓度。如图所示，甲氧沙林/烟碱和反苯环丙胺/烟碱的联合治疗诱导出的血浆烟碱平均浓度增加值均比安慰剂/烟碱之组合所诱导的高至少四倍。
图8描述了用0至100的形象化模拟记分法来自身评估“当前抽烟欲望”的评价结果。如图所示，甲氧沙林/烟碱以及反苯环丙胺/烟碱的组合均使抽烟欲望比安慰剂/烟碱组合显著减少。
实施例9
代谢增强的口服烟碱替代疗法对于短期抽烟行为的影响
进行研究以确定代谢增强的口服烟碱替代疗法对短期抽烟行为的影响。
由于烟碱是烟草依赖性中的成瘾剂，而抽烟者在相当窄的个体浓度范围内调节他们的脑内烟碱，因此任何有效的非抽烟的烟碱输送方法应无需凭借抽烟即可维持抽烟者的血浆烟碱浓度，从而减少抽烟行为，在一些情况下，该方法减少了作为最终终止抽烟之一个组成的抽烟行为的继发性增强(secondary reinforcement)。该效果只有当确保有效输送的机制也延迟了吸收阶段之后血浆烟碱的清除时才能得以增强。在以前的烟碱口香糖效果研究中，提供了用来测试该治疗策略之急性行为效应的模型(Nemeth-CoslettR，等人，″烟碱口香糖：与剂量有关的对抽香烟和主观评价的作用″，Psychopharmacology，92(4)：424-30(1987))，其中在90分钟测试期内的抽烟行为明显受口香糖中烟碱含量的影响。
在本实施例中，测试了安慰剂/甲氧沙林和安慰剂/烟碱的所有四种组合(即，(i)安慰剂甲氧沙林和烟碱；(ii)甲氧沙林和烟碱；(iii)甲氧沙林和安慰剂烟碱；以及(iv)安慰剂甲氧沙林和安慰剂烟碱)。
本实施例证实了甲氧沙林增强的口服烟碱替代疗法在短暂戒烟的吸烟者中的动力学效果；甲氧沙林增强的口服烟碱替代疗法在短暂戒烟的吸烟者中的行为效果。
有11位对象。本实施例中采用实施例8所用的包括和排除对象的标准。
每个对象经历四个分开的90分钟戒烟期，然后是90分钟没有限制的抽烟期，其中在前四个研究日内在戒烟期内以随机而均衡的次序进行下列四种双盲处理各一次：(i)安慰剂甲氧沙林和安慰剂烟碱，(ii)安慰剂甲氧沙林和4毫克烟碱，(iii)甲氧沙林30毫克和安慰剂烟碱，以及(iv)甲氧沙林30毫克和4毫克烟碱。采用实施例1中的10毫克甲氧沙林胶囊，用蜂王浆胶囊作为安慰剂。胶囊配制在不透明小管中，对象和调查者均不能在对象将其直接放入口中之前看到胶囊。
如实施例8所述制得4毫克烟碱胶囊，另制得只含有乳糖的相应蜂王浆胶囊安慰剂。对象一次性或连续服用三个甲氧沙林/安慰剂胶囊和一个烟碱/安慰剂胶囊。
在可能的范围内在两种性别以及一天的两个时间上使处理次序均衡。处理次序用计算机化的随机化程序来确定。处理是双盲的。
如实施例8所述，有早上和下午的方案。
研究时期计划为每天两次，三位对象同时进行，从早上8:30/8:40/8:50以及下午1:00/1:10/1:20开始。测试期持续大约4小时。在每一测试期之前，让对象随意抽烟、吃东西和喝咖啡碱饮料直到各测试期前90分钟，此时让他们停止吃东西和喝饮料(除水外)。每一测试期在服用药物/安慰剂/烟碱之前60分钟开始。表5中列出了精确的方案。
表5
    经过的时间          行为
    -00:40    戒烟之前抽香烟
    -00:30    戒烟开始
    -00:10    1.取血样(8毫升)-#12.测定CO3.问附录C中的问题1-9
    00:00    1.测定CO2.经口服用所有胶囊
    00:50    1.取血样(8毫升)-#22.测定CO3.问附录C中的问题1-12
    00:59    1.测定CO2.打开摄像机
    01:00    1.戒烟结束2.自由抽烟开始
    02:30    1.关闭摄像机2.自由抽烟结束3.取血样(8毫升)-#34.测定CO5.问附录C中的问题1-176.恢复戒烟
    02:40    测定CO
    02:50    测定CO
    03:00    测定CO
第一个戒烟期持续90分钟，其中后60分钟在给予安慰剂/药物/烟碱之后。第二个戒烟期便于重复测定抽烟后呼气中的一氧化碳(CO)。在收集血样的三个场合，对象还答了关于所研究药物的可能症状和效果以及抽烟欲望的简单问卷。另外，在第三个场合，还有关于对自由抽烟期内所抽香烟感觉的问卷。该问卷(见附录A)根据的是烟碱口香糖研究中所用的问卷(Nemeth-Coslett，等人，(1987))。
在自由抽烟期间，让对象随意地抽烟、吃小吃和喝不含咖啡碱的饮料，只是他们须留在摄像机可看到的房间区域内。
测定的主要应变量是自由抽烟期内呼吸中的CO变化，根据抽烟后10、20和30分钟的平均值减去抽烟前10分钟和0分钟的两个样品的平均值来测得。测定的其它应变量是服药后0和150分钟之间的血浆烟碱变化，对症状的反应和评估的等级，自由抽烟期内所抽的烟草量(根据相同数量的未抽的香烟重量减去残余烟头的重量测得)，以及通过分析摄像带得出的喷烟时间和次数。
在方差分析中，以治疗药物组合作为主要的感兴趣的自变量，以性别、早上/下午方案和治疗次序作为从误差项除去的辅助性解释性变量，评价应变量。
现在将参照图9-14讨论实施例10的研究的结果。
图9描述了在口服药物之前、60分钟后(不允许抽烟)和90分钟的自由抽烟期后测得的呼气中的一氧化碳浓度平均值。如图所示，甲氧沙林/烟碱的组合治疗导致抽烟期内呼吸中一氧化碳的增量有明显的大幅度的降低。甲氧沙林/烟碱的组合治疗组中一氧化碳含量的增加只是在其它条件下所见的30％，这反映了抽烟行为以及与烟雾的接触有很大的减少。这种减少可能归功于喷烟较少，较浅和/或呼气前喷烟维持的时间较短的任意组合。
图10描述了在90分钟自由抽烟期内血浆烟碱浓度增量与呼吸中一氧化碳浓度增量之比。换句话说，该图描述了与烟雾接触可能的减少的量度，这种减少可能在依赖性抽烟者补充他们的全身血浆烟碱含量时发生。如图所示，甲氧沙林/烟碱的治疗与其它三种治疗不同，从它们的平均值可以看出，呼吸中一氧化碳浓度每单位增量的烟碱增加在两倍以上。
图11描述了抽烟的常用量度：在90分钟期间所抽的香烟平均数。如图所示，甲氧沙林/烟碱的组合治疗伴随有最少的抽烟，然而，与呼气中的一氧化碳浓度相比，所抽香烟数量却是接触烟雾和抽烟行为的一个不灵敏的量度。
图12描述了在90分钟自由抽烟期间在每10分钟末尾喷烟的平均累积次数，数据归纳为该曲线下的面积。如果总喷烟数增加，或较早地消费了相同的数量从而使曲线向左偏移，则该面积将会增加。如图所示，甲氧沙林/烟碱治疗伴随有最少的喷烟累积次数。
图13显示出甲氧沙林/烟碱治疗组中的燃烧的烟草克数明显较少。同样，该量度不如直接测定抽烟行为和烟雾接触(例如呼气中的一氧化碳浓度和烟碱/呼气中的一氧化碳浓度)那样灵敏。
图14描述了CYP2A6代谢烟碱的抑制作用通过改变烟碱调节的抽烟行为而减少了呼气中的一氧化碳。甲氧沙林/烟碱的联合治疗明显延长了各枝香烟间的等待时间。
总之，图9-14描述的结果表明，经甲氧沙林和烟碱联合处理的对象其抽烟行为有所改变。具体地说，关键性的客观的指标如血浆烟碱浓度和呼气中的一氧化碳比其它治疗方案明显减少。
CYP2A6代谢了体内约75％的烟碱。烟草依赖性抽烟者通过调节他们的抽烟行为来维持烟碱水平；CYP2A6的抑制应减少烟碱代谢，减少抽烟行为以及与烟雾的接触(例如呼吸中的CO)。戒烟过夜的依赖性抽烟者(6位男性，5位女性)抽一根香烟，然后以交叉均衡的次序接受甲氧沙林30毫克(CYP2A6抑制剂K；＝0.2μM)或安慰剂与烟碱4.0毫克或安慰剂之四种口服组合的一种。60分钟后，对象开始为期90分钟的随意抽烟期。接受甲氧沙林和口服烟碱的对象抽的烟比接受安慰剂/安慰剂的对象少(例如呼吸中的CO增量减少50％；到第二根香烟的等待时间增加83％；抽烟数减少24％；燃烧的烟草(克数)减少24％，总喷烟数减少25％[所有的p均小于0.05])。另外，在一些量度(例如至第二根香烟的等待时间)上，反应的等级次序是甲氧沙林/烟碱＞甲氧沙林/安慰剂＞安慰剂/烟碱＞安慰剂/安慰剂，这提示甲氧沙林对烟碱的全身清除有影响。单用CYP2A6抑制或与口服烟碱联合可减少抽烟，并在终止抽吸烟草、减少接触或预防复发策略中起一定作用。
实施例10
烟碱代谢的抑制剂：对烟草依赖性的可能的新的治疗
烟碱由CYP2A6灭活成可替宁。由于烟碱的生物利用度较低(20-35％)，因此口服烟碱疗法是可行的。用反苯环丙胺、甲氧沙林作为抑制剂(Ki＝0.05-6μM)，以表达的CYP2A6研究烟碱代谢的体外抑制。与安慰剂相比，在皮下注射烟碱3 1微克/千克(每小时一次共3剂)前30分钟口服30-50毫克甲氧沙林后，依赖性抽烟者的8小时血浆烟碱平均浓度增加49％(p＜0.01)，而香豆素(每小时225毫克×6)使该浓度增加15％(p＜0.05)。用上述方法在单独给予烟碱(4.0毫克经口)以及和安慰剂一同给予的标准抽烟者(n＝7-12)中进行研究，结果表明甲氧沙林(3毫克、10毫克或30毫克)或反苯环丙胺(2.5毫克或10毫克)使血浆烟碱浓度比安慰剂明显有所增加(见图15)。具体地说，10毫克和30毫克的甲氧沙林(图15的M10和M30)以及2.5毫克和10毫克的反苯环丙胺(图15的T2.5和T10)使血浆烟碱浓度增加大约100％(p＜0.01)。另外，M10、M30(p＜0.05)以及T2.5(p＝0.17)使口服烟碱生物利用度增加还伴随了抽烟欲望明显减少(见图15，实心圆)。
从这些研究可以明显看出，剂量为目前用来分别治疗牛皮癣和忧郁症之治疗剂量之1/4和1/8的甲氧沙林和反苯环丙胺可用来抑制烟碱首过代谢和全身代谢。预计其它CYP2A6抑制剂及其异构体形式同样如此。
实施例11
金丝桃的提取
采用下列程序来制备贯叶金丝桃提取物：
将10只贯叶金丝桃蒴果和50毫升的80％甲醇(水20％，v/v)的提取混合物(0.3％金丝桃素)加入烧杯(125毫升)中。在一个方法中，用冷甲醇进行萃取。在第二个方法中，将提取混合物放在水浴中并加热至沸腾(约80℃)。使混合物保持沸腾30分钟，加入甲醇使体积保持50毫升，然后室温下冷却，3000g离心5分钟。然后将所得提取物吹干，重悬于Tris缓冲液pH7.4中。
实施例12
金丝桃提取物对CYP2A6活性的影响
体外监测烟碱代谢。通过包括50微升tris缓冲液与实施例11中制得的提取物(50微升，以同一换成稀释)的测定进行比较，评价抑制剂。采用人肝微粒体或CYP2A6微粒体。根据抑制剂的表观分子量为504以及植物材料中该活性物质的浓度为0.3％，计算出当稀释至浓度为20、10、5、1、0.1以及0.01μM时金丝桃中抑制剂的浓度。
培育混合物：
底物80μM(50微升tris缓冲液)
NADPH 1mM(50微升tris缓冲液)
微粒体80微克(30微升tris缓冲液)
细胞溶质(大鼠)20微升(tris缓冲液)
Tris缓冲液50微升(pH7.4)
                                           
最终体积200微升
培育过程：
37℃培育30分钟。在培育混合物中加入内部标准品(50微升咖啡碱，0.05毫克/毫升)，然后加入DCM(1毫升)。振摇混合物10分钟，3000g离心5分钟。吸出顶层。加入HCl(0.01N，100微升)，然后振摇1分钟，3000g离心5分钟。将30微升HCl层注入HPLC。
HPLC条件
柱：              Supelco；5-8347；LC-8-DB；150×4.6mm；5μm
λ：              260nm
流速：            1.3毫升/分钟
流动相：          1000/120(柠檬酸缓冲液/乙腈，v/v)
柠檬酸缓冲液：    柠檬酸7.14克(0.34M)
                  磷酸二氢钾4.627克(0.34M)
                  1-庚烷磺酸盐670毫克
                  三乙胺5毫升
                                                         
                  最终体积1000毫升
                  用5NKOH调节pH至4.40
保留时间(分钟)：
                  2.2(烟碱亚胺(iminium)离子)
                  2.7(烟碱)
                  3.4(可替宁)
                  3.9(咖啡碱)(内部标准品)
图16表明(1)冷的金丝桃的甲醇提取物；(2)热的金丝桃的甲醇提取物；(3)纯化的金丝桃素；和(4)阴性对照对烟碱代谢的抑制作用。结果表明两种金丝桃的甲醇提取物均能抑制CYP2A6活性。
实施例13
小翘连属植物对烟碱代谢的影响
给予12位对象安慰剂或3颗小翘连属植物胶囊300毫克再加上口服烟碱4.0毫克(以碱基计)口服。在3小时内的指定时间取血样。
图18和19显示的结果证实小翘连属植物增加了体内的烟碱生物利用度。在接受小翘连属植物后，血浆烟碱平均浓度升高64％。
实施例14
七叶亭对CYP2A6活性的影响
用实施例12所述的方法测试七叶亭(一种在菊苣和叶子花中发现的化合物)抑制CYP2A6代谢烟碱的能力。
图19中显示的结果表明七叶亭是一种强效的CYP2A6抑制剂。
在以较佳的方式描述了本发明的原理后，本领域技术人员应当理解可以在不脱离这些原理的情况下对本发明作改动。我们要求了包括在下列权利要求范围内的所有改动。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均全部纳入本文作为参考，正如每一出版物、专利或专利申请具体地单独地全部纳入本文作为参考那样。
表1
                       每日抽的香烟的平均数
          基因型频率                 TD                  AT
  NTD     TD    AT    男性     女性    总数    男性    女性    总数
  年龄   28.3    31.2   37.8    31.1     31.4    31.2    37.2    41.4    37.8
  野生型/野生型   130    114    62    26.1     19.5    23.2    28.9    27.8    28.7
  野生型/突变型    31    17    7    19.3     18.7    19.1    29.7    50.0    32.6
  突变型/突变型    2     2    1    22.5      -    22.5     25     -     25
    n   163   133    70     76     57    133     60     10     70
野生型/野生型：CYP2A6*1/CYP2A6*1
野生型/突变型：CYP2A6*1/CYP2A6*2+CYP2A6*1/CYP2A6*3
突变型/突变型：CYP2A6*2/CYP2A6*2

Claims (22)

1.CYP2A6抑制剂和烟碱的组合在制备药物中的用途，所述药物用来治疗需要调节烟碱代谢的病情，所述药物包含有效量的一种或多种所述CYP2A6抑制剂，所述CYP2A6抑制剂选自(i)抑制CYP2A6活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A6的基因转录、翻译或这两者的物质。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述病情是抽烟，或所述病情是烟碱转变成可替宁。
3.根据权利要求1所述的用途，其中将所述药物配制成用于口服给药。
4.根据权利要求1所述的用途，其中将药物配制成单个组合物。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制CYP2A6的物质选自甲氧沙林、补骨脂素、反苯环丙胺、毛果碱、香豆素、色酮、七叶亭、苯乙肼、帕罗西汀、司来吉兰和帕吉林。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制CYP2A6的物质选自甲氧沙林、香豆素和反苯环丙胺。
7.根据权利要求6所述的用途，其中甲氧沙林给药剂量为0.1毫克至50毫克；香豆素给药剂量为1毫克至100毫克；或反苯环丙胺给药剂量为0.1毫克至80毫克。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制CYP2A6的物质是天然产物。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述天然产物选自金丝桃、菊苣、叶子花及其提取物。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还与CYP2B6的抑制剂一同使用。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述病情是前致癌物代谢成致癌物。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述前致癌物是选自N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二甲胺和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮的N-亚硝基二烷基胺。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述病情具有选自(i)对烟草成瘾、(ii)有产生烟草成瘾危险，(iii)有产生与抽烟相关的癌症的危险，以及(4)与一种或多种由CYP2A6转变成致癌物的化合物接触的情况。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制成控制释放系统。
15.一种组合物，该组合物包含有效量的(a)烟碱和(b)一种或多种物质，该物质选自(i)抑制CYP2A6活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A6的基因转录、翻译或这两者的物质；，并与合适的稀释剂或载体混合在一起。
16.根据权利要求1 5所述的组合物，其中所述抑制CYP2A6的物质是天然产物。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述抑制CYP2A6的物质选自甲氧沙林、补骨脂素、反苯环丙胺、毛果碱、香豆素、色酮、七叶亭、苯乙肼、帕罗西汀、司来吉兰和帕吉林。
18.一种增强烟碱替代疗法效果的组合物，该组合物包含(a)烟碱和(b)一种或多种物质，该物质选自(i)抑制CYP2A6活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A6的基因转录、翻译或这两者的物质。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述物质选自甲氧沙林、补骨脂素、反苯环丙胺、毛果碱、香豆素、色酮、七叶亭、苯乙肼、帕罗西汀、司来吉兰和帕吉林。
20.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物被配制成控制释放系统。
21.一种试剂盒，它包含(a)烟碱和(b)一种或多种物质，所述物质选自(i)抑制CYP2A6活性的物质；(ii)抑制编码CYP2A6的基因转录、翻译或这两者的物质。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述物质选自甲氧沙林、补骨脂素、反苯环丙胺、毛果碱、香豆素、色酮、七叶亭、苯乙肼、帕罗西汀、司来吉兰和帕吉林。
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