CN109997027A

CN109997027A - 记录具有一个或多个空腔的细胞培养板的全区域图像的装置

Info

Publication number: CN109997027A
Application number: CN201780074149.6A
Authority: CN
Inventors: F.福伊斯; M.哈瑙; K.奥克曼
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2017-11-22
Publication date: 2019-07-09
Also published as: KR20190088970A; BR112019011137B1; EP3548871A1; BR112019011137A2; WO2018099778A1; EP3330697A1; JP2020501138A; US20210109087A1; EP3548871B1

Abstract

本发明涉及一种用于记录具有一个或多个空腔的细胞培养板的全区域图像的装置（1），包括：用于容纳细胞培养板的保持器（40），其中所述细胞培养板（50）具有下侧（51）、上侧（62）以及在下侧（51）和上侧（52）之间延伸的多个侧表面；相机（20），用于在预定义的景深内记录所述细胞培养板的下侧的图像，以及照明装置（30），用于照射所述细胞培养板（50），其中所述照明装置（30）包括多个光源。在细胞培养板（50）的使用位置中，第一、第二、第三和第四光源的光分别在其整个长度上穿过分配的第一、第二、第三和第四侧表面（53）地从外部进入所述细胞培养板（50）。该装置包括用于调整的部件，利用所述部件可以单独调节所产生的光束的强度、在细胞培养板上方的垂直高度、倾斜角度以及光源到相应侧表面的水平距离。

Description

记录具有一个或多个空腔的细胞培养板的全区域图像的装置

技术领域

本发明涉及一种在水性测试中确定生物活性物质对线虫和其他有机体的作用的装置。此外，还涉及一种用于调整该装置的照明装置的方法。

背景技术

许多类型的线虫（nematode）是农业中的害虫，因为它们可以通过其穿透到根系中来严重损害植物新陈代谢。针对线虫感染已经开发了各种化学物质，即所谓的杀线虫剂。然而，非常需要识别能够有效抑制线虫的其他生物活性物质。

WO2016/116291A1公开了一种用于确定生物活性物质对线虫的作用的装置，利用该装置可以在短时间内测试大量生物活性物质。在该文献中，同时检查细胞培养板的各个填充有线虫和不同生物活性物质的空腔。在该文献中，由该装置的保持器保持的细胞培养板具有下侧、上侧以及四个侧表面，所述侧表面在细胞培养板的下侧和上侧之间延伸。该装置包括相机，用于记录细胞培养板下侧的图像并因此同时记录所有空腔的图像。该装置的照明装置具有两个相对的光源，所述光源照射细胞培养板。

已经表明，WO2016/116291A1的装置的使用在检查诸如恶丝虫的非常小的丝虫的情况下是有其局限性的。虽然原则上可以通过选择相应更高分辨率的相机来提高该装置的分辨率，但是已经发现，在分辨率更高的情况下不再能够通过软件技术令人满意地校正照射细胞培养板时的不均匀性。因此，对于非常小的有机体，不再可能可靠且可证明地确定生物活性物质的作用。

发明内容

因此，本发明所基于的任务是提供一种用于确定生物活性物质对线虫和其他有机体的作用的装置，通过该装置对于诸如恶丝虫的非常小的有机体也可以可靠地确定生物活性物质的作用。

通过使用根据权利要求1的装置解决了本发明所基于的任务。本发明的实施例可以从权利要求1的从属权利要求中得到。

根据本发明的装置的特征在于，第一光源的光穿过第一侧表面、第二光源的光穿过第二侧表面、第三光源的光穿过第三侧表面、第四光源的光穿过第四侧表面地分别从外部进入细胞培养板。因此，光从所有侧表面进入细胞培养板的内部。通过该措施，原则上在本发明的含义下可以对细胞培养板进行均匀的照射。因此在相应功能强大的相机的情况下，也可以检查生物活性物质对细胞培养板中非常小的有机体的作用。因此可以在分辨率为30μm和更小的情况下实现可证明的结果。在一个实施例中，分辨率小于20μm，例如为15μm。

对于第一光源而言可以单独调节光的强度。这类似地也适用于第二光源、第三光源和第四光源。因此，例如可以独立于第二光源或另一光源的光强度来调节第一光源的光强度。因此，最终四个分别具有不同光强度的光源可以将光发射到细胞培养板中。

第一光源可以侧向地布置在第一侧表面旁边，使得在细胞培养板的使用位置（在此情况下细胞培养板在水平面中延伸）中第一光源的光束基本上水平地穿过第一侧表面而进入细胞培养板。因此可以省去可能的偏转镜或其他光学偏转装置。

对第一光源的实施还应当类似地适用于其他光源。从而例如第二光源也可以侧向地布置在第二侧表面旁边。下面描述的与第一光源有关的特征也可以在其余光源中仅单个光源存在的情况下、在其余光源中若干光源存在的情况下或在所有其余光源存在的情况下实现。

本发明基于一种矩形细胞培养板，其具有四边形基本形状，具有分别两个平行的侧表面。例如，长边（长侧表面）与短边（短侧表面）的比例可以是3比2。空腔通常布置成彼此平行布置的多行。例如，细胞培养板可以具有8行，每行具有12个空腔。典型地，根据ANSI标准使用具有6、12、24、96或384个空腔的四边形微量滴定板。

本发明基于以下发现：在检查非常小的有机体的情况下，当光从所有侧表面进入细胞培养板时，可以利用照明装置对细胞培养板的所有空腔进行所需的良好照射。在六角形细胞培养板的情况下（但其相应的基本形状目前是不常见的），根据本发明所有六个侧表面都必须用光加以照射。在三角形细胞培养板的情况下，仅使用三个光源就足够了。

典型地，侧表面在具有可透光壁的细胞培养板的上侧和下侧之间延伸。

第一光源典型地在整个第一侧表面上延伸，由此可以均匀地照射第一侧表面。

在一个实施例中，通过用于调整照明装置（30）的部件，可以针对第一光源单独地调节相对于细胞培养板的垂直高度、围绕自己的纵轴的倾斜角度和/或到第一侧表面的水平距离。

通过灵活且单独可调地调节每个光源，可以优化对细胞培养板的照射。在此情况下，每个光源从空间上看是可以三维移动的（高度，水平距离，倾斜角度）。附加地，可以调节第四维度，即光强度。已经发现，即使在具有矩形基本形状的对称细胞培养板的情况下，在每个侧表面处对光源的精确单独调节对于测量的质量也是非常重要的。

优选地，每个光源连接到控制器。特别优选地，每个光源安装在连接到一个或多个单独控制器的保持器上。

从第一光源射出的光束的垂直高度可以是2至6mm，优选3至5mm。在第一光源侧向布置的情况下，该光束没有倾斜角度地水平穿过第一侧表面，也就是在上侧和下侧之间而进入细胞培养板。

优选地，光束的开口角非常小，由此例如覆盖细胞培养板的各个空腔的覆盖膜不被照射，因此不会引起干扰效应。然而，如果例如通过相机仅对细胞培养板的小的垂直部分清晰地成像，使得覆盖膜所位于的细胞培养板的平面不再清晰，则开口角的较大值也是可以容忍的。在该实施方式中，保持每次入射，使得仅从细胞培养板的底部一直照射到由物镜限定的景深。优选不照射盖子或保护膜以避免光反射。

优选地，控制器被配置用于自动执行用于调整照明装置的方法。

第一光源可以具有并排布置的一行发光二极管（LED）。为了在第一光源的有效长度上产生均匀的光，第一光源可以具有菲涅耳透镜装置。因此，通过这种菲涅耳透镜装置，第一光源发射光束，该光束的强度在光源的纵向延伸上看是恒定的。

用于细胞培养板的保持器（也称为MTP保持器）可以具有多个容纳角，其中第一容纳角用于容纳第一侧表面的一个端部，而第二容纳角用于容纳第一侧表面的相对端部。第一容纳角和第二容纳角之间的距离在此情况下优选地大于沿第一侧表面延伸的一行空腔的长度。因此，第一光源的光可以在该行空腔的整个长度上不受阻碍地进入细胞培养板。优选地，保持器被构造成使得在第一光源和细胞培养板的第一侧表面之间不布置其他障碍物，以允许第一光源的光无阻碍和无阴影地进入细胞培养板。

相机可以包括用于精确测量的焦阑物镜（例如来自Sill Optics），以排除或至少在很大程度上排除细胞培养板边缘处的图像的透视误差。

典型地，使用具有图像传感器的数码相机。优选地，朝着图像传感器表面调整细胞培养板的底部（也称为芯片倾斜）并且将细胞培养板朝着图像传感器旋转，使得细胞培养板被调节为尽可能恰好平行于图像传感器（优选地，表面和侧面）。为了该调节，典型地可以精确地在所有方向上移动MTP保持器，例如借助于具有限定厚度的夹具。

通过将焦阑物镜与可移动地安装在MTP保持器上的细胞培养板结合使用，可以无需软件校正就实现<+/-2％的失真，即平面的图像记录。此外，通过焦阑物镜的孔径，可以调节出小的景深，由此可以减少例如由上面提到的用于空腔的覆盖膜引起的干扰效应。

根据本发明的装置允许对完整的板表面进行图像分析，并且适用于具有多达384个具有小有机体（约15μm的分辨率极限）的空腔的细胞培养板，所述小有机体例如是恶线虫。显然，总的来说可以借助于根据本发明的装置记录包含悬浮在溶液中的有机体或颗粒的细胞培养板的全区域图像，并借助于图像分析对所述图像进行处理。

在装置的操作期间，相机以例如1至5秒的时间间隔从例如包括96个空腔的细胞培养板的整个下侧记录多个数字图像。通过基于像素分析来评估这些图像，例如可以为每个单独的空腔确定位于该空腔中的恶线虫移动的平均速度的特征数。在具有有效的生物活性物质的空腔中，平均速度在此情况下原则上小于在没有生物活性物质的空腔中的平均速度。因此，在平均速度的基础上可以估计生物活性物质的有效性。在本文中参考WO2016/116291A1，其中详细描述了用于确定生物活性物质的作用的相应方法，利用该方法可以操作根据本发明的装置。

在完全均匀照射细胞培养板并且每个空腔被相同填充的情况下（例如每个空腔都没有生物活性物质），如果不考虑不可避免存在的生物散射，理论上对于每个空腔都必定得到恶线虫的运动具有相同的平均速度。相反，在对空腔的照射太差的情况下，尽管填充相同，结果也仍然非常清楚地彼此不同。因此，在用这种方式照射具有填充了不同生物活性物质的空腔的细胞培养板的情况下，关于各个生物活性物质的结论是不可证明的。然而，通过根据本发明的装置的照明装置，可以将实践中不能完全排除的照射差异的影响保持得如此低，使得即使对于非常小的恶线虫（也就是在相应高分辨率的情况下），关于生物活性物质的作用的可证明结论也是可能的。

另外，任务是提供一种用于调整在各种实施方式中描述的上述装置的照明装置的方法。该任务通过根据权利要求12的特征组合来解决。根据本发明的方法的实施例可以从权利要求12的从属权利要求中得到。

根据本发明的方法规定，对于每个光源，单独调节相对于细胞培养板的相对高度、倾斜角度、到相邻侧表面的水平距离以及光强度，以获得对细胞培养板的各个空腔的尽可能均匀的照射。

在系统过程中，可以迭代地针对每个光源调节各个参数（高度，距离，倾斜角度，光强度），并且可以利用这些调节的参数分别对相同填充的每个空腔执行平均速度的上述确定。可以任意频繁地重复此过程。在此情况下，所确定的平均速度结果彼此相差越小，细胞培养板的不均匀照射对测试结果的影响就越小。最后，如果结果彼此仅还相差一个数量级，该数量级可归因于生物散射，则可以结束调整方法。

用于调整照明装置的方法可以规定，利用相机创建单色片材的图像，该片材位于细胞培养板上方的平面中（例如，可以将该片材布置在位于保持器内的未填充细胞培养板上，其中插入另一个空的细胞培养板），并且基于图像的评估进行或精制所述调整。例如，可以从图像生成光强度的直方图，并且基于该直方图进行所述调整。当所属的直方图对于所有子区域（这也可以是数字图像的各个像素）分别具有相同的光强度时——这意味着该直方图仅由一个具有这一光强度的方格组成，得到片材的均匀照射。

在一个实施例中，一方面借助于具有相同填充的空腔的细胞培养板的结果并且附加地借助于上述片材来调整照明装置。基于相同填充的细胞培养板的（初始）调整和通过片材的（再）调整可以连续多次和/或以相反的顺序进行。

此外，在调整结束时，各个光源的光强度可以分别被减小相同的量或成比例地减小，使得单色纸张片材的图像的平均光强度是预定值（例如，如果光强度可以为0至256，则平均值为128）。然后在根据本发明的装置的操作期间，向细胞培养板的每个空腔分配纸张片材上的相应区域。然后可以基于纸张片材上的相应区域的光强度对通过相机确定的空腔像素的光强度值进行标准化。例如，如果对于空腔已经确定了纸张片材的更亮的区域，则通过所述标准化来减小针对该空腔确定的光强度值。

附图说明

应当基于图中所示的实施例更详细地解释本发明。

图1示意性地示出了根据本发明的装置的结构；

图2示意性地示出了细胞培养板和具有四个光源的照明装置；以及

图3示出了沿图2中的线III-III的截面。

具体实施方式

图1示意性地示出了用于在水性测试中确定生物活性物质对恶线虫和其他有机体的作用的装置。整体用1表示的该装置包括壳体10，壳体10具有上隔板11和中隔板12。隔板11,12将由壳体10包围的内部空间细分为上部区域13、中部区域14和下部区域15。在下部区域15中安装有相机20。相机20具有焦阑物镜21，该焦阑物镜的背离相机20的端部22伸入到壳体10的中部区域14中。中隔板12具有圆形开口16，物镜21穿过该开口。物镜21的截头锥形部分23在此情况下支撑在开口16的圆形边缘上。

在壳体10的上部区域13中容纳有照明装置30以及用于细胞培养板50的保持器40。下面将基于图2和图3更详细地描述照明装置30、保持器40和细胞培养板50。

除了相机20之外，壳体10的下部区域15还容纳用于相机20和照明装置30的控制器60。控制器60在此情况下可以由单独用于相机20和照明装置30的控制单元组成。控制器60可以连接到计算机。

利用根据本发明的装置1，可以从细胞培养板50的下侧51产生。因此，在隔板11中镶入玻璃片17。

图2从上方示出了照明装置30，其具有第一光源31、第二光源32、第三光源33和第四光源34。第一光源31包括多个发光二极管（未示出），这些发光二极管并排地布置成行并且在第一光源31的几乎整个长度上发射条形光束35。该光束通过平行箭头35表示。其余的光源32,33,34也分别在其几乎完整的长度上朝着细胞培养板50的方向发射条形光束。然而，为了清楚起见，在图2中未示出用于标示各个光束的相应箭头。

除了上面已经提到的下侧51之外，细胞培养板50还具有上侧52以及第一侧表面53、第二侧表面54、第三侧表面55和第四侧表面56。由于细胞培养板50的矩形基本形状，相对的侧表面53,54垂直于另一对平行的侧表面55,56延伸。

细胞培养板50具有大量空腔57，这些空腔57布置成8行，每行具有12个空腔。从图3中可以看出，每个单独的空腔57在纵截面中具有U形形状。每个空腔57在此情况下可以从上方、也就是从上侧52用水溶液填充，其中恶线虫和生物活性物质位于所述水溶液中。在成功填充之后，可以经由覆盖膜覆盖空腔。

如在图2和3的概要中清楚示出的，各个光源31,32,33,34分别将光穿过侧表面53,54,55,56而发送到细胞培养板50中。从而来自第一光源的光从外部穿过第一侧表面53而进入细胞培养板50。同样地以类似的方式适用于光源32,33,34。为了实现对细胞培养板50的各个空腔57的尽可能好的照射，可以改变光源31相对于细胞培养板50的位置。

通过双箭头36表明第一光源31和细胞培养板50的第一侧表面53之间的距离可以增大或减小。双箭头37（参见图3）表示第一光源31可以相对于细胞培养板50向上或向下移动。另外，第一光源31可以围绕纵轴38倾斜，纵轴38平行于细胞培养板50的第一侧表面53延伸。通过弯曲的箭头39标示出围绕纵轴38或围绕与纵轴38平行延伸的轴线的相应可移动性。另外，可以经由控制器60调节第一光源31的光强度。第一光源到第一侧表面的水平距离、第一光源的垂直位置、第一光源的倾斜角度和第一光源的光强度可以由其余光源32,33,34的相应设置参数单独调节。因此，例如可以调整照明装置，使得第一光源31的光强度不仅偏离横向于该第一光源布置的光源33,34的光强度，而且还偏离相对的光源32的光强度。

保持器40具有第一容纳角41、第二容纳角42、第三容纳角43和第四容纳角44。优选地，在此情况下四个容纳角41,42,43,44中的三个被构造为固定止动件，而其余的第四容纳角被构造为弹性止动件。例如第一容纳角和第二容纳角之间的距离被测定为使得第一光源31的光束35可以不受阻碍地入射到第一侧表面的空腔57所位于的区域上。换句话说，容纳角41,42之间的距离大于第一列空腔的长度，第一列空腔沿第一侧表面53延伸。

由于较长侧表面55,66和较短侧表面53,54的长度不同，一方面光源33,34和另一方面光源31,32也具有不同长度。来自光源的光束的宽度在此情况下总是长于所属侧表面的空腔所位于的区域的长度。

通过照明装置30并且通过保持器40的各个容纳角的特殊布置，细胞培养板50的侧表面的空腔57所位于的所有区域都被施加有来自光源的光。通过各个光源的单独可调节性，可以调整照明装置30，使得实现对空腔57的近似最佳的照射。上面已经描述了用于尽可能最佳照射的优选控制标准。如果在细胞培养板的各个空腔中分别填充有相同的生物活性物质的情况下，在分别相同的生物活性物质的有效性方面的特定于空腔的结果不是彼此不同或者具有标准偏差，则可以假设存在最佳照射，其中所述标准偏差由于生物有机体而大致对应于估计的标准偏差。

附图标记列表

1 装置

10 壳体

11 上隔板

12 中隔板

13 上部区域

14 中部区域

15 下部区域

16 开口

17 玻璃板

20 相机

21 物镜

22 端部

23 截头锥形区域

30 照明装置

31 第一光源

32 第二光源

33 第三光源

34 第四光源

35 箭头（光束）

36 双箭头

37 双箭头

38 箭头

40 保持器

41 第一容纳角

42 第二容纳角

43 第三容纳角

44 第四容纳角

50 细胞培养板

51 下侧

52 上侧

53 第一侧表面

54 第二侧表面

55 第三侧表面

56 第四侧表面

57 空腔

60 控制器

Claims

1.用于记录具有一个或多个空腔的细胞培养板的全区域图像的装置（1），包括

-用于容纳具有空腔（57）的细胞培养板（50）的保持器（40），其中所述细胞培养板（50）具有下侧（51）、上侧（62）以及在下侧（51）和上侧（52）之间延伸的多个侧表面，

-相机（20），其用于在预定义的景深内记录所述细胞培养板（50）的下侧（51）的图像，

-照明装置（30），用于照射所述细胞培养板（50），

其中所述照明装置（30）包括多个用于产生光束的光源，其特征在于，在所述细胞培养板（50）的使用位置中

-第一光源（31）的光在其整个长度上穿过第一侧表面（53）、

-第二光源（32）的光在其整个长度上穿过第二侧表面（54）、

-第三光源（33）的光在其整个长度上穿过第三侧表面（55）、和

-第四光源（34）的光在其整个长度上穿过第四侧表面（56）

地从外部进入所述细胞培养板（50），其中对于每个光源（31）能够通过用于调整所述照明装置（30）的部件单独调节所产生的光束的强度、所产生的光束相对于所述细胞培养板的垂直高度、所述光源到相应侧表面的水平距离以及所产生的光束围绕纵轴（38）的倾斜角度。

2.根据权利要求1所述的装置（1），其特征在于，所述第一光源（31）具有菲涅耳透镜装置，以便在所述第一光源（31）的有效长度上产生均匀的光。

3.根据权利要求1或2所述的装置（1），其特征在于，每个光源和/或用于固定该光源的保持器与一个或多个用于调整所述照明装置（30）的控制器连接。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置（1），其特征在于，用于调整所述照明装置（30）的控制器被配置为执行用于调整所述照明装置的方法。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置（1），其特征在于，所述第一光源（31）侧向地布置在所述第一侧表面（53）旁边。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的装置（1），其特征在于，对于每个光源（31）调节所产生的光束的强度、所产生的光束相对于所述细胞培养板的垂直高度、所述光源到相应侧表面的水平距离以及所产生的光束围绕纵轴（38）的倾斜角度，使得从所述细胞培养板的底部一直照射到预定义的景深。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的装置（1），其特征在于，从所述第一光源（31）射出的光束的垂直高度为2mm至6mm。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的装置（1），其特征在于，所述保持器（40）具有多个容纳角，其中第一容纳角（41）用于容纳所述第一侧表面（53）的一个端部，而第二容纳角（42）用于容纳所述第一侧表面（53）的相对端部，并且其中所述第一容纳角（41）和所述第二容纳角（42）之间的距离大于沿着所述第一侧表面（53）延伸的一行或一列空腔（57）的长度。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的装置（1），其特征在于，所述相机（20）包括焦阑物镜（21）。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的装置（1），其特征在于，所述相机包括图像传感器，并且所述细胞培养板（50）和/或所述图像传感器在所有方向上能够朝着彼此移动，使得所述细胞培养板被调整为在所有方向上平行于所述图像传感器。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的装置（1），其中用于在水性测试中确定生物活性物质对线虫和其它有机体的作用，其中，用在具有和不具有生物活性位置的水溶液中的线虫或其它有机体来填充所述细胞培养板的空腔。

12.一种用于调整根据权利要求1至11中任一项所述的装置（1）的照明装置（30）的方法，其特征在于，相对于细胞培养板，单独调节每个光源的相对高度、每个光源的倾斜角度以及每个光源的光强度，以获得对所述细胞培养板（50）的各个空腔（57）的良好照射以及对所述细胞培养板的均匀照射。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，利用相机（20）创建单色片材的图像，该片材位于被照射的细胞培养板（50）上方的平面中，并且基于对所述图像的评估来进行所述调整。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，从所述图像产生光强度的直方图，并基于该直方图通过控制用于调整所述照明装置（30）的部件来进行所述调整，直到该直方图具有最小宽度为止。