CN109971879A - 检测转基因大豆品系mon87705的pcr引物组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用。所述引物组合包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对，其上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。所述引物组合还包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针，其序列为SEQ ID No.3或其互补序列。所述引物组合在使用微滴式数字PCR方法检测待测样品时，特异性好，灵敏度(检测下限)为PCR扩增的反应体系中DNA模板的浓度0.025ng/μL。本发明对转基因大豆品系MON87705外源基因成分的定性和定量检测具有十分重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体说是一种检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用。
背景技术
转基因作物已经商业化二十余年，2016年时种植面积已达到了1.851亿公顷，超过26个国家种植了转基因作物。转基因大豆作为最早进行商业化应用的转基因植物品种之一，它的种植面积达到了9140万公顷，占转基因作物总量的50％。转基因大豆在美国、巴西和阿根廷有较大种植面积，在国际农产品市场中占有重要的地位。随着转基因大豆在全球范围内大面积的种植与消费，我国面临多种情况与问题：转基因作物可能在生产加工、运输销售等过程中掺杂到非转基因产品中，而且截至目前为止共有10个大豆转基因品系获得我国转基因生物安全证书，其产品也会随着正常的国际贸易流入市场，同时很多消费者也在关注转基因作物的安全性问题，呼吁保证自身知情权和消费权等。这些促使着我国在实现转基因成分的检测基础上，加快实现转基因产品的定量检测，尽快完善转基因产品管理体系。
目前，转基因成分定量检测一般采用实时荧光PCR技术，是通过绘制标准物质浓度曲线，通过检测阈值来计算转基因成分含量的，但是在实际应用中局限性很大，最主要的是标准曲线的制备，首先很难做到精准的标准浓度梯度，其次在操作步骤及绘制曲线过程中会不可避免地产生误差，数字PCR就能很好地避免这一点并可以不受扩增效率的影响，实现精准的定量。
数字PCR(以下简称dPCR)是一种基于油包水结构实现单分子扩增的PCR方法，能实现不依赖于标准曲线检测拷贝数，利用内参基因与外源基因拷贝数比例来计算转基因成分含量，从而实现高灵敏度的定量。dPCR根据样本分散方式主要有微滴式数字PCR(ddPCR)和芯片式数字PCR(cdPCR)两种。
转基因大豆品系MON87705是孟山都公司研发的品质改良抗除草剂复合性状转基因作物。它是利用二元质粒载体PV-GMPQ/HT4404通过农杆菌介导转化常规大豆A3525的分生组织得到的，含有FAD2-1A/FATB1Ab表达抑制盒和cp4-epsps耐除草剂基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用，所述引物组合具有检测特异性高、灵敏度高等优点，对外源基因成分的定性和定量检测具有十分重要的应用价值。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合，所述引物组合包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对；
所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对的上游引物如SEQ IDNo.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。
所述引物组合可用于基于PCR反应原理的检测中，其中，在一种实施方式中，为了进行相对定量检测，所述引物组合还包括特异检测内参基因Lectin的引物对；
优选的，所述特异检测内参基因Lectin的引物对的上游引物如SEQ ID No.4所示，下游引物如SEQ ID No.5所示。
在另一种实施方式中，为了进行如实时荧光定量PCR或数字PCR等需要通过检测信号大小的方法检测靶基因数量时，所述引物组合还包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针；优选的，所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列；
和/或，所述引物组合还包括特异检测内参基因Lectin的探针；优选的，所述特异检测内参基因Lectin的探针的序列为SEQ ID No.6或其互补序列；
优选的，所述探针为Taqman探针；
更优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团VIC、FAM、HEX、Texas Red或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。
本发明保护以上任一所述的引物组合在检测转基因大豆品系MON87705外源基因中的应用；所述检测可为定性检测，即检测待测样品中是否存在转基因大豆品系MON87705外源基因；也可为定量检测，即检测待测样品中转基因大豆品系MON87705外源基因的绝对拷贝数；所述定性或定量检测的方法为普通PCR、荧光定量PCR或数字PCR，优选为数字PCR，更优选为微滴式数字PCR。
本发明还提供一种用于检测转基因大豆品系MON87705外源基因的PCR试剂盒，所述试剂盒包括以上任一所述引物组合；优选的，所述试剂盒中还包括微滴PCR反应预混液、微滴生成油、微滴分析油、微滴生成卡槽、和/或微滴生成卡槽胶垫。
本发明还提供一种检测转基因大豆品系MON87705外源基因的方法，包括如下步骤：
S1、采集待测样品的基因组DNA；
S2、以步骤S1的DNA为模板，使用以上任一所述引物组合或所述试剂盒进行PCR扩增；
S3、根据步骤S2的结果，判断待测样品中是否含有转基因大豆品系MON87705外源基因或确定待测样品中转基因大豆品系MON87705外源基因的拷贝数；
所述PCR为普通PCR、荧光定量PCR或数字PCR，优选为数字PCR，更优选为微滴式数字PCR。
在上述方法中，所述PCR扩增的反应体系中DNA模板的浓度为0.025—5ng/μL，优选1.25—5ng/μL。
在上述方法中，所述PCR扩增的反应体系中，所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对的上游引物和下游引物的浓度分别为0.5μmol/L；
所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针的浓度为0.25μmol/L；
所述特异检测内参基因Lectin的探针的浓度为0.25μmol/L。
在上述方法中，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性10min；94℃变性15s，57℃退火60s，共39个循环；扩增结束后进行98℃、10min的热失活。
本发明保护以上任一所述引物组合、所述试剂盒或以上任一所述方法在制备转基因大豆品系MON87705检测用标准品中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明所述的检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合，在使用微滴式数字PCR方法检测待测样品时，特异性好，灵敏度(检测下限)为PCR扩增的反应体系中DNA模板的浓度0.025ng/μL。本发明对转基因大豆品系MON87705外源基因成分的定性和定量检测具有十分重要的应用价值。
附图说明
图1为不同外源基因引物对及其探针的ddPCR一维反应热点图，其中，粗横线为荧光阈值限，粗横线上方的点为阳性点，粗横线下方的点为阴性点；G05、G06、G08和G09分别为外源基因引物对B1-F/R、B2-F/R、B3-F/R和B4-F/R及其对应探针的检测结果。
图2为引物组合特异性检测的ddPCR一维反应热点图，其中，A01和A02为检测转基因大豆品系MON87705标准品的结果，B01和B02为检测转基因大豆品系MON87701标准品的结果，C01和C02为检测转基因大豆品系MON87769标准品的结果，D01和D02为检测转基因大豆品系DP356043标准品的结果，E01和E02为检测转基因大豆品系DAS68416标准品的结果。
图3为MON87705转基因成分定量结果的线性拟合标准曲线。
图4为数字PCR一维反应热点图，其中，粗横线为荧光阈值限，粗横线上方的点为阳性点，粗横线下方的点为阴性点；其中A01、B01、C01、D01、E01、F01分别代表相对质量百分比为100％、50％、25％、5％、0.5％、0.05％的转基因大豆样品，G01为空白对照。
图5为双重数字PCR单孔双通道二维图，其中，纵坐标为通道1采集的外源基因扩增的荧光信号值；横坐标为通道2采集的大豆内参基因扩增的荧光信号值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所用的转基因大豆品系MON87705、MON87701、MON87769、DP356043、DAS68416标准品购自美国油脂化学家协会(AOCS)。
下述实施例所用的基因组DNA采用CTAB法提取，通过Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量仪评价纯度和浓度。
下述实施例所用的ddPCR预混液(2×ddPCR Master Mix)、微滴生成油、微滴分析油、微滴生成卡槽、微滴生成卡槽胶垫和96孔板购自美国Bio-Rad公司。
下述实施例使用实验仪器：Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量仪(ThermoScientific，美国)，QX200Droplet Digital PCR系统(Bio-Rad，美国，包括微滴生成仪、微滴读取仪和封膜仪)，ABI StepOne Plus定量PCR仪(Applied Biosystem，美国)。
实施例1、转基因大豆MON87705品系外源基因的数字PCR定量检测方法
一、引物和探针的设计
根据转基因大豆MON87705品系特异性序列(即外源基因在大豆基因组的5’端插入位点两端序列)设计若干不同的PCR特异引物对及与各引物对的扩增产物匹配的特异探针，同时设计大豆内参基因Lectin的PCR特异引物对及与该引物对的扩增产物匹配的特异探针，两种针对不同靶基因的探针分别采用不同的报告荧光基团FAM和VIC，以及相同的淬灭基团BHQ1标记；各引物及探针的序列信息见表1。
表1、引物和探针序列
二、数字PCR(dPCR)定量检测及最优引物组合确定
以转基因大豆品系MON87705标准品的基因组DNA为模板，使用步骤一表1中的不同引物对和探针，分别按照如下反应体系与条件进行微滴式数字PCR(ddPCR)检测：
ddPCR包含四步：制备PCR反应体系、微滴生成、PCR扩增和信号读取并分析结果。
PCR反应体系为20μL，包含10μL 2×ddPCR Master Mix，10μmol/L内参基因与外源基因的上游引物和下游引物(共4条引物)各1μL(即终浓度各为0.5μmol/L)、双探针(探针A和探针B1或B2或B3或B4)各0.5μL(即终浓度各为0.25μmol/L)，DNA模板2μL(模板浓度50ng/μL)。
微滴生成步骤使用专用的微滴生成卡槽以及微滴生成仪，将20μL PCR体系和70μL微滴生成油(droplet generation oil)加入微滴生成卡槽，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴，将微滴转入96孔板后，用锡箔纸密封置于ABI-PCR仪中进行扩增。
微滴数字PCR扩增程序：94℃预变性10min；94℃变性15s，57℃退火60s，共39个循环；扩增结束后进行98℃、10min的热失活。
每个模板三个重复。在扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用软件QuantaSoft V1.3.2.0分析实验数据，通过数字PCR反应总微滴数和阳性微滴数直接计算得到同一待测样中外源基因与内参基因的绝对拷贝数。
结果：如图1所示，与其他引物对相比，引物对B1-F/R及其探针B1(图1中的G05)具有良好的扩增效率，扩增稳定、荧光信号强度比较一致，可以明显区分阴性与阳性微滴且生成微滴数稳定在12000以上，即阳性微滴数量适中，扩增结果稳定，阈值限清晰明确，可以明显区分阴性与阳性微滴；而其他引物对及其探针出现了荧光值较优选引物对相对分散、无阳性微滴、或阴性微滴数量远高于阳性微滴等扩增效率不高的现象。因此，选用结果相对稳定、具有良好的扩增效率的引物对B1-F/R及其探针B1作为优选组合。
实施例2、特异性检测
不同于常规PCR和qPCR，可以分别通过电泳条带和熔解曲线观测特异性，数字PCR观测的是每个体系中的终点荧光，无论PCR产物是否是特异性产物，只要荧光信号足够强，也是会判读为阳性结果。因此dPCR的引物特异性要求极高，本实施例使用实施例1中最优组合：引物对B1-F/R及其探针B1与引物对A-F/R及其探针A，按照实施例1中ddPCR检测方法，分别对五个不同转基因大豆品系MON87705、MON87701、MON87769、DP356043、和DAS68416标准品的基因组DNA进行检测。
结果：如图2所示，转基因大豆品系MON87705标准品中外源基因有扩增信号，对MON87701、MON87769、DP356043、和DAS68416标准品中外源基因均无扩增信号，且上述五个不同转基因大豆品系标准品中内参基因均有扩增信号。
实施例3、灵敏度检测
对于转基因成分(即外源基因)检测来说，低百分含量下的转基因成分的检测是转基因成分检测的重点和难点。本实施例对双重数字PCR检测的下限进行了研究。
将50ng/μL的转基因大豆品系MON87705标准品的基因组DNA用水稀释，取相对质量百分比为100％、50％、25％、5％、0.5％以及0.05％的转基因大豆样品，使用实施例1中最优组合：引物对B1-F/R及其探针B1与引物对A-F/R及其探针A，按照实施例1的ddPCR反应体系与条件进行双重数字PCR的灵敏度检测。
结果：MON87705转基因成分定量结果如表3所示，其线性拟合标准曲线结果如图3所示，双重数字PCR反应热点图如图4所示。双重数字PCR二维聚类图如图5所示。
表3、MON87705转基因成分定量(绝对拷贝数)结果
表3结果显示，本申请双重数字PCR检测方法在DNA模板相对质量百分比为0.5％(DNA模板质量浓度0.25ng/μL)以上时，RSD(相对标准偏差)值小于25％，结果稳定性和重复性较好；
图3结果显示，本申请双重数字PCR检测方法的相对系数R2为0.999，具有较高的检测线性；
图4结果显示，本申请双重数字PCR检测方法的阳性点与阴性点的区分非常明显，实验结果不受荧光阈值限变化的影响；
图5结果显示，本申请双重数字PCR检测方法的扩增区分明显，荧光阈值同单孔一致。
定量范围是指双重数字PCR检测方法所能实现稳定定量检测的质量百分比范围。现阶段较为通用质控标准为欧盟标准，其界定线性范围内的点应满足线性拟合标准曲线线性系数大于95％，并且所有组内的值的RSD(相对标准偏差)值小于25％。
由于数字PCR的方法在较高浓度下同样具有较高的精确性和稳定性，因此，本实施例方法的定量范围为0.5％到100％。检测限是指检测方法最低所能达到稳定检测的质量百分比。从以上结果可以看出，本实施例检测方法在DNA模板相对质量百分比为0.5％的样品中可以实现稳定扩增，在0.05％的样品中可以出现阳性结果，但是所有平行(重复)不全为阳性，因此，本实施例的灵敏度或检测限为DNA模板相对质量百分比0.5％，即DNA模板质量浓度0.25ng/μL，反应体系中DNA浓度0.025ng/μL。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合及应用
<130> JH-CNP190092
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcccggaca tgaagccatt tac 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acaacggtgc cttggcccaa ag 22
<210> 3
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<212> DNA
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<400> 3
aagagactca gggtgttgtt atcactgcgg 30
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<212> DNA
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cctcctcggg aaagttacaa 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gggcatagaa ggtgaagtt 19
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccctcgtctc ttggtcgcgc cctct 25
Claims (9)
1.一种用于检测转基因大豆品系MON87705的PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对；
所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括特异检测内参基因Lectin的引物对；
优选的，所述特异检测内参基因Lectin的引物对的上游引物如SEQ ID No.4所示，下游引物如SEQ ID No.5所示。
3.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合还包括特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针；优选的，所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列；
和/或，所述引物组合还包括特异检测内参基因Lectin的探针；优选的，所述特异检测内参基因Lectin的探针的序列为SEQ ID No.6或其互补序列；
优选的，所述探针为Taqman探针；
更优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团VIC、FAM、HEX、Texas Red或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。
4.权利要求1—3中任一所述的引物组合在检测转基因大豆品系MON87705外源基因中的应用；优选的，所述检测的方法为普通PCR、荧光定量PCR或数字PCR，优选为数字PCR，更优选为微滴式数字PCR。
5.一种用于检测转基因大豆品系MON87705外源基因的数字PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1—3中任一所述引物组合；
优选的，所述试剂盒中还包括微滴PCR反应预混液、微滴生成油、微滴分析油、微滴生成卡槽、和/或微滴生成卡槽胶垫。
6.一种检测转基因大豆品系MON87705外源基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采集待测样品的基因组DNA；
S2、以步骤S1的DNA为模板，使用权利要求1—3中任一所述引物组合或权利要求5所述试剂盒进行PCR扩增；
S3、根据步骤S2的结果，判断待测样品中是否含有转基因大豆品系MON87705外源基因或确定待测样品中转基因大豆品系MON87705外源基因的拷贝数；
所述PCR为普通PCR、荧光定量PCR或数字PCR，优选为数字PCR，更优选为微滴式数字PCR。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系中DNA模板的浓度为0.025—5ng/μL，优选1.25—5ng/μL。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系中，所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的引物对的上游引物和下游引物的浓度分别为0.5μmol/L；
所述特异检测转基因大豆品系MON87705外源基因的探针的浓度为0.25μmol/L；
所述特异检测内参基因Lectin的探针的浓度为0.25μmol/L。
9.如权利要求6—8中任一所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性10min；94℃变性15s，57℃退火60s，共39个循环；扩增结束后进行98℃、10min的热失活。
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