CN109952108A

CN109952108A - 包括黄花蒿提取物作为有效成分的用于改善皮肤疾病的组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN109952108A
Application number: CN201780070713.7A
Authority: CN
Inventors: 权学哲; 咸政烨; 李宰旭; 朴真洙; 李主永; 朴映泰; 车珍旭; 权宰英; 金星勳; 朴雄飞; 黄浩成; 朴在圭; 金善砺; 姜旼澈
Original assignee: Jia Quan Institution Of Higher Education Industry And School Cooperation; Korea Institute of Science and Technology KIST
Current assignee: Jia Quan Institution Of Higher Education Industry And School Cooperation; Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2019-06-28
Also published as: KR20190087343A; KR101991894B1; KR102168095B1; KR20180054501A

Abstract

本公开提供一种用于分离黄花蒿提取物的方法和用于防止或治疗皮肤疾病的组合物，所述方法包括用低极性溶剂提取黄花蒿以及用亲水性溶剂提取残余物，所述组合物包括获得分离的具有低含量的倍半萜内酯的黄花蒿提取物、其馏分物或由其单离的化合物。

Description

包括黄花蒿提取物作为有效成分的用于改善皮肤疾病的组合物及其制备方法

技术领域

涉及一种包括黄花蒿(Artemisia annua)提取物作为有效成分的用于预防或治疗皮肤疾病的组合物及其制备方法。

背景技术

已经对黄花蒿提取物进行了研究和开发。然而，没有开发从其除去低极性馏分物或提取物而获得的提取物或由其制备的提取物来用于改善皮肤瘙痒和皮肤炎的实例。

皮肤与抗原直接接触引起过敏反应或皮肤刺激，其作为持续的压力因子，使皮肤屏障的稳态被破坏，导致瘙痒和炎症。特别是，由于特应性皮炎的病因尚不清楚而没有确实的治疗方法，通常使用如下方法：只使用类固醇类抗炎药来暂时缓和症状，或者将如保湿霜的保湿剂涂抹在皮肤上来缓和瘙痒。近年来，约10％的婴儿和儿童受着特应性皮炎带来的痛苦，并且患者数目呈持续增加的趋势。此外，随着人口老龄化老年人皮肤的干燥症增加的同时，各种形式的皮肤炎也正在增加。由于类固醇类制剂会引起副作用和对其的抵抗力，因此，迫切需要开发可以治疗包括特应性皮炎的皮肤炎的非类固醇类天然药物。

此外，现有已经对黄花蒿的黄花蒿素或包括倍半萜内酯成分的提取物或精油成分进行了研究，但是如本公开的从其除去包括黄花蒿素的倍半萜内酯成分和精油成分的提取物改善皮肤炎的效果并非公知。

发明内容

技术问题

本公开提供一种用于预防或治疗各种皮肤疾病的组合物及其制备方法，该组合物包括在过去未被报道的通过除去大部分倍半萜内酯、精油成分和植物甾醇的黄花蒿提取物作为有效成分。

技术方案

本公开的一方面提供一种分离黄花蒿提取物的方法，其包括：将黄花蒿植物体(Artemisia annua)与低极性溶剂接触并用所述低极性溶剂提取黄花蒿植物体成分的步骤；从所述接触后得到的混合物中分离并除去所述低极性溶剂来得到残余物的步骤；以及将所述残余物与亲水性溶剂接触以将所述黄花蒿植物成分从所述亲水性溶剂提取的步骤。

本公开一方面提供了用于预防或治疗皮肤疾病的组合物，该组合物包括根据所述分离黄花蒿提取物的方法所制备的黄花蒿植物体提取物。

本公开另一方面提供了一种用于预防或治疗皮肤疾病的组合物，该组合物包括选自于鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种化合物。

本公开另一方面提供了医学﹑医药外品﹑食物或化妆品组合物，该组合物包括根据所述分离黄花蒿提取物的方法所制备的黄花蒿植物体提取物或选自于鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种化合物。

本公开另一方面提供用于预防或治疗个体的皮肤疾病的方法，该方法包括将所述组合物施用于个体的步骤。

附图说明

图1是从用二氯甲烷提取黄花蒿后留下的残渣中提取黄花蒿乙醇提取物的HPLC色谱图。

图2和图3是实施例2中描述的黄花蒿高极性馏分物(AAMM-馏分1)的HPLC色谱图。

图4和图5是显示AAMM-馏分4的HPLC结果的色谱图。

图6显示用黄花蒿二氯甲烷提取物(AAM)及二氯甲烷提取后的残渣中用乙醇提取的黄花蒿乙醇提取物(AAMM)治疗大鼠的炎症部位后用¹⁸F-FDG作为示踪剂的PET-CT图像。

图7是显示用黄花蒿提取物AAM及AAMM治疗大鼠的炎症部位后组织的变化的显微镜照片。

图8是用1-氟-2,4-二硝基苯(DNFB)、地塞米松、AAMM、AAMM-馏分1、AAMM-馏分2、AAMM-馏分3及AAMM-馏分4治疗大鼠的炎症部位后组织的变化通过H&E染色显示的组织病理学显微镜照片(倍率×200)。

图9是显示用DNFB、地塞米松、AAMM、AAMM-馏分1、AAMM-馏分2、AAMM-馏分3及AAMM-馏分4治疗大鼠的炎症部位后组织变化中的胶原蛋白分布的天狼星红(Picrosirius Red)染色组织切片的显微镜照片(倍率×100)。

图10是用包括倍半萜内酯的提取物(AA)及AAMM-1+4治疗大鼠的炎症部位后组织的变化通过H&E染色及天狼星红染色显示的表皮厚度﹑炎性细胞的存在﹑棘皮和黑棘皮病(acanthosis)及胶原蛋白分布的显微镜照片(倍率×200)。

图11的(A)显示通过诱导具有化学式1至7中任一式的化合物的自体诱导细胞保护活性，图11的(B)显示包括具有化学式1至7中任一式的化合物的可选组合的组合物的自体诱导细胞保护活性的图。(RPM＝作为阳性对照组的纳巴霉素(Rapamycin)，C＝与施用到药物处理组的浓度相同的浓度下用DMSO治疗的阴性对照组)

图12是显示其中用AA-M6组合物及AA-M9组合物治疗DNFB诱导的炎症部位的H&E染色皮肤组织切片后用显微镜观察组织切片的结果。

图13显示了用甲醇提取除去用二氯甲烷提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图14显示了用乙醇提取除去用二乙醚提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图15显示了用乙醇提取除去用乙酸乙酯提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图16显示了用乙醇提取除去用丙酮提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图17显示了用乙醇提取除去用液体二氧化碳提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图18显示了用乙醇提取除去用二氯甲烷提取韩国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图19显示了用乙醇提取除去用二乙醚提取韩国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图20显示了用乙醇提取除去用乙酸乙酯提取韩国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图21显示了用乙醇提取除去用丙酮提取韩国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。

图22显示从残渣制备的乙酸乙酯提取物(AAE1)和乙醇提取物(AAEM1)对细胞中的白细胞介素1β(IL-1β)表达的影响的图。

图23显示AAE1和AAEM1对细胞中的LC3表达的影响的图。

具体实施方式

在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于说明本公开，并且本公开的范围不限于这些实施例。

实施例1：黄花蒿(Artemisia annua)提取物的制备

1.包含倍半萜和精油成分的黄花蒿提取物的制备

购买黄花蒿(中国产)的地上部干燥物并细切5kg的样品后放入作为提取容器的50L玻璃瓶中，然后加入40L二氯甲烷(dichloromethane)后在室温下摇匀搅拌48小时以进行提取，并使用具有0.34mm膜厚度的whatman纸滤纸和直径为30cm的玻璃漏斗对该混合物重复进行两次重力过滤的过程("提取-过滤"2次)，以得到过滤的提取液。将所述过滤的提取液放入减压浓缩机，并在减压下和30℃下完全蒸发溶剂来进行浓缩。结果，获得114g含有包括青蒿素的倍半萜内酯成分及精油成分作为主要成分的黄花蒿二氯甲烷提取物(于下文中称为“AAM”)(产率2.3％)

2.除去大部分黄花蒿的倍半萜及精油成分的黄花蒿乙醇提取物的制备

向残余物(残余物是在第1节中对二氯甲烷和地上部分的混合物执行过滤后残留的残余物)中加入40L乙醇后，在45℃下摇匀搅拌48小时然后浸泡并冷却至室温后，使用具有0.34mm膜厚度的whatman纸滤纸和直径为30cm的玻璃漏斗对该混合物重复进行两次重力过滤的过程("温浸-过滤"2次)。然后，将所述过滤的提取液放入减压浓缩机，并在减压下和40℃下完全蒸发溶剂来进行浓缩。结果，获得484g除去大部分包括青蒿素的倍半萜内酯成分及精油成分的黄花蒿乙醇提取物(于下文中称为“AAMM”)。(产率9.7％)

根据以下分析条件对所述AAMM提取物进行高效液相色谱法(HPLC)。结果证实，在停留时间(residence time)为14分钟后主要观察到诸如倍半萜内酯、倍半萜、精油成分的低极性成分的峰非常小或几乎没有。具体地，基于所述AAMM提取物的重量，倍半萜内酯为约0.001(w/w)％，并且挥发性精油成分为约0.01(w/w)％或更低。倍半萜内酯包括青蒿素(artemisnin)﹑青蒿酸﹑黄花蒿素及青蒿素(artemisitin)。

图1是从提取用二氯甲烷提取黄花蒿后留下的残渣中提取黄花蒿乙醇提取物的HPLC色谱图。在图1中，(A)、(B)及(C)分别表示通过在紫外线(UV)检测器检测254nm、320nm及420nm的波长而获得的色谱图。在图1中的(C)中，通过搜索并比较参考(reference)UV光谱，30分钟后主要检测到的低极性成分主要被确认为类胡罗卜素成分及叶绿素成分。

所述AAMM的HPLC分析条件如下。

使用的设备:Waters 1525 HPLC系统

柱:RP C-18 HPLC柱(4.6×150mm，5μm)

溶剂:(a)含有0.02％三氟乙酸(TFA)的乙腈

(b)含有0.02％TFA的水

流动相组成:0分钟(a)溶剂：(b)溶剂以10:90的体积比开始溶出

0至30分钟(a)溶剂倍率从10％增加到100％

30分钟至37分钟(a)溶剂以100％溶出

流动相流速:1.0mL/min

检测器检测波长:紫外线254nm；320nm；420nm

3.黄花蒿乙醇提取物的制备

购买中国种植的黄花蒿的全草干燥物，并细切200g的样品后放入提取容器，然后加入1.6L乙醇后在45℃下摇匀搅拌48小时后浸泡并冷却至室温，然后重复2次过滤的过程。然后，将过滤的提取液放入减压浓缩机，并在减压下和40℃下完全蒸发溶剂来进行浓缩。结果，得到23g黄花蒿乙醇提取物(于下文称为“AA”)(产率:11.3％)，黄花蒿乙醇提取物包括青蒿素、倍半萜内酯和精油成分以及在所述第2节制备的AAMM提取物中所含的大部分成分。

4.不同溶剂的提取物的制备

将中国种植或韩国产的黄花蒿分别用二氯甲烷(methylene chloride)、乙醚(diethyl ether)、乙酸乙酯(ethyl acetate)丙酮(acetone)或液体二氧化碳进行提取后，除去提取液并对留下的残渣以根据第2节中描述的方法用甲醇﹑乙醇或90％乙醇水溶液进行提取来制备分析样品。所有提取均按照第1节中描述的方法进行。但是，仅通过使用超临界提取方法对中国种植的黄花蒿进行液体二氧化碳预处理(超临界提取方法是本公开说明书中提到的提取方法之一)，使用如第2节所述的方法用乙醇提取除去用液体二氧化碳获得的提取液后残留的残渣，从而制备待使用的样品。

使用甲醇、乙醇或90％乙醇水溶液获得的提取物的分析结果，提取物显示出与第2节获得的AAMM提取物具有相似的成分形式。

图13显示了用甲醇提取除去用二氯甲烷提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图13中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为4.62％、1.52％、3.18％、4.71％、1.00％。

图14显示了用乙醇提取除去用乙醚提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图14中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为1.93％、0.92％、3.05％、2.75％、0.57％。

图15显示了用乙醇提取除去用乙酸乙酯提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图15中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为1.14％、0.86％、2.42％、2.80％、0.83％。

图16显示了用乙醇提取除去用丙酮提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图16中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为0.66％、0.62％、2.22％、2.64％、0.58％。

图17显示了用乙醇提取除去用液体二氧化碳提取中国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图17中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为1.77％、0.83％、2.82％、1.55％、1.12％。

图18显示了用甲醇提取除去用二氯甲烷提取韩国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图18中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为3.43％、0.73％、1.01％、2.74％、0.24％。

图19显示了用乙醇提取除去用乙醚提取韩国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图19中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为2.96％、1.14％、2.41％、2.84％、1.37％。

图20显示了用乙醇提取除去用乙酸乙酯提取韩国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图20中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为1.14％、0.42％、0.39％、1.24％、0.46％。

图21显示了用乙醇提取除去用丙酮提取韩国产的黄花蒿获得的提取液后留下的残渣的提取物的HPLC的结果。在图21中，相对于提取物的总质量，基于图的峰面积计算的化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6的含量或比例按重量计分别为1.20％、0.25％、0.93％、1.58％、1.46％。

根据图13至图21，化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6相对于提取物重量的含量或比例分别为0.66％至4.62％、0.25％至1.53％、0.39％至3.18％、1.24％至4.71％、0.24％至1.46％。

所述提取物含有为本公开的主要有效成分的并由化学式2、化学式3、化学式4、化学式5及化学式6表示的所有五种化合物。本公开的由化学式2至化学式5表示的四种化合物通过以下分析方法1进行分析(图13至图21中的(A))，本公开的由化学式6表示的化合物通过以下分析方法2进行分析(图13至图21中的(B))。使用其他溶剂通过提取获得的提取物包括与用二氯甲烷进行提取后从残渣中获得的乙醇提取物相似的成分。此外，所述提取物具有类似于以下试验例中描述的AAMM提取物及其馏分物的改善炎症皮肤的效果。

分析方法1

分析仪器:HPLC(Young Lin,YL9100系列)

检测器:ELSD(温度:50℃,气体:2.5ln)(GmbH,ZAM 3000)

分析条件:1mL/min,87％A(MeCN)；13％B(D.W),等度50分钟

柱:YMC NH₂(5μm,150×4.6mm)

柱温度:30℃

注入量:10μL

分析方法2

分析仪器:HPLC(Waters)

检测器:2996PDA检测器(254nm)(waters)

分析条件:1mL/min,A(含0.02％TFA的MeCN)；B(含0.02％TFA的D.W),0分钟:10％A->30分钟:100％A

柱:Phenomenex Luna C18(2)(5μm,150×4.6mm)

柱温度:室温

注入量:10μL

因此，作为低极性溶剂的二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、液体二氧化碳或类似其结构的溶剂可以用作本公开的活性溶剂。

实施例2:从AAMM提取物制备馏分物

使用乙醇、水或乙醇和水的混合溶剂对在据实施例1的第2节描述的16g的AAMM提取物进行分馏，以制备AAMM提取物的馏分物。具体地，包括以体积比为2:8、4:6、6:4及10:0混合的乙醇和水的混合物或1L乙醇用作分馏溶剂。

即，将所述AAMM提取物与作为所述分馏溶剂的乙醇和水的混合物接触后，展开用作固定相的100g十八烷基-二氧化硅(ODS)树脂并进行用各溶剂溶出的色谱法，获得4种馏分物[称为'AAMM-馏分1'(作为分馏溶剂的乙醇:水-2:8，9.6g)、'AAMM-馏分2'(乙醇:水-4:6,2.4g)、'AAMM-馏分3'(作为分馏溶剂的乙醇:水-6:4，1.3g)及'AAMM-馏分4'(乙醇:水-10:0，1.5g)。

在通过试验例2的方法分别测量每个馏分物的效能后，效能比较优异的所述馏分1和馏分4根据各自的产率以9:1混合，来制备'AAMM-馏分1+4'样品。

图2和图3是显示AAMM-馏分1的HPLC结果的色谱图。图2和图3中的HPLC条件分别与下述条件1和2相同。在图2和图3中，(A)及(B)分别使用了UV检测器(254nm)和ELSD检测器。

如图2中的(B)所示，在根据条件1的HPLC结果中，由化学式1至化学式5表示的成分被检测为主峰。另外，如图3所示，在根据条件2的HPLC结果中，由化学式6表示的绿原酸(Chlorogenic acid)被检测为主峰。

条件1:

使用的设备:Young Lin 9100 HPLC

柱:NH₂HPLC柱(4.6×250mm,5μm)

流动相组成:乙腈:水体积比80:20(20分钟)

流动相流速:1.0ml/min

检测器:紫外线254nm(图2中的(A))；ELSD(图2中的(B))

条件2:

使用的设备:Young Lin 9100 HPLC

柱:RP C-18 HPLC柱(4.6×150mm,5μm)

溶剂:(a)含有0.02％TFA的乙腈

(b)含有0.02％TFA的水

流动相组成:0分钟(a)溶剂：(b)溶剂以10:90的体积比开始溶出

0至30分钟(a)溶剂倍率从10％增加到100％

30分钟至37分钟(a)溶剂以100％溶出

流动相流速:1.0ml/min

检测器:紫外线254nm(图3中的(A))；ELSD(图3中的(B))

图4和图5是显示AAMM-馏分4的HPLC结果的色谱图。图4和图5中的HPLC条件分别与下述条件3和4相同。在图4和图5中，(A)及(B)分别使用了UV检测器(420nm)和ELSD检测器。

如图4中的(A)所示，在UV检测器(检测波长420nm)下，预测为类胡罗卜素或叶绿素的成分被检测为主峰。如图5中的(B)所示，在ELSD检测器下，使用由化学式7表示的α-亚麻酸(α-linolenic acid)作为主要不饱和脂肪酸成分，并检测到类似的脂肪酸成分为主峰。

条件3:

检测器:除了使用紫外线420nm(图4中的(A))；ELSD(图4中的(B))之外，与条件2相同。

条件4:

使用的设备:Young Lin 9100 HPLC

柱:RP C-18 HPLC柱(4.6×150mm,5μm)

溶剂:(a)含有0.02％TFA的甲醇

(b)含有0.02％TFA的水

流动相组成:0分钟至10分钟(a)溶剂:(b)溶剂以80:20的体积比开始溶出

将溶剂的比例增加，使变为100％(a)溶剂

10溶剂至30分钟(a)溶剂以100％溶出

流动相流速:1.0ml/min

检测器:紫外线420nm(图5中的(A))；ELSD(图5中的(B))

实施例3:主要成分化合物的分离与种属鉴定

1.包含在AAMM-馏分1中的成分的分离与种属鉴定

将实施例2的AAMM-馏分1在减压下进行浓缩后，通过如以下分离方法1的HPLC分离方法将其分离为小馏分物。

结果，分离出鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇及甜菜碱。从以干重计为100mg的AAMM-馏分1获得3mg鸟氨酸、29mg松醇、4mg粘质纤维醇、7mg手性肌醇及3mg甜菜碱。此外，以AAMM-馏分1的干重计，分离出产率为约15％的果糖(fructose)。

分离方法1

使用的设备:Waters 515pump

柱:YMC NH₂HPLC柱(10×250mm,10μm)

溶剂:(a)乙腈

(b)水

流动相组成:0分钟a)溶剂：(b)溶剂以80:20的体积比开始溶出

由6分钟至60分钟以相同体积比来溶出

流动相流速:4.0ml/min

检测器:RI

此外，通过如以下分离方法2的HPLC分离方法将AAMM-馏分1分离成小馏分物。

结果，分离出根据本公开的绿原酸。从100mg AAMM-馏分1获得7mg绿原酸。

分离方法2

使用的设备:YMC LC-Forte R

柱:Phenomenex Luna C-18 RP HPLC柱(21.2×250mm,10μm)

溶剂:(a)含有0.02％TFA的乙腈

(b)含有0.02％TFA的水

流动相组成:0分钟a)溶剂：(b)溶剂以10:90的体积比开始溶出

0至40分钟(a)溶剂倍率从10％增加到40％

流动相流速:20.0ml/min

检测器:紫外线254nm；ELSD

对所述分离的化合物进行NMR分析和质量分析以获得数据，通过将数据与现有文献作出比较证实了该结构。

具体而言，鸟氨酸(ornithine)的分子量通过使用Agilent 1100高效液相色谱-质量光谱仪(HPLC-ESI-MS)的MS测量确定为132，并通过使用核磁共振波谱仪(Varian 500MHzNMR)的¹H及¹³C-NMR光谱(spectrum)分析推定为以以下化学式1表示该结构的鸟氨酸。此外，将NMR数据与现有文献(J.C.MacDonald等人.Can.J.Chem.1976,54,1126-1133)的数据进行比较来种属鉴定该结构。

化学式1

白色粉末；分子式C₅H₁₂N₂O₂；ESI-MS:m/z 132[M-H]^-；

¹H NMR(500MHz,D₂O):δ3.94(1H,dd,J＝9.0,6.5Hz),3.23(1H,dt,J＝11.5,7.0Hz),3.14(1H,dt,J＝11.5,7.0Hz),2.16(1H,m),1.89(1H,m),1.82(2H,m)¹³C NMR(125MHz,D₂O):δ174.6,61.1,45.9,28.8,23.6.

松醇(pinitol)的分子量通过使用Agilent 1100高效液相色谱-质量光谱仪(HPLC-ESI-MS)的MS测量确定为194，并通过使用核磁共振波谱仪(Varian 500MHz NMR)的¹H及¹³C-NMR光谱分析推定为以以下化学式2表示该结构的松醇。此外，将NMR数据与现有文献(M.Della greca等人.Chem.Biodivers.2007,4,118-128；C.Sridhar等人.Ind.J.Pharm.Sci.2006,68,111-114)的数据进行比较来对该结构进行种属鉴定。以下化学式2的立体结构示出相对立体化学(Relative stereochemistry)结构。

化学式2

白色粉末；分子式C₇H₁₄O₆；ESI-MS:m/z 193[M-H]^-；

¹H NMR(500MHz,D₂O^*):δ3.28(1H,t,J＝9.5Hz),3.54(3H,s),3.59(1H,t,J＝9.5Hz),3.70(1H,dd,J＝9.5,3.0Hz),3.75(1H,dd,J＝9.5,3.0Hz),3.95(1H,m),3.94(1H,m),^*D₂Oδ4.79；¹³C NMR(125MHz,D₂O):δ82.6,72.0,71.5,71.3,70.3,69.7,59.6.

粘质纤维醇(Muco-inositol)的分子量通过使用Agilent 1100高效液相色谱-质量光谱仪(HPLC-ESI-MS)的MS测量确定为180，并通过使用核磁共振波谱仪(Varian 500MHzNMR)的¹H及¹³C-NMR光谱分析推定为以以下化学式3表示对称结构的纤维醇衍生物。此外，本公开的粘质纤维醇的NMR数据与现有文献的NMR相似(S.J.An gyal及L.Odier,Carbohydrate Res.1982,100,43-54)，并确定了该结构。化学式3的立体结构示出相对立体化学结构。

化学式3

白色粉末；分子式C₆H₁₂O₆；ESI-MS:m/z 179[M-H]^-；

¹H NMR(500MHz,D₂O^*):δ3.95(2H,br t,J＝6.0Hz),3.82(4H,br d,J＝6.0Hz),^*D₂Oδ4.79；¹³C NMR(125MHz,D₂O):δ72.1,70.0.

手性肌醇(chiro-inositol)的分子量通过使用Agilent 1100高效液相色谱-质量光谱仪(HPLC-ESI-MS)的MS测量确定为180，并通过使用核磁共振波谱仪(Varian 500MHzNMR)的¹H及¹³C-NMR光谱分析推定为以以下化学式4表示该结构的手性肌醇。此外，本公开的手性肌醇的NMR数据与现有文献的NMR相似(R.Abraham等人.Ma gn.Reson.Chem.2005,43,611-624)，并确定了该结构。化学式4的立体结构示出相对立体化学结构。

化学式4

白色粉末；分子式C₆H₁₂O₆；ESI-MS:m/z 179[M-H]^-；

¹H NMR(500MHz,D₂O^*):δ3.96(1H,br t,J＝2.5Hz),3.96(1H,br t,J＝2.5Hz),3.69(1H,br t,J＝2.5Hz),3.68(1H,br t,J＝2.5Hz),3.53(1H,t,J＝6.5Hz),3.51(1H,t,J＝6.5Hz).^*D₂Oδ4.79；¹³C NMR(125MHz,D₂O):δ72.6,71.5,70.3.

甜菜碱(betaine)通过使用核磁共振波谱仪(Varian 500MHz NMR)的¹H及¹³C-NMR光谱分析推定为以以下化学式5表示该结构的甜菜碱。此外，将NMR数据与现有文献(W.Gronwald等人.Anal.Chem.2008,80,9288-9297；D.godzisz等人.J.Mol.Struct.2002,606,123-137)的数据进行比较来对该结构进行种属鉴定。

化学式5

白色粉末；¹H NMR(500MHz,D₂O^*):δ3.85(2H,s),3.21(6H,s)^*D₂Oδ4.79；¹³C NMR(125MHz,D₂O):δ169.1,[65.97,95.94,95.92],[53.13,53.16,53.19].

绿原酸的分子量通过使用Agilent 1100高效液相色谱-质量光谱仪(HPLC-ESI-MS)的MS测量确定为355，并通过使用核磁共振波谱仪(Varian 500MHz NMR)的¹H-NMR光谱分析推定为以化学式6表示该结构的绿原酸。此外，将NMR数据与现有文献(T.Han等人.Chem.Nat.Comp.2006,42,597-570)的数据进行比较来对该结构进行种属鉴定。

化学式6

白色粉末；分子式C₁₆H₁₈O₉；ESI-MS:m/z 355[M+H]⁺；

¹H NMR(500MHz,CD₃OD):δ7.56(1H,d,J＝16.0Hz),7.05(1H,d,J＝1.5Hz),6.95(1H,dd,J＝8.0,1.5Hz),6.78(1H,d,J＝8.0Hz),6.27(1H,d,J＝16.0Hz),5.33(1H,br td,J＝9.5,3.0Hz),4.17(1H,br m),3.73(1H,br dd,J＝9.5,2.5Hz),2.18(2H,br m),2.04(2H,br m).

2.AAMM-馏分4的主要成分的分离与种属鉴定

将实施例2的AAMM-馏分4在减压下进行浓缩后，通过如以下分离方法的HPLC分离方法将其分离成小馏分物。

结果，分离出根据本公开的α-亚麻酸。从100mgAAMM-馏分4获得25mgα-亚麻酸。在分离α-亚麻酸的过程中，以馏分4的干重计，进一步分离出产率分别为10％的亚油酸(linoleic acid)及棕榈酸(palmitic acid)。

分离方法

使用的设备:YMC LC-Forte R

柱:Phenomenex Luna C-18 RP HPLC柱(21.2×250mm,10μm)

溶剂:(a)含有0.02％TFA的甲醇

(b)含有0.02％TFA的水

流动相组成:0分钟a)溶剂：(b)溶剂以90:10的体积比开始溶出

0分钟至10分钟将(a)溶剂的倍率从90％增加到100％

由10分钟至40分钟以相同体积比来溶出

流动相流速:20.0ml/min

检测器:紫外线210nm；ELSD

对分离的化合物进行GS-MS分析和NMR分析以获得数据，通过将数据与现有数据作出比较证实了该结构。

具体而言，α-亚麻酸的分子量通过使用GS-MS(气相色谱-质量分析仪)的MS测量确定为278，并通过使用核磁共振波谱仪(Varian 500MHz NMR)的¹H-NMR光谱分析推定为以化学式7表示该结构的α-亚麻酸。

化学式7

α-亚麻酸

无色油；分子式C₁₈H₃₀O₂；ESI-MS:m/z 301[M+Na]⁺；

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ0.97(3H,t,J＝7.0Hz),1.30-1.38(8H,br m),1.62(2H,m),2.06(4H,m),2.35(2H,t,J＝7.5Hz),2.81(4H,br m),5.31-5.42(6H,m).

实施例4:由化学式1至化学式7的化合物组成的混合物的制备

为了阐明实施例1中制备的黄花蒿提取物及实施例2中制备的黄花蒿馏分物的有效成分，将实施例3中分离的一些或所有单一化合物再次以与母馏分物的产率相似的组成混合。

具体而言，制备由选自在实施例3的第1节中分离的并由化学式1至6表示的六种化合物中的四种或更多种化合物组成的混合物，或者在实施例3的第2节分离的α-亚麻酸、亚油酸及棕榈酸以同量混合的组合物。此外，通过将α-亚麻酸或类似其的不饱和脂肪酸或植物饱和脂肪酸中的一种或更多种的化合物加入到由选自由化学式1至6表示的六种化合物中的四种或更多种化合物组成的混合物中来制备混合物。制备的混合物的组成和比例示于下表1中。

表1示出了由从AAMM-馏分1及AAMM-馏分4分离的化合物组合的混合物的构成成分及组成比。

【表1】

试验例1:由实施例1制备的两种提取物AAM和AAMM的皮肤炎缓和效果

本发明人为了在实施例1中获得的黄花蒿二氯甲烷提取物(AAM)及提取二氯甲烷后残余物的乙醇提取物(AAMM)的皮肤炎缓和效果，购买了NC/Nga特应性皮炎小鼠模型(每只体重30g的6周龄雄性，中央试验动物)并将其安置在气流式无菌试验台，并以自我喂养标准固体饲料饲养一周。将所有试验药物溶解在少量DMSO中并用橄榄油稀释至最终浓度为0.2％来使用。去掉背部的毛后，在第1天，涂抹0.15％的1-氟-2,4-二硝基氟苯(DNFB)，然后在第5天涂抹0.15％的DNFB，在第9天涂抹0.2％的DNFB，使DNFB引起皮肤瘙痒和特应性炎症后，用试验药物对其进行治疗。具体而言，在第11天、第13天、第15天及第17天(即总共4次)，分别涂抹2％DNFB和试验药物。此后，使用¹⁸F-氟脱氧葡萄糖(FDG)作为示踪剂，以PET-CT图像和组织染色显微镜照片比较DNFB炎症诱发组和AAM提取物治疗组及AAMM提取物治疗组的状态。

为了获得PET-CT图像，除了水外，所有小鼠禁食12小时。通过小鼠的尾静脉施用37MBq(1.0mCi)的¹⁸F-FDG，并在60分钟后，用小动物PET扫描仪(small animal PETscanner)进行发射扫描(emission scan)22分钟。

图6显示用黄花蒿二氯甲烷提取物(AAM)及二氯甲烷提取后的残渣中用乙醇提取的黄花蒿乙醇提取物(AAMM)治疗大鼠的炎症部位后用¹⁸F-FDG作为示踪剂的PET-CT图像。在图6中，(A)和(B)分别表示横轴平面(transaxial plane)图像和冠状平面(coronal plane)图像。

图7是显示用黄花蒿提取物AAM及AAMM治疗大鼠的炎症部位后组织的变化的显微镜照片。在图7中，(A)、(B)和(C)分别是通过苏木素和伊红(H&E)染色的组织病理学(histopathology)显微镜照片(倍率×200)和使用兔单克隆原代角蛋白10多克隆抗体的免疫组织化学显微镜照片(倍率×200)，以及使用兔单克隆原代物质(substance)P的免疫组织化学显微镜照片(倍率×200)。

PET-CT图像条件：

视野(FOV)38mm

能量窗350至650keV

算法/重建OSEM 2D/反复(2次)，子集:8

矩阵尺度(mm)128×128

扫描时间(分钟)22分钟

P.I时间(分钟)60分钟

RI/活动(uCi)¹⁸F/1mCi

焦点大小50μm

X射线探测器像素2,048x 3,072

80kV,500μA,3600的200投影旋转，锥束滤波器

PET-CT扫描后，取出小鼠的皮肤细胞并用4％多聚甲醛(pH 7.4)固定细胞，将组织样品细切成5μm的厚度并用苏木素和伊红(H&E)染色后以光学显微镜观察组织。

此外，为了通过免疫组织化学法(immunohistochemistry)进行组织变化的观察，将10μm厚的组织切片在磷酸缓冲盐溶液(PBS)内在3％胎牛血清(fetal bovine serum)中培养1小时。于切片加入兔单克隆原代角蛋白10多克隆抗体(1:100稀释，Covance，美国)或兔单克隆原代物质P抗体(1:100稀释，Abcam，美国)后培养过夜。将每个样品在PBS中洗涤3次并与Vectastain ABC试剂一起培养，然后与3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)(Vector实验室,美国)进行反应。

表2示出了药物治疗部位的放射性同位素¹⁸F-FDG摄取密度(UD)。

【表2】

药物治疗组	0.2％DNFB	AAM(0.2％)	AAMM(0.2％)
				UD	9.71	2.40	0.17

如表2及图6和图7所示，可以确认用二氯甲烷进行提取并去除青蒿素及黄花蒿素B等的倍半萜内酯成分的黄花蒿乙醇提取物(AAMM)具有显着缓和DNFB诱导的特应性炎症和瘙痒的效能。

如图6所示，炎症诱发组(0.2％DNFB)及AAM治疗组(0.2％)因炎症部位的¹⁸F-FDG的细胞内积累而引致PET-CT图像中被标记为红色(明亮的部分的周边部分)。相反，在AAMM治疗组的情况下，在药物施用部位没有细胞炎症反应，并且没有观察到由于¹⁸F-FDG的细胞内积累引起的红色，而且仅观察到蓝色(所述红色部分之外的部分)。¹⁸F-FDG PET由于与正常细胞相比葡萄糖代谢亢进，使炎症组织细胞或恶性肿瘤细胞成像，并在恶性肿瘤和炎症的鉴别诊断，改善的确认和对治疗的反应的评价中被广泛使用。在这些炎症或恶性肿瘤组织中的FDG细胞内积累增加通过类似于葡萄糖的葡萄糖转运蛋白质(glucose transporterprotein)移动至细胞并且通过细胞中的己糖激酶磷酸化，但是与葡萄糖不同并作为磷酸化的FDG的FDG-6-磷酸盐因不再代谢而产生。此外，FDG-6磷酸盐是一种非常强的极性物质，无法向细胞外扩散，导致显示高FDG积累量。

如图7中的(A)所示，对引起炎症的组织的切片用H&E染色后，在组织切片的显微镜观察结果中，炎症诱发组(0.2％DNFB)及AAM治疗组(0.2％)中观察到在表皮上很多深蓝色(较深色)的细长模样的棘细胞层或圆形炎症细胞。相反，在AAMM治疗组(0.2％)中，观察到相对清洁的表皮组织。

图7中的(B)是选择性地对引起炎症的组织中的角质的角蛋白染色的照片，在炎症诱发组(0.2％DNFB)及AAM治疗组(0.2％)中，在表皮表面上可以观察到许多染成深棕色(较深色)层的角蛋白。但是，在AAMM治疗组(0.2％)中，在正常皮肤组织模样的表皮上仅观察到非常薄的角蛋白层。

图7中的(C)是选择性地对已知为在引起炎症的组织中诱发炎性反应及瘙痒的物质P染色的照片，在炎症诱发组(0.2％DNFB)及AAM治疗组(0.2％)中，在表皮表面上可以观察到很多染色成深棕色层(较深色)的物质P，相反，在AAMM治疗组(0.2％)中，已经证实在正常皮肤组织模样几乎没有物质P或很少。

试验例2:来自实施例2的馏分物的皮肤炎缓和效果

为了比较并了解在实施例1中获得的用二氯甲烷提取后残余物的乙醇提取物(AAMM)及实施例1中从AAMM制备的4种馏分物AAMM-馏分1、AAMM-馏分2、AAMM-馏分3和AAMM-馏分4的皮肤炎缓和效果与作为类固醇类消炎剂的地塞米松的效能，购买了NC/Nga特应性皮炎小鼠模型(每只体重30g的6周龄雄性，中央试验动物)并将其安置在气流式无菌试验台，并以标准自我喂养饲养一周。炎症诱发和药物处理以与试验例1中相同的方式进行。将试验药物溶解在少量DMSO中并用橄榄油稀释至终浓度为0.2％来使用。将试验动物模型分类为单独涂抹橄榄油代替药物的对照组、通过0.2％DNFB处理的皮肤炎诱发阴性对照组(DNFB)、应用0.2％地塞米松于炎症诱发部位的阳性对照组(地塞米松)、应用0.2％AAMM的比较组(AAMM)及所述四种馏分物分别以0.2％用量应用于炎症诱发部位的药物治疗组。在第11天、第13天、第15天和第17天(即总共4次)分别涂抹2％DNFB和比较药物及试验药物。然后，以与实施例1相同的方式取出小鼠的皮肤细胞并用4％多聚甲醛(pH 7.4)固定细胞，将组织样品细切(section)成5μm的厚度并使用苏木素和伊红(H&E)染色后，以光学显微镜观察组织。

此外，胶原蛋白的表达和分布可以通过苦味酸-天狼星红(Picrosirius-Red)以显微镜观察到在炎症诱发及药物治疗部位的组织切片中染色成红色的胶原蛋白。为了了解每个试验组的炎症程度和改善情况，通过照片比较了DNFB炎症诱发组与对照组、DNFB治疗组、地塞米松治疗组、AAMM治疗组及馏分物治疗组的状态。

图8是用DNFB、地塞米松、AAMM、AAMM-馏分1、AAMM-馏分2、AAMM-馏分3及AAMM-馏分4治疗大鼠的炎症部位后组织的变化通过H&E染色显示的组织病理学显微镜照片(倍率×200)。

如图8所示，在将引起发炎的组织的切片H&E进行染色后以显微镜观察组织切片的结果中，与正常组织(对照)相比，在炎症诱发组(0.2％DNFB)中，表皮表面上观察到许多染成红色的厚角蛋白层(较深色的层)和细长形态的棘细胞症(Acnathosis)以及许多在表皮层中形态倒塌并染色成深蓝色的炎症反应细胞(染色的角蛋白层下面延续许多小点(dots)及大圆形态的团。相反，在地塞米松和AAMM治疗组中，观察到在表皮表面上的角蛋白薄薄地分布以及少数的棘细胞症及炎症细胞，并且炎症症状大大好转。在AAMM-馏分1或AAMM-馏分4治疗组中，在表皮表面上观察到深蓝色的拉长模样的棘细胞症，虽然相比地塞米松和AAMM治疗组的效能弱，但角蛋白相对较薄地分布并且几乎没有炎症细胞等，相比起AAMM-馏分2或AAMM-馏分3显示出相对优秀的效能。一方面，在AAMM-馏分2治疗组中观察到很多炎症反应，在AAMM-馏分3治疗组中角蛋白分布相对较薄以及很少的棘细胞症，并且炎症反应小，但是，观察到胶原蛋白层破裂显著，并且稍微弱的效能。

图9是用DNFB、地塞米松、AAMM、AAMM-馏分1、AAMM-馏分2、AAMM-馏分3及AAMM-馏分4治疗大鼠的炎症部位后组织变化中的胶原蛋白分布的天狼星红(Picrosirius Red)染色组织切片的显微镜照片(倍率×100)。

如图9所示，在炎症诱发组(0.2％DNFB)中观察到胶原蛋白的分布倒塌的状态，并且在地塞米松(0.2％)和AAMM(0.2％)治疗组中可以确认到致密的胶原蛋白分布。另外，AAMM-馏分1或AAMM-馏分4治疗组中也观察到致密的胶原蛋白分布，相反，在AAMM-馏分2治疗组或AAMM-馏分3治疗组中观察到在表皮层中略微不致密的胶原蛋白分布或不规则空间的分布，可以确认胶原蛋白的规则分布有些倒塌。

表3比较了通过组织染色法测量的实施例1的黄花蒿乙醇提取物与实施例2的馏分物的每个项目的生理活性，并示出将通过所述显微镜观察的组织指数化并比较每个项目的效能强度。

【表3】

项目	对照组	DNFB	DM	AAMM	馏分1	馏分2	馏分3	馏分4
									角化过度(Hyperkeratosis)	0	3	1	1	1	2	1	1
棘细胞症(Acanthosis)	0	3	1	0	2	3	1	1
									炎症细胞的数量	0	3	0	0	0	3	1	1
胶原蛋白	0	3	0	0	0	3	2	0

分数:无＝0，轻度＝1，中等＝2，严重＝3

Hyperkeratosis:角质增殖，Acanthosis:棘细胞症

炎症细胞的数量:炎症细胞数量，胶原蛋白:胶原蛋白破坏

对照:DNFB未治疗非炎症组

DNFB:0.2％1-氟-2,4-二硝基氟苯，炎症诱发药物

DM:0.2％地塞米松，阳性对照组

AAMM:在实施例1制备的对提取二氯甲烷后的残余物的乙醇提取物(0.2％)

馏分1:在实施例2制备的20％乙醇分馏溶剂的高极性馏分物(0.2％),AAMM-馏分1，

馏分2:在实施例2制备的40％乙醇分馏溶剂的中等极性馏分物(0.2％)，AAMM-馏分2，

馏分3:在实施例2制备的60％乙醇分馏溶剂的中等极性馏分物(0.2％),AAMM-馏分3，

馏分4:在实施例2制备的100％乙醇分馏溶剂的低极性馏分物(0.2％),AAMM-馏分4.

通过以上结果，AAMM在与作为类固醇类皮肤炎治疗剂的地塞米松同一用量下显示出与地塞米松相同水平的炎症治疗效能，由AAMM提取物制备的AAMM-馏分1及AAMM-馏分4在与地塞米松同一用量下，虽然比地塞米松或AAMM稍弱，但显示出显著的皮肤炎治疗效能。

试验例3:由实施例1制备的AA提取物及由实施例2制备的AAMM-馏分1+4馏分的皮肤炎缓和效果

为了确认在试验例2中AAMM-馏分1及AAMM-馏分4分别的效能稍微弱于作为母提取物的AAMM的效能的理由，根据从AAMM提取物获得的产率将AAMM-馏分1及AAMM-馏分4以重量比9:1混合来制备AAMM-馏分1+4以与地塞米松和AAMM的效能进行比较。此外，为了再次验证制备AAMM提取物的重要性，将可以包括在实施例1的第3节制备的AAMM提取物和AAM提取物的大部分成分的AA提取物的效能与AAMM提取物的效能进行比较。所有药物的浓度均为0.2％，以与上述试验例1相同的方法进行动物模型确保和药物治疗。在对动物模型治疗确保药物两周后，使用¹⁸F-FDG作为示踪剂，并计算使用光谱动物成像系统(Spectrumanimal imaging system)的摄取(uptake)感兴趣区(region of interest，ROI)值，来比较每种样品的效能(表4)。为了获得PET-CT图像，除了水外，所有小鼠禁食12小时。通过小鼠的尾静脉施用37MBq(1.0mCi)的¹⁸F-FDG，并在60分钟后，进行图像扫描30分钟。

表4示出根据使用光谱动物成像系统的摄取感兴趣区值的实施例3的黄花蒿乙醇提取物(AA)、实施例2的馏分1及馏分4的混合物(馏分1+4，混合比率9:1)，以及相关试验样品的皮肤炎缓和效能的比较(所有药物浓度均为0.2％)。(单位:ROI值，×10⁵)

【表4】

对照组:DNFB未治疗非炎症组

DNFB:0.2％1-氟-2,4-二硝基氟苯,炎症诱发药物

DM:0.2％地塞米松,阳性对照组

AA:在实施例3制备的黄花蒿的干燥物直接以乙醇提取的乙醇提取物(0.2％)

馏分1+4:将在实施例2制备的20％乙醇分馏溶剂的高极性馏分物(AAMM-馏分1)及低极性馏分物(AAMM-馏分4)以9:1的比率混合的样品(0.2％)

如表4所示，显示在炎症诱发区域中的FDG的细胞内积累水平的ROI值在地塞米松治疗组和AAMM治疗组中比DNFB炎症诱发组显着降低。相反，AA提取物被确认具有弱效能，并可以再次确认本公开的AAMM提取物的制备方法在应用于改善诸如黄花蒿的皮肤炎症的皮肤疾病的效能方面非常重要。此外，AAMM馏分1+4的效能示出AAMM提取物的效能水平并与AAMM馏分1及AAMM馏分4混合来使用时，确认了显示母提取物的优秀效能的事实。因此，根据本公开的用于预防、改善或治疗皮肤疾病的组合物不是作为显示一种作用机制的为单一化合物或单一馏分物，而是各自不同的作用机制的物质复合地作用，以被判断为显示出与地塞米松相当的优异效能。

此外，为了验证ROI值的可信性，以与实施例1相同的方法获取对应于对照组、DNFB炎症诱发组、AA提取物治疗组及AAMM-馏分1+4治疗组的小鼠皮肤细胞并用4％多聚甲醛(pH7.4)固定细胞，将组织样品细切成5μm的厚度并用苏木素和伊红(H&E)染色后，以光学显微镜观察组织(图10的上部)。另外，胶原蛋白的表达和分布可以通过苦味酸-天狼星红(Picrosirius-Red)以显微镜观察到在炎症诱发及药物治疗部位的组织切片中染色成红色的胶原蛋白(图10的下部)。

如图10上方的图所示，在对引发炎症的组织的切片染色后以显微镜的结果中，相比正常组织(对照)，在炎症诱发组(0.2％DNFB)和AA提取物治疗组中，表皮表面上观察到相对较厚的角蛋白层(表皮最外围的颜色较深)及在表皮层中观察到棘细胞症和炎症细胞。相反，在AAMM-馏分1+4治疗组中，观察到表皮表面上的角蛋白分布很薄，并几乎没有示出棘细胞症，以及很少数的炎症细胞。

如图10下方的图所示，在对引发炎症的组织中的胶原蛋白染色成红色并示出胶原蛋白分布的结果中，在炎症诱发组(0.2％DNFB)及AA提取物治疗组中，观察到在表面层对下的胶原蛋白分布倒塌的状态，或者表皮层中的胶原蛋白的致密度下降得很多的状态，在AAMM-馏分1+4治疗组中，在表皮层中观察到致密的胶原分布。

试验例4：由实施例4制备的本公开的单一化合物的混合物的体外自噬诱导活性

为了再次确认在试验例2中的馏分1及馏分4的效能稍微弱于作为母提取物AAMM的效能的理由，并且与单独使用本公开的单一化合物相比，来验证以复合组合物形式使用的有效性，将实施例3中公开的单一化合物对作为人皮肤角质形成细胞株的HaCaT细胞的生物活性与实施例4中公开的实施例3的单一化合物的每个组合物的混合物的体外自噬诱导活性进行比较。

HaCaT细胞在添加了10％胎牛血清(FBS)及0.1％抗生素(青霉素、链霉素)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，Hyclone，Utah，美国)中培养来用于试验。将细胞应用在37℃及5％二氧化碳下的湿润培养基中培养。

为了在测量自噬诱导活性之前测量样品在试验中使用的细胞中是否有毒，进行了使用MTT分析的细胞毒性测量。将HaCaT细胞在96孔板中调节至4×10⁴细胞/mL的浓度来分株并培养24小时，以试行附着性及稳定性。完成24小时的培养后，在培养液中将每种化合物或混合物的最终浓度稀释至10μg/mL、50μg/mL及100μg/mL，并供应粘附和稳定的细胞株来培养24小时。培养24小时后，去除培养基加入100μL的MTT溶液(PBS中0.5mg/mL)并再次在37℃和5％二氧化碳下的湿润培养箱中进行反应30分钟直至使MTT还原。在每个孔中形成的甲臜(formazan)结晶溶解在200μL的DMSO中，并使用酶标仪(Bio-Rad,美国)测量570nm处的吸光度，来测量药物未治疗组(阴性对照)对比的细胞存活率(Cell Viablity)。

在测量对于HaCaT细胞株的试验样品的MTT细胞毒性的结果中，试验中使用的浓度中的所有单一化合物和混合物显示80％或以上的细胞存活率，并且确认所有试验样品都没有显着的细胞毒性。

为了测量自噬诱导活性，将HaCaT细胞分株在60mm培养皿上，并在附着后进行培养。24小时的培养后，将作为比较药物的纳巴霉素在培养液中稀释至最终浓度为250nM，并将每种化合物或混合物的最终浓度在培养液中稀释至1μg/mL或10μg/mL，以及供应附着并稳定的细胞株来培养12小时。此后，回收培养的细胞并加入RIPA溶解缓冲液后使溶解，在12,000rpm离心30分钟后分离蛋白质。通过马斯亮兰法(Bradford)(Bio-RadLaboratories,CA,美国)对分离的蛋白质进行定量，并将定量的蛋白质用SDS-PA GE在12％丙烯酰胺凝胶电泳并转移到硝化纤维膜上。硝化纤维膜与第一抗体抗-LC33在4℃下进行反应一天后，用TBS-T在10分钟期间洗涤3次后，使所述膜与第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)进行反应一小时。在与抗体表达后用TBS-T溶液洗涤细胞后，与增强化学发光(ECL)免疫印迹试剂((GE Healthcare,查尔芬特-圣贾尔斯英国)进行反应并用Chemidoc系统(Bio-Rad,美国)确认，并作为自体吞噬测量标志物的LC3B表达程度与LC3A和LC3B的比例进行比较及分析。

如图11所示，本公开的单一化合物用作对照组的自体吞噬药物分别表现出在等于或低于纳巴霉素(Rapamycin)(浓度为250nM)的水平处LC3B表达增加(LC3B作为自体吞噬活性指标)，相反，包括α-亚麻酸的不饱和脂肪酸及作为饱和脂肪酸十六烷基磷酸的混合物的AA-M4组合物(1μg/ml、10μg/ml浓度)、作为绿原酸和不饱和脂肪酸的混合物的AA-M5组合物(1μg/ml浓度)、作为'鸟氨酸'-'松醇'-'手性肌醇'-'甜菜碱'的混合物的AA-M6组合物(1μg/ml浓度)、混合所述七种单一化合物的AA-M9组合物和AA-M10组合物(1μg/ml,10μg/ml浓度)表现出纳巴霉素活性的1.5倍或更多的显着自体吞噬皮肤细胞保护作用。所述生物活性样品中AA-M9和AA-M10组合物表现出相对优异的LC3B表达，考虑到LC3B的表达与LC3A的表达比较，可以确认AA-M9组合物(1μg/ml浓度)及AA-M10(1μg/ml及10μg/ml浓度)组合物诱导最多自噬体(autophagosome)的形成。

试验例5:由实施例4制备的本公开的的单一化合物的混合物的皮肤炎缓和效果

为了验证在试验例4中表现出相对优异的体外自噬诱导活性的组合物改善体内皮肤炎的效能，以0.3％浓度的DMSO测量了试验例4中的生物活性样品中的AA-M6组合物及AA-M9组合物在由DNFB诱导皮肤炎的小鼠模型中的效能。使用所述试验例4中的混合物中显示相对弱程度的生物活性的AA-M7组合物(DMSO中0.3％浓度)作为比较组及地塞米松(DMSO中0.15％浓度)作为阳性对照。另外，未经任何溶剂或药物治疗的对照组(Control)及仅用DNFB和DMSO溶剂治疗的对照组(Solvent Control)的效能也被测量来与试验组比较并确认。

为了测量样品的效能，购买了NC/Nga特应性皮炎小鼠模型(每只体重30g的6周龄雄性，中央试验动物)并将其安置在气流式无菌试验台，并以自我喂养饲养一周。将所有试验药物溶解在少量DMSO中并使最终浓度为0.3％来使用于试验中，并且作为阳性对照组的地塞米松溶解在DMSO中并以0.15％的浓度使用。每个对照组和试验组由4只小鼠组成。为了使DNFB引起皮肤瘙痒和特应性皮炎，去掉背部的毛后，在第1天，涂抹溶解在丙酮-橄榄油(体积比3:1)混合溶剂中的0.15％浓度的DNFB，在第5天，再次涂抹0.15％的DNFB后，在第9天涂抹0.2％的DNFB后，用试验药物对其进行治疗，直至第30天，每两天涂抹0.2％的DNFB后用试验药物对其进行治疗。然后，以与实施例1相同的方式取出小鼠的皮肤细胞并用4％多聚甲醛(pH 7.4)固定细胞，将组织样品细切成5μm的厚度并使用苏木素和伊红(H&E)染色后，以光学显微镜观察组织(图12。图12是显示用AA-M6组合物及AA-M9组合物治疗DNFB诱导炎症部位并H&E染色皮肤组织切片后用显微镜观察组织切片的结果。

在图12中，曲线(A)、(B)、(C)、(D)、(E)及(F)分别示出用0.2％DNFB处理的小鼠、涂抹0.2％DNFB后仅用DMSO溶剂处理的小鼠、阳性对照组、涂抹0.2％DNFB后用地塞米松治疗的小鼠、涂抹0.2％DNFB后用0.3％AA-M6组合物治疗的小鼠、涂抹0.2％DNFB后用0.3％AA-M7组合物治疗的小鼠以及涂抹0.2％DNFB后用0.3％AA-M9组合物治疗的小鼠。图12示出每组四只小鼠中分别的H&E染色组织病理学的显微镜照片。

如图12中的(A)和(B)所示，相比正常组织(对照)，在炎症诱发组(0.2％DNFB)和DNFB及DMSO处理组中，观察到在表皮表面上相对较厚的角蛋白层及表皮层中棘细胞症和和炎症细胞在表皮部位中相对深蓝色线条或小斑点的集合体。如图12C所示，在作为阳性对照组的地塞米松治疗组中，观察到在表皮表面上的角蛋白分布很薄，几乎没有棘细胞症，并且极少数的炎症细胞，可以观察到炎症和瘙痒很好转的组织状态。在试验药物组情况下，如图12中的(D)(AA-M6治疗组)和(E)(AA-M7治疗组)所示，相比地塞米松治疗组，观察到厚厚的角蛋白层及在对下的棘细胞症形态，并示出弱的效能，相反，如图12中的(F)所示，在AA-M9治疗组中，观察到相对较薄的角蛋白层及很小的棘细胞症，并示出相比AA-M6及AA-M7更优秀的炎症症状好转效果。

试验例6:乙酸乙酯提取物及提取乙酸乙酯后留下的残余物的乙醇提取物的效能

根据实施例1的第4节“4.不同溶剂的提取物的制备”，获得了韩国产的黄花蒿的乙酸乙酯提取物(于下文中称为“AAE1”)及提取乙酸乙酯后留下的残余物以90％乙醇提取的90％乙醇提取物(于下文中称为“AAEM1”)。

然后，在AAE1及AAEM1提取物的存在下，培养皮肤角质细胞HaCaT细胞株，并测量作为抗炎症指标的白细胞介素-1β(IL-1β)的水平。

为了测量样品在试验中使用的细胞中是否有毒，进行了使用MTT分析的细胞毒性测量。将HaCaT细胞在96孔板中调节至3×10⁴细胞/mL的浓度来分株并培养24小时，以试行附着性及稳定性。完成24小时的培养后，以10μg/mL、50μg/mL及100μg/mL的浓度添加提取物，并在二氧化碳培养箱中培养24小时。培养24小时后，去除培养基加入100mL的MTT溶液(PBS中0.5mg/mL)并再次在37℃和5％二氧化碳下的湿润培养箱中进行反应1小时直至使MTT还原。去除MTT试剂后，以200μL的DMSO溶解并使用酶标仪(Bio-Rad,美国)测量570nm处的吸光度，来测量药物未治疗组(阴性对照)对比的细胞存活率。结果，试验中使用的浓度下的所有提取物显示80％或以上的细胞存活率，并且确认所有试验样品都没有显着的细胞毒性。

为了测量IL-1β的分泌量，将HaCaT细胞以6×10⁴/mL分株到48个孔，并使稳定化24小时。根据浓度处理提取物并在一个小时后，以TNF-α(10ng/mL)及IFN-γ(10ng/mL)激活后，在二氧化碳下的湿润培养箱中进行培养24小时。获得培养液，并根据制造商的指示通过ELISA试剂盒进行ELISA。细胞活素(Cytokine)分泌量在450nm波长下以显微分光光度计被分析。

图22显示AAE1和AAEM1提取物对细胞中IL-1β表达的影响的图。如图22所示，AAEM1提取物与AAE1提取物相比显着减少IL-1β表达并具有抗炎症作用。在图22中，对照(Ctrl)是阴性对照并只使用培养基，TNF-a/INF-r是阳性对照并在培养基中分别以10ng/ml的浓度添加了TNF-α/INF-r。

另外，在AAE1及AAEM1提取物的存在下，在自噬诱导条件下培养皮肤角质细胞HaCaT细胞株，并测量作为自体吞噬标志物的LC3的水平。在试验例4中，除了在培养基中含有所述10μg/ml的提取物外并为了分析，培养HaCAT细胞在相同条件下进行。LC3的测量通过蛋白质免疫印迹来进行。

图23显示AAE1和AAEM1提取物对细胞中LC3表达的影响的图。如图23所示，AAEM1提取物与AAE1提取物相比显着增加LC3表达并具有细胞保护作用。在图23中，对照(Ctrl)是阴性对照并只使用培养基。Tub显示用于以微管蛋白测量LC3水平的参考值。

发明的模式

本公开的一方面提供一种分离黄花蒿提取物的方法，所述方法包括：将黄花蒿植物体(Artemisia annua)与低极性溶剂接触并将黄花蒿植物体中的成分提取到所述低极性溶剂中的步骤；从所述接触后得到的混合物中除去所述低极性溶剂来得到残余物的步骤；以及将所述残余物与亲水性溶剂接触以将所述黄花蒿植物中的成分提取到所述亲水性溶剂的步骤。

可以使用所述黄花蒿植物体的全部或其一部分。所述一部分可以是地上部分或地下部分。所述地上部分可以是叶、花、果实或其组合。所述地下部分可以是地下的茎、根或其组合。所述黄花蒿植物体可以是干燥的。所述黄花蒿植物体可以从商业购买，或者在自然采取或栽培来使用。

所述提取物具有在本领域中用作粗提物(crude extract)的含义，但广泛地包括通过进一步分馏(fractionation)的馏分物。因此，所述提取物可以是粗提物、馏分物或其组合。所述粗提物是通过使黄花蒿与提取溶剂接触来获得的，并不分成含有特定成分。所述馏分物是指通过对所述粗提物进行分离含有特定成分的物质而获得。所述提取物或其馏分物可以包括在本公开的组合物中的黄花蒿植物体提取物、其馏分物或各自小馏分物或其混合物，可以仅包括单一化合物，或者可以包括所述化合物作为主要成分。所述小馏分物可以通过具有截止(cut-off)值的超过滤膜来获得。

在一个实施例中，所述分离可以通过过滤，浸渍，离心，色谱法或其组合进行。所述色谱法根据各种条件(即尺寸、电荷、疏水性或亲和力来设计用于分离)可以是离子交换色谱法、亲和色谱法、排阻色谱法、HPLC、高效流体色谱法、柱色谱法、反相柱色谱法或其组合。分离并除去所述低极性溶剂的步骤指将所述黄花蒿植物体与低极性溶剂接触后，将从所述黄花蒿植物体及低极性溶剂的混合物中提取成分物质后留下的黄花蒿植物体，即残余物从低极性溶剂中分离，并除去分离的低极性溶剂。

所述提取可包括将所述植物体在溶剂中温育一段时间。所述提取可以在搅拌或不搅拌的情况下进行，或者可以包括加热。所述温育可以在室温至回流温度下进行，或者在不搅拌的情况下进行。温育温度可根据所选溶剂适当选择。例如，可以是室温至回流温度、30℃至回流温度、40℃至回流温度。所述加热可以包括加热至50℃、60℃、70℃、80℃或回流温度。所述加热可以是加热至50℃至回流温度、60℃至回流温度、70℃至回流温度、80℃至回流温度，或者至回流温度。所述提取时间可以根据所选温度而变化，可以是1小时至2个月，例如，1小时至1个月、1小时至15天、1小时至10天、1小时至5天、1小时至3天、1小时至2天、1小时至1天、5小时至1个月、5小时至15天、5小时至10天、5小时至5天、5小时至3天、5小时至2天、5小时至1天、10小时至1个月、10小时至15天、10小时至10天、10小时至5天、10小时至3天或10小时至2天。所述提取可以是在溶剂中回流提取所述植物体。所述溶剂可以具有基于所述植物体重量的1倍、2倍、5倍、10倍或15倍以上的体积。所述溶剂可以具有基于所述植物体重量的1倍至15倍、2倍至15倍、5倍至15倍、10倍至15倍或约15倍的体积。所述植物体可以是在阴凉处干燥的。

所述提取方法可以使用过滤法、热水提取、浸渍提取、冷浸法、微波提取、回流冷却提取、加压提取、亚临界提取、超临界提取和超声波提取等的本领域的常规方法。例如，可以是浸渍提取方法。浸渍提取可以是温浸或在室温下浸渍并可以提取1次至5次。所述黄花蒿植物体可以与0.1倍至10倍或1倍至6倍的提取溶剂接触。冷浸提取温度可以为20℃至40℃。温浸或加热提取温度可以是40℃至100℃。冷浸提取时间可以是24小时至120小时，温浸或加热提取温度可以是0.5小时至48小时。

所述提取还可以包括通过如在减压下浓缩的已知方法从所得提取液中除去溶剂。所述提取还可以包括通过如冻结干燥的干燥将所得提取物制备成干燥提取物。所述在减压下浓缩可以使用真空减压浓缩器或真空旋转蒸发器来进行。另外，干燥可以是在减压下干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冻结干燥。

包括本公开的黄花蒿植物体的提取物的组合物包括低含量的倍半萜内酯(sesquiterpene lactone)或不包括倍半萜内酯。因此，所述低极性溶剂可溶解或提取倍半萜内酯，通过从在提取所述黄花蒿植物体成分的步骤后所得的混合物中分离低极性溶剂，可以从所述黄花蒿植物体提取物中除去所述倍半萜内酯。所述倍半萜内酯是指碳数为15个及包括内酯环的结构，根据衍生物或倍半萜内酯的下位分类，碳的数量可以变化。所述倍半萜内酯包括大根香叶内酯(Germacranolides)、Heliangolides、愈创木内酯(Guaianolides)、伪愈创木内酯(Pesudoguaianolide)、Hypocretenolides或Eudesmanolides。

所述低极性溶剂指包括非极性溶剂，并可以指与亲水性相反，当介电常数小于15，可以分为低极性或非极性，但不限于此。

所述倍半萜内酯相对溶于低极性溶剂或非极性溶剂中并溶出，所述低极性溶剂可以包括直链或支链的烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃、醚、酯、酮及亚砜。烷烃、烯烃、炔烃、环烷烃、环烯烃、醚、酯、酮或亚砜分别具有未取代或被一个或更多个取代基取代的1个至12个碳原子，例如，1个至6个、1个至3个、3个至12个、3个至8个或3个至10个碳原子。所述溶剂是未取代或被一个或更多个取代基取代的C1-C6的烷烃、烯烃或炔烃；未取代或被一个或更多个取代基取代的C3至C12、C5至C12或C5至C10的环烷烃或环烯烃；未取代或被一个或更多个取代基取代并包括C1至C5或C1至C3烷基的乙酸烷基酯；或者未取代或被一个或更多个取代基取代的C1-C6的醚或酮。所述取代基为卤族元素，可以选自F、Cl、Br及I。所述低极性溶剂可以是例如液体二氧化碳、甲烷、乙烷、异丙烷、丁烷、戊烷、异戊烷、己烷、庚烷、辛烷、石油醚、环己烷、DMSO、乙腈、四氢呋喃、乙酸甲酯、乙酸乙酯、醋酸异丙酯、n-乙酸丁酯、丙酮、乙醚、t-丁基甲醚、甲基乙基甲酮、甲基异丁基酮、乙腈、1,2-二氯乙烯、二氯甲烷、二氯甲烷或其组合。

另外，与所述倍半萜内酯的情况一样，包括本公开的黄花蒿植物体的提取物的组合物包括低含量的精油成分或几乎不包括精油成分。因此，本公开的黄花蒿植物体的提取物的组合物包括或几乎不包括低含量的倍半萜内酯、精油成分及其组合。

在分离所述黄花蒿提取物的方法中，所述亲水性溶剂(hydrophilic solvent)可以溶解选自于鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱、绿原酸、α-亚麻酸、亚油酸及棕榈酸中的至少一种。在所述黄花蒿植物体的提取物或其馏分物中，溶解在所述亲水性溶剂并溶出的化合物可以包括以下化学式1至6的化合物或其衍生物、立体异构体或其药学上可接受的盐形式中的四种或更多种，还可以包括化学式7的化合物或其衍生物、立体异构体或其药学上可接受的盐形式。即，所述亲水性溶剂可以是能够溶解选自于鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种的化合物，还可以溶解选自于α-亚麻酸、亚油酸及棕榈酸中的一种或更多种。

化学式1

化学式2

化学式3

化学式4

化学式5

化学式6

化学式7

所述化学式1的化合物可以称为鸟氨酸，化学式2的化合物可以称为松醇，化学式3的化合物可以称为粘质纤维醇，化学式4的化合物可以称为手性肌醇，化学式5的化合物可以称为甜菜碱，化学式6的化合物可以称为绿原酸，以及化学式7的化合物可以称为α-亚麻酸。

所述亲水性溶剂可以由例如水、醇或其组合提取。所述醇可以是低级醇，并可以是具有一个或更多个-OH基的C1至C3、C1至C4、C1至C5或C1至C6的化合物。在一个实施例中，所述C1至C4醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇或其组合。

在一个实施例中，所述方法还可以包括通过将所述提取物与分馏溶剂接触来进行分馏的步骤。在一个实施例中，所述分馏可以包括将所述提取物与层析介质接触并结合来以分馏溶剂溶出的步骤。

所述分馏溶剂可以是亲水性溶剂，在一个实施例中，所述亲水性溶剂可以是低级醇或其组合，所述低级醇可以是具有一个或更多个-OH基的C1至C3、C1至C4、C1至C5或C1至C6的化合物。在一个实施例中，所述C1至C4醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇或其组合。

相对于分馏溶剂的总体积，所述分馏溶剂具有0体积百分比至100体积百分比的醇，因此，醇:水的体积比可以是0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、1:9或0:10。在所述体积比中，当比率是"0"时，表示是纯水或醇。例如，当醇:水是2:8时，可以称醇是20体积百分比。在一个实施例中，基于分馏溶剂的总体积，可以以20体积百分比或更多且少于40体积百分比、40体积百分比或更多且少于60体积百分比、60体积百分比或更多且少于100体积百分比以及100体积百分比的醇溶出，因此，例如，所述通过分馏的馏分物可以是用包括基于分馏溶剂的总体积为20体积百分比、40体积百分比、60体积百分比或100体积百分比的醇的溶剂分馏获得的馏分物。在一个实施例中，所述醇可以是低级醇，所述低级醇可以是具有一个或更多个OH基的C1至C3、C1至C4、C1至C5或C1至C6的化合物。在一个实施例中，所述醇可以是乙醇。

本公开的另一方面提供了包括根据分离所述黄花蒿的提取物的方法所制备的黄花蒿植物体提取物、馏分物或其单离的化合物的用于预防、改善或治疗皮肤疾病的组合物。

根据本公开的方法提取的黄花蒿植物体提取物包括使用能够溶解倍半萜内酯的低极性或非极性溶剂来提取、分离和除去所述倍半萜内酯的步骤，因此，本公开的黄花蒿植物体提取物包括低含量的倍半萜内酯或不包括倍半萜内酯。在根据本公开的方法中使用的所述低极性或非极性溶剂也可以溶解精油成分，因此，与所述倍半萜内酯的情况一样，可以从本公开的提取物提取和分离并除去精油成分。因此，本公开的黄花蒿植物体提取物、馏分物或其小馏分物包括低含量的倍半萜内酯、精油成分及其组合或不包括倍半萜内酯、精油成分及其组合。在一个实施例中，本公开的组合物包括以下重量比(w/w)的倍半萜内酯：1.00％至0.001％、0.80％至0.001％、0.60％至0.001％、0.50％至0.001％、0.40％至0.001％、0.30％至0.001％、0.20％至0.001％、0.10％至0.001％、0.08％至0.001％、0.06％至0.001％、0.05％至0.001％、0.04％至0.001％、0.03％至0.001％、0.02％至0.001％、0.01％至0.001％、﹑0.1％或更低、0.05％或更低、0.01％或更低、0.005％或更低或者0.001％或更低。在一个实施例中，本公开的组合物包括以下重量比(w/w)的精油成分：1.00％至0.01％、0.80％至0.01％、0.60％至0.01％、0.50％至0.01％、0.40％至0.01％、0.30％至0.01％、0.20％至0.01％、0.10％至0.01％、0.08％至0.01％、0.06％至0.01％、0.05％至0.01％、0.04％至0.01％、0.03％至0.01％、0.02％至0.01％、0.1％或更低、0.05％或更低、0.01％或更低、0.005％或更低或0.001％或更低。所述精油成分可以是挥发性精油成分。

在一个实施例中，本公开的提取物可以包括选自于鸟氨酸、松醇、﹑粘质纤维醇、手性肌醇、﹑甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种的化合物，或者还可以包括选自于亚油酸、棕榈酸及α-亚麻酸中的一种或更多种的化合物。

所述化合物的组合可以包括在馏分物中，所述馏分物通过用包括基于分馏溶剂的总体积的20体积百分比或更多且小于40体积百分比、40体积百分比或更多且小于60体积百分比、60体积百分比或更多且小于100体积百分比及100体积百分比的醇的分馏溶剂分馏得到。通过用包括基于分馏溶剂的总体积的20体积百分比或更多且小于40体积百分比、40体积百分比或更多且小于60体积百分比、60体积百分比或更多且小于100体积百分比的醇的分馏溶剂分馏得到的馏分物可以包括鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱、绿原酸或其组合作为主要成分，但是，通过100体积百分比的醇的分馏溶剂分馏得到的馏分物可以包括亚油酸、棕榈酸、α-亚麻酸或其组合作为主要成分，由于包括在每个馏分物中的每种化合物的含量可以不同，所述每种馏分物以适当的比例搅拌或混合以达到最佳的药理效果，并根据需要变化组成和比例。例如，当通过基于分馏溶剂的总体积的20体积百分比或更多且小于40体积百分比、40体积百分比或更多且小于60体积百分比、60体积百分比或更多且小于100体积百分比及100体积百分比的醇的分馏溶剂分馏得到的馏分物被分别称为第一馏分物、第二馏分物、第三馏分物及第四馏分物时，所述组合物可以是第一馏分物及第二馏分物的混合物；第一馏分物及第三馏分物的混合物；第一馏分物及第四馏分物的混合物；第二馏分物及第三馏分物的混合物；第二馏分物及第四馏分物的混合物或第三馏分物及第四馏分物的混合物；第一馏分物、第二馏分物及第三馏分物的混合物；第一馏分物、第三馏分物及第四馏分物的混合物；或第二馏分物、第三馏分物及第四馏分物的混合物；或第一馏分物、第二馏分物、第三馏分物及第四馏分物的混合物。当混合两种馏分物时，两种馏分物的重量比可以是1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、﹑6:4、7:3、8:2或1:9，当所述混合三种馏分物时，其重量比可以是1:1:8、1:2:7、1:3:6、1:4:5、1:5:4、1:6:3、1:7:2、1:8:1、2:1:7、2:2:6、2:3:5、2:4:4、2:5:3、2:6:1、2:7:1、3:1:6、3:2:5、3:3:4、3:4:3、3:5:2、3:6:1、4:1:5、4:2:4、4:3:3、4:4:2、4:5:1、5:1:4、5:2:3、5:3:2、5:4:1、6:1:3、6:2:2、6:3:1、7:1:2、7:2:1或8:1:1，混合四种馏分物时其重量比可以是1:1:1:7、1:2:1:6、1:3:1:5、1:4:1:4、1:5:1:3、1:6:1:2、1:7:1:1、1:1:2:6、1:1:3:5、1:1:4:4、1:1:5:3、1:1:6:2、1:1:7:1、2:1:1:6、2:2:1:5、2:3:1:4、2:4:1:3、2:5:1:2、2:6:1:1、2:1:2:5、2:1:3:4、2:1:4:3、2:1:5:2、2:1:6:1、3:1:1:5、3:2:1:4、3:3:1:3、3:4:1:2、3:5:1:1、3:1:2:4、3:1:3:3、3:1:4:2、3:1:5:1、4:1:1:4、4:2:1:3、4:3:1:2、4:4:1:1、4:1:2:3、4:1:3:2、4:1:4:1、5:1:1:3、5:2:1:2、5:3:1:1、5:1:2:2、5:1:3:1、6:1:1:2、6:2:1:1、6:1:2:1或7:1:1:1。

在一个实施例中，当组合物包括选自于鸟氨酸、松醇、粘质肌醇(或粘质纤维醇)、手性肌醇、甜菜碱和绿原酸中的四种或更多种化合物及选自于亚油酸、棕榈酸及α-亚麻酸中的一种或更多种的化合物的组合时，组合物可以是所述提取物中基于分馏溶剂的总体积的20体积百分比或更多且小于40体积百分比的醇溶剂分馏得到的馏分物及100体积百分比的醇溶剂分馏得到的馏分物的混合或组合。因此，本公开的组合物可以包括单独的馏分物或者可以包括重量比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2的两种馏分物的组合。在一个实施例中，本公开的组合物可以包括重量比为9:1的两种馏分物的组合。

本公开的组合物可以用于治疗、改善或预防皮肤疾病。在一个实施例中，所述皮肤疾病可以是炎症性皮肤疾病。此外，所述黄花蒿植物体的提取物、其馏分物或由其单离的化合物可以抑制炎症反应。因此，所述组合物中的黄花蒿植物体的提取物、其馏分物或由其单离的化合物可以包括抑制诱发皮肤疾病的炎症反应或恢复伤口的有效量。所述有效量可以根据本领域技术人员选择的细胞或个体来适当选择。所述有效量可以是每1,000mg组合物0.1mg至1000mg，例如，0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1,000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg或10mg至25mg。所述组合物可以用于体外或在个体中的细胞中抑制炎症反应。个体中的细胞可以位于例如炎症反应正在进行或预计会进行的部位，或通过炎症反应使疾病可以从外观性观察到的部位。

在一个实施例中，所述皮肤疾病可以是皮肤炎。所述皮肤疾病可以包括诸如皮肤瘙痒、荨麻疹、特应性、干燥性皮肤炎、接触性皮肤炎等疾病。皮肤瘙痒可以指因被昆虫叮咬或皮肤可能敏感反应的特定接触物而受到刺激，或者因特应性、皮肤炎、牛皮癣、感染、干性皮肤或皮肤老化使皮肤神经微弱地受到持续刺激，使发生无法忍受想挠的症状。所述荨麻疹可以指由强烈精神压力、﹑食物或药或过敏原引起的过敏性炎症反应引起的皮疹。所述特应性可以指就算没有过敏原直接接触，身体敏感地过度发起免疫反应引起伴随皮疹、湿疹和严重瘙痒症的过敏性炎症性疾病。所述干燥性皮肤炎可以指随着引起很多皮肤角质的干燥症变得严重而恶化成干燥性湿疹或老年性湿疹的皮肤炎症状。所述神经性皮肤炎可以指由于神经过敏使轻微刺激都能感到严重的瘙痒而挠，使角质层和皮肤皱纹变厚而引起瘙痒症严重并继续挠，而结果恶化成湿疹等皮肤炎。所述接触性皮肤炎可以指当露出于过敏原或特定刺激源时出现的局部皮疹或刺激和瘙痒的症状。

所述皮肤疾病具体地可以是皮肤瘙痒症、痱子、脂溢性皮肤炎、接触性皮肤炎、剥脱性皮肤炎、鱼鳞癣、汗腺炎、脓疱病、特应性皮炎、药物过敏、糖尿病性皮肤炎、皮肤干燥症、皮肤变色症、细菌性皮肤炎、真菌性皮肤炎、水痘、冻疮、火疮、湿疹、浮肿、突发性皮疹、胆碱能性荨麻疹、毛囊炎、痤疮、毛孔性角化症、疣、光线性角化病、粟粒疹、牛皮癣、汉森氏病、白塞病、褥疮、瘢痕疙瘩性疾病、患部浮肿、甲周炎、指甲营养不良症、指尖疮、过敏性皮肤炎、慢性单纯性苔藓、皮肤脓肿、神经性皮肤炎或其组合。

本公开另一方面提供包括选自鸟氨酸、﹑松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种化合物的组合物。

所述组合物可以包括在从黄花蒿植物体获得的提取物或馏分物中，并可以包括为通过所述馏分物的小馏分或进一步的工艺而单离的化合物，所述化合物可以是立体异构体、其溶剂化物其药学上可接受的盐的形式。所述组合物可以包括四种化合物、五种化合物或六种化合物。所述四种化合物可以是鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇及手性肌醇；鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇及甜菜碱；鸟氨酸、﹑松醇、粘质纤维醇及绿原酸；鸟氨酸、松醇、手性肌醇及甜菜碱；鸟氨酸、松醇、手性肌醇及绿原酸；鸟氨酸、松醇、甜菜碱及绿原酸；鸟氨酸、粘质纤维醇、手性肌醇及甜菜碱；鸟氨酸、粘质纤维醇、手性肌醇及绿原酸；鸟氨酸、粘质纤维醇、甜菜碱及绿原酸；鸟氨酸、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸；松醇、粘质纤维醇、手性肌醇及甜菜碱；松醇、粘质纤维醇、手性肌醇及绿原酸；松醇、粘质纤维醇、甜菜碱及绿原酸；松醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸；或者粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸。所述五种化合物可以是鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇及甜菜碱；鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇及绿原酸；鸟氨酸、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸；鸟氨酸、松醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸；鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、甜菜碱及绿原酸；或者松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸。所述组合物包括鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的至少一种。当六种化合物包括在组合物中时，可以包括1至5:4至35:1至8:2至16:2至20:2至16的重量比。所述组合物包括鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的至少一种时，这些化合物分别包括成基于总重量的0.1(w/w)％至4(w/w)％、0.6(w/w)％至25(w/w)％、0.2(w/w)％至8(w/w)％、0.3(w/w)％至16(w/w)％、0.3(w/w)％至24(w/w)％及0.2(w/w)％至12(w/w)％。

在一个实施例中，本公开的组合物可以包括选自鸟氨酸、﹑松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种化合物与选自亚油酸、棕榈酸及α-亚麻酸中的一种或更多种化合物的另加组合。因此，本公开的组合物可以包括选自鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种的化合物与亚油酸、棕榈酸、α-亚麻酸、亚油酸及棕榈酸、亚油酸及α-亚麻酸、棕榈酸及α-亚麻酸或者亚油酸、棕榈酸及α-亚麻酸的另加组合。所述组合物可以以1至30:1至15:1至15的重量比包括α-亚麻酸、亚油酸及棕榈酸。所述组合物可以包括分别基于总重量的1(w/w)％至30(w/w)％、1(w/w)％至15(w/w)％及1(w/w)％至15(w/w)％的α-亚麻酸亚油酸及棕榈酸。

所述组合可以包括简单地在溶剂中混合，混和，混合熔化，溶解，悬浮或胶体，当施用所述组合物时，所述化合物可以分别同时地，个别地或依次地施用。

本公开的组合物可以是包括所述黄花蒿(Artemisia annua)植物体的提取物，或其馏分物及从其单离的化合物，或其药学上可接受的盐的药物组合物。此外，本公开的组合物可以包括药学上可接受的载体的形式的药剂或制剂以将所述黄花蒿植物体的提取物，或其馏分物及从其单离的化合物施用于个体。术语“药学的”意指具有药理学活性，除了用作狭义上用于治疗疾病的药物组合物之外，还有包括所有用于利用本公开组合物的药理活性的目的的用途。因此，所述组合物可以是用于皮肤健康的的功能性食物、化妆品、医药外品或皮肤外用剂的组合物。

所述"药学上可接受的盐"以对患者相对无毒且无害并具有有效作用的浓度对该盐引起的副作用不损害本公开的组合物中的化合物的有益效能。这些盐可以将无机酸和有机酸用作游离酸，可使用盐酸、溴酸、硝酸、硫酸、过氯酸和磷酸等作为无机酸。作为有机酸，可使用柠檬酸、乙酸、乳酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、甲磺酸、甘醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸、酒石酸、半乳糖醛酸、扑酸、谷氨酸、天冬氨酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、4-甲苯磺酸、水杨酸、柠檬酸、苯甲酸或丙二酸等。此外，这些盐包括碱金属盐(如钠盐和钾盐等)及碱土金属盐(如钙盐和镁盐等)等。例如，作为酸加成盐，可包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸酯、六氟磷酸盐、0-(4-羟苯甲酰)苯甲酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸一氢盐/磷酸二氢盐、糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟醋酸盐、铝、精氨酸、苄星、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、甲葡胺、乙醇胺、钾、钠、氨基丁三醇及锌盐等、或其中的盐酸盐或三氟醋酸盐。

本公开另一方面提供包括将本公开的组合物施用于个体的步骤的用于预防或治疗个体的皮肤疾病的方法。

所述个体可以是哺乳动物，例如人、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫。例如，所述个体可以是人类。本公开的化合物对人体的有效施用量可以根据患者的年龄、体重、性别、施用状态、健康状况及疾病程度而变化。

所述施用可以口服给药，或以各种制剂给药以用于静脉、腹腔、皮内、皮下、上皮或肌肉给药等的非口服给药，并且在进行制剂化的情况下，使用通常使用的稀释剂(诸如，填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂及表面活性剂等)或赋形剂来制备。

用于口服施用的固体制剂可包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂及片剂(troche)，并且这种固体制剂可以通过将一种或更多种的本公开的化合物与至少一种赋形剂(诸如，淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)或明胶等)混合来制备。除了简单的赋形剂外，还可以使用如硬脂酸镁滑石的润滑剂。作为口服施用的液体制剂，可以使用悬浮剂、内用液剂、油剂或糖浆(syrup)剂等，并且除了常用的简单的稀释剂如水和液体石蜡外，还可以包括各种赋形剂如润湿剂、甜味剂、芳香剂及防腐剂等。

用于非口服给药的液体制剂可包括灭了菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、油剂、冷冻干燥制剂和栓剂等。作为非水性溶剂和悬浮剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油的植物油及如油酸乙酯的可注射的酯等。作为栓剂的基质，可使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、乳化剂(Tween)61、可可油脂、月桂脂、甘油和明胶等。

特别地，用于皮肤施用的皮肤外用剂可以以贴剂、带(band)、油液、软膏、膜、凝胶、乳膏、乳液、液体或粉末的形式施用，作为化妆品，可以以柔软化妆水、营养化妆水、按摩霜、营养霜、保湿霜、﹑功能性乳液、雾剂、膜、凝胶或皮肤黏着型剂型施用。因此，所述皮肤外用剂可以根据需要适当混合通常用作化妆品或药物等的皮肤外用剂的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂、各种皮肤营养剂。

所述皮肤外用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属螯合剂、咖啡因、单宁、戊脉安、甘草提取物、光甘草定、大蓟果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或其盐等的药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等的糖类。

本公开另一方面提供包括根据分离所述黄花蒿的提取物的方法制备的黄花蒿植物体提取物、馏分物或其单离的化合物作为有效成分的用于预防或治疗皮肤疾病的动物用医药物。

所述动物可以是哺乳类、鸟类、鱼类或爬虫类，并可以是家畜、宠物、或养殖用鱼类，或可以是选自鸡、猪、牛、马、狗、兔、猫、鸭、山羊和绵羊中的一种或更多种的动物。

所述动物用医药物可以用作单独的医药物，并可以制成动物饲料添加剂来使用。作为动物饲料添加剂的动物用医药物可以是粉体﹑颗粒﹑丸粒(pellet)﹑液相或悬浮液等制剂，并可以单独供应或与饲料混合供应。

本公开另一方面提供包括根据分离所述黄花蒿的提取物的方法制备的黄花蒿植物体提取物﹑馏分物或其单离的化合物作为有效成分的用于预防或改善皮肤疾病的食物组合物。所述食物组合物可以进一步包括食物上可接受的赋形剂或载体。所述食物组合物可以是保健功能食物。

在本公开中，所定义的保健功能食物过在2008年修订的有关保健功能食物的法律充分确立新定义的有关人体的功能性和安全性，并可以是有关食物药品安全厅食药厅告示第2008-72号中规定的的健康功能食物功能性原料认可的规定中所含的保健功能食物。

当将公开的组合物包括在保健功能食物中时，可以完整添加所述组合物或与其他健康功能食物或健康功能食物成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据使用目的适当决定。通常，构成根据本公开的组合物的有效成分可以包括总食物重量的0.01重量百分比至15重量百分比，优选地包括0.2重量百分比至10重量百分比，当制造为饮料时，可以含有基于100mL的0.1g至30g，优选地0.2g至5g的比率，并且整个饮料可以构成为天然成分。但是，以健康控制和卫生作目的作长期摄取的情况下，所述量可以小于或等于所述范围，由于在安全性方面没有问题，因此有效成分可以以超过上述范围的量使用。

根据本公开的用于保健功能食物的组合物可以制剂成本领域已知的常规保健功能食物的制剂。所述保健功能食物可以制备为如散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆剂、浸渍剂、液剂、萃取剂、口香糖、茶、果冻或饮料等，优选地可以制备为饮料的形式。所述食物上可接受的载体或添加剂可以使用本领域已知可用于制备制剂的任何载体或添加剂。此外，所述食物上可接受的载体或添加剂还可以包括用作动物饲料的食物。

所述保健功能食物根据目的或喜好可以含有营养剂、维生素、电解质、﹑调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。还可以含有制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。此外，所述保健功能食物组合物可进一步包含食物添加剂，除非另有规定，“食物添加剂”是否符合可根据食物医药物安全处承认的食物添加剂法典的总则及一般试验法等由有关相应的项目的规格和标准来判断。

本公开另一方面提供包括根据分离所述黄花蒿的提取物的方法制备的黄花蒿植物体提取物﹑馏分物或其单离的化合物作为有效成分的用于预防或改善皮肤疾病的医药外品组合物。所述医药外品组合物可以进一步包括医药外品上可接受的赋形剂或载体。

术语"医药外品"是指排除根据药事法使用为医药物的用途的物品，并指基于保健福祉部定下的分类标准的对人体的影响轻微于用于治疗或预防疾病的药物的药品。因此，可以包括用于治疗或预防人类或动物疾病的纤维·橡胶产品、对人体的作用是温和的或不直接作用并类似非机具或非机械的物品，或用于预防传染病杀菌和杀虫剂等。在一个实施例中，所述医药外品可以用于保湿﹑预防或治疗皮肤瘙痒症或特应性皮炎。

本公开另一方面提供包括根据分离所述黄花蒿的提取物的方法制备的黄花蒿植物体提取物、馏分物或其单离的化合物作为有效成分的用于预防或改善皮肤疾病的化妆品组合物。所述化妆品组合物可以进一步包括化妆品上可接受的赋形剂或载体。所述化妆品组合物可以是功能性化妆品。

根据食物医药物安全处于2016年8月11日立法预告的"化妆品法执行规则的一些改正案，根据功能性化妆品添加特应性皮肤保湿功能，在一个实施例中，功能性化妆品可用于预防或治疗特应性皮炎。

产业上利用可能性

根据一方面的分离所述黄花蒿的提取物的方法可以分离包括很少或几乎不包括倍半萜内酯的提取物。

根据一方面的分离所述黄花蒿的提取物的方法所制备的包括黄花蒿植物体提取物的组合物可以用作类固醇类的替代药物或其组合预防或治疗特应性﹑炎症性皮肤疾病或瘙痒症等的皮肤疾病。

根据一方面的包括选自鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种的组合物作为单一化合物的组合的组合物，可以用作类固醇类的替代药物或其组合预防或治疗皮肤疾病。

根据另一方面的包括将所述组合物施用于个体的步骤的预防或治疗皮肤疾病的方法可以用作类固醇类的替代药物或其组合预防或治疗个体的皮肤疾病。

根据另一方面的包括所述组合物的医药物、动物用医药物、保健功能食物、医药外品或能性化妆品可以用作类固醇类的替代药物或其组合预防、改善或治疗人和动物的特应性、炎症性皮肤疾病或瘙痒症等的皮肤疾病。

Claims

1.一种分离黄花蒿提取物的方法，所述方法包括如下步骤：

将黄花蒿植物体与低极性溶剂接触以将黄花蒿植物体中的成分提取到低极性溶剂中的步骤；

从所述接触步骤后得到的混合物中分离并除去所述低极性溶剂来得到残余物的步骤；以及

将所述残余物与亲水性溶剂接触以将所述黄花蒿植物体中的成分提取到所述亲水性溶剂中的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述低极性溶剂是能够溶解或提取倍半萜内酯的溶剂。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述低极性溶剂是未取代或被一个或更多个取代基取代的C1-C6的烷烃、烯烃或炔烃；未取代或被一个或更多个取代基取代的C5-C12的环烷烃或环烯烃；具有未取代或被一个或更多个取代基取代的C1-C5烷基的乙酸烷基酯；未取代或被一个或更多个取代基取代的C1-C12的醚或酮；未取代或被一个或更多个取代基取代的C1-C6的亚砜；乙腈；四氢呋喃；或它们的组合，其中，所述一个或更多个取代基选自F、Cl、Br及I。

4.如权利要求1所述的方法，其中，

所述亲水性溶剂能够溶解或提取选自于鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱、绿原酸、α-亚麻酸、亚油酸及棕榈酸中的至少一种。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述亲水性溶剂为C1-C6的醇、水或它们的组合。

6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述黄花蒿提取物与分馏溶剂接触以对所述黄花蒿提取物分馏的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述分馏的步骤包括将所述黄花蒿提取物与层析介质接触并结合并用分馏溶剂溶出所述黄花蒿提取物。

8.如权利要求6所述的方法，其中，所述分馏溶剂是亲水性溶剂。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述亲水性溶剂为C1-C6的醇、水或它们的组合。

10.如权利要求6所述的方法，其中，所述分馏的步骤包括以基于分馏溶剂的总体积的20体积百分比或更多且少于40体积百分比、40体积百分比或更多且少于60体积百分比、60体积百分比或更多且少于100体积百分比或100体积百分比的醇溶出。

11.一种用于预防或治疗皮肤疾病的组合物，所述组合物包括根据权利要求1的方法所制备的黄花蒿提取物。

12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述黄花蒿提取物包括少于或等于0.01重量/重量％的倍半萜内酯或不包括倍半萜内酯。

13.如权利要求11所述的组合物，其中，所述黄花蒿提取物包括选自于鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种。

14.如权利要求13所述的组合物，其中，所述黄花蒿提取物还包括选自于亚油酸、棕榈酸及α-亚麻酸中的一种或更多种。

15.如权利要求11所述的组合物，其中，所述黄花蒿提取物是用包括基于溶剂的总体积的20体积百分比或更多且少于40体积百分比的醇的溶剂分馏的馏分物以及用100体积百分比的醇的溶剂分馏的馏分物的组合。

16.一种用于预防或治疗皮肤疾病的组合物，所述组合物包括选自于鸟氨酸、松醇、粘质纤维醇、手性肌醇、甜菜碱及绿原酸中的四种或更多种。

17.如权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物还包括选自于亚油酸、棕榈酸及α-亚麻酸中的一种或更多种。

18.如权利要求11或16所述的组合物，其中，所述组合物为医学组合物、医药外品组合物、食物组合物或化妆品组合物。

19.如权利要求11或16所述的组合物，其中，所述皮肤疾病是炎症性皮肤疾病。

20.如权利要求18所述的组合物，其中，所述皮肤疾病选自于皮肤瘙痒症、痱子、脂溢性皮肤炎、接触性皮肤炎、剥脱性皮肤炎、鱼鳞癣、汗腺炎、脓疱病、特应性皮炎、药物过敏、糖尿病性皮肤炎、皮肤干燥症、皮肤变色症、细菌性皮肤炎、真菌性皮肤炎、水痘、冻疮、火疮、湿疹、浮肿、突发性皮疹、胆碱能性荨麻疹、毛囊炎、痤疮、毛孔性角化症、疣、光线性角化病、粟粒疹、牛皮癣、汉森氏病、白塞病、褥疮、瘢痕疙瘩性疾病、患部浮肿、甲周炎、指甲营养不良症、指尖疮、过敏性皮肤炎、慢性单纯性苔藓、皮肤脓肿和神经性皮肤炎。