CN109932448A - 一种线叶金雀花及其制品中有效成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品质量控制技术领域，具体提供了线叶金雀花及其制品中有效成分的含量测定方法，包括如下异荭草苷的含量测定步骤：A异荭草苷的含量测定；制备异荭草苷对照品溶液；供试品溶液的制备；色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，采用Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱或Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度0.8‑1.5％的醋酸溶液或以体积浓度0.1‑0.5％的甲酸为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析，控制流动相流速为0.8‑1.2ml/min；检测波长为275～295nm和340～360nm；测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量，本发明提供了一种快速、准确、方便的测定线叶金雀花及其制品中有效成分的含量测定方法。
Description
技术领域
本发明属于食品质量控制技术领域，具体地说涉及线叶金雀花及其制品中有效成分的含量测定方法。
背景技术
线叶金雀花为南非的豆科植物(拉丁学名：Aspalathus Linearis(Brum.f.)R.Dahlgren)，是国家卫生和计划生育委员公告的新食品原料。线叶金雀花提取物为线叶金雀花的水提物，线叶金雀花茶是含有线叶金雀花提取物的普通饮品。线叶金雀花含丰富的抗氧化类黄酮，对清除人体自由基，调节人体机能，预防和控制多种疾病起显著的疗效，线叶金雀花中不含咖啡因和草酸，有镇静中枢神经系统的效果，适合患有过敏、头痛、睡眠失常、失眠、神经紧张、轻微忧郁症及神经高度紧张等症状的人服用；还有缓解皮肤过敏的效果，可直接敷在受感染的皮肤上，对皮肤痒、湿疹、尿布疹、挫疮等皮肤过敏症状都可有缓解和减轻的作用。因此建立一种线叶金雀花和线叶金雀花提取物及线叶金雀花茶中有效成分的含量测定方法对于线叶金雀花食品、保健品或药品的开发利用具有重要的意义。
目前认为黄酮类化合物是线叶金雀花的主要活性成份，黄酮类化合物主要为荭草苷、异荭草苷、阿司巴汀等。由于荭草苷和异荭草苷为同分异构体，有效分离较为困难，而且阿司巴汀在发酵型线叶金雀花中含量较低，不易提取，且不稳定，测定准确性低，价格昂贵，此外，线叶金雀花成分繁多、复杂，杂质含量多，目前暂未有线叶金雀花的质量控制标准。《博士茶中阿司巴汀的含量测定》文献中公开了博士茶中阿司巴汀的HPLC测定方法，在该方法中，通过测定阿司巴汀的浓度来确定线叶金雀花的质量，该方法存在提取操作复杂、分离度低、峰型差、成本高、运行时间长的问题(见查圣华等，博士茶中阿司巴汀的含量测定，天然产物研究与开发，2009,21:414-415)。
因此，为了控制线叶金雀花和线叶金雀花提取物及线叶金雀花茶的食用安全性，有必要建立一种快速、准确、方便、低廉地检测线叶金雀花中有效成分的含量测定方法。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术的检测方法测定结果单一、提取操作复杂、分离度低、峰型差、运行时间长，无法准确、全面评定其质量的问题，进而提供一种快速、准确、方便、低廉测定线叶金雀花和线叶金雀花提取物及线叶金雀花茶中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀含量的检测方法，进而全面、准确的控制线叶金雀花及其制品的质量。
为解决上述技术问题，本发明的提供了一种线叶金雀花及其制品中有效成分的含量测定方法，包括如下异荭草苷的含量测定步骤：
A异荭草苷的含量测定
制备异荭草苷对照品溶液；
供试品溶液的制备：取待测样品，加入醇溶液，超声提取或热回流提取，放冷，加入醇溶液稀释定容，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，采用Waters SymmetryC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱或Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度0.8-1.5％的醋酸溶液或以体积浓度0.1-0.5％的甲酸为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析，控制流动相流速为0.8-1.2ml/min；检测波长为275～295nm和340～360nm；
测定法：分别吸取异荭草苷对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量。
进一步地，还包括如下荭草苷和阿司巴汀的含量测定步骤：
B荭草苷和阿司巴汀的含量测定
异荭草苷、荭草苷对照品溶液和阿司巴汀的混合对照品溶液；
取异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品，加入醇溶液制成一系列浓度的含异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品的混合对照品溶液，在所述色谱条件下，分别注入液相色谱仪，分别制得异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的标准曲线，利用标准曲线的斜率计算出荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子；
通过供试品溶液图谱中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰值与荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子，通过内标法计算供试品溶液中荭草苷和阿司巴汀的含量。
优选地，所述待测样品为线叶金雀花、线叶金雀花提取物、线叶金雀花茶、线叶金雀花药物组合物或线叶金雀花药物制剂中的至少一种。
进一步地，所述线叶金雀花包括发酵型线叶金雀花和非发酵型线叶金雀花中的至少一种，所述线叶金雀花提取物包括发酵型线叶金雀花提取物和非发酵型线叶金雀花提取物中的至少一种。
优选地，所述荭草苷、阿司巴汀的特征峰的相对校正因子分别为1.066和1.168。
进一步地，所述色谱条件与系统适用性试验的方法具体为：按照高效液相色谱法，采用Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱或Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照如下梯度洗脱程序进行色谱分析：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；并控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288和350nm。
优选地，在所述供试品溶液的制备中，所述醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液；在所述提取过程中，所述待测样品与醇溶液的用量比为：0.2～0.5g：20～50ml。
进一步地，所述醇溶液的体积浓度为20～80％，优选的，所述醇溶液的体积浓度为60～80％。
优选地，在所述供试品溶液的制备中，超声提取的时间为30～40min，超声频率为35～40kHz。
本发明还提供了上述任一所述的含量测定方法在线叶金雀花、线叶金雀花提取物、线叶金雀花茶、线叶金雀花药物组合物或线叶金雀花药物制剂质量检测及控制领域的应用。
1.本发明所述的线叶金雀花及其制品中有效成分的含量测定方法，通过控制高效液相色谱条件，筛选合适的流动相和梯度洗脱程序，有效克服了因线叶金雀花中成分复杂、杂质种类和含量多而易造成异荭草苷主成分峰干扰的问题以及异荭草苷和荭草苷为同分异构体，分离效果差，相互干扰的问题，不仅简化了待测样品预处理的步骤，而且提高了异荭草苷和荭草苷彼此间的分离度，且与其他杂质峰有效分离开来，建立的HPLC方法不仅专属性强，线性关系、精密度、回收率均满足药物分析要求，而且提取方法简单、运行时间短。
2.本发明所述的线叶金雀花及其制品中有效成分的含量测定方法，还包括荭草苷和阿司巴汀的含量测定步骤，通过前述筛选合适的流动相和梯度洗脱程序，有效克服了因线叶金雀花中成分复杂、杂质种类和含量多而易造成荭草苷和阿司巴汀与其他杂质峰不能有效分离的问题，同时实现了使用同一流动相系统，即可一次性完成线叶金雀花茶中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的含量测定，能够快速、简便的获知该产品的质量情况，解决了现有技术的检测方法仅能够测定单一成分，无法全面控制药材质量的问题，从而实现了通过测定有效成分异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的含量来控制线叶金雀花及其提取物与线叶金雀花茶的质量的目的，且该含量测定方法具有简单快速、稳定可靠、精密度高、易于掌握的优势，此外，采用廉价易得的异荭草苷对作为内参物进行一测多评，可准确测定线叶金雀花及其提取物与线叶金雀花茶中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的含量，节约成本，同时提高检测的准确性。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1是本发明方法学考察中专属性试验的的色谱图；其中A为288nm下线叶金雀花茶阴性对照溶液的色谱图，B为288nm下线叶金雀花供试品溶液的色谱图；C为350nm下线叶金雀花茶阴性对照溶液的色谱图，D为350nm下线叶金雀花供试品溶液的色谱图；
图2是本发明方法学考察中系统适用性试验中混合对照品溶液和线叶金雀花茶的色谱图；其中A为288nm下混合对照溶液的色谱图，B为350nm下混合对照溶液的色谱图，C为288nm下线叶金雀花茶供试品溶液的色谱图，D为350nm下线叶金雀花茶供试品溶液的色谱图；
图3是本发明方法学考察中系统适用性试验中发酵型线叶金雀花和非发酵型线叶金雀花的色谱图；其中A为288nm下发酵型线叶金雀花供试品溶液的色谱图，B为350nm下发酵型线叶金雀花供试品溶液的色谱图，C为288nm下非发酵型线叶金雀花供试品溶液的色谱图，D为350nm下非发酵型线叶金雀花供试品溶液的色谱图；
图4是本发明方法学考察中系统适用性试验中发酵型线叶金雀花提取物和非发酵型线叶金雀花提取物的色谱图；其中A为288nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，B为350nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，C为288nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，D为350nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；
图5是本实施例6和实施例7中的供试品溶液的色谱图；其中A为288nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，B为350nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；C为288nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，D为350nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；
图6是实施例10和实施例11中的供试品溶液的色谱图；其中A为实施例10中288nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，B为实施例10中350nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；C为实施例11中288nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，D为实施例11中350nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；
图7是对比例1中的供试品溶液在350nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；
图8是对比例2中的供试品溶液的色谱图；其中A为288nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，B为350nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；
图9是对比例3中的供试品溶液的色谱图；其中A为288nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，B为350nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；
图10是对比例4中的供试品溶液的色谱图；其中A为288nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，B为350nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图；C为288nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，D为350nm下非发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图。
图11是对比例5中混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图，其中A为为280nm下混合对照品溶液的色谱图，B为350nm下混合对照品溶液的色谱图；C为280nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，D为350nm下发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
1方法学考察
1.1主要试验仪器与试剂
仪器：Agilent 1260液相色谱仪，配置二极管阵列检测器；
试剂：乙腈、甲醇、醋酸、甲酸，均为色谱纯；
线叶金雀花：购自漳州大闽食品有限公司，批号：TLE6124847(发酵型)，TLE6124848(非发酵型)；
线叶金雀花提取物：购自Rooibos Limited，批号：20151022(发酵型)，20150203(非发酵型)。
线叶金雀花茶：由完美(广东)日用品有限公司提供，批号：20180531-1、20180531-2和20180531-3。
不含线叶金雀花提取物的阴性对照样品：由完美(广东)日用品有限公司提供，批号：20180530。
1.2试验方法
混合对照品溶液的制备：按表1所示，精密称取异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品适量，加入含0.2wt％维生素C的60vt％乙醇溶液溶解分别制成每1ml含476.016μg异荭草苷对照品和含444.074μg荭草苷对照品的混合标准储备液以及含182.662μg阿司巴汀对照品的阿司巴汀标准储备液B，然后分别精密吸取两组标准储备液各1ml，置于10ml量瓶中混合，随后加入含0.2wt％维生素C的60vt％乙醇溶液稀释定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；
异荭草苷对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成异荭草苷对照品溶液；
供试品溶液的制备：取线叶金雀花茶0.3g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液20mL，超声处理30min，超声频率为35Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花茶供试品溶液；或
取线叶金雀花提取物0.2g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液约20mL，超声处理30min，超声频率为35Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花提取物供试品溶液；或
取线叶金雀花0.5g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液20mL，超声处理30min，超声频率为40Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
测定：分别精密吸取异荭草苷对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量，采用一测多评法，以异荭草苷为内标物，通过供试品溶液图谱中的异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰值与荭草苷的相对校正因子和阿司巴汀的相对校正因子，通过内标法计算供试品溶液中荭草苷与阿司巴汀的含量。
表1标准储备液的配制表
1.3专属性试验
取不含线叶金雀花提取物的线叶金雀花茶阴性样品，按照上述1.2项下试验方法“供试品溶液的制备”中记载的线叶金雀花茶供试品溶液的制备方法制得线叶金雀花茶阴性对照溶液，取线叶金雀花茶按1.2项下的试验方法制得的线叶金雀花茶供试品溶液，分别按1.2项的试验方法中的“色谱条件与系统适用性试验”测定。结果见图1所示，结果显示288nm和350nm下，线叶金雀花茶阴性对照溶液色谱图中均未见与供试品溶液色谱图中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀相同保留时间的色谱峰，表明阴性对照品溶液对主成分峰的检测没有干扰。
1.4系统适用性试验
取线叶金雀花茶按1.2项下“供试品溶液的制备”中记载的线叶金雀花茶供试品溶液的制备方法制得线叶金雀花茶供试品溶液；取发酵型线叶金雀花提取物和非发酵型线叶金雀花提取物分别按1.2项下“供试品溶液的制备”中记载的线叶金雀花提取物试品溶液的制备方法制得线叶金雀花提取物供试品溶液；取发酵型线叶金雀花和非发酵型线叶金雀花分别按1.2项下“供试品溶液的制备”中记载的线叶金雀花供试品溶液的制备方法制得线叶金雀花供试品溶液；取异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品分别按1.2项下的试验方法制得混合对照品溶液，按1.2项中的色谱条件与系统适用性试验测定；结果如图2-4所示，在350nm下，异荭草苷的保留时间约为20.7min，荭草苷的保留时间约为22.1min，在288nm下，阿司巴汀的保留时间约为24.2min，理论塔板数均大于50000，供试品溶液中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀峰与相邻未知峰的分离度均大于1.5，系统适应性良好。
1.5线性关系考察
按表2精密移取按1.2项下制得的异荭草苷和荭草苷的混合标准储备液和阿司巴汀标准储备液B适量，加入含0.2wt％维生素C的60vt％乙醇溶液稀释配制成一系列实际浓度的对照溶液，每一个浓度的对照溶液各精密量取5μl，注入液相色谱仪，按1.2项下的色谱条件与系统适用性试验测定并记录色谱图，以浓度(μg/ml)对峰面积进行线性回归。
表2系列对照溶液配制表
结论：异荭草苷的线性方程为y＝14.86237x+5.36195(R2＝0.99992)，异荭草苷在4.7602～142.8048μg/mL浓度范围内线性关系良好；荭草苷的线性方程为y＝13.79783x+5.29306(R2＝0.99992)，荭草苷在4.4407～133.2223μg/mL浓度范围内线性关系良好；阿司巴汀的线性方程为y＝12.34226x+0.844934(R2＝0.99997)，阿司巴汀在1.8266～54.7985μg/mL浓度范围内线性关系良好。
1.6精密度试验
精密量取按1.2项下制得的混合对照品溶液，按1.2项下的色谱条件，连续进样6次，测定异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰面积，计算峰面积的RSD值。结果见表3所示，异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的保留时间与峰面积的RSD均小于2％，表明仪器精密度良好。
表3精密度试验结果
1.7重复性试验
分别取线叶金雀花茶0.3g、线叶金雀花提取物0.2g以及线叶金雀花0.5g各6份，精密称定，分别按1.2项下的方法制备线叶金雀花茶供试品溶液、线叶金雀花提取物供试品溶液和线叶金雀花供试品溶液，依照1.2项下的色谱条件测定。异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的含量用色谱数据处理软件中的外标法计算，结果见表4。由表4可知，6份平行样测试结果的RSD小于2％，表明本法具有较好的重复性。
表4重复性试验结果表
1.8准确度和回收率试验
分别取线叶金雀花提取物0.1g、线叶金雀花0.25g以及线叶金雀花茶0.15g各9份，精密称定，根据低、中、高浓度对照品加入量与供试品中待测成分含量之比在0.8:1、1:1、1.2:1，按表5-1、5-2、5-3、6-1、6-2、6-3、7-1、7-2和7-3所示加入异荭草苷标准品溶液、荭草苷标准品溶液和阿司巴汀标准品溶液，按1.2项下方法分别制备线叶金雀花提取物供试品溶液、线叶金雀花供试品溶液和线叶金雀花茶供试品溶液，按1.2项下的色谱条件测定。结果见表5-1、5-2、5-3、6-1、6-2、6-3、7-1、7-2和7-3所示，回收率均在95％-105％之间，表明本法具有较好的准确度。
表5-1线叶金雀花茶中异荭草苷的回收率试验结果
表5-2线叶金雀花茶中荭草苷的回收率试验结果
表5-3线叶金雀花茶中阿司巴汀的回收率试验结果
表6-1线叶金雀花提取物中异荭草苷的回收率试验结果
表6-2线叶金雀花提取物中荭草苷的回收率试验结果
表6-3线叶金雀花提取物中阿司巴汀的回收率试验结果
表7-1线叶金雀花中异荭草苷的回收率试验结果
表7-2线叶金雀花中荭草苷的回收率试验结果
表7-3线叶金雀花中阿司巴汀的回收率试验结果
1.9稳定性试验
取同一混合对照品试液和供试品溶液，按1.2项下色谱条件，分别于0、8、16、24h进样测定。结果见表8。结果表明异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀峰的峰面积的RSD均小于2％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
表8稳定性试验结果
1.10耐用性试验
取1.2项下制备的供试品溶液，分别考察流速(0.9mL/min和1.1mL/min)、柱温(23℃和30℃)、不同批次色谱柱和不同仪器(1.Agilent 1260，色谱柱Waters Symmetry C18，批号为0309372961；2.Waters UPLC H-Class，色谱柱Waters Symmetry C18，批号为0314380961；3.Waters UPLC H-Class，色谱柱Waters Symmetry C18，批号为0313380991)等条件的变化对色谱分离和含量测定结果的影响，结果见表9。
结果表明，流速和柱温条件的微小变化对色谱峰分离效果无明显影响，待测成分含量的误差均小于5％，且在不同批次色谱柱、不同仪器上的重现性较好，表明该方法耐用性较好。
表9耐用性考察结果
1.11定量限和检出限考察
取浓度为30.7192μg/mL的异荭草苷与浓度为29.0567μg/mL的荭草苷混合标准溶液，逐级稀释，依照1.2项下的色谱条件测定。通过工作站色谱软件计算出异荭草苷的浓度为4.9ng/mL时其信噪比为3.6、浓度为24.6ng/mL时其信噪比为13.5；荭草苷的浓度为4.6ng/mL时其信噪比为3.5、浓度为23.2ng/mL时其信噪比为12.0。即异荭草苷的检出限为4.9ng/mL，定量限为24.6ng/mL；荭草苷的检出限为4.6ng/mL，定量限为23.2ng/mL。
取浓度为6.893μg/mL的阿司巴汀标准溶液，逐级稀释，依照1.2项下的色谱条件测定。通过工作站色谱软件计算出阿司巴汀浓度为34.5ng/mL时的信噪比为2.7，浓度为137.9ng/mL时的信噪比为10.7。即阿司巴汀的检出限为34.5ng/mL，定量限为137.9ng/mL。
1.12相对校正因子的计算
按项1.5下试验方法制得的6个浓度的对照溶液，各三份，即为对照品溶液A，对照品溶液B和对照品溶液C，分别在下述不同时间注入不同液相色谱仪，记录保留时间和峰面积，并绘制曲线。以异荭草苷为内标，分别计算荭草苷的相对校正因子fsi以及阿司巴汀的相对校正因子fsi，得出荭草苷的相对校正因子为1.068，阿司巴汀的相对校正因子为1.165，结果见下表所示，
*注：1为对照品溶液A在Agilent 1260仪器上测得的结果；2为对照品溶液A于10天后在Agilent1260仪器上测得的结果；3为对照品溶液B在Agilent 1260仪器上测得的结果；4为对照品溶液B于10天后在Agilent 1260仪器上测得的结果；5为对照品溶液B于10天后在Waters UPLC H-Class仪器上测得的结果；6为对照品溶液C在Waters UPLC H-Class仪器上测得的结果；7为对照品溶液C于1天后在Waters UPLC H-Class仪器上测得的结果。
1.13相对保留时间的计算
在项1.2色谱条件下，取按项1.2下配制的混合对照品溶液，以及1.2下制备的供试品溶液，分别在不同时间注入不同液相色谱仪，记录保留时间。以异荭草苷为参照物，计算荭草苷、阿司巴汀与异荭草苷的保留时间的比值，得出荭草苷的相对保留时间为1.066，阿司巴汀的相对保留时间为1.168。
*注：1为对照品溶液在Agilent 1260仪器上测得的结果平均值；2为2天后对照品溶液在Agilent1260仪器上测得的结果平均值；3为供试品溶液在Agilent 1260仪器上测得的结果平均值；4为2天后供试品溶液在Agilent 1260仪器上测得的结果平均值；5为5天后对照品溶液和供试品溶液在Agilent 1260仪器上测得的结果平均值；6为对照品溶液在Waters UPLC H-Class仪器上测得的结果平均值；7为供试品溶液在Waters UPLC H-Class仪器上测得的结果平均值；8为1天后对照品溶液在Waters UPLC H-Class仪器上测得的结果平均值；9为1天后供试品溶液在Waters UPLC H-Class仪器上测得的结果平均值。
1.14相对校正因子和相对保留时间的耐用性考察
取项1.2制备的标准品溶液，分别考察流速(0.9mL/min～1.1mL/min)、柱温(23℃～30℃)、不同批次色谱柱和不同仪器(1.Agilent 1260，色谱柱Waters Symmetry C18，批号为0309372961；2.Waters UPLC H-Class，色谱柱Waters Symmetry C18，批号为0314380961；3.Waters UPLC H-Class，色谱柱Waters Symmetry C18，批号为0313380991)等条件的变化对荭草苷及阿司巴汀相对校正因子和相对保留时间的影响，结果见下表所示。
结果表明，流速和柱温条件的微小变化、不同仪器对荭草苷及阿司巴汀的相对校正因子和相对保留时间均无明显影响(RSD＜5％)，且在不同批次色谱柱上的重现性较好。
1.15一测多评法与外标法测定结果的比较
取线叶金雀花、线叶金雀花提取物及线叶金雀花茶，按项1.2下的试验方法制备标准品溶液和供试品溶液，按项1.2下色谱条件进行测定，通过一测多评法确定各待测色谱峰峰位，并计算其含量。再用外标法测定各成分的含量。结果见下表。结果表明相对保留值法能较准确的定位阿司巴汀色谱峰，且将2种方法所得含量经秩和检验分析二者差异，结果荭草苷两组数据间P值为0.739，阿司巴汀两组数据间P值为0.075，均大于0.05，故荭草苷、阿司巴汀外标法实测值与一测多评法计算值间无显著性差异，表明建立的一测多评法(QAMS)法准确可行。
实施例1
本实施例所述的线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
混合对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成每1ml含476.016μg异荭草苷对照品和含444.074μg荭草苷对照品的混合标准储备液以及含182.662μg阿司巴汀对照品的阿司巴汀标准储备液B，然后精密吸取两组标准储备液各1ml，置于10ml量瓶中混合，随后加入60vt％乙醇溶液稀释定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：取发酵型线叶金雀花提取物0.2g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液约20mL，超声处理30min，超声频率为35Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花提取物供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
实施例2
本实施例所述的线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
混合对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品适量，加入含0.2wt％维生素C的60vt％乙醇溶液溶解分别制成每1ml含476.016μg异荭草苷对照品和含444.074μg荭草苷对照品的混合标准储备液以及含182.662μg阿司巴汀对照品的阿司巴汀标准储备液B，然后精密吸取两组标准储备液各1ml，置于10ml量瓶中混合，随后加入含0.2wt％维生素C的60vt％乙醇溶液稀释定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：取非发酵型线叶金雀花提取物0.2g，精密称定，置50mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液约40mL，超声处理40min，超声频率为40Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花提取物供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
实施例3
本实施例所述的线叶金雀花茶中有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
异荭草苷对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成异荭草苷对照品溶液；
供试品溶液的制备：取线叶金雀花茶0.3g，精密称定，置20mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液约15mL，超声处理35min，超声频率为35Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花提取物供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
测定法：分别精密吸取异荭草苷对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量，采用一测多评法，以异荭草苷为内标物，通过供试品溶液图谱中的异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰值与荭草苷的相对校正因子和阿司巴汀的相对校正因子，通过内标法计算供试品溶液中荭草苷与阿司巴汀的含量。
实施例4
本实施例所述的线叶金雀花中有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
异荭草苷对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成异荭草苷对照品溶液；
供试品溶液的制备：取发酵型线叶金雀花0.5g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液约20mL，超声处理30min，超声频率为35Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花提取物供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
测定法：分别精密吸取异荭草苷对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量，采用一测多评法，以异荭草苷为内标物，通过供试品溶液图谱中的异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰值与荭草苷的相对校正因子和阿司巴汀的相对校正因子，通过内标法计算供试品溶液中荭草苷与阿司巴汀的含量。
实施例5
本实施例所述的线叶金雀花中有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
异荭草苷对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成异荭草苷对照品溶液；
供试品溶液的制备：取非发酵型线叶金雀花0.5g，精密称定，置50mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液约40mL，超声处理30min，超声频率为35Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花提取物供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
测定法：分别精密吸取异荭草苷对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量，采用一测多评法，以异荭草苷为内标物，通过供试品溶液图谱中的异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰值与荭草苷的相对校正因子和阿司巴汀的相对校正因子，通过内标法计算供试品溶液中荭草苷与阿司巴汀的含量。
实施例6
本实施例所述的线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，与实施例1的区别仅在于，色谱条件与系统适用性试验不同，本实施例的色谱条件与系统适用性试验具体为：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度0.2％甲酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-30min，流动相A：流动相B为10％：90％→14％：86％；30-35min，流动相A：流动相B为14％：86％→100％：0％；35-45min，流动相A：流动相B为100％：0％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
结果如图5所示，供试品溶液中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀峰与相邻未知峰的分离度均大于1.5，分离效果良好，然而保留时间和仪器运行时间较长。
实施例7
本实施例所述的线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，与实施例2的区别仅在于，色谱条件与系统适用性试验中，本实施例采用体积浓度0.2％甲酸溶液代替实施例2中的体积浓度1％醋酸溶液，结果如图5所示，供试品溶液中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀峰与相邻未知峰的分离度均大于1.5，分离效果良好，然而保留时间和仪器运行时间较长。
实施例8
本实施例所述的发酵型线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
混合对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成每1ml含476.016μg异荭草苷对照品和含444.074μg荭草苷对照品的混合标准储备液以及含182.662μg阿司巴汀对照品的阿司巴汀标准储备液B，取混合标准储备液和阿司巴汀标准储备液B加入醇溶液制成一系列浓度的含异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品的混合对照品溶液；
异荭草苷对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成异荭草苷对照品溶液；
供试品溶液的制备：取发酵型线叶金雀花提取物0.2g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液约20mL，超声处理30min，超声频率为35Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花提取物供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
测定法：分别精密吸取异荭草苷对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量，采用一测多评法，精密吸取一系列浓度的混合对照品溶液，在所述色谱条件下，分别注入液相色谱仪，分别制得异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的标准曲线，以异荭草苷为内标物，利用标准曲线的斜率计算出荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子；通过供试品溶液图谱中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰值与荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子，通过内标法计算供试品溶液中荭草苷和阿司巴汀的含量。
实施例9
本实施例所述的非发酵型线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：
混合对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成每1ml含476.016μg异荭草苷对照品和含444.074μg荭草苷对照品的混合标准储备液以及含182.662μg阿司巴汀对照品的阿司巴汀标准储备液B，取混合标准储备液和阿司巴汀标准储备液B加入醇溶液制成一系列浓度的含异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品的混合对照品溶液；
异荭草苷对照品溶液的制备：精密称取异荭草苷对照品适量，加入60vt％乙醇溶液溶解分别制成异荭草苷对照品溶液；
供试品溶液的制备：取非发酵型线叶金雀花提取物0.2g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入60vt％乙醇溶液约20mL，超声处理30min，超声频率为35Hz，放冷，用60vt％乙醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得线叶金雀花提取物供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288nm和350nm；进样量5μl；柱温：25℃；
测定法：分别精密吸取异荭草苷对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量，采用一测多评法，精密吸取一系列浓度的混合对照品溶液，在所述色谱条件下，分别注入液相色谱仪，分别制得异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的标准曲线，以异荭草苷为内标物，利用标准曲线的斜率计算出荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子；通过供试品溶液图谱中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰值与荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子，通过内标法计算供试品溶液中荭草苷和阿司巴汀的含量。
实施例10
本实施例所述的发酵型线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，与实施例1的区别仅在于色谱柱不同，本实施例中采用Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)柱替代实施例8中采用的Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱，结果如图6所示，异荭草苷的保留时间为22.445min，荭草苷的保留时间为23.661min，阿司巴汀的保留时间为25.342min；以异荭草苷为参照，计算出荭草苷的相对保留时间为1.0542，阿司巴汀的相对保留时间为1.1291，满足一测多评法要求相对保留时间误差范围需在±5％以内。
实施例11
本实施例所述的非发酵型线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，与实施例9的区别仅在于色谱柱不同，本实施例中采用Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)柱替代实施例1中采用的Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱，结果如图6所示，异荭草苷的保留时间为22.456min，荭草苷的保留时间为23.672min，阿司巴汀的保留时间为25.346min；以异荭草苷为参照，计算出荭草苷的相对保留时间为1.0542，阿司巴汀的相对保留时间为1.1287，可以满足一测多评法要求相对保留时间误差范围需在±5％以内。
对比例1
本对比例所述的线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，与实施例1的区别仅在于色谱条件不同，本对比例中采用的色谱条件为：
按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度0.1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-60min，流动相A：流动相B为5％：95％→100％：0％，控制流动相流速为1ml/min；检测波长为350nm，结果如图7所示，异荭草苷色谱峰、荭草苷色谱峰与阿司巴汀色谱峰与相邻干扰峰均不能有效分离，分离效果差。
对比例2
本对比例所述的线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，与实施例2的区别仅在于色谱条件不同，本对比例中采用的色谱条件为：
按照高效液相色谱法测定，以Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度0.1％的醋酸溶液为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
本对比例中采用的梯度洗脱程序具体为：0-30min，流动相A：流动相B为10％：90％→14％：86％；30-50min，流动相A：流动相B为14％：86％，控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288和350nm，结果如图8所示，从A中可以看出，288nm下，阿司巴汀与相邻未知峰的分离度为1.10，分离度小于1.5，分离度不能满足色谱分析的要求。
对比例3
本对比例所述的线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，与实施例2的区别仅在于色谱柱不同，本对比例中采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)柱替代实施例1中采用的Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱，结果如图9所示，其中，从图A中可知，288nm下，阿司巴汀与相邻未知峰的分离度为1.24，小于1.5，分离度不能满足色谱分析的要求。
对比例4
本对比例所述的线叶金雀花提取物中有效成分的含量测定方法，与实施例1的区别仅在于色谱柱不同，本对比例中采用Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)柱替代实施例1中采用的Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)柱，结果如图10所示，异荭草苷的保留时间为15.795min，荭草苷的保留时间为18.188min，阿司巴汀的保留时间为20.774min；以异荭草苷为参照，计算出荭草苷的相对保留时间为1.1515，阿司巴汀的相对保留时间为1.3152，不能满足一测多评法要求相对保留时间误差范围需在±5％内。
对比例5
本对比例参照背景技术中引用的文献，与实施例1的区别仅在于色谱条件不同，本对比例采用SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以体积浓度0.25％的甲酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析；
所述梯度洗脱程序具体为：0-5min，流动相A：流动相B为80％：20％；5-25min，流动相A：流动相B为80％：20％→70％：30％；25-40min，流动相A：流动相B为70％：30％→65％：35％；40-50min，流动相A：流动相B为65％：35％→60％：40％；50-70min，流动相A：流动相B为60％：40％→80％：20％；70-80min，流动相A：流动相B为80％：20％；控制流动相流速为0.4ml/min；检测波长为280nm和350nm；进样量10μl；柱温：38℃。结果见图11所示，由图A和B可知，混合对照品溶液在上述色谱条件下仅显示2个色谱峰，其中荭草苷和阿司巴汀的特征峰完全重合，并不能有效分离，由图C和D可知，发酵型线叶金雀花提取物供试品溶液的色谱图，各色谱峰分离度较差，均小于1.5，因此，在该色谱条件下，并不能准确测定线叶金雀花中荭草苷、异荭草苷和阿司巴汀的含量。
实验例1提取溶剂浓度的考察
本实验考察了体积浓度分别为20％乙醇溶液、40％乙醇溶液、50％乙醇溶液、60％乙醇溶液、70％乙醇溶液、80％乙醇溶液、95％乙醇溶液，共7种提取溶剂浓度。
分别取发酵型线叶金雀花提取物0.2g、非发酵型线叶金雀花提取物0.2g、发酵型线叶金雀花0.5g、非发酵型线叶金雀花0.5g以及线叶金雀花茶0.3g各7份，精密称定，置25mL容量瓶中，分别加入上述溶液约20mL，超声处理30min，放冷，用相应溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，按1.2项下记载的色谱条件进行测定，结果见表10-1、10-2、11-1、11-2和12-1所示。结果显示，采用体积浓度20％～80％的乙醇溶液为提取溶剂提取时，发酵型线叶金雀花提取物、非发酵型线叶金雀花提取物和线叶金雀花茶的含量相对标准偏差均小于3％，而当乙醇溶液浓度为60％和80％时，测得的线叶金雀花中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的含量最高，因此，优选体积浓度60％的乙醇溶液为提取溶剂。
表10-1不同浓度的乙醇溶液对发酵型线叶金雀花提取物的提取结果表
表10-2不同浓度的乙醇溶液对非发酵型线叶金雀花提取物的提取结果表
表11-1不同浓度的乙醇溶液对发酵型线叶金雀花的提取结果表
表11-2不同浓度的乙醇溶液对非发酵型线叶金雀花的提取结果表
表12-1不同浓度的乙醇溶液对线叶金雀花茶的提取结果表
实验例2提取溶剂种类的考察
本实验考察了水、体积浓度60％乙醇溶液、体积浓度60％甲醇溶液3种提取试剂对发酵型线叶金雀花提取物、非发酵型线叶金雀花提取物、发酵型线叶金雀花、非发酵型线叶金雀花以及线叶金雀花茶的提取效果。
分别取发酵型线叶金雀花提取物0.2g、非发酵型线叶金雀花提取物0.2g、发酵型线叶金雀花0.5g、非发酵型线叶金雀花0.5g以及线叶金雀花茶0.3g各3份，精密称定，置25mL容量瓶中，分别加入上述溶液约20mL，超声处理30min，放冷，用相应溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，按1.2项下记载的色谱条件进行测定，结果见表13-1、13-2、14-1、14-2和15-1所示。结果显示，采用水为提取溶剂提取时，比采用体积浓度60％的乙醇溶液或体积浓度60％的甲醇溶液为提取溶剂提取所得的含量低，三者的结果相对标准偏差大于5％，采用体积浓度60％的乙醇溶液为提取溶剂提取时，发酵型线叶金雀花提取物、非发酵型线叶金雀花提取物、发酵型线叶金雀花、非发酵型线叶金雀花以及线叶金雀花茶的含量均较其它提取溶剂高，因此，优选体积浓度60％的乙醇溶液或体积浓度60％的甲醇溶液为提取溶剂。
表13-1不同提取溶剂对发酵型线叶金雀花提取物的提取结果表
表13-2不同提取溶剂对非发酵型线叶金雀花提取物的提取结果表
表14-1不同提取溶剂对发酵型线叶金雀花的提取结果表
表14-2不同提取溶剂对非发酵型线叶金雀花的提取结果表
表15-1不同提取溶剂对线叶金雀花茶的提取结果表
实验例3提取时间的考察
本实验考察了30min和60min的两种提取时间对发酵型线叶金雀花提取物、非发酵型线叶金雀花提取物、发酵型线叶金雀花、非发酵型线叶金雀花以及线叶金雀花茶的提取效果。
分别取发酵型线叶金雀花提取物0.2g、非发酵型线叶金雀花提取物0.2g、发酵型线叶金雀花0.5g、非发酵型线叶金雀花0.5g以及线叶金雀花茶0.3g各3份，精密称定，置25mL容量瓶中，分别加入上述溶液约20mL，超声处理上述时间，放冷，用相应溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，按1.2项下记载的色谱条件进行测定，结果见表16-1、16-2、17-1、17-2和18-1所示。结果显示，超声处理(37kHz，500w)30min提取时，发酵型线叶金雀花提取物、非发酵型线叶金雀花提取物、发酵型线叶金雀花、非发酵型线叶金雀花以及线叶金雀花茶的含量结果最高，因此，优选提取时间为30min。
表16-1不同提取时间对发酵型线叶金雀花提取物的提取结果表
表16-2不同提取时间对非发酵型线叶金雀花提取物的提取结果表
表17-1不同提取时间对发酵型线叶金雀花的提取结果表
表17-2不同提取时间对非发酵型线叶金雀花的提取结果表
表18-1不同提取时间对线叶金雀花茶的提取结果表
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种线叶金雀花及其制品中有效成分的含量测定方法，其特征在于，包括如下异荭草苷的含量测定步骤：
A异荭草苷的含量测定
制备异荭草苷对照品溶液；
供试品溶液的制备：取待测样品，加入醇溶液，超声提取或热回流提取，放冷，加入醇溶液稀释定容，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
色谱条件与系统适用性试验：按照高效液相色谱法测定，采用Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱或Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度0.8-1.5％的醋酸溶液或以体积浓度0.1-0.5％的甲酸为流动相B；按照梯度洗脱程序进行色谱分析，控制流动相流速为0.8-1.2ml/min；检测波长为275～295nm和340～360nm；
测定法：分别吸取异荭草苷对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，测定并计算供试品溶液中异荭草苷的含量。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，还包括如下荭草苷和阿司巴汀的含量测定步骤：
B荭草苷和阿司巴汀的含量测定
取异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品，加入醇溶液制成一系列浓度的含异荭草苷对照品、荭草苷对照品和阿司巴汀对照品的混合对照品溶液，在所述色谱条件下，分别注入液相色谱仪，分别制得异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的标准曲线，利用标准曲线的斜率计算出荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子；
通过供试品溶液图谱中异荭草苷、荭草苷和阿司巴汀的峰值与荭草苷和阿司巴汀的相对校正因子，通过内标法计算供试品溶液中荭草苷和阿司巴汀的含量。
3.根据权利要求1或2所述的含量测定方法，其特征在于，所述待测样品为线叶金雀花、线叶金雀花提取物、线叶金雀花茶、线叶金雀花药物组合物或线叶金雀花药物制剂中的至少一种。
4.根据权利要求1-3中任一所述的含量测定方法，其特征在于，所述线叶金雀花包括发酵型线叶金雀花和非发酵型线叶金雀花中的至少一种，所述线叶金雀花提取物包括发酵型线叶金雀花提取物和非发酵型线叶金雀花提取物中的至少一种。
5.根据权利要求1-4中任一所述的含量测定方法，其特征在于，所述荭草苷、阿司巴汀的特征峰的相对校正因子分别为1.066和1.168。
6.根据权利要求1-5中任一所述的含量测定方法，其特征在于，所述色谱条件与系统适用性试验的方法具体为：按照高效液相色谱法，采用Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱或Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度1％的醋酸溶液为流动相B；按照如下梯度洗脱程序进行色谱分析：0-12min，流动相A：流动相B为12％：88％；12-25min，流动相A：流动相B为12％：88％→20％：80％；25-28min，流动相A：流动相B为20％：80％；28-28.01min，流动相A：流动相B为20％：80％→100％：0；28.01-38min，流动相A：流动相B为100％：0；38-38.01min，流动相A：流动相B为100％：0→12％：88％；38.01-50min，流动相A：流动相B为12％：88％；并控制流动相流速为1ml/min；检测波长为288和350nm。
7.根据权利要求1-6中任一所述的含量测定方法，其特征在于，在所述供试品溶液的制备中，所述醇溶液为乙醇溶液或甲醇溶液；在所述提取过程中，所述待测样品与醇溶液的用量比为：0.2～0.5g：20～50ml。
8.根据权利要求1-7中任一所述的含量测定方法，其特征在于，所述醇溶液的体积浓度为20～80％；优选的，所述醇溶液的体积浓度为60～80％。
9.根据权利要求1-8中任一所述的含量测定方法，其特征在于，在所述供试品溶液的制备中，超声提取的时间为30～40min，超声频率为35～40kHz。
10.一种根据权利要求1-9任一所述的含量测定方法在线叶金雀花、线叶金雀花提取物、线叶金雀花茶、线叶金雀花药物组合物或线叶金雀花药物制剂质量检测及控制领域的应用。
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