CN109929821A - 一种角质酶突变体及其在白水处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种角质酶突变体及其在白水处理中的应用，属于酶工程技术领域。本发明的角质酶突变体水解聚醋酸乙烯酯等树脂类物质的活力高、白水处理效果好，其水解聚醋酸乙烯酯的活力可较野生型提高1.72倍、白水处理效果可较野生型提高54％，在白水处理领域有极高的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种角质酶突变体及其在白水处理中的应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
造纸废水主要包括黑液、中段水和白水。其中，白水为纸页成型过程中，从纸机的网部及压榨部脱出的水。白水中含有大量的细小纤维、无机填料以及各种化学助剂，因此，业界通常将白水回用于造纸浆料的制备，这样不仅可节约清水的用量，减少纤维和化学品的流失，节省资源和降低成本，也可减少对环境污染，有利于环保。
但是，白水如果不经过处理直接回用，随着白水封闭循环程度的提高，白水中的有害物质也会逐渐积累，造成系统电荷量增加、聚电解质增多，最终影响化学助剂的作用效果，使得由该浆料所制得纸张的一次保留率及填料留着率变差，成纸出现破孔等品质问题。
在这些有害物质中，对造纸湿部化学影响最大、最难处理的是白水中的溶解物质和胶体物质(DCS)。DCS可来源于可溶性木材抽出物(如小分子木素、淀粉、7帽类)，可来源于树脂等天然物质，可来源于水和生产过程中添加的各种有机和无机添加剂，也可来源于应用的化学药品。
其中，树脂类物质是一些溶于中性有机溶剂的憎水性物质，这部分物质在造纸过程中会以多种形式沉积在设备表面，因此，树脂类物质不仅可使纸质品质下降，还会对造纸设备本身造成危害，是白水处理中最亟待解决的问题。
目前，白水中树脂类物质无法被现有化学试剂分解，主要通过添加絮凝剂等化学助剂的方法解决，此方法无法从根本上处理树脂类物质。
幸运的是，江南大学吴敬教授等人已经发现角质酶可水解聚醋酸乙烯酯等树脂类物质，且水解过程具有稳定且绿色无污染的优势，因此，角质酶在白水处理中有极高的应用前景。
不过，在使用角质酶处理白水的过程中，依然存在角质酶水解活力不足、白水处理效果欠佳的问题，此问题大大阻碍了角质酶在白水处理中的应用。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是得到一种水解聚醋酸乙烯酯等树脂类物质活力高、白水处理效果好的角质酶。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种角质酶突变体，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸和/或第169位异亮氨酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为异亮氨酸得到的；
所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为丙氨酸得到的；
所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为缬氨酸得到的；
所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第169位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的；
所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第169位异亮氨酸突变为丙氨酸得到的；
所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第169位异亮氨酸突变为缬氨酸得到的；
所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为丙氨酸以及第169位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的；
所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为丙氨酸以及第169位异亮氨酸突变为丙氨酸得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、 SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ IDNo.9。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶来源于特异腐质霉(Humicolainsolens)。
本发明还提供了编码上述角质酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pUC载体、pET载体或pGEX载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET20b(+)载体。
本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了上述角质酶突变体的制备方法，所述方法为使用上述宿主细胞，将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB培养基或TB培养基。
本发明还提供了应用上述方法制备得到的角质酶突变体。
本发明还提供了上述角质酶突变体或上述制备得到的角质酶突变体在水解聚醋酸乙烯酯方面的应用。
本发明还提供了一种处理白水的方法，所述方法为将上述角质酶突变体或上述制备得到的角质酶突变体添加入白水中进行酶解。
在本发明的一种实施方式中，所述角质酶突变体在白水中的添加量为2.5～5U/g。
[有益效果]
本发明的角质酶突变体水解聚醋酸乙烯酯等树脂类物质的活力高、白水处理效果好，其水解聚醋酸乙烯酯的活力可较野生型提高1.72倍、白水处理效果可较野生型提高54％，在白水处理领域有极高的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21(DE3)购自生工生物工程(上海) 股份有限公司，pET-20b(+)质粒购自Novagen公司，造纸厂二级循环剩余白水来源于浙江某造纸厂。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1；
TB培养基：胰蛋白胨12g·L-1，酵母粉24g·L-1，甘油5g·L-1，KH2PO4 2.31g·L-1，K2HPO4·3H2O 16.43g·L-1，甘氨酸7.5g·L-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
角质酶的酶活测定方法：在37℃下，采用连续分光光度法测定酶活力。
反应总体积为1.5mL，包括30μL发酵粗酶液和1470μL含50mmol/L硫磺脱氧胆酸钠和50mmol/L对硝基苯丁酸酯(pNPB)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，在波长405nm处，记录对硝基酚的生成速率；
酶活的定义为：在37℃，每分钟将对硝基苯丁酸酯催化水解生成1μmol对硝基酚所需要的酶量即为一个酶活力单位(1U)。
浊度的检测方法：参考国标GB 13200-91《水质浊度的测定》。
实施例1：野生型角质酶的表达
具体步骤如下：
(1)根据NCBI中来源于特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶的基因序列(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)，得到重组质粒HIcut/pET20b(+)(重组质粒HIcut/pET20b(+) 的构建方法可参考文献：孙益荣,吴敬,宿玲恰.特异腐质霉角质酶在大肠杆菌中的表达和发酵优化[J].食品与机械,2018(4).)；
(2)将重组质粒HIcut/pET20b(+)转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到 HIcut/pET20b(+)/BL21(DE3)；
(3)接种HIcut/pET20b(+)/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)生长8h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L氨苄青霉素)；大肠杆菌在25℃摇床培养发酵48h后，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为野生酶发酵粗酶液。
检测野生酶发酵粗酶液中的角质酶酶活，检测结果为85U/mL。
实施例2：角质酶单突变体的制备及表达
具体步骤如下：
(1)单突变体的制备
根据NCBI中来源于特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶的基因序列(核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)，分别设计并合成引入突变的引物，并利用快速PCR技术，以实施例1中的携带编码野生型角质酶的基因的表达载体HIcut/pET-20b(+)为模板，对角质酶基因 HIcut进行定点突变，得到角质酶突变体；分别测序确认酶突变体的编码基因是否正确，并将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到突变角质酶；
其中，引入L66I突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的正向引物：5’-CATACGATGCCGCCTATGCTACTAA -3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的反向引物：5’-GAAAAGTTAGTAGCATAGGCGGCAT -3’(下划线为突变碱基)；
引入L66A突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的正向引物：5’-CATACGATGCCGCCGCAGCTACTAA -3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的反向引物：5’-GAAAAGTTAGTAGCTGCGGCGGCAT -3’(下划线为突变碱基)；
引入L66V突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的正向引物：5’-CATACGATGCCGCCGTAGCTACTAA -3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的反向引物：5’-GAAAAGTTAGTAGCTACGGCGGCAT -3’(下划线为突变碱基)；
引入I169L突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的正向引物：5’-ACCGGAACTTTAATTTATACTCCT-3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的反向引物：5’-AGATGAGCAGGAGTAATAATTAAAGT-3’(下划线为突变碱基)；
引入I169A突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的正向引物：5’-ACCGGAACTTTAATTGCTACTCCT -3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的反向引物：5’-AGATGAGCAGGAGTAGCAATTAAAGT-3’(下划线为突变碱基)；
引入I169V突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的正向引物：5’-ACCGGAACTTTAATTGTAACTCCT -3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.22所示的反向引物：5’-AGATGAGCAGGAGTACATATTAAAGT-3’(下划线为突变碱基)；
引入I169H突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.23所示的正向引物：5’-ACCGGAACTTTAATTCATACTCCT -3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.24所示的反向引物：5’-AGATGAGCAGGAGTAATGATTAAAGT-3’下划线为突变碱基)；
PCR反应体系为：20μM正向引物和反向引物各0.5μL，dNTPMix 4μL，5×PS Buffer10 μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5μL，模板0.5μL，加双蒸水补齐50μL；
PCR条件为：94℃预变性4min；随后进行25个循环(94℃10s，55℃5s，72℃7min50s)72℃延伸10min；最后4℃保温，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测；
将上述验证正确的PCR产物进行Dpn I消化，转入大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，经37℃过夜培养，平板上挑取2个单菌落，接入LB液体培养基，8h后提取质粒并测序，得到测序正确的分别携带有突变体L66I、L66A、L66V、I169L、I169A、I169V或I169H的重组质粒。
(2)双突变体的制备
以携带有突变体L66A的重组质粒作为模版，分别设计并合成引入突变的引物，并利用快速PCR技术，对角质酶基因HIcut再次进行定点突变，得到角质酶突变体；分别测序确认酶突变体的编码基因是否正确，并将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到突变角质酶；
其中，引入L66A/I169L突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.25所示的正向引物：5’-ACCGGAACTTTAATTTATACTCCT-3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.26所示的反向引物：5’-AGATGAGCAGGAGTAATAATTAAAGT-3’(下划线为突变碱基)；
引入L66A/I169A突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的正向引物：5’-ACCGGAACTTTAATTGCTACTCCT -3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.28所示的反向引物：5’-AGATGAGCAGGAGTAGCAATTAAAGT-3’(下划线为突变碱基)；
引入L66A/I169H突变的定点突变引物为：
核苷酸序列如SEQ ID No.29所示的正向引物：5’-ACCGGAACTTTAATTCATACTCCT -3’(下划线为突变碱基)；
核苷酸序列如SEQ ID No.30所示的反向引物：5’-AGATGAGCAGGAGTAATGATTAAAGT-3’(下划线为突变碱基)；
PCR反应体系为：20μM正向引物和反向引物各0.5μL，dNTPMix 4μL，5×PS Buffer10 μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5μL，模板0.5μL，加双蒸水补齐50μL；
PCR条件为：94℃预变性4min；随后进行25个循环(94℃10s，55℃5s，72℃7min50s)72℃延伸10min；最后4℃保温，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测；
将上述验证正确的PCR产物进行Dpn I消化，转入大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，经37℃过夜培养，平板上挑取2个单菌落，接入LB液体培养基，8h后提取质粒并测序，得到测序正确的分别携带有突变体L66A/I169L、L66A/I169A或L66A/I169H的重组质粒。
(3)突变体的表达
接种上述测序正确的重组质粒于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)生长8h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L氨苄青霉素)；大肠杆菌在25℃摇床培养发酵48h后，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心15min，取发酵上清，即为突变体的发酵粗酶液。
检测突变体L66I、L66A、L66V、I169L、I169A、I169V、I169H、L66A/I169L、L66A/I169A、L66A/I169H的发酵粗酶液中的角质酶酶活，检测结果分别为82U/mL、78U/mL、75U/mL、 113U/mL、128U/mL、125U/mL、120U/mL、116U/mL、112U/mL、95U/mL。
实施例3：角质酶及角质酶突变体在水解聚醋酸乙烯酯方面的应用
具体步骤如下：
取1mL聚醋酸乙烯酯(约1g/mL)乳液加入到99mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，混合均匀后取10mL加入200U实施例1-2得到的野生角质酶或角质酶突变体，在50℃水浴中精确反应120min后，取5mL样品加入5mL 95％的乙醇终止反应，然后利用0.05mol/L氢氧化钠标准液在电位滴定仪上滴定至pH 10.3为终点，根据滴定消耗的氢氧化钠标准液的体积来判断角质酶对聚醋酸乙烯酯的分解情况(结果如表1所示)。
由表1可知，突变体L66I、L66A、L66V、I169L、I169A、I169V、L66A/I169L、L66A/I169A 的水解聚醋酸乙烯酯能力较野生角质酶有了明显提高，其中，突变体L66A/I169L、L66A/I169A 分别较野生酶分别提高了1.52和1.72倍；突变体I169H、L66A/I169H的水解聚醋酸乙烯酯能力较野生角质酶有了明显下降，较野生酶分别降低了16％和4％。
表1角质酶突变体水解聚醋酸乙烯酯
| 酶 | 氢氧化钠消耗量(mL) |
| 野生酶 | 5 |
| L66I | 5.4 |
| L66A | 6.8 |
| L66V | 5.9 |
| I169L | 6.2 |
| I169A | 6.8 |
| I169V | 5.3 |
| I169H | 4.2 |
| L66A/I169L | 7.6 |
| L66A/I169A | 8.6 |
| L66A/I169H | 4.8 |
实施例4：角质酶及角质酶突变体处理造纸厂二级循环剩余白水方面的应用
1、处理水量与水质：
处理水量：1500m3
进水水质：COD 50～400mg/L、pH 7.0、浊度200～1000NTU。
2、处理过程：
调节白水pH至8.0±0.2，加入实施例3中水解聚醋酸乙烯酯能力较野生角质酶提高的角质酶突变体L66I、L66A、L66V、I169L、I169A、I169V、L66A/I169L、L66A/I169A 50000U(加酶量约2.5～5U/g)，在室温(16～25℃)下处理4小时。
测定处理后水质，结果如表2所示，野生酶浊度减少量为108NTU，突变体L66I、L66A、 L66V、I169L、I169A、I169V、L66A/I169L、L66A/I169A分别较野生型提高25％、32％、12％、 27％、38％、16％、45％、54％。
表2 Humicola Insolens来源的角质酶水解剩余白水
| 酶 | 浊度减少量(NTU) |
| 野生酶 | 108 |
| L66I | 135 |
| L66A | 144 |
| L66V | 121 |
| I169L | 137 |
| I169A | 148 |
| I169V | 126 |
| L66A/I169L | 156 |
| L66A/I169A | 166 |
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种角质酶突变体及其在白水处理中的应用
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Leu Gly Ala Ile Glu Asn Gly Leu Glu Ser Gly Ser Ala Asn Ala
1 5 10 15
Cys Pro Asp Ala Ile Leu Ile Phe Ala Arg Gly Ser Thr Glu Pro Gly
20 25 30
Asn Met Gly Ile Thr Val Gly Pro Ala Leu Ala Asn Gly Leu Glu Ser
35 40 45
His Ile Arg Asn Ile Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Pro Tyr Asp Ala
50 55 60
Ala Leu Ala Thr Asn Phe Leu Pro Arg Gly Thr Ser Gln Ala Asn Ile
65 70 75 80
Asp Glu Gly Lys Arg Leu Phe Ala Leu Ala Asn Gln Lys Cys Pro Asn
85 90 95
Thr Pro Val Val Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ile Ala
100 105 110
Ala Ala Val Ser Glu Leu Ser Gly Ala Val Lys Glu Gln Val Lys Gly
115 120 125
Val Ala Leu Phe Gly Tyr Thr Gln Asn Leu Gln Asn Arg Gly Gly Ile
130 135 140
Pro Asn Tyr Pro Arg Glu Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Val Gly Asp
145 150 155 160
Ala Val Cys Thr Gly Thr Leu Ile Ile Thr Pro Ala His Leu Ser Tyr
165 170 175
Thr Ile Glu Ala Arg Gly Glu Ala Ala Arg Phe Leu Arg Asp Arg Ile
180 185 190
Arg Ala
<210> 2
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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65 70 75 80
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<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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1 5 10 15
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35 40 45
His Ile Arg Asn Ile Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Pro Tyr Asp Ala
50 55 60
Ala Leu Ala Thr Asn Phe Leu Pro Arg Gly Thr Ser Gln Ala Asn Ile
65 70 75 80
Asp Glu Gly Lys Arg Leu Phe Ala Leu Ala Asn Gln Lys Cys Pro Asn
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Thr Pro Val Val Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ile Ala
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<211> 194
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<213> 人工序列
<400> 6
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<213> 人工序列
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165 170 175
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cgtggagaag ccgctagatt tcttcgtgat cgtattcgtg cttaa 585
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<400> 30
agatgagcag gagtaatgat taaagt 26
Claims (10)
1.一种角质酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸和/或第169位异亮氨酸进行突变得到的。
2.如权利要求1所述的角质酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为异亮氨酸得到的；
或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为丙氨酸得到的；
或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为缬氨酸得到的；
或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第169位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的；
或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第169位异亮氨酸突变为丙氨酸得到的；
或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第169位异亮氨酸突变为缬氨酸得到的；
或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为丙氨酸以及第169位异亮氨酸突变为亮氨酸得到的；
或所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的角质酶的第66位亮氨酸突变为丙氨酸以及第169位异亮氨酸突变为丙氨酸得到的。
3.如权利要求1或2所述的角质酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8或SEQ ID No.9。
4.编码权利要求1-3任一所述角质酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。
6.携带权利要求4所述基因或权利要求5所述重组质粒的宿主细胞。
7.权利要求1-3任一所述角质酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求6所述的宿主细胞，将权利要求6所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵。
8.应用权利要求7所述方法制备得到的角质酶突变体。
9.权利要求1-3任一所述的角质酶突变体或权利要求8所述的制备得到的角质酶突变体在水解聚醋酸乙烯酯方面的应用。
10.一种处理白水的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-3任一所述的角质酶突变体或权利要求8所述的制备得到的角质酶突变体添加入白水中进行酶解。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060194303A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-08-31 | Novozymes Biologicals, Inc. | Wastewater treatment compositions |
| CN101423824A (zh) * | 2000-06-02 | 2009-05-06 | 诺维信公司 | 角质酶变体 |
| CN104271737A (zh) * | 2012-05-14 | 2015-01-07 | 诺维信公司 | 角质酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
| CN106480771A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-03-08 | 江南大学 | 一种利用角质酶处理造纸白水的方法 |
-
2018
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101423824A (zh) * | 2000-06-02 | 2009-05-06 | 诺维信公司 | 角质酶变体 |
| US20060194303A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-08-31 | Novozymes Biologicals, Inc. | Wastewater treatment compositions |
| CN104271737A (zh) * | 2012-05-14 | 2015-01-07 | 诺维信公司 | 角质酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
| CN106480771A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-03-08 | 江南大学 | 一种利用角质酶处理造纸白水的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 郝玥: "造纸废水处理方法概述", 《科技展望》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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