CN109917032B - 一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量。本发明稳定性好、定量准确、重复性好、特异性高、适用性广。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，特别涉及一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法。
背景技术
随着转基因技术的日渐成熟，转基因农产品食品产业化已呈现出较好的势头。转基因农产品食品在给人类带来巨大经济效益和社会效益的同时，也存在潜在的环境和食品安全风险。出于对转基因农产品食品安全性考虑，中国、欧盟、日本、韩国等国家和组织纷纷制定相应的法律和法规要求对转基因农产品食品和加工食品进行标识，以对人、动物的健康和生态环境多样性进行保护。由于转基因农产品食品及其产品对人类健康和生态环境可能存在潜在的不利影响，在转基因农产品食品及其产品是否有害没有定论之前，转基因农产品食品及其产品的检测是非常重要的。
目前关于转基因农产品食品的检测方法主要有两种：基于蛋白质的检测方法和基于核酸的检测方法。
基于蛋白质的检测方法通常是基于抗原抗体的检测方法，包括ELISA、试纸条等方法。但是上述技术均存在假阳性、假阴性、定量结果不准确的情况。由于农产品食品中基质复杂，非常容易导致抗体误将结构相似的基质蛋白质识别为Bt蛋白质，导致假阳性。在食品加工过程中，尤其是热加工过程中，蛋白质的折叠会发生变化，导致抗体无法正确识别蛋白质，导致假阴性。不同批次的抗体、同样抗体对不同的Bt蛋白亲和力都不相同，导致定量结果的不准确。
基于核酸的检测方法主要指PCR技术，采用特异性引物对转入的外源基因的核苷酸序列进行扩增。依据扩增产物的有、无、多、少来判断。这种方法无法进行准确定量。同时，食品加工过程中会导致DNA的损失和破坏，影响结果的正确性。
发明内容
本发明的目的在于解决现有检测方法存在的缺陷，提供一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量。
本发明先采用酶对Bt蛋白进行酶解，选择特定的酶解多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法进行定量检测，是基于特异性多肽的检测方法，虽然蛋白质的空间结构容易受食品加工而破坏，但是一级结构(多肽)稳定性非常好，因此可以避免食品加工过程对检测结果的影响。
采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解具体操作如下：精确称取0.1g样品于2mlEP管，加入900mg碳酸氢铵溶液，再加入10mg DTT，50℃水浴30min，再加入30mg IAA暗处反应30min，最后加入10mg胰蛋白酶，在37℃水浴酶解4h，酶解结束后取出，加入20mg 10％甲酸终止反应，最后加入人工合成的同位素标记特异性多肽10mg混匀。
碳酸氢铵溶液浓度为50mM，DTT浓度为100mM，IAA浓度为100mM，胰蛋白酶浓度为500mM，人工合成的同位素标记特异性多肽浓度为1000μg/kg。
用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；
用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK。
用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA。
用于检测Bt蛋白Cry3家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IRELFSQAESHFR；
用于检测Bt蛋白Cry4家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IDESKLKPYTR；
用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；
用于检测Bt蛋白Cry9家族的特异性多肽的氨基酸序列为：KMLLEAVR。
用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：MLALSNRMQK。
同位素稀释液相色谱串联质谱法的色谱条件为：使用C18蛋白分析柱，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为B相0-9min从3％到30％，9-10min从30％到40％，10.1min升到100％保持到10.6min，10.7min回到3％保持到13min。总洗脱时间为13min，流速为0.3mL/min。
同位素稀释液相色谱串联质谱法的质谱条件为：毛细管电压：3.0kv，脱溶剂温度：550℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6eV；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。
一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测盒，包括胰蛋白酶、碳酸氢铵溶液、DTT、IAA、10％甲酸及用于检测Bt蛋白的特异性多肽，
用于检测Bt蛋白的特异性多肽具体如下：
用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；
用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK；
用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA；
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用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；
用于检测Bt蛋白Cry9家族的特异性多肽的氨基酸序列为：KMLLEAVR；
用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：MLALSNRMQK。
本发明的有益效果是：
1、稳定性好：虽然蛋白质的空间结构容易受食品加工而破坏，但是一级结构稳定性非常好。
2、定量准确：同位素稀释液相色谱串联质谱法是定量检测的黄金标准，结果准确可靠。
3、重复性好：采用化学合成的多肽作为标准物质，能够批量合成，质量稳定。
4、特异性高：选择多肽作为标准物质，多肽具有遗传密码特征，能够将目标多肽很好地与基质多肽区分开来。
5、适用性广：Bt蛋白不是单个蛋白质，而是一大类蛋白的总称(Bt Cry1Aa、BtCry1Ab、Bt Cry1Ac、Bt Cry1Ah、Bt Cry1B、Bt Cry1C、Bt Cry1F、Bt Cry2A、Bt Cry3B和BtCry9C蛋白)，通过选择不同的多肽，可以同时定量检测多种Bt蛋白，也可以对每个Bt蛋白分别进行定量检测，满足各种检测要求。
附图说明
图1是Bt蛋白热变性试验图；
图2是Cry1Aa转基因大豆检测图谱-1；
图3是Cry1Aa转基因大豆检测图谱-2；
图4是Cry1Aa转基因大豆检测图谱-3；
图5是无转基因大豆检测图谱-1；
图6是无转基因大豆检测图谱-2；
图7是无转基因大豆检测图谱-3。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
目前已经发现了100个以上的Bt蛋白质Pesticidal crystal protein，经过uniprot验证的就有87个，他们之间同源性有高有低。根据同源性分类，本方法采用少数几个特异性多肽就能满足各种检测需求，特异性多肽(含同位素标记序列)由上海生工合成。
以下实施例中：碳酸氢铵溶液浓度为50mM，DTT浓度为100mM，IAA浓度为100mM，胰蛋白酶浓度为500mM，人工合成的同位素标记特异性多肽浓度为1000μg/kg。
实施例1：检测豆浆中Cry1家族蛋白质
1、预处理
精确称取0.1g样品(豆浆)于2ml EP管，加入900mg碳酸氢铵溶液，再加入10mgDTT，50℃水浴30min，再加入30mg IAA暗处反应30min，最后加入10mg胰蛋白酶，在37℃水浴酶解4h，酶解结束后取出，加入20mg 10％甲酸终止反应，最后加入人工合成的同位素标记特异性多肽10mg混匀，过滤进样。
2、液相色谱条件
参考条件如下：使用C18蛋白分析柱(1.7μm粒径，2.1mm×100mm)。A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为B相0-9min从3％到30％，9-10min从30％到40％，10.1min升到100％保持到10.6min，10.7min回到3％保持到13min。总洗脱时间为13min，流速为0.3mL/min。
3、质谱条件
质谱检测条件如下：毛细管电压：3.0kv，脱溶剂温度：550℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6eV；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。
表1质谱多反应监测的参数条件
注：L*为同位素标记[13C6，15N]-亮氨酸。
根据本实施例的方法，抽检了2个非转基因大豆制作的豆浆和2个转基因大豆制作的豆浆，结果见下表：
表2
| 样本编号 | 类型 | Cry1含量[mg/kg] |
| 1 | 非转基因 | 0 |
| 2 | 非转基因 | 0 |
| 3 | 转基因 | 0.28 |
| 4 | 转基因 | 0.79 |
实施例2：检测玉米制品中的Cry2家族蛋白质
本实例1-3步的参数同实施例1，不同之处在于以下内容：
表3质谱多反应监测的参数条件
注：L*为同位素标记[13C6,15N]-亮氨酸。
根据本实施例的方法，抽检了2个非转基因玉米和2个转基因玉米，结果见下表：
表4
| 样本编号 | 类型 | Cry2含量[mg/kg] |
| 1 | 非转基因 | 0 |
| 2 | 非转基因 | 0 |
| 3 | 转基因 | 13.4 |
| 4 | 转基因 | 2.0 |
。
实施例3：同时检测大豆中的Cry1和Cry2
本实例1-3步的参数同实施例1，不同之处在于以下内容：
表5质谱多反应监测的参数条件
注：L*为同位素标记[13C6,15N]-亮氨酸。
根据本实施例的方法，抽检了2个非转基因大豆和2个转基因大豆，结果见下表
表6
| 样本编号 | 类型 | Cry1+Cry2含量[mg/kg] |
| 1 | 非转基因 | 0 |
| 2 | 非转基因 | 0 |
| 3 | 转基因 | 14.3 |
| 4 | 转基因 | 6.8 |
实施例4-8的方法参考实施例1，只需将特异性多肽替换为Cry3、Cry4、Cry5、Cry9及Cry3、Cry4和Cry5对应的多肽进行检测即可。
方法学验证(线性、精密度、准确度、灵敏度)
1、标准曲线
实验目的：验证本方法的线性范围
实验方法
准确吸取不同体积的肽段【EKLEWETNIVYK】标准中间溶液：4μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL于进样小瓶中，分别加入10μL同位素特异肽标准溶液，然后用0.1％甲酸水溶液稀释至1mL，使得浓度为400μg/kg、1000μg/kg、2000μg/kg、4000μg/kg、6000μg/kg、8000μg/kg、10000μg/kg的标准系列工作曲线(同位素内标浓度1000μg/kg)，进样分析，以标准溶液的浓度为横坐标，以标准色谱峰的峰面积与内标色谱峰的峰面积的比值为纵坐标进行线性拟合，如表7所示。
表7标准曲线线性及回归方程
实验结论
标准曲线线性r2均大于0.99，满足检测及相关法规要求。
2、精密度实验
实验目的：考察实验方法的稳定性。
实验方法：取一种转入Cry1Ab的大豆，每天平行五次测定，重复4天，预处理(与实施例1相同)。
表8：日间精密度实验结果统计表
实验结论
实验结果RSD≤15％，满足检测及相关法规要求。
3、准确度/回收率实验
实验目的：通过对加标样品的回收率测试来考察实验结果的准确性。
实验方法：取一种无转基因豆浆，分别添加适量Cry1Aa标准蛋白质使得样本加标浓度分别为500、2000、8000μg/kg，三个浓度点的样本各平行五次，重复4天。预处理(与实施例1相同)。
实验结果：见下表
表9：回收率实验结果统计表
实验结论
由实验结果可知三个加标浓度的回收率均为80-120％之间，且相对标准偏差RSD<15％，满足检测及相关法规要求。
4、检测限
称取8份无转基因豆浆试样，加入接近检测的Cry1Aa标准蛋白质，样本预处理(与实施例1相同)后检测，计算结果及标准偏差，以当置信度为95％时的变异系数f(n)与标准偏差s的乘积作为方法的检测限(LOD)，结果如表10所示，本方法标准蛋白的检测限为55.7μg/kg，满足日常样品的测定需求。
表10检测限
注：LOD＝s×f(n)；f(n)为置信度95％时的变异系数，查表得；当n＝8时，f(8)＝3.18。
5、稳定性验证【热变性实验】
热变性实验
大豆蛋白产品的生产工艺过程中往往伴随着热变性的产生，多数方法如酶联免疫法等对因加热变性的Bt蛋白无法检测，而本方法则可测定非变性和热变性的Bt蛋白。为说明此问题，一份转基因豆浆试样，然后将其分别置于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90℃下恒温放置1h后，分别按本方法和酶联免疫法进行处理检测，结果如图1所示，随温度的升高，酶联免疫法所得结果逐渐降低，至80℃时，结果降低超过50％；而用本方法，检测结果不随温度的升高而降低；而在不加热或低温区，两者的结果具有可比性。由此可见，本法测定大豆中Bt蛋白结果更加准确。
6、特异性
检测多个转入Cry1Aa的大豆，都检出(图2-4)；多个无转基因大豆，都未检出(图5-7)，可见本发明的方法特异性强。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州老爸评测科技有限公司
<120> 一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法
<130> 2019.03
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr Val Ser Ile Trp Ser Leu
1 5 10 15
Phe Lys
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Ile Arg Glu Leu Phe Ser Gln Ala Glu Ser His Phe Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Pro Tyr Thr Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
Asn Leu Glu Lys Gly Ile Asn Ala Gly Thr Tyr Ser Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
Lys Met Leu Leu Glu Ala Val Arg
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
Met Leu Ala Leu Ser Asn Arg Met Gln Lys
1 5 10
Claims (4)
1.一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，其特征在于：采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量；
用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；
用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK；
用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA；
用于检测Bt蛋白Cry3家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IRELFSQAESHFR；
用于检测Bt蛋白Cry4家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IDESKLKPYTR；
用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；
用于检测Bt蛋白Cry9家族的特异性多肽的氨基酸序列为：KMLLEAVR；
用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：MLALSNRMQK；
同位素稀释液相色谱串联质谱法的色谱条件为：使用C18蛋白分析柱，A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸乙腈溶液；洗脱条件为 B相0-9 min从3%到30%，9-10 min从30%到40%，10.1 min升到100%保持到10.6 min，10.7 min回到3%保持到13 min；总洗脱时间为13min，流速为0.3 mL/min；
同位素稀释液相色谱串联质谱法的质谱条件为：毛细管电压：3.0kv，脱溶剂温度：550℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3 .0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6 eV；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0 V，离子能量2：2.0 eV；离子源温度：150℃，提取器电压：5 .0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。
2. 根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解具体操作如下：精确称取 0.1g样品于 2ml EP管，加入900 mg 碳酸氢铵溶液，再加入10 mg DTT，50℃水浴 30 min，再加入30 mg IAA 暗处反应30min， 最后加入10mg胰蛋白酶，在37℃水浴酶解4h，酶解结束后取出，加入20mg 10%甲酸终止反应，最后加入人工合成的同位素标记特异性多肽10 mg混匀。
3.根据权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于：碳酸氢铵溶液浓度为50mM，DTT浓度为100mM，IAA浓度为100mM，胰蛋白酶浓度为500mM，人工合成的同位素标记特异性多肽浓度为1000μg/kg。
4.一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测盒，其特征在于：包括胰蛋白酶、碳酸氢铵溶液、DTT、IAA、10%甲酸及用于检测Bt蛋白的特异性多肽，
用于检测Bt蛋白的特异性多肽具体如下：
用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；
用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK；
用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA；
用于检测Bt蛋白Cry3家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IRELFSQAESHFR；
用于检测Bt蛋白Cry4家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IDESKLKPYTR；
用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；
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用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：MLALSNRMQK。
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