CN109900823A - 一种人血浆中孟鲁司特的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于孟鲁司特检测技术领域，公开了一种人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，包括如下步骤：称取孟鲁司特和孟鲁司特钠‑d6，用甲醇和甲醇水溶液溶解稀释制备系列孟鲁司特工作溶液和系列内标工作溶液；利用内标工作溶液和乙腈沉淀剂对血浆样品前处理后进行LC‑MS/MS分析；再利用空白血浆和系列孟鲁司特工作溶液，配制成系列校正标样及质控样品，然后分别注入LC‑MS/MS中进行测定，以孟鲁司特和内标孟鲁司特钠‑d6的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中孟鲁司特的浓度为横坐标制作标准曲线；根据标准曲线计算人血浆样品中的孟鲁司特浓度。本发明的优点在于，该方法检测快速、准确、灵敏度高、检测限低、操作简单且误差小。

Description

一种人血浆中孟鲁司特的定量检测方法

技术领域

本发明属于孟鲁司特检测技术领域，具体涉及一种人血浆中孟鲁司特的定量检测方法。

背景技术

哮喘是一种多发性疾病，目前在世界范围内的患者数量已经超过3亿，并且其发病率仍在不断地增加。目前，抗哮喘的药物主要可以分为两大类：一类是抗炎药物；另一类是支气管扩张药。孟鲁司特作为新一代非甾体抗炎药物，在哮喘及支气管炎等治疗方面有着良好的效果。该药是由美国Merck公司开发的一种新型高选择性LTD4受体拮抗剂，商品名为顺尔宁，1998年2月首次在芬兰和墨西哥上市，同年4月和10月分别在英国和美国上市，随后在加拿大、意大利、西班牙、瑞典、瑞士、德国、法国等71个国家上市，2002在我国上市。该药可以和人气道中的白三烯LTD4受体选择性地结合，阻断过敏介质的作用，改善呼吸道炎症，使气道畅通，是一种高效、低毒、安全性好的平喘抗炎和抗过敏药。

孟鲁司特临床主要用于轻中度哮喘的预防和长期治疗及与其他药物联合治疗重度哮喘，它具有以下特点：有较强的抗炎效果，能有效控制哮喘的发作；对于儿童哮喘市场具有针对性，孟鲁司特是唯一可用于12岁以下儿童的白三烯受体拮抗剂，疗效显著，副作用少，对儿童的身高发育没有显著影响；适合特殊类型哮喘的治疗，是运动性哮喘、与阿司匹林过敏相关的哮喘的首选治疗用药；具有良好的安全性，不良反应轻微，适合长期用药，并且与其它常用的抗哮喘药物联用时，无相互作用。

孟鲁司特不仅可以改善哮喘患者的肺功能，在治疗哮喘方面优于其他药品，而且可以与其他药物联用，取得更好的治疗效果。孟鲁司特在抗炎、免疫等诸多方面也有重要的应用价值，因此其应用前景非常广阔。

孟鲁司特的检测方法对缩短孟鲁司特一致性评价的研究周期和研究人血浆中孟鲁司特的药代动力学特征是重要前提。然而，目前孟鲁司特的检测方法，存在检测时间长、检测质量不稳定且进样量小等缺陷，严重影响孟鲁司特一致性评价和人血浆中孟鲁司特的药代动力学特征的进度，增加其用药难度和后续研究难度。

因此，急需开发一种快速、灵敏、准确的孟鲁司特的检测方法。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述“检测时间长及检测质量不稳定”问题，本发明目的在于提供一种人血浆中孟鲁司特的定量检测方法。

本发明所采用的技术方案为：

本发明提供了一种人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取孟鲁司特对照品至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1～10mg·mL^-1的孟鲁司特储备液，将所述孟鲁司特储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为20.0～12000ng·mL^-1的孟鲁司特工作溶液；称取一定量的内标孟鲁司特钠-d6至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1～10mg·mL^-1的内标储备液，用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成100～500ng·mL^-1的内标工作溶液；

(2)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μL人血浆样品，向样品中加入等量步骤(1)所述的内标工作溶液，然后加入4倍于人血浆样品体积的乙腈沉淀剂，涡旋混合，于3～8℃的离心机中离心10～15分钟；取上清液并向上清液中加入纯化水，振荡混匀3～5分钟，进行LC-MS/MS分析；

(3)标准曲线配制过程：量取空白血浆，向其中加入步骤(1)中所述的系列孟鲁司特工作溶液，配制成系列校正标样及质控样品，然后分别注入LC-MS/MS中进行测定，以孟鲁司特和内标孟鲁司特钠-d6的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中孟鲁司特的浓度为横坐标制作标准曲线；

(4)LC-MS/MS测定过程：根据标准曲线计算人血浆样品中的孟鲁司特浓度。

优选地，上述人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，所述步骤(2)或(3)中LC-MS/MS测定过程工作条件为：

a.色谱条件：色谱柱为WelchXB-C18，2.1×50mm；流动相A：含0.5％(体积百分数)甲酸的水溶液；流动相B：乙腈；柱温箱温度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；

b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：5000～6000V；涡旋离子喷雾温度：550～650℃；气帘气：25psi；碰撞池气体：6unit；雾化气：40psi；辅助气：50psi；数据收集时间：3～5min。

优选地，上述人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，所述步骤(2)或步骤(3)中LC-MS/MS测定过程中孟鲁司特的监测离子对为586.2/422.2，每次扫描一个离子对时所停留的时间150msec，去簇电压40V，碰撞能量35eV。

优选地，上述人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，所述步骤(2)或步骤(3)中LC-MS/MS测定过程中内标孟鲁司特钠-d6的监测离子对为592.2/427.2，每次扫描一个离子对时所停留的时间150msec，去簇电压40V，碰撞能量35eV。

优选地，上述人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，所述步骤(3)中的校正标样包括的个数为8～10个，所述步骤(3)中的校正标样的浓度为1.00～600ng·mL^-1。

优选地，上述人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，所述步骤(3)中的质控样品包括DQC、HQC、MQC、GMQC、LQC和LLOQ QC；所述DQC中孟鲁司特的浓度为1000ng·mL^-1，稀释因子为5，所述HQC、MQC、GMQC、LQC和LLOQ QC中孟鲁司特的浓度依次分别为450ng·mL^-1、300ng·mL^-1、30.0ng·mL^-1、3.00ng·mL^-1和1.00ng·mL^-1。

优选地，上述人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，所述步骤(2)或步骤(3)中色谱条件还包括：自动进样器清洗溶液为甲醇；自动进样器温度：4.0℃；自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；自动进样器洗针体积：200μL；自动进样器进样针清洗时浸泡时间：1s；自动进样器进样体积：20.0μL。

优选地，上述人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，所述步骤(1)中甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1:1；所述步骤(2)所述离心机条件优选为4℃、4000rpm或2270g离心10min。

本发明的有益效果为：

与现有技术相比，本发明提供的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法具有以下优点：

1、本发明提供的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，采用多反应监测模式进行定性和定量，能够有效提高定性准确度和方法的灵敏度，最低检测限可达到纳克级水平，分析时间短，所需样品量更少；

2、本发明提供的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，在人血浆样品中加入乙腈沉淀剂，较传统固相萃取前处理方法，操作更简单，处理速度快，引进误差小，分离效果好，检测效率高；

3、本发明提供的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，利用校正标样及随行质控样品确定标准曲线，提高了检测的精密度和准确度，确保定性定量分析结果可靠。

附图说明

图1是本发明的人血浆中孟鲁司特浓度测定的代表性标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。

实施例1：

本实施例的目的在于提供一种孟鲁司特的定量检测方法。

1.实验耗材与仪器：

分析天平：XP6百万分之一电子天平，METTLER TOLEDO；

离心机：5810R离心机，Eppendorf；

超声清洗器：KQ-400DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；

移液器：0.5-10μL，2-20μL，20-200μL，100-1000μL，Eppendorf；

玻璃样品瓶及螺旋盖：包含1.5mL，4mL，10mL，100mL，500mL，1000mL及2000mL等不同规格，武汉宝因生物科技有限公司；

96孔深孔板：DW-96-22-C，2.2mL，上海百赛生物技术股份有限公司；

聚丙烯离心管：1.5mL，武汉宝因生物科技有限公司；

高效液相色谱泵：LC-20AD，Shimadzu公司；

自动进样器：SIL-20AC_MP，Shimadzu公司；

柱温箱：CTO-20AC，Shimadzu公司；

质谱仪：API4000，ABSciex公司；

2.人血浆中孟鲁司特浓度LC-MS/MS测定方法的建立：

(1)标准工作溶液的配制：

储备液的配制：

分别精密称取两份一定量的孟鲁司特对照品至玻璃瓶中，精密加入一定体积的甲醇，配制成孟鲁司特的浓度为1.00mg·mL^-1的孟鲁司特储备液，标记为S01-1与S01-2；称取一定量的孟鲁司特钠-d6(内标)至玻璃瓶中，精密加入一定体积的甲醇，配制成孟鲁司特钠-d6的浓度为1.00mg·mL^-1的内标储备液；所有储备液保存在-20℃冰箱中，备用。

工作溶液的配制：

将配制好的孟鲁司特储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液逐级稀释成浓度为12000、10800、8000、2000、1000、200、40.0和20.0ng·mL^-1的孟鲁司特工作溶液，用于配制校正标样；将平行称量配制的另一份孟鲁司特储备液逐级稀释成浓度为20000、9000、6000、600、60.0和20.0ng·mL^-1的孟鲁司特工作溶液，用于配制质控样品；用体积比为1:1的甲醇水溶液将孟鲁司特-d6(内标)储备液稀释成100ng·mL^-1的内标工作溶液；所有的工作溶液保存在-20℃冰箱中，备用。

(2)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μL人血浆样品，以50μL为例；取50.0μL人血浆样品，加入50.0μL内标工作溶液，然后加入200μL乙腈沉淀剂，涡旋混合至少10分钟，样品于3～8℃的离心机中以4000rpm(2270×g)离心10～15分钟，以4℃、4000rpm(2270×g)离心10min为佳。转移100μL上清液至另一干净的96孔板中，然后加入100μL纯化水，振荡混匀至少3分钟，进行LC-MS/MS分析。

(3)标准曲线配制过程：取20.0μL步骤(1)所述的孟鲁司特工作溶液，加入到380μL空白血浆中，涡旋混匀，配制成1.00、2.00、10.0、50.0、100、400、540和600ng·mL^-1的校正标样，及1000ng·mL^-1(DQC)、450ng·mL^-1(HQC)、300ng·mL^-1(MQC)、30.0ng·mL^-1(GMQC)、3.00ng·mL^-1(LQC)和1.00ng·mL^-1(LLOQ QC)的质控样品，其中DQC样品用以考察稀释可靠性；将校正标样及随行质控样品，分别注入LC-MS/MS中进行测定。孟鲁司特和内标孟鲁司特钠-d6的色谱图采集和色谱峰积分由软件Analyst1.6.3(AB Sciex)进行处理，分别以孟鲁司特和孟鲁司特钠-d6的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法以血浆中孟鲁司特的浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归，所得的回归方程(Y＝a+bX)即为标准曲线，根据标准曲线计算人血浆样品中的孟鲁司特浓度。

(4)LC-MS/MS测定过程工作条件为：

a.色谱条件：

色谱柱：WelchXB-C18(2.1×50mm Column)；

流动相A：含0.5％(体积百分数)甲酸水溶液；

流动相B：乙腈；

自动进样器清洗溶液：甲醇；

柱温箱温度：40℃；

流速：0.60mL/min；

自动进样器温度：4.0℃；

自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；

自动进样器洗针体积：200μL；

自动进样器进样针清洗时浸泡时间：1s；

自动进样器进样体积：20.0μL；

洗脱梯度：洗脱梯度如表1所示。

表1

Time(minute)	Module	Function	Value(％)
				0.00	Pumps	Pump B Conc.	60
0.01	Pumps	Pump B Conc.	60
				1.70	Pumps	Pump B Conc.	90
2.20	Pumps	Pump B Conc.	90
				2.30	Pumps	Pump B Conc.	60
3.50	Pumps	Pump B Conc.	60

b.质谱条件：

离子化模式：正离子模式，Electrospray Ionization(ESI)；

扫描模式：多反应监测(MRM)；

电喷雾电压：5000V；

涡旋离子喷雾温度：600℃；

气帘气种类：氮气，设置为25psi；

碰撞池气体种类：氮气，设置为6Unit；

雾化气种类：氮气，设置为40psi；

辅助气种类：氮气，设置为50psi；

数据收集时间：3.5min；

分析物和内标的监测离子对、停留时间、去簇电压和碰撞能量参数见表2。

表2

*注明：停留时间，此处指的是在监测离子对时，每次扫描一个离子对时所停留的时间。

(5)分析结果：进样原始结果见表3，以孟鲁司特和孟鲁司特钠-d6的峰面积比(Analyte Area/IS Area)为纵坐标，人血浆中孟鲁司特的浓度(ng·mL^-1)(Analyte Conc./IS Conc.)为横坐标进行线性回归。孟鲁司特的代表性标准曲线y＝0.0153x+0.000823(r＝＝0.9996)，结果如图1所示。由图1可知，孟鲁司特在1.00～600ng·mL^-1范围内线性良好。

表3图1中八个坐标点对应数据

注：每个标曲样品浓度设置两个2个平行样品；

效果例1

本效果例的目的在于对上述实施例中LC-MS/MS方法测定人血浆中孟鲁司特浓度的准确度、精密度进行评价。

取50.0μL上述HQC、MQC、GMQC、LQC、LLOQ QC五个浓度的质控样品各一份，按上述方法操作，于1日内进行LC-MS/MS测定，每个浓度6个样品重复测定6次，并分别在不同天连续测定3个分析批，计算精密度，结果如下表所示：

表4

分析批	LLOQ QC	LQC	GMQC	MQC	HQC
						准确度(％)	105.0	98.3	100.3	104.7	99.1
精密度(n＝3)(％)	7.0	4.4	3.0	2.2	2.6

本发明提供的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法的各项指标均符合生物样品分析测定要求，采用本发明提供的方法能够高效、严谨、便捷、准确的进行样品分析，获得相应的PK参数，缩短孟鲁司特一致性评价的研究周期，研究人血浆中孟鲁司特的药代动力学特征，利于制药企业开展对孟鲁司特的研究，使老百姓吃到安全、有效又便宜的药。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (10)

1.一种人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)标准工作溶液的配制：称取孟鲁司特和孟鲁司特钠-d6，分别用甲醇溶解配制成孟鲁司特储备液和内标储备液；将所述孟鲁司特储备液和内标储备液分别用甲醇水溶液稀释成系列孟鲁司特工作溶液和系列内标工作溶液；

(2)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μL待测人血浆，向其中加入内标工作溶液和乙腈沉淀剂，进行LC-MS/MS分析；

(3)标准曲线配制过程：取空白血浆，向其中加入步骤(1)中所述的系列孟鲁司特工作溶液，配制成系列校正标样及质控样品，然后分别注入LC-MS/MS中进行测定，以孟鲁司特和内标孟鲁司特钠-d6的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中孟鲁司特的浓度为横坐标制作标准曲线；

(4)LC-MS/MS测定过程：根据标准曲线计算人血浆样品中的孟鲁司特浓度。

2.根据权利要求1所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于，所述步骤(2)包括如下步骤：取人血浆样品，向人血浆样品中加入等量的步骤(1)中所述的内标工作溶液，再加入4倍于人血浆样品体积的乙腈沉淀剂，涡旋混合，于3～8℃的离心机中离心10～15分钟；取上清液并向上清液中加入与上清液等体积的纯化水，振荡混匀3～5分钟，进行LC-MS/MS分析。

3.根据权利要求1所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中孟鲁司特工作溶液中孟鲁司特的浓度为20.0～12000ng·mL^-1，所述内标工作溶液中孟鲁司特钠-d6的浓度为100～500ng·mL^-1。

4.根据权利要求1所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于，所述步骤(2)或(3)中LC-MS/MS测定过程中的工作条件为：

a.色谱条件：色谱柱为WelchXB-C18，2.1×50mm；流动相A：含0.5％甲酸的水溶液；流动相B：乙腈；柱温箱温度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；

b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：5000～6000V；涡旋离子喷雾温度：550～650℃；气帘气：25psi；碰撞池气体：6unit；雾化气：40psi；辅助气：50psi；数据收集时间：3～5min。

5.根据权利要求1或4所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(2)或步骤(3)中LC-MS/MS测定过程中孟鲁司特的监测离子对为586.2/422.2，每次扫描一个离子对时所停留的时间150msec，去簇电压40V，碰撞能量35eV。

6.根据权利要求1或4所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(2)或步骤(3)中LC-MS/MS测定过程中内标孟鲁司特钠-d6的监测离子对为592.2/427.2，每次扫描一个离子对时所停留的时间150msec，去簇电压40V，碰撞能量35eV。

7.根据权利要求1所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中的校正标样的个数为8～10个，所述校正标样中孟鲁司特的浓度为1.00～600ng·mL^-1。

8.根据权利要求1所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中的随行质控样品包括DQC、HQC、MQC、GMQC、LQC和LLOQ QC；所述DQC中孟鲁司特的浓度为1000ng·mL^-1，稀释因子为5，所述HQC、MQC、GMQC、LQC和LLOQ QC中孟鲁司特的浓度依次分别为450ng·mL^-1、300ng·mL^-1、30.0ng·mL^-1、3.00ng·mL^-1和1.00ng·mL^-1。

9.根据权利要求4所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于，所述步骤(2)或步骤(3)中的色谱条件还包括：自动进样器清洗溶液为甲醇；自动进样器温度为4.0℃；自动进样器清洗模式为进样前清洗和进样后清洗；自动进样器洗针体积为200μL；自动进样器进样针清洗时浸泡时间为1s；自动进样器进样体积为20.0μL。

10.根据权利要求1所述的人血浆中孟鲁司特的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1:1；所述步骤(2)中离心条件为在4℃、4000rpm或2270g离心10min。