CN109900827B - 基于一测多评法鉴别制何首乌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于一测多评鉴别制何首乌的方法，经方法学验证及省级检验机构复核，制何首乌样品重现好，表明拟定的方法可行。首次提出的一测多评法经过四年时间的数据普查分析，从实验室到饮片公司调研，从同一批生品加工炮制品，对传统的制何首乌“九蒸九制”进行炮制时间的考察，得出的F值限度可行，以大黄素作为对照品，数据表明F值不大于0.6的为炮制完全的制何首乌，因为F值在0.6以下处于稳定的状态；F值≥1.0的为生品特性，F值在0.6～1.0之间的炮制不完全的制何首乌样品。本发明解决了制何首乌从外观性状上不能区分是否炮制完全的难题。同时一测多评法检验成分低，为大宗药材制何首乌的安全使用提供了很好的支持。
Description
技术领域
本发明属于中药鉴别技术领域，具体涉及一种基于一测多评法鉴别制何首乌的方法。
背景技术
何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效。制何首乌为何首乌的炮制品，制何首乌与何首乌功效完全不同：制何首乌作为大宗药材，在中医临床广泛使用，制何首乌具有补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨，化浊降脂的功效；何首乌具有解毒，消痈，截疟，润肠通便的功效。
《本草汇言》记载“制非九次，勿寝其毒。非黑豆，勿杀其势”。制何首乌的炮制方法参照《中国药典》2010年版及《北京市中药材炮制规范》，何首乌炮制品的毒性随着炮制时间的增加而显著降低。有相关课题组报道，在研究其购买的30批制何首乌中，实验结果显示有14批的毒性接近甚至高于生何首乌的对照药材，提示这些炮制品未有效炮制减毒，可能增加临床肝损伤的风险，严重威胁患者临床用药安全。然而，现行版药典标准制何首乌与何首乌检验项目类似，不能区分制何首乌是否炮制完全。制何首乌肝毒性报道不断增加：检索中国知网，近5年文献统计686例肝毒性不良反应。因此，炮制不完全的制何首乌从外观性状上不能判定制何首乌是否炮制完全，因而不同于正品与非正品的鉴定。
罗定强老师课题组在2015年承担了何首乌与制何首乌的国评质量分析课题，通过实验与比较文献资料，发现何首乌在炮制过程中，随着炮制时间的增加，苷类成分在下降，对应的苷元成分在增加。2016年，通过对何首乌生品、制何首乌数据普查分析，罗定强等在《中药材》第39卷第10期“何首乌质量分析”论文中首次提出了“首乌规则”，即大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的含量总和与大黄素、大黄素甲醚含量总和的比值F，大于等于1.0的为何首乌生品，反之为制何首乌。
按照上述规则进行判断，当F值小于1.0时判断应为制何首乌，但是，随着该课题组近年来的进一步研究，发现F值小于1.0时并不能准确确定是否是炮制完全的制何首乌，炮制不完全的制何首乌的肝毒性仍然影响该药品的广泛应用。因此，现有的方法依然无法解决制何首乌的鉴别难题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，能够解决现有技术无法判断制何首乌是否炮制完全的问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，包括以下步骤：
1)计算相对校正因子：精密量取大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷，分别制备得到四种对照品溶液，然后采用外标法，得到四个对照品的标准曲线，以大黄素为内标，分别计算出大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的相对校正因子；
2)计算各成分含量：取待检测的制何首乌粉末制备供试品溶液，以大黄素作为对照品制备对照品溶液，采用高效液相色谱法进行梯度洗脱，获得色谱图，以大黄素对照品的峰面积为对照，然后按照步骤1)计算得到的对应成分的相对校正因子，计算得到大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的含量；
3)计算F值判断待检测的制何首乌是否炮制完全，F值按式(1)计算：
F＝大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷含量+大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷含量/大黄素含量+大黄素甲醚含量 (1)
则有：
当F≤0.6时，判断待检测的制何首乌为炮制完全的制何首乌；
当F≥1.0，判断待检测的制何首乌为何首乌生品；
当0.6＜F＜1，判断待检测的制何首乌为炮制不完全的制何首乌。
优选地，F值的变化与炮制加工时间相关，何首乌生品炮制时间≥8h，F值≤0.6。
优选地，高效液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，检测波长为254nm。
进一步优选地，采用高效液相色谱梯度洗脱时，流动相A与流动相B的变化比例如下：
0～8min，流动相A：18％～30％、流动相B：70％～82％；
8～24min，流动相A：30％～36％、流动相B：64％～70％；
24～28min，流动相A：36％～80％、流动相B：20％～64％；
28～39min，流动相A：80％～95％、流动相B：5％～20％；
39～40min，流动相A：18％～95％、流动相B：5％～82％；
40～45min，流动相A：18％、流动相B：82％。
优选地，步骤1)所述相对校正因子计算方法为：以大黄素作为内标物，按下式(2)计算大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的相对校正因子fkm；
其中，Ak为大黄素峰面积；Wk为大黄素浓度；Am为其他待测组分的峰面积；Wm为其他待测组份的浓度；k为大黄素，m为其他待测组分，fk为大黄素的校正因子，fm为其他待测组分的校正因子。此处，其他待测组分指的是大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
进一步优选地，大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的相对保留时间及相对校正因子如下：
优选地，步骤2)中，供试品溶液是向1g待检测的制何首乌粉末加入50mL甲醇，加热回流处理1h，冷却制得。
优选地，步骤2)中，对照品溶液是将大黄素溶于甲醇中制成浓度为30μg/ml的溶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，经过大量的试验积累和数据普查分析，从实验室到饮片公司调研，从同一批生品加工炮制品，对传统的制何首乌的“九蒸九制”进行炮制时间的考察，得到了F值的可行限度，以大黄素作为对照品，数据表明F值不大于0.6的为炮制完全的制何首乌，因为F值在0.6以下处于稳定的状态；F值≥1.0的为生品特性，F值在0.6～1.0之间的炮制不完全的制何首乌样品。该方法能够非常明确的鉴定制何首乌，可以准确判断制何首乌是否炮制完全，为保证大宗药材制何首乌在临床安全使用提供了有效的鉴别手段。同时，本方法仅使用大黄素一个对照品，检验成本非常低，节约资源。
附图说明
图1为6批何首乌样品F值变化折线图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
一、现行制何首乌标准与何首乌生品质量标准对比
标准比较见表1。
表1何首乌与制何首乌现行标准比较
从标准比较看，检验项目类似，何首乌与制何首乌均含有结合蒽醌与游离蒽醌，不同产地何首乌与制何首乌含量差异大，部分生品的含量测定项目也符合制何首乌的含量测定限度，即不能有效区分制何首乌是否炮制完全。
二、一测多评法鉴别制何首乌
1、仪器：BP211D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；ME204(瑞士梅特勒-托利多公司)；LC-2030C 3D高效液相色谱仪(日本岛津公司)；LC-30AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Agilent 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Empower色谱工作软件。
2、材料与试剂：大黄素对照品(110756-201512，纯度98.7％)，大黄素甲醚对照品(110758-201415，纯度99.1％)，均由中国食品药品检定研究院提供；大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷对照品(纯度97.0％)和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷对照品(纯度98％)购自上海同田生物技术股份有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水；其余试剂均为分析纯。乙腈为色谱纯，其他为分析纯，水为去离子水。
3、样品来源：制何首乌、何首乌样品按照国家专项抽验计划与2020版中国药典饮片修订任务，依照《中国药典》2015年版四部附录0211“药材和饮片取样法”进行抽验。每批饮片至少抽样150g。除香港、澳门、台湾外，共抽取22个省份、5个自治区、4个直辖市共31个省级行政区何首乌饮片66批，涉及生产企业数51家，分布在19个省份；制何首乌饮片106批，涉及生产企业数100家，分布在26个省份。
4、方法
1)测试溶液配制：取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1h，取出，放冷，取续滤液作为供试品。另取大黄素对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品溶液。
2)高效液相色谱条件：按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部(通则0512))试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于5000。
采用高效液相色谱梯度洗脱时，流动相A与流动相B的变化比例如下：
0～8min，流动相A：18％～30％、流动相B：70％～82％；
8～24min，流动相A：30％～36％、流动相B：64％～70％；
24～28min，流动相A：36％～80％、流动相B：20％～64％；
28～39min，流动相A：80％～95％、流动相B：5％～20％；
39～40min，流动相A：18％～95％、流动相B：5％～82％；
40～45min，流动相A：18％、流动相B：82％。
3)测定与计算：取上述供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以大黄素对照品的峰面积为对照，分别按下表相对应的校正因子计算大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的含量，用待测成分色谱峰与大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的峰位，其相对保留时间应在规定值的±5％范围以内(若相对保留时间偏离超过5％，以大黄素和何首乌对照药材或相应的对照品确认)。
4)相对校正因子的计算：
对照品的制备：精密称取大黄素甲醚对照品10.08mg，置于100mL量瓶中，加甲醇使溶解，定容至刻度，摇匀，作为1号储备液；精密称取大黄素对照品7.20mg，大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷11.16mg，大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷9.92mg置于100mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为2号储备液。分别精密量取1号储备液、2号储备液各1mL置于50mL量瓶中，用甲醇稀释至至刻度，摇匀，作为1号对照品溶液；分别精密量取1号储备液、2号储备液2mL置于50mL量瓶，用甲醇稀释至至刻度，作为2号对照品溶液；分别精密量取1号储备液、2号储备液各2mL置于25mL量瓶，用甲醇定容至刻度作为3号对照品溶液；分别精密量取1号，2号两种储备液各1mL置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为4号对照品溶液；分别精密量取1号，2号两种储备液各2mL分别置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为5号对照品溶液；分别精密量取1号，2号两种储备液各2mL置于5mL量瓶中，用甲醇稀释至至刻度，作为6号对照品溶液；精密量取1号，2号储备液各5ml置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为7号对照品溶液。
供试品溶液的制备：取供试品适量，粉碎，过四号筛，精密称定供试品粉末1g，置三角瓶中，精密加入甲醇50mL，称重，加热回流1小时，防冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
线性范围：精密吸取上述1,2,3,4,5,6,7号混合对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱峰面积，以进样量(X，μg)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。4种标准曲线分别在线性范围内线性良好，见表2：
表2四种成分的标准曲线
精密吸取6号混合对照品溶液10μL，进样3次，记录色谱峰面积及保留时间。以大黄素为内标，以大黄素为内标，按下式(2)计算大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的相对校正因子。
其中，Ak为大黄素峰面积；Wk为大黄素浓度；Am为其他待测组分的峰面积；Wm为其他待测组份的浓度；k为大黄素，m为其他待测组分，fk为大黄素的校正因子，fm为其他待测组分的校正因子。结果大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的相对校正因子分别是0.92、2.27、2.04。以大黄素保留时间为1.00，计算得大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的相对保留时间分别是1.11、0.47、0.61。
相对保留时间及相对校正因子见下表3：
表3相对保留时间及相对校正因子
同时，经过精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及回收率试验，均符合设备精密度要求，在室温下稳定性良好，重复性良好，测定结果稳定。
5)校正因子耐用性考察
考察不同的进样体积，不同的色谱柱，不同的仪器对校正因子的影响，RSD均小于3％，见表4和表5：
表4不同进样体积的校正因子
表5不同仪器不同色谱柱的校正因子
综上可以看出，本发明的相对校正因子耐用性较好经过耐用性实验测试，结果可靠。
6)F值计算：
F＝大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷含量+大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷含量/大黄素含量+大黄素甲醚含量 (1)
当F≤0.6时，判断待检测的制何首乌为炮制完全的制何首乌；
当F≥1.0，判断待检测的制何首乌为何首乌生品；
当0.6＜F＜1，判断待检测的制何首乌为炮制不完全的制何首乌。
按照上述方法，进行具体实验如下：
从市场上购买10批何首乌生品，分别蒸制不同时间的制何首乌样品，测定结果见表6：
表6一测多评法与外标法F值结果比较
表6结果显示，根据组内组间分析，本发明的一侧多评法和外标法无显著性差异，但仅使用大黄素一个对照品，对照品检验费用不足100元，极大节约了检测经费。
实施例1(F值限度的确定)
分别选取具有代表性的6批何首乌生品，F值在1.03～9.61，生品与黑豆汁润焖8小时，蒸制不同时间(0.2-0.4MPa)由陕西广济堂医药集团股份有限公司炮制加工。按建立的方法进行测定，结果见表7：
表7 6批何首乌生品蒸制时间与F值
结合从上述表7和图1，可以看出，F值的变化与炮制加工时间直接相关，在何首乌生品蒸制8h后，即F值在0.6以下，F值越来越稳定。故本发明提出F值不大于0.6的限度，即为炮制完全的制何首乌。
实施例2(F值限度的验证)
对66批何首乌生品进行数据普查，验证F值的范围，结果见表8：
表8 66批何首乌生品F值测定结果
通过对66批何首乌生品F值的数据普查分析，发现F值≥1.0。说明F值≥1.0为生品的特性，而生品与炮制品的功效完全不同，文献资料已证明生品及炮制不完全的制何首乌对肝毒性的损伤显著高于炮制完全的制何首乌。
实施例3(F值限度的验证)
对106批制何首乌进行数据普查，分析与验证F值的范围，结果见表9：
表9 106批制何首乌生品F值测定结果
通过建立的F值的限度0.6，能明确区分市场上制何首乌样品炮制情况。按拟定的方法，合格率为84.9％，10批样品具有生品特性，6批制何首乌为炮制不完全。
实施例4
将制何首乌样品3批寄送黑龙江食品药品检验检测所对本发明方法的结果进行复核检测，根据出具的检验报告(报告书编号为HL2017Q4289、HL2017Q4290和HL2017Q4290)，能够确认本发明方法的重现性好。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (8)
1.基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)计算相对校正因子：精密量取大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷，分别制备得到四种对照品溶液，然后采用外标法，得到四个对照品的标准曲线，以大黄素为内标，分别计算出大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的相对校正因子；
2)计算各成分含量：取待检测的制何首乌粉末制备供试品溶液，以大黄素作为对照品制备对照品溶液，采用高效液相色谱法进行梯度洗脱，获得色谱图，以大黄素对照品的峰面积为对照，然后按照步骤1)计算得到的对应成分的相对校正因子，计算得到大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的含量；
3)计算F值判断待检测的制何首乌是否炮制完全，F值按式(1)计算：
F＝(大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷含量+大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷含量)/(大黄素含量+大黄素甲醚含量) (1)
则有：
当F≤0.6时，判断待检测的制何首乌为炮制完全的制何首乌；
当F≥1.0，判断待检测的制何首乌为何首乌生品；
当0.6＜F＜1，判断待检测的制何首乌为炮制不完全的制何首乌。
2.根据权利要求1所述的基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，其特征在于，F值的变化与炮制加工时间相关，何首乌生品炮制时间≥8h，F值≤0.6。
3.根据权利要求1所述的基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，其特征在于，高效液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，检测波长为254nm。
4.根据权利要求3所述的基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，其特征在于，采用高效液相色谱梯度洗脱时，流动相A与流动相B的变化比例如下：
0～8min，流动相A：18％～30％、流动相B：70％～82％；
8～24min，流动相A：30％～36％、流动相B：64％～70％；
24～28min，流动相A：36％～80％、流动相B：20％～64％；
28～39min，流动相A：80％～95％、流动相B：5％～20％；
39～40min，流动相A：18％～95％、流动相B：5％～82％；
40～45min，流动相A：18％、流动相B：82％。
5.根据权利要求1所述的基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，其特征在于，步骤1)所述相对校正因子计算方法为：以大黄素作为内标物，按下式(2)计算大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的相对校正因子fkm；
其中，Ak为大黄素峰面积；Wk为大黄素浓度；Am为其他待测组分的峰面积；Wm为其他待测组份的浓度；k为大黄素，m为其他待测组分，fk为大黄素的校正因子，fm为其他待测组分的校正因子。
6.根据权利要求5所述的基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，其特征在于，大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷的相对保留时间及相对校正因子如下：
7.根据权利要求1所述的基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，其特征在于，步骤2)中，供试品溶液是向1g待检测的制何首乌粉末加入50mL甲醇，加热回流处理1h，冷却制得。
8.根据权利要求1所述的基于一测多评法鉴别制何首乌的方法，其特征在于，步骤2)中，对照品溶液是将大黄素溶于甲醇中制成浓度为30μg/ml的溶液。
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| GR01 | Patent grant | ||
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