CN109908186A

CN109908186A - 改善生殖功能的羊肚菌的活性物质、其用途及其组合物

Info

Publication number: CN109908186A
Application number: CN201810219948.4A
Authority: CN
Inventors: 陈劲初; 吴思颖; 张晓苓; 陈彦博
Original assignee: Grape King Bio Ltd
Current assignee: Grape King Bio Ltd
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2019-06-21
Also published as: TWI661830B; US20210308199A1; TW201927322A; US11116807B2; US20190175673A1; US11730783B2

Abstract

本发明提供改善生殖功能的羊肚菌的活性物质、其用途及其组合物，特别用于制备改善由肥胖或代谢症候群所引起的生殖功能障碍的医药组合物。包含羊肚菌的活性物质的组合物能有效改善睪丸组织型态与精子型态、提高血液中睪固酮的含量与减少精子的氧化压力。

Description

改善生殖功能的羊肚菌的活性物质、其用途及其组合物

技术领域

本发明关于一种用于改善生殖功能的羊肚菌活性物质、其用途及其组合物；更明确地说，关于一种以羊肚菌的组合物用于提高睪固酮含量、减少精子异常型态的比例、降低精子的氧化压力或改善睪丸的组织型态，以改善由肥胖或代谢症候群所引起的生殖功能障碍。

先前技术

生殖功能可从多种面向评估，例如但不限于从睪丸组织的结构是否完整、精子形态是否出现异常、血液中睪固酮浓度的高低或精子所承受的氧化压力来判断。

睪丸

睪丸由数个生精小管所组成，而生精小管是由支持细胞(sertoli cell)所支撑，生精小管之间的间隙则为间质细胞(leydig cell)。生精作用即由支持细胞和间质细胞所调控，雄性激素的浓度也是通过这些细胞维持，进而帮助精子成熟(Kotaja et al.,2004)。从组织结构上来看，未成熟的精细胞位于生精小管的基底膜(basal membrane)，随着精子逐渐成熟，会移动至生精小管的管腔中心。

睪固酮

睪固酮是一种类固醇激素，其由胆固醇衍生而来，主要由男性的睪丸或女性的卵巢分泌。根据统计资料，成年男性睪固酮的分泌量约是成年女性的20倍，而睪固酮于成年男性体内中的含量则是成年女性的7-8倍。

睪固酮作为人体内最主要的雄性激素，其对男性的影响虽较为明显，但对女性也都同样重要。因此，不论对于男性或女性，睪固酮在人体的生理活动上都产生重大的影响。睪固酮的效益有增强性欲、力量、免疫功能、对抗骨质疏松症等。此外，由于睪固酮能有效提升体能，一些运动员会为了保持体能状态或提升表现，于赛前使用睪固酮以激发并优化身体状况。现时大部分的体育项目都已把睪固酮视为禁药。

男性随着年龄的增长，尤其在年过40后，其血清中的睪固酮(Testosterone)含量会逐年递减，而有睪固酮低下症(testosterone deficiency syndrome)。该症状在中老年男性是常见的现象，一般认为和更年期有关。虽然不像女性的更年期会有明显的发生时间，但随着睪固酮的浓度逐渐降低，症状会逐渐出现并且加剧。常见的病征有性欲下降、勃起功能障碍、活力减退、焦躁不安、情绪低落、生活丧失乐趣、专注力下降、工作效率减退、睡眠障碍。再者，伴随第二性征退化、骨质疏松、脂肪增加、睪丸萎缩与男性女乳等特征。从目前许多的研究发现，当体内睪固酮不足时，除了因上述病征而影响到生活质量外，更会增加罹患骨质疏松与骨折及心血管疾病等风险。此外，若男性血液中睪固酮的浓度下降，还会导致精液中的精子浓度下降及/或总精子数减少，进而导致不孕。

睪固酮含量的影响因素除年纪外，以往也有研究发现肥胖患者血液中睪固酮的浓度相对于一般人较低，且肥胖程度与血液中睪固酮浓度下降相关联。若和一般人比较，几乎每四个肥胖者里就有一个人血液中睪固酮的浓度明显较低。探究其原因，有研究指出脂肪细胞里的芳香环酶(aromatase)会催化睪固酮成为雌激素。因此，由于肥胖者体内的脂肪细胞的质量较大，而于脂肪细胞中的芳香环酶(aromatase)可以催化更多睪固酮成为雌激素，使得肥胖男性血液中雌激素的浓度变高，但睪固酮的浓度却降低。上述的加强催化现象随着年纪增加和肥胖情形加剧会更加明显。肥胖者若以饮食控制来减重并维持体重稳定，其血液中睪固酮的浓度有回升至正常值的趋势。

代谢症候群的病患血液中睪固酮的浓度和一般人相比也相对较低。Corona G等人于2010年发表一篇针对代谢症候群中的糖尿病的研究(Type 2diabetes mellitus andtestosterone:a meta-analysis study.)，其证实第二型糖尿病病患于血液中的睪固酮浓度较低，也指出第二型糖尿病病人的勃起障碍会随着睪固酮浓度越低而越加恶化。再者，Adamopoulos等人于1987年以及Jelodar等人于2009年所发表的研究结果指出，糖尿病会造成胰岛素阻抗及发炎情形，因而抑制脑下垂体分泌荷尔蒙，以及生精小管中的间质细胞制造睪固酮。

氧化压力

当体内抗氧化防御系统与活性氧化物(ROS)的生成量无法达到平衡时，氧化压力是造成糖尿病男性患者生殖功能退化的主要原因(Amaral et al.,2008)。糖尿病男性患者的精子DNA损伤机制，主要是精子在睪丸的输送过程中，或是储存于副睪时，因受到氧化压力而导致的伤害。与其他组织相比，精子中由于含有较多的不饱和脂肪酸，因此更容易受到ROS的攻击，进而造成精子DNA片断化(Parlaktas et al.,2008)。

羊肚菌

羊肚菌是世界著名的大型食用真菌，属于子囊菌纲、盘菌目、羊肚菌科、羊肚菌属(Morchella)。因其子实体的上半部表面具不规则的皱褶，形如羊肚而得名，又称羊肚蘑、羊肚菜、编笠菌、草笠竹等。Bunyard等人于1994年发表一研究，其通过28S RNA基因的RFLP分析，将羊肚菌至少分为两群：(1)黑色羊肚菌，其包括黑脉羊肚菌(M.angusticeps)、尖顶羊肚菌(M.conica)和高羊肚菌(M.elata)，此类群的头部较偏深棕色，皱褶较规则类似格子状；(2)黄色羊肚菌，其包括小羊肚菌(M.deliciosa)、美味羊肚菌(M.esculenta)和粗柄羊肚菌(M.crassipes)，其头部颜色为淡黄色至棕色，皱褶较不规则。

羊肚菌分布广泛，除南北极之外的五大洲均有生长，特别是在北半球的温带地区最多，其产季为春末夏初。但由于羊肚菌一年仅一采，导致其产量有限，价格居高不下。然而，羊肚菌又因其浓郁但又不腻的风味与丰富的营养价值，而深受世人喜爱，因此在1880年代即有尝试人工栽培的记录。但到目前为止，仍尚无法完全掌握人工培育羊肚菌子实体的技术，其中虽然于中国已有半商业化规模的生产，但仍受到许多条件的限制。因此使得羊肚菌菌丝体的发酵技术开始受到重视；而羊肚菌菌丝体具有生长快速、来源干净、可加以调控的特性。于产品开发上，羊肚菌菌丝体较羊肚菌子实体更加有利。

羊肚菌在保健方面的价值也极为引人注目。中国自古以来就将羊肚菌作为食药用菇类使用，其记录最早可追溯至明代《本草纲目》，文中载明羊肚菜(即羊肚菌)“甘寒无毒、益肠胃、化痰理气”，显示其具有一定的生理活性。近年来的研究也陆续以科学方法证明其功效性，包括抗肿瘤、护肾、抗疲劳、保肝、抗辐射、抗菌、调节免疫力及调节胃肠蠕动等功能。

本发明为首篇研究证明羊肚菌菌丝体具有治愈高血糖诱导的生殖伤害的效果。具体来说，通过施予羊肚菌的活性物质以提升血液中的睪固酮浓度、减少精子异常形态比例、降低精子氧化压力及/或改善睪丸的组织型态。本发明提供羊肚菌于医药领域中另一可开发的用途，显著地提升羊肚菌作为医药组合物的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于开发用于改善生殖功能的障碍的羊肚菌的活性物质，其是由包括下列所述步骤的方法制备：

(a)取羊肚菌菌丝体接种于培养基以进行固态培养；

(b)将步骤(a)培养的羊肚菌菌丝体接种于液体培养基以进行液态培养；及

(c)将步骤(b)培养的羊肚菌菌丝体接种于发酵槽以进行发酵。

较佳地，该步骤(c)的温度为23-28℃、通气量为0.5-1.0vvm、转速为30-50rpm及/或培养天数6-10天。

较佳地，该羊肚菌选购自中国台湾财团法人食品工业发展研究所，其寄存编号为BCRC-36352及/或BCRC-36336。

本发明的另一目的在于，开发羊肚菌的活性物质用于制备改善生殖功能的障碍的医药组合物的用途。

较佳地，该羊肚菌包含美味羊肚菌(morchella esculenta)、粗柄羊肚菌(morchella crassipes)或其组合。

较佳地，该羊肚菌的活性物质为羊肚菌菌丝体经发酵与冷冻干燥后所得的冻干粉。

较佳地，该羊肚菌的活性物质为羊肚菌菌丝体以纯水或乙醇萃取所得的萃取物。

较佳地，该生殖功能为睪固酮含量、精子形态、精子氧化压力、睪丸的组织型态或其组合。

较佳地，该改善生殖功能的障碍为提高睪固酮于血液中的含量。

较佳地，该改善生殖功能的障碍为减少精子断尾、弯曲或折颈的比例。

较佳地，该改善生殖功能的障碍为减少精子内的ROS生成量以降低精子的氧化压力。

较佳地，该改善生殖功能的障碍为减少睪丸中管腔中心的空洞比例或增加睪丸间质细胞(Leydig cell)以改善睪丸的组织型态。

较佳地，该改善生殖功能的障碍起因于肥胖及/或代谢症候群。

较佳地，该代谢症候群为糖尿病。

本发明为于医药领域中发挥羊肚菌的效益，再提供一种用于改善生殖功能的障碍的组合物，其包含有效量的羊肚菌的活性物质。

较佳地，其中该有效量为500mg/60kg-10g/60kg体重(body weight)/天(day)。

较佳地，其包含一种选自下列群组的添加剂：赋型剂、防腐剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、甜味剂或其组合。

较佳地，其为药品、饲料、饮料、营养补充品、乳制品、食品或保健食品。

较佳地，其形态为粉剂、锭剂、造粒、栓剂、微胶囊、安瓶、液剂喷剂或塞剂。

附图说明

图1显示对照组(C)、糖尿病组(D)、糖尿病给予美味羊肚菌(morchellaesculenta)组(D+ME)与糖尿病给予粗柄羊肚菌(morchella crassipes)组(D+MC)的睪丸组织的切片染色。

图2显示对照组(C)、糖尿病组(D)、糖尿病给予美味羊肚菌(morchellaesculenta)组(D+ME)与糖尿病给予粗柄羊肚菌(morchella crassipes)组(D+MC)的精子形态。

图3显示对照组(C)、糖尿病组(D)、糖尿病给予美味羊肚菌(morchellaesculenta)组(D+ME)与糖尿病给予粗柄羊肚菌(morchella crassipes)组(D+MC)的血浆中睪固酮的含量。

图4显示对照组(C)、糖尿病组(D)、糖尿病给予美味羊肚菌(morchellaesculenta)组(D+ME)与糖尿病给予粗柄羊肚菌(morchella crassipes)组(D+MC)的精子中ROS的含量。

具体实施方式

菌种来源

羊肚菌可选自由黑脉羊肚菌(M.angusticeps)、尖顶羊肚菌(M.conica)、高羊肚菌(M.elata)、小羊肚菌(M.deliciosa)、美味羊肚菌(M.esculenta)和粗柄羊肚菌(M.crassipes)所组成的群组。在一较佳的实施方式中，自中国台湾财团法人食品工业发展研究所的生物资源研究中心(BCRC)，选购两种羊肚菌菌种，一为美味羊肚菌(morchellaesculenta)，其寄存编号为BCRC-36352，另一为粗柄羊肚菌(morchella crassipes)，及寄存编号为BCRC-36336。本发明所述的羊肚菌的活性物质不限于由上述这些菌种所得。

菌种培养

将购入的羊肚菌从菌保中，勾取其菌丝接种于作为固态培养基上活化菌种。在一较佳的实施方式中，该固态培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)。待羊肚菌的菌丝生长完成后，将新鲜的菌丝体连同固态培养基接入于含有1L液态培养基的锥形瓶中。在一较佳的实施方式中，液态培养基的配方如下表1所示。在一较佳的实施方式中，于温度25℃、速率50-150rpm的条件下，液态培养菌丝体4-7天，以待菌种完成生长。

表1、液态培养基的配方如下：

成分	比例
		蔗糖	1-10％
酵母菌萃取物(Yeast extract，YE)	0.1-2％
		黄豆粉	1-10％
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.01-0.2％
		MgSO<sub>4</sub>	0.01-.0.2％

随后，于百公升级发酵槽的灭菌培养液中，接种生长完成的锥形瓶中的种菌，并进行量产。在一较佳的实施方式中，以温度25℃、通气量0.5-1.0vvm、转速40rpm的条件下，培养6-10天以量产羊肚菌菌丝体。待菌丝体干重不再增加或蔗糖残糖小于1000mg/L时，即加热收槽。在一较佳的实施方式中，以100℃煮15分钟加热收槽。

冻干粉制备

收槽完成后，将槽中部分的发酵全液(包含培养基与菌丝体)铺盘并进行冷冻干燥以制备“发酵全液冻干粉”。在一较佳的实施方式中，冷冻干燥的温度设定于30℃，冷冻干燥时间至少3天。另一部分的发酵全液则经离心后，取羊肚菌菌丝体经冷冻干燥得到“菌丝体冻干粉”。在一较佳的实施方式中，离心发酵全液的转速为4500rpm，使用连续式离心的卧式离心机。

萃取物制备

取适量“发酵全液冻干粉”以纯水回溶。在一较佳的实施方式中，回溶用的纯水体积为冻干粉重量的5-40倍，更佳为20倍。接着，以121℃加热20分钟后，通过离心(转速为4500rpm，连续式离心的卧式离心机)去除菌丝体，得到发酵全液萃取液。将发酵全液萃取液冷冻干燥得到“热水萃取物”。取适量“菌丝体冻干粉”，以醇类回溶。在一较佳的实施方式中，回溶用的醇类体积为冻干粉重量的5-40倍，更佳为20倍。在一较佳的实施方式中，醇类浓度为95-100％。在一较佳的实施方式中，醇类为乙醇。

再以超声波萃取机震荡该回溶后的菌丝体冻干粉2小时后，离心(转速为4500rpm，连续式离心的卧式离心机)去除菌丝体，得到菌丝体萃取液。将菌丝体萃取液经减压浓缩得到“乙醇萃取物”。将热水萃取物及乙醇萃取物充分混合以获得“萃取混合物”，作为喂食试验的羊肚菌的活性物质。在一较佳的实施方式中，热水萃取物及乙醇萃取物的混合比例为以重量为基准1:1。

试验动物

五周龄Sprague-Dawley(SD)品系的雄性大白鼠购自乐斯科生物科技股份有限公司。饲养实验大鼠的透明鼠笼，于置入大鼠前先以75％乙醇消毒。每笼饲养两只大鼠，温度控制于23±1℃的范围内，湿度保持在40-60％，光暗循环采用12/12(AM7:00-PM 6:59亮，PM7:00-6:59暗)。喂食粒状饲料(Laboratory Rodent Diet 5001, St.Louis,Missouri,U.S.A.)，饲料与蒸馏水的供应采用自由摄食饲育法(ad libitum)。

动物饲料

粉状饲料Laboratory Rodent Diet 5001M(PMI Nutrition International,Inc.,USA)购自雍立公司，而油脂选用猪油(Lard)购自宏升公司(Taiwan)，其成分配方如下表：

重量百分比(％)	对照组	高脂饮食组
			粗蛋白质(Crude protein)	23.9	21.5
粗脂肪(Crude fat)	5.0	18.4
			碳水化合物(Carbohydrates)	53.8	40.8
灰分(Ash)	7.0	6.0
			其他(Others)	10.3	13.3

高脂饮食组是将猪油添加入粉状饲料中，以脂肪热量占总热量的40％的高脂饮食以诱导胰岛素阻抗。

试验组别

五周龄雄性SD大鼠于驯养一周后，每组8只，共四组32只。一组为对照组，其他三组实验组则采用上述高油脂饮食组(high fat diet，HFD)的动物饲料，并以链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)以诱导胰岛素阻抗来形成糖尿病模式的实验大鼠，并于以下试验中将这些实验大鼠称为糖尿病组。再从三组糖尿病组中挑选两组施予羊肚菌的活性物质，根据施予的羊肚菌种类于下称为糖尿病喂食美味羊肚菌组与糖尿病喂食粗柄羊肚菌组。

各组名称与简称如下：

1.对照组Control(C)

2.糖尿病组HFD/STZ-Diabetes(D)

3.糖尿病喂食美味羊肚菌(morchella esculenta)组(D+ME)

4.糖尿病喂食粗柄羊肚菌(morchella crassipes)组(D+MC)

管喂与牺牲

成功诱导实验组大鼠形成糖尿病后，以管喂方式分别施予样品。将萃取混合物溶于载体溶液，以500mg/kg体重(B.W.)施予糖尿病喂食美味羊肚菌组与糖尿病喂食粗柄羊肚菌组。对照组则施予与实验组所施予的样品的同体积的载体溶液(vehicle，0.1mol/L柠檬酸缓冲溶液，pH 4.5)。每周测量并纪录实验动物的体重。喂食样品四周后，进行口服葡萄糖耐受试验(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)。各组实验动物禁食12小时后，由尾部静脉收集血液，测定血糖浓度。实验结束后，通过二氧化碳迷昏大鼠，并预先以肝素(heparin,500IU/mL)润湿针筒及离心管，由腹腔大动脉抽血以牺牲大鼠。将上述方式所获的血液视为全血，将其装入15mL的离心管中，并使用离心机于4℃下以3000x g低速离心15分钟。离心完成后，收集上层液作为大鼠血浆。于此同时，牺牲大鼠后取出各脏器并称重。肝脏、睪丸、下视丘保存于-80℃下待后续实验分析，副睪的精子则于牺牲当日完成分析。

睪丸染色切片

大鼠牺牲后，将其睪丸浸泡于10％甲醛(福尔马林，formalin)备用。取出浸泡甲醛的睪丸组织，以手术刀从组织的中段切下厚度约0.5公分的组织。使该组织的高度不超过包埋盒，再将组织泡回福尔马林中。以苏木紫-伊红染色法(hematoxylin and eosin，H&E)制作睪丸组织的染色切片。H&E染色法中，苏木紫染液为碱性，使细胞核内染色质与胞质内核糖体着上紫蓝色，伊红则为酸性染料，其使细胞质和细胞外基质中的成分着上红色，而可据此染色结果判断组织的结构。完成大鼠睪丸组织的染色切片后，观察睪丸的生精小管的形态。

精子收集

利用上游法(swim-up)收集副睪丸中的精子。从牺牲的大鼠取出副睪丸，将其放入含有8mL的RPMI培养基的烧杯中。以解剖剪刀将副睪丸剪成二段，将其放置在摇摆器上摇晃10分钟，接着以转速190x g进行离心5分钟。离心完成后，将其置于培养箱中以温度37℃、气体环境5％的二氧化碳培养30分钟。最后，收集上层活动力较好的精子进行精子型态的观察。

睪固酮测定

血浆样品以睪固酮的酶连结免疫吸附分析的套组(testosterone ELISA kits)分析血清中的睪固酮浓度。取50μL的大鼠血浆加入50μL的乙酰胆碱酯酶(AChE)和抗睪固酮血浆一同反应。接着，去除上清液，并利用清洗缓冲液(wash buffer)清洗5次。加入作为AChE受质的Ellman’s试剂，避光下摇晃以作用80分钟后，完成检测样本。利用ELISA测读仪测量样本于412nm的吸光值，以标准品所得的标准曲线代入样本的吸光值换算，即取得血清中睪固酮的浓度(ng/mL)。

ROS测定

DCFH-DA为荧光探针，其本身没有荧光，当DCFH-DA进入细胞内，经由酯酶水解会生成非荧光极性物质DCFH，当其进入细胞后受胞内ROS氧化，使其成为荧光物质DCF，由此可间接测量细胞内ROS生成量。

取各组1mL的精子数已调整至1×10⁶sperm/mL的精子的RPMI溶液，加入DCFH-DA以使最终浓度为20μM，于37℃作用30分钟。接着，以转速760xg离心5分钟。离心后去除上清液，并以PBS清洗1次。再次离心以去除上清液，加入1mL PBS以冲散细胞，利用流式细胞仪进行分析，流式细胞仪采用的软件为cell quest。收集10,000个细胞作为检测样本，利用机器发出的荧光强度来推估检测样本的细胞中所含有的ROS含量。若吸光值高，则表示样本中细胞的ROS含量高。

统计分析

数据的统计分析以Statistical Product&Service Solutions(SPSS)软件19.0版进行，实验结果以平均值±平均标准偏差(Mean±S.E.M.)表示。折线图以成对样本T检定(Paired-Sample T test)进行分析，统计结果以p<0.01(**),p<0.05(*)表示；柱状图则以单因子变异数分析(One-way analysis of variance One-way ANOVA)，再使用Duncan'sTest进行多重比较测试(Multiple comparison method)，p<0.05表示具有统计上的显著差异(Statistical differences)。

根据上述实验所得的实验结果，详述如下。

睪丸组织形态

大鼠睪丸组织染色切片结果如图1所示。相较于未诱导糖尿病的对照组(C)，于糖尿病组(D)的生精小管的官腔中心观察到明显空洞，说明生精小管中的支持细胞的数量相较于对照组(C)明显减少。再者，糖尿病组(D)的生精小管的间隙亦出现空洞，显示糖尿病组(D)的间质细胞数量也少于对照组(C)。根据对照组(C)与糖尿病组(D)的实验结果，证实由高脂饮食诱发的糖尿病的确会造成睪丸组织的伤害，而导致生精小管中的细胞数量锐减，于组织架构上形成空洞。

反观糖尿病喂食美味羊肚菌组(D+ME)及糖尿病喂食粗柄羊肚菌(D+MC)组，其生精小管的管腔中心或是生精小管的间隙的空洞，皆明显少于糖尿病组(D)，显示D+ME组与D+MC组的支持细胞与间质细胞的数量多于糖尿病组(D)。从此睪丸组织染色切片的结果可得知，因糖尿病导致的睪丸中支持细胞与间质细胞数量减少的现象，可通过施予羊肚菌的活性物质使这些细胞数量上升，甚至如D+ME组与D+MC组的间质细胞还可恢复至正常的状态。据此，证实羊肚菌具有改善生殖功能的效果。

精子形态

收集的精子的形态如图2所示。相较于未诱导糖尿病的对照组(C)，糖尿病组(D)出现异常形态精子的比例较高。异常的形态举例如：断尾、弯曲、折颈。糖尿病组(D)中黄色箭头所指分别为右侧两个箭头的折颈与左侧两个箭头的断尾的异常形态。

反观糖尿病喂食美味羊肚菌组(D+ME)及糖尿病喂食粗柄羊肚菌(D+MC)组，其精子型态与对照组(C)较为接近，说明喂食羊肚菌的活性物质能减少由糖尿病所造成的精虫伤害。

睪固酮含量

大鼠血浆样中睪固酮含量的测定结果如图3所示。相较于未诱导糖尿病的对照组(C)的睪固酮浓度约为0.5ng/mL，糖尿病组(D)的血浆中的睪固酮浓度约少于0.25ng/mL，说明糖尿病组(D)的血浆中的睪固酮含量较对照组(C)少。

反观糖尿病喂食美味羊肚菌组(D+ME)及糖尿病喂食粗柄羊肚菌(D+MC)组，其睪固酮量分别约为1.0ng/mL及1.25ng/mL，两者皆高过于糖尿病组(D)的含量。甚至相较于对照组(C)，睪固酮的含量也显著提升许多。从此结果，说明喂食羊肚菌的活性物质能改善由糖尿病所造成的睪固酮分泌或制造低落的情况，而恢复至一般未患病的水平，甚至还有加强睪固酮分泌的效果。

ROS含量

精子中的ROS含量测定结果如图4所示。相较于未诱导糖尿病的对照组(C)的荧光测定量做为基准值100％，糖尿病组(D)所生成的ROS于测定结果的荧光量约为150％，相当于约对照组荧光量的1.5倍，显著升高。

反观糖尿病喂食美味羊肚菌组(D+ME)及糖尿病喂食粗柄羊肚菌(D+MC)组，其ROS生成量分别下降至约120％及100％，两者皆回复至与对照组(C)相似的水平。从此结果可说明，喂食羊肚菌的活性物质能减少在糖尿病患病环境中的氧化压力，因而可有效降低由氧化压力所带给精子的伤害。

经上述实验结果，证实萃取自羊肚菌的活性物质具有提升雄性动物的生殖功能的功效，而开发出羊肚菌于医药领域中的另一新颖用途。据此，为使羊肚菌的活性物质得以具体应用，制造一种包含羊肚菌的活性物质的组合物，并以有效量施予个体来达到治愈效果。

本文中所述“有效量”是指一使用量，其足以使前述预防及/或治疗的效果产生。基于活体外细胞培养实验，前述有效量的定义为“μg/ml”，其基于每一个培养中所用的细胞培养液的总体积。基于动物模型实验，前述有效量定义为“g/60kg体重(body weight)/天(day)”。此外，经由活体外细胞培养实验所得到的有效量数据可经下列计算公式而转换为合理的供动物使用的有效量：

1.一般来说(Reagan-Shaw et al.,2008)，1“μg/ml”单位(基于活体外细胞培养实验所得的有效量)可等同于1“mg/kg体重(body weight)/天(day)”单位(基于老鼠模型实验所得的有效量)，并且，基于已知老鼠的新陈代谢率是人类的六倍，可进一步求得人类的有效剂量。

2.因此，若基于活体外细胞培养实验求得有效量为500μg/ml，则于老鼠中使用的有效量可计为500mg/kg体重(body weight)/天(day)(即，0.5g/kg体重(body weight)/天(day))。进一步地，参酌前述新陈代谢率的差异，供人类使用的有效量则可计为5g/60kg体重(body weight)/天(day)。

3.根据上述段落中所记载的试验结果，基于大鼠实验经验证的有效量为500mg/kg体重(body weight)/天(day)，因此供人类使用的合理的有效剂量应为5g/60kg体重(bodyweight)/天(day)。

在一较佳的实施方式中，组合物中所含的羊肚菌的活性物质的有效量为500mg/60kg-10g/60kg体重(body weight)/天(day)。

该组合物进一步包含添加剂。在一较佳的实施方式中，该添加剂可为赋型剂、防腐剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、甜味剂、或其组合。该赋型剂可选自柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸钙或其组合。该防腐剂可延长医药组合物的储藏期限，例如苯甲醇、对羟基苯甲酸(parabens)。稀释剂可选自水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合。填充剂可选自乳糖、牛乳糖、高分子量聚乙二醇或其组合。吸收促进剂可选自二甲基亚砜(DMSO)、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其组合。甜味剂可选自安塞甜(Acesulfame K)、阿斯巴甜(aspartame)、糖精(saccharin)、三氯蔗糖/蔗糖素(sucralose)、纽甜(neotame)或其组合。除上述所列举的添加剂以外，在不影响羊肚菌的活性物质的医药效果前提下，可依需求选用适合的其他添加剂。

该组合物于医药领域中可开发为不同商品。在一较佳实施方式中，该组合物为药品、饲料、饮料、营养补充品、乳制品、食品或保健食品。

该组合物可根据受施予者的需要，而采用不同形态。在一较佳实施方式中，该组合物的形态为粉剂、锭剂、造粒、栓剂、微胶囊、安瓶(ampoule/ampule)、液剂喷剂或塞剂。

本发明的组合物可使用于动物或是人类。在不影响羊肚菌的活性物质发挥效果的前提下，包含羊肚菌的活性物质的组合物可制为任何药物型态，并根据药物型态以适用的途径施予该动物或人类。

组合物制备

组合物1：取热水萃取物(20wt％)作为羊肚菌的活性物质，与作为防腐剂的苯甲醇(8wt％)、作为稀释剂的甘油(7wt％)充分混合，并溶于纯水(65wt％)中，以制得液体剂型的本发明的医药组合物，前述wt％是指各成分占组合物总重的比例。存放于4℃备用。

组合物2：取乙醇萃取物(15wt％)作为羊肚菌的活性物质，与作为防腐剂的苯甲醇(5wt％)、作为稀释剂的甘油(10wt％)充分混合，并溶于纯水(70wt％)中，以制得液体剂型的本发明的医药组合物，前述wt％是指各成分占组合物总重的比例。存放于4℃备用。

Claims

1.一种用于改善生殖功能障碍的羊肚菌的活性物质，其是由包括下列步骤的方法制备：

(a)取羊肚菌菌丝体接种于培养基以进行固态培养；

(c)将步骤(b)培养的羊肚菌菌丝体接种于发酵槽以进行发酵。

2.如权利要求1所述的活性物质，其中该步骤(c)的温度为23-28℃、通气量为0.5-1.0vvm、转速为30-50rpm及/或培养天数6-10天。

3.如权利要求1所述的活性物质，其中该羊肚菌选购自财团法人食品工业发展研究所，其寄存编号为BCRC-36352及/或BCRC-36336。

4.一种如权利要求1至3中任一项所述的羊肚菌的活性物质用于制备改善生殖功能的障碍的医药组合物的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其中该羊肚菌包含美味羊肚菌、粗柄羊肚菌或其组合。

6.如权利要求4所述的用途，其中该羊肚菌的活性物质为羊肚菌菌丝体经发酵与冷冻干燥后所得的冻干粉。

7.如权利要求4所述的用途，其中该羊肚菌的活性物质为羊肚菌菌丝体以纯水或乙醇萃取所得的萃取物。

8.如权利要求4所述的用途，其中该生殖功能为睪固酮含量、精子形态、精子氧化压力、睪丸的组织型态或其组合。

9.如权利要求8所述的用途，其中该改善生殖功能的障碍为提高睪固酮于血液中的含量。

10.如权利要求8所述的用途，其中该改善生殖功能的障碍为减少精子断尾、弯曲或折颈的比例。

11.如权利要求8所述的用途，其中该改善生殖功能的障碍为减少精子内的ROS生成量以降低精子的氧化压力。

12.如权利要求8所述的用途，其中该改善生殖功能的障碍为减少睪丸中管腔中心的空洞比例或增加睪丸间质细胞以改善睪丸的组织型态。

13.如权利要求4所述的用途，其中该生殖功能的障碍起因于肥胖及/或代谢症候群。

14.如权利要求13所述的用途，其中该代谢症候群为糖尿病。

15.一种用于改善生殖功能的障碍的组合物，其包含有效量的如权利要求1至3项中任一项的羊肚菌的活性物质。

16.如权利要求15所述的组合物，其中该羊肚菌的活性物质为羊肚菌菌丝体经发酵与冷冻干燥后所得的冻干粉。

17.如权利要求15所述的组合物，其中该羊肚菌的活性物质为羊肚菌菌丝体以纯水或乙醇萃取所得的萃取物。

18.如权利要求15所述的组合物，其包含一种选自下列群组的添加剂：赋型剂、防腐剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、甜味剂或其组合。

19.如权利要求15所述的组合物，其为药品、饲料、饮料、营养补充品、乳制品、食品或保健食品。

20.如权利要求15所述的组合物，其形态为粉剂、锭剂、造粒、栓剂、微胶囊、安瓶、液剂喷剂或塞剂。