CN109892327A - 一种微生物种子包衣的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微生物种子包衣的制备方法及其应用，属于农业生物技术领域，包括以下步骤：(1)提供木霉厚垣孢子的发酵液；所述木霉包括哈茨木霉菌和绿色木霉菌；(2)将含木霉厚垣孢子的发酵液与分散剂、成膜剂和5％的保护剂混合；(3)在步骤(2)搅拌完成后，加入粘结剂、种子；(4)在剩余保护剂中加入剩余保护剂质量50％的冷水，搅拌均匀，加热至60℃持续2min至形成均一液体，冷却备用；(5)将步骤(3)得到的发酵液和步骤(4)的保护剂混合均匀，混合液进行喷雾干燥即得；本发明利用厚垣孢子作为制剂的有效成分有助于解决木霉菌孢子保存时间短、不能规模生产的问题，能满足作为生物农药的要求。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，特别是涉及一种微生物种子包衣的制备方法及其应用。
背景技术
种子包衣剂是指由相关药剂、营养元素、成膜剂、分散剂和助剂加工而成并形成具有一定强度和通透性的且可直接包覆于种子表面的活性悬浮剂。
种子包衣剂是一种集保健、营养、保护、抗逆等性能于一体的专用制剂，具有种子消毒、防治病虫鼠害、缓慢释放药肥、避免伤害天敌、减少环境污染、提高作物抗逆性等作用。
目前，相关技术中，常见的种子包衣剂的成分主要是活性组分和非活性成分；其中活性成分有杀虫剂、杀菌剂、生长调节剂、营养物质及微生物等。非活性组分有填充料、湿润剂、氧化剂、成膜剂、悬浮剂、胶体保护剂、粘度稳定剂、扩散剂、防冻剂、酸碱调节剂、防腐剂、消泡剂、安全警戒色等。
20世纪30年代，Weindling发现木霉菌能够抑制土传病原真菌的生长。从20世纪70年代以来，木霉菌的生物防治机制被广泛研究，发现木霉菌具有显著的生防作用和促生长作用。木霉菌的生防机理主要包括拮抗作用、重寄生作用、分泌溶解细胞壁的酶。木霉菌的拮抗作用范围具有广谱性，相关研究显示，木霉菌至少对18个属29种病原真菌有拮抗作用。目前木霉菌主要应用于化学农药难以发挥作用的土传病原菌的抑制，特别是对灰霉菌(Botrytiscinerea)、丝核菌属(Rhizotonia)、镰刀菌属(Fusarium)、疫霉属(Phytophthora)等病原真菌有较好的防治效果。
然而，目前市场上以木霉为主的种子包衣数量较少，且木霉菌包衣有效成分均为分生孢子，如美国拜沃公司的哈茨木霉菌，山东泰诺药业的牛博士。这些制剂都存在孢子储存不稳定，以及货架期短，活菌的常温保存时间不会超过3个月，制剂中的木霉存活量难以达到要求，其防效的稳定性没法得到有效保证，同时，由于分生孢子为固态发酵获得，难以大规模化生产，所以目前市面销售的木霉菌制剂在植物病害防治中尚不能完全取代化学农药。当前国内外对木霉厚垣孢子的研究主要集中在其产生条件和摇瓶培养优化方面，对于木霉菌厚垣孢子工业化液体发酵和制剂的研究很少。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案。
一方面，本发明提供一种微生物种子包衣的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供木霉厚垣孢子的发酵液；所述木霉包括哈茨木霉菌(Trichodermaviride)和绿色木霉菌(Trichoderma viride)；
(2)将含木霉厚垣孢子的发酵液与分散剂、成膜剂和5％质量的保护剂混合，600r/min搅拌10-20分钟；
(3)在步骤(2)搅拌完成后，加入粘结剂、种子，粘结剂与种子的质量比为50：9，600r/min搅拌5min；
(4)在剩余保护剂中加入剩余保护剂质量50％的冷水，搅拌均匀，加热至60℃持续2min至形成均一液体，冷却备用；
(5)将步骤(3)得到的发酵液和步骤(4)的保护剂混合均匀，混合液进行喷雾干燥，制得微生物种子包衣；
其中，所述粘结剂的含量为发酵液的8％-25％(kg/L)，所述保护剂的含量为发酵液的60％-80％(kg/L)，所述分散剂的含量为发酵液的4-10％(kg/L)，所述成膜剂的含量为发酵液的2-5％(kg/L)；所述微生物种子包衣中所述木霉厚垣孢子的含量为108-1010个活孢子/克。
进一步地，所述粘结剂选自白炭黑、硅藻土、高岭土、活性炭或其组合物。粘结剂常用于加工粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂等固体剂型，其作用是稀释有效成分便于加工，粘结活性物质，改善理化性状便于使用。
进一步地，所述保护剂选自麦芽糊精、阿拉伯树胶、环糊精或其组合物。保护剂用于喷雾干燥过程中对种子和菌体的保护和制剂形成后的外部保护膜。
进一步地，所述成膜剂为聚乙二醇。
进一步地，所述分散剂为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、NNO或其组合物。
进一步地，所述步骤(1)中发酵液用以下方法获得：
在发酵培养基中接入5-10％的木霉菌种子液，种子浓度为106-108个/mL，发酵温度23～30℃，发酵90-150小时，获得含木霉厚垣孢子的发酵液，其中所述发酵培养基的组成按重量百分数是：蔗糖0.2-1.5％，酵母浸粉1-5％，糖蜜2-8％，麦麸0.3-0.8％，大豆粉1.2-5.5％，pH6.5。
进一步地，所述喷雾干燥进风温度90℃，进样流量55-80L/h，喷雾干燥。
另外，本发明的微生物种子包衣内还可添加其它具有活性组分，比如作为补偿的化学杀菌剂或者营养物质、生长促进因子，这可根据具体目的来进行选择和确定。
另一方面，本发明上述的微生物种子包衣的制备方法制得的微生物种子包衣在防治青菜灰霉病中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
木霉菌的厚垣孢子是木霉菌在逆境中生成的休眠孢子，有更强的环境耐受性，厚垣孢子一旦遇到适宜的环境条件便萌发产生菌丝。所以，利用厚垣孢子作为制剂的有效成分有助于解决木霉菌孢子保存时间短、不能规模生产的问题，能满足作为生物农药的要求。
本发明制备的微生物种子包衣是类似微胶囊的物质，固体、液体、气体封装在小的密封的囊内，这个囊在特定的条件下能控制速率地释放囊芯物质。微囊化可以使微生物和种子与环境隔绝，使木霉菌和种子能抵御机械力和外界环境的影响，从而长时间保持生物活性。而且，微囊化可以控制菌体释放到外界环境，达到缓释控释的效果，具有良好的阳离子交换性、吸附性、保水性，改善种子表面微环境，储水透气；可缓冲种子周围环境的酸碱度，保持养分缓释，提供矿质元素，促进苗期作物生长。
按照上述的重量比混合而制成的种子包衣剂，各组份发挥各自功效的同时，不同的组份之间还会产生协同作用，使得包衣剂产生抑菌、防虫、有机无机养分、生长促进因子等相关成分，可在实现促进种子萌发、防病虫害、增产增效等的同时，对地域及种子种类的选择性较宽，且可用于抗盐碱、抗旱、抗病等具有特殊抗性种子的包衣，提高其相应的抗性，进而使得种子包衣剂同时兼具针对性和通用性。更为重要的是，该包衣剂的各组分均为纯天然组分，可生物降解，对人畜及环境无危害，满足农业生产无公害的要求。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种微生物种子包衣的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供木霉厚垣孢子的发酵液；所述木霉包括哈茨木霉菌和绿色木霉菌；
(2)将含木霉厚垣孢子的发酵液与分散剂、成膜剂和5％的保护剂混合，600r/min搅拌10-20分钟；
(3)在步骤(2)搅拌完成后，加入粘结剂、青菜种子，粘结剂与青菜种子的质量比为50：9，600r/min搅拌5min；
(4)在剩余保护剂中加入剩余保护剂质量50％的冷水，搅拌均匀，加热至60℃持续2min至形成均一液体，冷却备用；
(5)将步骤(3)得到的发酵液和步骤(4)的保护剂混合均匀，混合液进行喷雾干燥，制得微生物种子包衣；
其中，所述粘结剂的含量为发酵液的19％(kg/L)，所述保护剂的含量为发酵液的60％(kg/L)，所述分散剂的含量为发酵液的6％(kg/L)，所述成膜剂的含量为发酵液的3％(kg/L)；所述微生物种子包衣中所述木霉厚垣孢子的含量为109个活孢子/克。
在本实施例中，粘结剂：白炭黑(260目)含量为发酵液的10％(kg/L)、硅藻土(350目)含量为发酵液的9％(kg/L)。
在本实施例中，保护剂：麦芽糊精含量为发酵液的35％(kg/L)、阿拉伯树胶含量为发酵液的25％(kg/L)。
在本实施例中，成膜剂:聚乙二醇。
在本实施例中，分散剂：木质素磺酸钠含量为发酵液的2％(kg/L)、木质素磺酸钙含量为发酵液的1％(kg/L)。
在本实施例中，哈茨木霉菌购自山东伟多丰生物技术有限公司，绿色木霉菌购自济南金雨源生物科技有限公司。
在本实施例中，喷雾干燥进风温度90℃，喷雾压力0.2MP，进样流量70L/h。
在本实施例中，所述步骤(1)中发酵液用以下方法获得：
在发酵培养基中接入8％的木霉菌种子液，种子浓度为107个/mL，发酵温度25℃，通气比1:2，罐压0.03MPa，发酵125小时，获得含木霉厚垣孢子的发酵液，其中所述发酵培养基的组成按重量计是：蔗糖0.9％，酵母浸粉3％，糖蜜5％，麦麸0.5％，大豆粉3.5％，pH6.5。
发酵20-72小时左右处于对数期，发酵液也开始变得黏稠，菌丝大量生长。72-120小时处于稳定期，厚垣孢子大量产生。在125小时左右，游离厚垣孢子达到最多，约2×108cfu/ml，总厚垣孢子5×108个/mL。
本实施例制备的微生物种子包衣的菌体存活率为85.36％，种子存活率100％，高温喷雾干燥仍有种子菌体存活可能是菌体形成的厚垣孢子对高温有抗逆性，喷雾干燥得到的微胶囊对囊内的活菌和种子起到了显著保护作用
对实施例1制得的微生物种子包衣进行常温贮存，在12个月的贮存中，室温条件下微生物种子包衣的存活率在90％以上，24个月后活孢率仍可达84％，显著高于木霉菌分生孢子的活孢率(30％)。
实施例2
以实施例1制得的带有微生物种子包衣的种子为实验例，以巴斯夫公司生产的50％啶酰菌胺水分散粒剂和清水为两个对照例。
实验在温室内进行，实验例与对照例分为三组，每组20株青菜，设3个重复，统一模拟青菜田间管理环境。
结果显示：带有微生物种子包衣的青菜获灰霉病概率为5％，且患病苗不会传染非患病苗；施用50％啶酰菌胺水分散粒剂的青菜获灰霉病概率为15％，三组60株青菜中共发现有3株为被患病苗传染获得灰霉病；施用清水的青菜获灰霉病概率为45％，其中，5株为被患病苗传染获得灰霉病。
可见，微生物种子包衣对于青菜灰霉病具有很好的防治效果。微生物种子包衣是木霉厚垣孢子活体制剂，在包衣中保存的时候处于休眠状态。施入田间后，在合适的温度、湿度条件下萌发、生长、繁殖，发挥对病原菌的拮抗作用，效果稳定性。
实施例3
采用实施例1制得的具有微生物种子包衣的青菜种子为实验组，和不含包衣青菜种子为对照组，在无灰霉病病害影响的实验室环境下进行生长实验。
实验表明：在相同生长管理的情况下，具有微生物种子包衣的实验组生长情况全阶段好于对照组，实验组青菜萌发快，生长快，产量高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种微生物种子包衣的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供木霉厚垣孢子的发酵液；所述木霉包括哈茨木霉菌(Trichoderma viride)和绿色木霉菌(Trichoderma viride)；
(2)将含木霉厚垣孢子的发酵液与分散剂、成膜剂和5％质量的保护剂混合，600r/min搅拌10-20分钟；
(3)在步骤(2)搅拌完成后，加入粘结剂、种子，600r/min搅拌5min；
(4)在剩余保护剂中加入剩余保护剂质量50％的冷水，搅拌均匀，加热至60℃持续2min至形成均一液体，冷却备用；
(5)将步骤(3)得到的发酵液和步骤(4)的保护剂混合均匀，混合液进行喷雾干燥，制得微生物种子包衣；
其中，所述粘结剂的含量为发酵液的8％-25％(kg/L)，所述保护剂的含量为发酵液的60％-80％(kg/L)，所述分散剂的含量为发酵液的4-10％(kg/L)，所述成膜剂的含量为发酵液的2-5％(kg/L)；所述微生物种子包衣中所述木霉厚垣孢子的含量为108-1010个活孢子/克。
2.根据权利要求1所述的一种微生物种子包衣的制备方法，其特征在于，所述粘结剂选自白炭黑、硅藻土、高岭土、活性炭或其组合物。
3.根据权利要求1所述的一种微生物种子包衣的制备方法，其特征在于，所述保护剂选自麦芽糊精、阿拉伯树胶、环糊精或其组合物。
4.根据权利要求1所述的一种微生物种子包衣的制备方法，其特征在于，所述成膜剂为聚乙二醇。
5.根据权利要求1所述的一种微生物种子包衣的制备方法，其特征在于，所述分散剂为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、NNO或其组合物。
6.根据权利要求1所述的一种微生物种子包衣的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中发酵液用以下方法获得：
在发酵培养基中接入5-10％的木霉菌种子液，种子浓度为106-108个/mL，发酵温度23～30℃，发酵90-150小时，获得含木霉厚垣孢子的发酵液，其中所述发酵培养基的组成按重量百分数是：蔗糖0.2-1.5％，酵母浸粉1-5％，糖蜜2-8％，麦麸0.3-0.8％，大豆粉1.2-5.5％，pH6.5。
7.根据权利要求1所述的一种微生物种子包衣的制备方法，其特征在于，所述喷雾干燥进风温度90℃，进样流量55-80L/h，喷雾干燥。
8.权利要求1-7任一项所述的微生物种子包衣的制备方法制得的微生物种子包衣在防治青菜灰霉病中的应用。
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