CN109876157A - 离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料、纳米传感器及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料、纳米传感器及其产品和应用。其中，离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料包括介孔二氧化硅纳米粒子和沉积于介孔二氧化硅纳米粒子表面的离子特异性滤膜。纳米传感器包括离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料以及吸附在介孔二氧化硅纳米粒子内的相应的离子指示剂。该纳米传感器可高选择性、高灵敏度的对自由移动的活体细胞外离子浓度的变化进行动态成像，从而反应脑部神经活动情况。

Description

离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料、纳米传感器及其产品和 应用

技术领域

本发明涉及纳米传感器的制备领域，具体涉及一种离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料、纳米传感器及其产品和应用。

背景技术

长期以来，人们需要利用记录神经元活动的技术来了解大脑的工作原理。为此，科学家们已积极尝试构建用于绘制组织电生理学的可伸缩电极阵列，并且设计各种能够非侵入地测量钙或电压变化的传感器。这些进步为大脑的研究开辟了新途径，并带来了许多新的生物学见解。

K⁺是决定膜电位的关键因素之一，细胞外K⁺浓度([K⁺]_o)的改变可直接影响膜电位并广泛影响神经元活动，如电压门控通道的激活和失活、突触传递和神经递质的生电性转运。因此，K⁺通过细胞膜的特异性渗透从根本上影响电信号并构成信息存储和转移的基础。此外，异常的[K⁺]_o信号与许多脑部疾病有关联，如癫痫、皮质扩散性抑制和缺血性中风。鉴于K⁺在大脑各种生理和病理功能中起重要作用，在复杂行为中精确测量[K⁺]_o动力学具有重要的科学意义。然而，由于可用的K⁺敏感性探针的限制，这仍然具有挑战性。

时至今日，可用的K⁺光学传感器(例如Xiangxing,K.；Fengyu,S.；Liqiang,Z.；Jordan,Y.；Fred,L.；Zhengwei,S.；Yanqing,T.；Meldrum,D.R.,A Highly SelectiveMitochondria-Targeting Fluorescent K(+)Sensor.Angewandte Chemie 2015,127(41),12221-12225.和Yang,Y.；Cuartero,M.；V.R.；Gooding,J.J.；Bakker,E.,Light-Addressable Ion Sensing for Real-Time Monitoring of ExtracellularPotassium.Angewandte Chemie International Edition 2018,57(51),16801-16805.)可以对培养的细胞、小鼠脑切片或麻醉动物的[K⁺]_o进行时空动力学的常规测量，但无法实现在自由移动的动物中进行测量。由于动物行为影响大脑的状态，自由移动的动物脑部[K⁺]_o变化动态成像对他们的行为和神经活动的直接比较分析是至关重要的。

然而，这种动态成像至今未被报道，主要存在以下几点原因。第一，在神经放电过程中，[K⁺]_o的最大变化只有十倍(从3nM增加到30nM，然而细胞外Ca²⁺的浓度变化可以高达10⁴倍)；K⁺光学传感器的灵敏度不够高，不足以探测到如此狭窄的[K⁺]_o波动范围。第二，尽管K⁺传感器的选择性有了显著的提高，但仍未能很好的区分开Na⁺和K⁺。在神经放电过程中，K⁺外流经常伴随相应量Na⁺内流，假若K⁺传感器选择性不够高，在结合K⁺的同时还会结合Na⁺，那么细胞外Na⁺浓度的下降会抵消部分[K⁺]_o改变诱导的信号变化幅度。

因此，构建具有高灵敏度和高选择性的新型K⁺传感器对[K⁺]_o的动态成像至关重要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料、纳米传感器及其产品和应用。

本发明所提供的技术方案为：

一种离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，包括介孔二氧化硅纳米粒子和沉积于介孔二氧化硅纳米粒子表面的离子特异性滤膜；

所述离子特异性滤膜由结构式(1)的分子组装而成。

本发明中由于离子特异性滤膜由结构式(1)的分子组装而成，滤膜的孔道直径适宜且富含碳基，使得离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料能够选择性捕获钾离子。离子特异性滤膜捕获钾离子，随后将离子扩散至介孔二氧化硅纳米粒子，局部离子浓度升高利于信号放大，同时介孔二氧化硅纳米粒子可以携载离子指示剂，可高选择性、高灵敏度的对自由移动的活体细胞外钾离子浓度的变化进行动态成像，从而反应脑部神经活动情况。

本发明中所述离子特异性滤膜厚度为0.5～100nm。作为优选，所述离子特异性滤膜厚度为0.5～30nm。进一步优选为1.5～20nm。

本发明中所述的介孔二氧化硅纳米粒子的粒径为5～500nm。作为优选，所述介孔二氧化硅纳米粒子的粒径为5～100nm。进一步优选为30～50nm。

本发明中所述离子特异性滤膜上的羰基被部分氧化为羧基。由于滤膜上的羰基被部分氧化为羧基，孔道对离子的亲和性发生改变，同时孔道直径缩小，使得离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料能够选择性捕获钠离子。

本发明中所述离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的表面修饰有PEG。PEG修饰后，提高其在体内分散性和稳定性，可以实现高选择性、高灵敏度的监测自由移动的活体脑部细胞外离子浓度动态变化，从而反应出脑部神经活动情况。

本发明中提供一种纳米传感器，包括如上述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，以及吸附在介孔二氧化硅纳米粒子内的相应的离子指示剂。介孔二氧化硅纳米粒子具有极大的孔洞体积，能够携载离子指示剂，用于脑部监测细胞外离子浓度的动态变化情况；其次，表面包裹的离子特异性滤膜对某种离子具有较高的亲和性，选择性捕获某种离子并将其扩散至介孔硅，提高局部离子浓度，可实现高选择性、高灵敏度监测。

作为优选，当离子特异性滤膜用于特异性捕获钾离子时，所述的离子指示剂为K⁺指示剂APG、K⁺指示剂PBFI等。

作为优选，当离子特异性滤膜用于特异性捕获钠离子时，所述的离子指示剂为Na⁺指示剂SBFI等。

本发明中提供一种如上述的纳米传感器在监测活体脑部细胞外离子浓度动态变化中的应用。作为优选，提供一种纳米传感器在监测自由移动的活体脑部细胞外离子浓度动态变化中的应用。纳米传感器通过对自由移动的活体细胞外钾离子浓度的变化进行动态成像，从而反应脑部神经活动情况，可用于监测脑部神经活动。

本发明中提供一种离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的制备方法，包括：

1)将N-苄基水杨酰胺和无水碳酸钾加入到N,N-二甲基甲酰胺中，加热至85～95℃，继续加入1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和2-氨基对苯二甲酸反应，得到滤膜前体；

2)将滤膜前体沉积于介孔二氧化硅纳米粒子表面，得到钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

步骤1)中的滤膜前体为结构式(1)的分子：1,1,1-tris-{[(2’-benzylaminoformyl)phenoxyl]methyl}ethane。

具体的反应式如下：

作为优选，所述步骤1)中N-苄基水杨酰胺、无水碳酸钾、1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和2-氨基对苯二甲酸的投料比为：3～4g：2～3g：2.5～3.5g：0.2～0.4ml。

作为优选，所述步骤1)中将N-苄基水杨酰胺和无水碳酸钾加入到N,N-二甲基甲酰胺中，加热至85～95℃，继续加入1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和2-氨基对苯二甲酸反应10～15h，将得到的产物用硅胶柱色谱处理，以石油醚-乙酸乙酯混合液为洗脱液，得到白色的滤膜前体。洗脱液中石油醚与乙酸乙酯的体积比为1.5～2.5:1。

作为优选，所述介孔二氧化硅纳米粒子的制备：将十六烷基三甲基氯化铵和三乙醇胺溶于去离子水，在90～100℃下反应0.5～5h，继续加入正硅酸乙酯反应0.5～5h；用氯化钠甲醇溶液萃取产物，得到介孔二氧化硅纳米粒子。所述十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺与正硅酸乙酯的投料比为：1.5～2.5g：0.05～0.09g：1.4～1.6ml。进一步优选，采用0.5～1.5wt％氯化钠甲醇溶液对介孔二氧化硅纳米粒子萃取2～6h，除去十六烷基三甲基氯化铵。

作为优选，所述步骤2)中在超声条件下，将介孔二氧化硅纳米粒子分散于乙腈溶液中；在剧烈搅拌的条件下，向上述溶液中加入滤膜前体乙腈溶液进行反应，通过原位加载法将滤膜前体沉积于介孔二氧化硅纳米粒子表面；在室温条件下退火10～15h，得到钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

作为优选，所述介孔二氧化硅纳米粒子和滤膜前体的质量比为45～55:1。

本发明中所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的制备方法，包括对所述钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的表面修饰PEG。PEG修饰后，提高其在体内分散性和稳定性，可以实现高选择性、高灵敏度的监测自由移动的活体脑部细胞外离子浓度动态变化，从而反应出脑部神经活动情况。

作为优选，所述表面修饰PEG包括：在pH5～6的条件下，用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，反应0.5～1h；将单官能团氨基封端的PEG溶于pH8～9的N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液中；混合两种溶液机械搅拌过夜，得到PEG修饰的钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

作为优选，所述钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的投料比为：1mg：8～12mM：8～12mM。单官能团氨基封端的PEG、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的投料比为5mg：8～12mM：8～12mM。

本发明中所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的制备方法，包括对所述钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料采用高锰酸钾氧化，得到钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料。离子特异性滤膜上的羰基被部分氧化为羧基。由于滤膜上的羰基被部分氧化为羧基，孔道对离子的亲和性发生改变，同时孔道直径缩小，使得离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料能够选择性捕获钠离子。

作为优选，将钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料分散于去离子水中，加入高锰酸钾溶液，于20～30℃条件下反应8～15h，沉淀、洗涤，得到钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

作为优选，所述钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料和高锰酸钾的投料比为500μg：0.4～0.6mM。

本发明中所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的制备方法，包括对所述钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的表面修饰PEG。PEG修饰后，提高其在体内分散性和稳定性，可以实现高选择性、高灵敏度的监测自由移动的活体脑部细胞外离子浓度动态变化，从而反应出脑部神经活动情况。

作为优选，所述表面修饰PEG包括：在pH5～6的条件下，用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，反应0.5～1h；将单官能团氨基封端的PEG溶于pH8～9的N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液中；混合两种溶液机械搅拌过夜，得到PEG修饰的钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

作为优选，所述钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的投料比为：1mg：8～12mM：8～12mM。单官能团氨基封端的PEG、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的投料比为5mg：8～12mM：8～12mM。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明中纳米传感器能够选择性捕获某种特定离子，随后将离子扩散至介孔硅，局部离子浓度升高利于信号放大；同时可以携载离子指示剂，实现高选择性、高灵敏度的监测自由移动的活体的脑部细胞外某种离子浓度的动态变化情况。

(2)本发明中制备方法的反应体系温和，条件可控，所制备的材料均具有良好的生物相容性，具有良好的临床转化可能性。

附图说明

图1为实施例1中的介孔二氧化硅纳米粒子的TEM照片；

图2为实施例1中的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料的TEM照片(a)以及EDS元素线扫描结果图(b)；

图3为实施例1中的聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料的TEM照片；

图4为应用例1中含浓度不同的K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器对HEK 293细胞生物相容性的MTT细胞活性定量分析结果图(a)以及不同孵化时间MTT细胞活性定量分析结果图(b)；

图5为应用例1中K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器、APG/介孔硅纳米传感器和APG对癫痫性发作神经[K⁺]_o变化的动态成像结果图(a)以及相应的ICP-AES分析结果图(b)；

图6为应用例1中K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器、APG/介孔硅纳米传感器和APG对电点燃小鼠海马体[K⁺]_o变化和荧光信号变化振幅(a)以及持续时间(b)结果图；

图7为应用例2中Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器、SBFI/介孔硅纳米传感器、SBFI在150mM Na⁺/K⁺溶液中，荧光强度变化结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)介孔二氧化硅纳米粒子的合成：将2g十六烷基三甲基氯化铵和0.07g三乙醇胺依次溶解于20ml去离子水中，在剧烈搅拌条件下升温至95℃反应1h。之后，逐滴加入正硅酸乙酯1.5ml，继续搅拌反应1h。用甲醇洗涤数次除去杂质，离心收集产物。将收集到的产物用1wt％氯化钠甲醇溶液萃取3h洗去模板剂即可得到介孔二氧化硅纳米粒子。

对制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子进行透射电子显微镜形貌表征，如附图1所示，直径约为30～50nm。

(2)钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的合成：将3.4g N-苄基水杨酰胺和2.5g无水碳酸钾依次加入25mL无水二甲基甲酰胺中升温至90℃，随后加入2.9g 1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和0.3mL 2-氨基对苯二甲酸，搅拌12h。冷却至室温后，将反应混合物加入200ml去离子水中。以石油醚-乙酸乙酯(2：1)作为洗脱液，将得到的固体产物用硅胶柱色谱处理，得到白色的滤膜前体固体产物。

在剧烈搅拌下，将10ml浓度为0.1mg/ml的滤膜前体乙腈溶液加入到50ml含有浓度为1mg/ml的介孔二氧化硅纳米粒子的乙腈溶液中，升温至50℃反应20min，在室温下退火12h，用甲醇洗涤一次并用水洗涤两次，即可得到K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料，滤膜层厚度约为3.5nm。

对制备得到的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料进行透射电子显微镜形貌表征(a)以及EDS元素线扫描表征(b)，如附图2所示。

(3)聚乙二醇修饰的复合材料的合成：将1mg K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料分散于1ml pH为5.6含有浓度为10mM N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中反应30min；随后，将5mg单官能团氨基封端的聚乙二醇(MW 5000)溶于pH为8.6含有浓度为10mM的N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，加入上述溶液中机械搅拌过夜，即可得到聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

对制备得到的聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料进行透射电子显微镜形貌表征，如附图3所示。

实施例2

(1)介孔二氧化硅纳米粒子的合成：将2g十六烷基三甲基氯化铵和0.07g三乙醇胺依次溶解于20ml去离子水中，在剧烈搅拌条件下升温至95℃反应1h。之后，逐滴加入正硅酸乙酯1.5ml，继续搅拌反应1h。用甲醇洗涤数次除去杂质，离心收集产物。将收集到的产物用1wt％氯化钠甲醇溶液萃取3h洗去模板剂即可得到介孔二氧化硅纳米粒子。

(2)钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的合成：将3.4g N-苄基水杨酰胺和2.5g无水碳酸钾依次加入25mL无水二甲基甲酰胺中升温至90℃，随后加入2.9g 1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和0.3mL 2-氨基对苯二甲酸，搅拌12h。冷却至室温后，将反应混合物加入200ml去离子水中。以石油醚-乙酸乙酯(2：1)作为洗脱液，将得到的固体产物用硅胶柱色谱处理，得到白色的滤膜前体固体产物。

在剧烈搅拌下，将10ml浓度为0.1mg/ml的滤膜前体乙腈溶液加入到50ml含有浓度为1mg/ml的介孔二氧化硅纳米粒子的乙腈溶液中，升温至50℃反应10min，在室温下退火12h，用甲醇洗涤一次并用水洗涤两次，即可得到K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料，滤膜层厚度约为1.5nm。

(3)聚乙二醇修饰的复合材料的合成：将1mg K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料分散于1ml pH为5.6含有浓度为10mM N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中反应30min。随后，将5mg单官能团氨基封端的聚乙二醇(MW 5000)溶于pH为8.6含有浓度为10mM的N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，加入上述溶液中机械搅拌过夜，即可得到聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

实施例3

(1)介孔二氧化硅纳米粒子的合成：将2g十六烷基三甲基氯化铵和0.07g三乙醇胺依次溶解于20ml去离子水中，在剧烈搅拌条件下升温至95℃反应1h。之后，逐滴加入正硅酸乙酯1.5ml，继续搅拌反应1h。用甲醇洗涤数次除去杂质，离心收集产物。将收集到的产物用1wt％氯化钠甲醇溶液萃取3h洗去模板剂即可得到介孔二氧化硅纳米粒子。

(2)钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的合成：将3.4g N-苄基水杨酰胺和2.5g无水碳酸钾依次加入25mL无水二甲基甲酰胺中升温至90℃，随后加入2.9g 1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和0.3mL 2-氨基对苯二甲酸，搅拌12h。冷却至室温后，将反应混合物加入200ml去离子水中。以石油醚-乙酸乙酯(2：1)作为洗脱液，将得到的固体产物用硅胶柱色谱处理，得到白色的滤膜前体固体产物。

在剧烈搅拌下，将10ml浓度为0.1mg/ml的滤膜前体乙腈溶液加入到50ml含有浓度为1mg/ml的介孔二氧化硅纳米粒子的乙腈溶液中，升温至50℃反应40min，在室温下退火12h，用甲醇洗涤一次并用水洗涤两次，即可得到K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料，滤膜层厚度约为10nm。

(3)聚乙二醇修饰的复合材料的合成：将1mg K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料分散于1ml pH为5.6含有浓度为10mM N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中反应30min。随后，将5mg单官能团氨基封端的聚乙二醇(MW 5000)溶于pH为8.6含有浓度为10mM的N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，加入上述溶液中机械搅拌过夜，即可得到聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

实施例4

(1)介孔二氧化硅纳米粒子的合成：将2g十六烷基三甲基氯化铵和0.07g三乙醇胺依次溶解于20ml去离子水中，在剧烈搅拌条件下升温至95℃反应1h。之后，逐滴加入正硅酸乙酯1.5ml，继续搅拌反应1h。用甲醇洗涤数次除去杂质，离心收集产物。将收集到的产物用1wt％氯化钠甲醇溶液萃取3h洗去模板剂即可得到介孔二氧化硅纳米粒子。

(2)钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的合成：将3.4g N-苄基水杨酰胺和2.5g无水碳酸钾依次加入25mL无水二甲基甲酰胺中升温至90℃，随后加入2.9g 1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和0.3mL 2-氨基对苯二甲酸，搅拌12h。冷却至室温后，将反应混合物加入200ml去离子水中。以石油醚-乙酸乙酯(2：1)作为洗脱液，将得到的固体产物用硅胶柱色谱处理，得到白色的滤膜前体固体产物。

在剧烈搅拌下，将10ml浓度为0.1mg/ml的滤膜前体乙腈溶液加入到50ml含有浓度为1mg/ml的介孔二氧化硅纳米粒子的乙腈溶液中，升温至50℃反应60min，在室温下退火12h，用甲醇洗涤一次并用水洗涤两次，即可得到K⁺特异性滤膜/介孔硅纳米传感器，滤膜层厚度约为17nm。

(3)聚乙二醇修饰的复合材料的合成：将1mg K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料分散于1ml pH为5.6含有浓度为10mM N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中反应30min。随后，将5mg单官能团氨基封端的聚乙二醇(MW 5000)溶于pH为8.6含有浓度为10mM的N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，加入上述溶液中机械搅拌过夜，即可得到聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

实施例5

(1)介孔二氧化硅纳米粒子的合成：将2g十六烷基三甲基氯化铵和0.07g三乙醇胺依次溶解于20ml去离子水中，在剧烈搅拌条件下升温至95℃反应1h。之后，逐滴加入正硅酸乙酯1.5ml，继续搅拌反应1h。用甲醇洗涤数次除去杂质，离心收集产物。将收集到的产物用1wt％氯化钠甲醇溶液萃取3h洗去模板剂即可得到介孔二氧化硅纳米粒子。

(2)钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的合成：将3.4g N-苄基水杨酰胺和2.5g无水碳酸钾依次加入25mL无水二甲基甲酰胺中升温至90℃，随后加入2.9g 1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和0.3mL 2-氨基对苯二甲酸，搅拌12h。冷却至室温后，将反应混合物加入200ml去离子水中。以石油醚-乙酸乙酯(2：1)作为洗脱液，将得到的固体产物用硅胶柱色谱处理，得到白色的滤膜前体固体产物。

在剧烈搅拌下，将10ml浓度为0.1mg/ml的滤膜前体乙腈溶液加入到50ml含有浓度为1mg/ml的介孔二氧化硅纳米粒子的乙腈溶液中，升温至50℃反应20min，在室温下退火12h，用甲醇洗涤一次并用水洗涤两次，即可得到滤膜层厚度约为3.5nm的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

将500μg K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料分散于5ml去离子水中，加入5ml浓度为1M的高锰酸钾溶液，于25℃搅拌反应12h，用去离子水洗涤三次，即可得到Na⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料，滤膜层厚度约为3.5nm。

(3)聚乙二醇修饰的复合材料的合成：将1mg Na⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料分散于1ml pH为5.6含有浓度为10mM N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中反应30min。随后，将5mg单官能团氨基封端的聚乙二醇(MW 5000)溶于pH为8.6含有浓度为10mM的N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中，加入上述溶液中机械搅拌过夜，即可得到聚乙二醇修饰的Na⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

应用例1：K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器应用于自由移动活体脑部[K⁺]_o动态成像

(1)体外生物相容性评价

不同浓度传感器溶液的制备：选用实施例1制备得到的50mg产物(聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料)分散在10ml含5mg APG(K⁺指示剂)的水溶液中，室温搅拌24小时后离心、洗涤即可得到K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器，其中APG载药量为4.0wt％，得到的产物用不同体积的灭菌PBS溶液重新分散得到不同浓度的传感器溶液(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)。

选择人肾上皮细胞株(HEK 293)考察不同浓度的K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器的体外生物相容性。

MTT细胞活性定量分析结果如图4(a)所示，control组(0μg/ml)表示只用细胞培养液进行孵育，不同药物浓度组细胞成活率均在90％以上，表明K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器具有良好的体外生物相容性。

不同孵化时间MTT细胞活性定量分析，如图4(b)所示，选择浓度为20μg/ml的传感器溶液，不同孵化时间0h,6h,12h,24h,36h,48h，细胞成活率均在90％以上。

(2)癫痫性发作神经[K⁺]_o变化的动态监测

特异性传感器溶液的制备：选用实施例1制备得到的产物(聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料)50mg分散在10ml含5mg APG的水溶液中，室温搅拌24小时后离心、洗涤得到，其中APG载药量为4.0wt％。得到的产物用一定体积的人工脑脊液重新分散得到浓度为20.0μg/ml的传感器溶液。

非特异性传感器溶液的制备：选用实施例1制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子50mg分散在10ml含5mg APG的水溶液中，室温搅拌24小时后离心、洗涤即可得到APG/介孔硅纳米传感器。得到的产物用一定体积的人工脑脊液重新分散得到浓度为14.8μg/ml的传感器溶液。

细胞模型建立：从新生Sprague-Dawley大鼠幼崽获得海马体细胞。

成像组：给予1ml含有浓度为20.0μg/ml的K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器和10μM马桑内酯的人工脑脊液。

对照组1：给予1ml含有浓度为14.8μg/ml的APG/介孔硅纳米传感器和10μM马桑内酯的人工脑脊液。

对照组2：给予1ml含有浓度为0.8μg/ml的APG和10μM马桑内酯的人工脑脊液。

加入人工脑脊液后，记录0～30min荧光强度变化，并用ICP-AES对神经细胞外K⁺浓度变化进行定量测量，结果如图5所示。K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器可以有效区分开K⁺和Na⁺，可以对神经细胞外[K⁺]_o的变化进行动态成像；而APG/介孔硅纳米传感器和APG无法有效区分开K⁺和Na⁺，无法进行有效成像。

(3)癫痫诱导的小鼠神经活动变化引起[K⁺]_o变化的动态成像能力的评价

特异性传感器溶液的制备：选用实施例1制备得到的产物(聚乙二醇修饰的K⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料)50mg分散在10ml含5mg APG的水溶液中，室温搅拌24小时后离心、洗涤得到，其中APG载药量为4.0wt％。得到的产物用一定体积的灭菌PBS溶液重新分散得到浓度为20.0μg/ml的传感器溶液。

非特异性传感器溶液的制备：选用实施例1制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子50mg分散在10ml含5mg APG的水溶液中，室温搅拌24小时后离心、洗涤即可得到APG/介孔硅纳米传感器。得到的产物用一定体积的人工脑脊液重新分散得到浓度为14.8μg/ml的传感器溶液。

动物模型建立：持续对C57/BL6型小鼠右腹侧海马体进行电点燃刺激。

成像组：通过颅内注射给予小鼠1μl含有浓度为20.0μg/ml的K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器的人工脑脊液。

对照组1：通过颅内注射给予小鼠1μl含有浓度为14.8μg/ml的APG/介孔硅纳米传感器的人工脑脊液。

对照组2：通过颅内注射给予小鼠1μl含有浓度为0.8μg/ml的APG的人工脑脊液。

对C57/BL6型小鼠右腹侧海马体进行多次电点燃刺激，每次[K⁺]_o、荧光信号变化振幅以及持续时间结果如图6所示。K⁺特异性滤膜/APG/介孔硅纳米传感器可明显观察到[K⁺]_o、荧光信号变化振幅增大以及持续时间增加，而APG/介孔硅纳米传感器和APG无法检测到。

应用例2：Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器应用于自由移动活体脑部[K+]_o动态成像

(1)选择性和灵敏度评价

特异性传感器的制备：选用实施例5制备得到的产物(Na⁺特异性滤膜/介孔硅的复合材料)50mg分散在10ml含5mg SBFI(Na⁺指示剂)的水溶液中，室温搅拌24小时后离心、洗涤，即可得到Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器。

非特异性传感器溶液的制备：选用实施例5制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子50mg分散在10ml含5mg SBFI的水溶液中，室温搅拌24小时后离心、洗涤，即可得到SBFI/介孔硅纳米传感器。

将SBFI、SBFI/介孔硅纳米传感器、Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器分别分散于Na⁺浓度为150mM的溶液中，检测信号变化强度；将SBFI、SBFI/介孔硅纳米传感器、Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器分别分散于K⁺浓度为150mM的溶液中，检测信号变化强度，结果如图7所示。Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器具有较高的灵敏度，在Na⁺浓度相同的情况下，Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器的荧光强度变化最大；并且Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器具有较高的选择性，在K⁺浓度相同的情况下，Na⁺特异性滤膜/SBFI/介孔硅纳米传感器的荧光强度基本无变化。

以上所述实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改，补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，其特征在于，包括介孔二氧化硅纳米粒子和沉积于介孔二氧化硅纳米粒子表面的离子特异性滤膜；

所述离子特异性滤膜由结构式(1)的分子组装而成。

2.根据权利要求1所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，其特征在于，所述离子特异性滤膜厚度为0.5～100nm；所述的介孔二氧化硅纳米粒子的粒径为5～500nm。

3.根据权利要求1所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，其特征在于，所述离子特异性滤膜上的羰基被部分氧化为羧基。

4.根据权利要求1或3所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，其特征在于，所述离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的表面修饰有PEG。

5.一种纳米传感器，其特征在于，包括如权利要求1～4任一所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料，以及吸附在介孔二氧化硅纳米粒子内的相应的离子指示剂。

6.一种如权利要求5所述的纳米传感器在监测活体脑部细胞外离子浓度动态变化中的应用。

7.一种离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的制备方法，其特征在于，包括：

1)将N-苄基水杨酰胺和无水碳酸钾加入到N,N-二甲基甲酰胺中，加热至85～95℃，继续加入1,1,1-三(对甲苯磺酰氧基-甲基)乙烷和2-氨基对苯二甲酸反应，得到滤膜前体；

2)将滤膜前体沉积于介孔二氧化硅纳米粒子表面，得到钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

8.根据权利要求7所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的制备方法，其特征在于，包括对所述钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的表面修饰PEG。

9.根据权利要求7所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的制备方法，其特征在于，包括对所述钾离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料采用高锰酸钾氧化，得到钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料。

10.根据权利要求9所述的离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的制备方法，其特征在于，包括对所述钠离子特异性滤膜/介孔硅的复合材料的表面修饰PEG。