CN109876006A - 茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备及其在抗结肠癌药物制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茯苓多糖聚‑β‑羟丁酸纳米粒的制备及其在抗结肠癌药物制备中的应用。茯苓多糖聚‑β‑羟丁酸纳米粒的制备是以茯苓多糖、聚‑β‑羟丁酸和磷脂为原料，以复乳法制备得到。本发明方法制得的产品粒径分布均匀，质量稳定，可显著降低结肠癌的发生率，并可用于结肠癌的辅助治疗，增强传统药物治疗的治疗指数，为开发新的结肠癌辅助治疗制剂及药物奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备及其在抗结肠癌药物制备中的应用。
背景技术
结肠癌是全世界范围内发病率仅次于肺癌和乳腺癌的第三大肿瘤，发病率呈现逐年上升的趋势。目前的治疗方法主要有手术治疗、辅助化疗和放射治疗等。当前，临床上对结肠癌患者的治疗主要采用病灶切除术和术后化疗，效果良好。目前，临床结肠癌化疗多采用以5-氟尿嘧啶为基础的治疗方案，研究表明联合给药可以有效提高治疗效果。如何寻找一种辅助用药，可有效改善患者的术后不良反应，提高患者对化疗的耐受性，又能提高化疗药物的抗肿瘤作用，有效抑制癌症的复发、转移，延长患者生存期，具有重要临床实践意义。
中药具有免疫增强活性的作用，可用于抗病毒、抗肿瘤，减轻放、化疗副作用，以及治疗慢性肝炎、延缓衰老等。有研究表明，中药多糖可以通过保护和调节机体的免疫系统来抑制肿瘤的生长，可应用于提高免疫力和预防癌症。茯苓是目前临床上应用最广泛的中药之一，其中茯苓多糖是茯苓的重要组成部分，含量约为84.2％。有研究表明茯苓多糖可以发挥间接作用，通过增强机体免疫功能而抑制肿瘤生长。而同时，也有研究表明茯苓多糖可能有助于肿瘤细胞的生长。目前，尚未有有效的茯苓多糖药物制剂可充分发挥其免疫增强功能并提升其肿瘤抑制作用。
聚-β-羟丁酸是一种存在于许多细菌细胞质内属于脂质的碳源类贮藏物，不溶于水，而溶于氯仿，可用尼罗蓝或苏丹黑染色，具有贮藏能量、碳源和降低细胞内渗透压等作用。当巨大芽孢杆菌生长在含乙酸或丁酸的培养基中时，其聚-β-羟丁酸含量可达干重的60％左右。在生物材料和药物制备中，聚-β-羟丁酸主要用于制备外科缝线、肘钉、骨骼替代品、血管替代品等。目前，尚未有聚-β-羟丁酸与茯苓多糖用于抗肿瘤药物的制备的相关报道。
目前，国内外尚未有关于茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备及其用于结肠癌抗肿瘤药物制备的报道。
发明内容
为了解决背景技术中的问题，本发明提供了一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备及其在抗结肠癌药物制备中的应用，以解决现有的结肠癌抗肿瘤药物毒性较大的问题。
本发明采用的技术方案如下：
一、一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法
包括以下步骤：
1)将茯苓多糖溶于纯水中，经超声溶解得到内水相；将聚-β-羟丁酸溶于氯仿中，得到油相；将磷脂溶于纯水中，得到外水相；
2)将步骤1)制备得到的内水相加入步骤1)制备得到的油相中，经超声得到稳定的油包水型初乳；将油包水型初乳加入步骤1)制备得到的外水相中，经超声得到水包油包水型复乳；水包油包水型复乳经减压蒸发和离心去除较大沉淀后，收集上清液，即得茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒。
所述步骤1)的内水相中，茯苓多糖的浓度为3-10mg/ml，优选5mg/ml。
所述步骤1)的油相中，聚-β-羟丁酸的浓度为15-25mg/ml，优选20mg/ml。
所述步骤1)的外水相中，磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱中的至少一种，优选二硬脂酰磷脂酰胆碱。
所述步骤1)的外水相中，磷脂的质量百分比为0.05-0.20％，优选0.10％。
所述步骤2)中的内水相和油相的体积比为1:(3-10)，优选1:5。
所述步骤2)中的油包水型初乳和外水相的体积比为1:(3-10)，优选1:5。
所述步骤2)中，得到稳定的油包水型初乳的超声方法为：在150W的功率下超声2s间歇4s，总时长5min。
所述步骤2)中，得到水包油包水型复乳的超声方法为：在150W的功率下超声2s间歇4s，总时长5min。
所述步骤2)中，减压蒸发的方法为：在旋转蒸发仪上以40℃和50rpm的条件下减压蒸发30min左右。
所述步骤2)中，离心的方法为3000rpm离心10min。
二、采用上述制备方法得到的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的应用
茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒用于制备抗结肠癌药物。
所述的抗结肠癌药物为注射剂、口服液、胶囊剂或片剂。
本发明的有益效果：
1.茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备及其治疗结肠癌作用国内外未见报道，本发明提供的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法及应用，填补了国内外研究的空白。
2.本发明制备得到的产品粒径分布均匀，质量稳定，可显著降低结肠癌的发生率，并可用于结肠癌的辅助治疗，增强传统化疗、放疗和免疫治疗的治疗指数，为开放新的结肠癌辅助治疗奠定了基础。
附图说明
图1为茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的透射电镜图。
图2为茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的体外抑制人结肠癌细胞增殖实验结果。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备
精密称取一定量的茯苓多糖于10ml小烧杯中，以超声溶解形成内水相，其浓度为5mg/ml；精密称取一定量的聚-β-羟丁酸，加入氯仿，超声溶解形成油相，浓度为20mg/ml；精密称取二硬脂酰磷脂酰胆碱，溶于一定量的纯水中超声溶解形成外水相，其浓度为0.10％。将内水相缓慢加入油相中，并以功率150W，超声2s间歇4s，总时5min的条件进行超声得到稳定的油包水型初乳，将初乳缓慢加入外水相中，并以功率150W，超声2s间歇4s，总时5min的条件进行超声得到稳定的水包油包水型复乳，之后在旋转蒸发仪上减压蒸发去除有机溶剂，转速50rpm，水浴40℃，约30min。最后，将复乳装入EP管中，以转速3000rpm离心10min后收集上清液，即得茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒。
空白聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法同该法，所不同的是，在制备初乳时，以等体积的纯水作为内水相代替茯苓多糖溶液所制备的纳米粒。茯苓多糖聚乳酸的制备方法同该法，所不同的是，在制备初乳时，以等质量的聚乳酸替代聚-β-羟丁酸所制备的纳米粒。灵芝多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法同该法，所不同的是，在制备初乳时，以等质量的灵芝多糖替代茯苓多糖所制备的纳米粒。
实施例2：茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的表征
取实施例1中制备得到的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒，使用马尔文粒径分析仪分析纳米粒的粒径和电势。
表1茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的粒径、PDI和Zeta电位
从表1可以看出，茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的粒径较聚-β-羟丁酸纳米粒较大，其原因在于其包载了茯苓多糖。此外，包载茯苓多糖后，其Zeta电势的绝对值增大，Zeta电势绝对值越大说明纳米粒稳定性越好；PDI表示的是纳米粒粒径分布的均匀度，PDI值越小说明纳米粒大小越均匀，从表中可以看到，所制备的纳米粒的PDI均小于0.2，说明其分散性较好。
取实施例1中制备得到的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒，使用透射电镜分析其表面形貌。由图1的透射电镜图可以看出，茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒分布均匀，粒子均呈圆整的球形，大小均一，表面光滑。电镜及粒径、电势分析表明茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒具有优良的物理化学性质。
实施例3：茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒体外抑制人结肠癌细胞增殖实验
3.1)受试药物
受试药物1：茯苓多糖
受试药物3：聚-β-羟丁酸纳米粒
受试药物5：灵芝多糖聚-β-羟丁酸纳米粒
受试药物7：茯苓多糖聚乳酸纳米粒
受试药物9：茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒
3.2)实验方案及结果
取对数生长期的人结肠癌细胞株HT-29，用含10％FBS的DMEM培养液调整细胞浓度至5×104个/mL，接种于96孔细胞培养板中，100μL/孔，置于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中培养12h，然后在各孔中加入不同浓度的受试药物。加药后继续培养48小时后，在各孔中加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570nm处测定吸光度值，计算细胞存活率，结果见图2。
由图2表明，茯苓多糖自身毒性较低，对HT-29细胞没有增殖抑制作用。聚-β-羟丁酸纳米粒可以一定程度上抑制HT-29细胞的增殖，而本发明制备得到的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒可以显著抑制结肠癌细胞的增殖。而制备的灵芝多糖聚-β-羟丁酸纳米粒和茯苓多糖聚乳酸纳米粒对HT-29细胞不具有显著的增殖抑制作用。该体外增殖抑制实验结果表明本发明所制备得到的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒对结肠癌具有较好的治疗效果。
实施例4：茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒体外抑制人结肠癌细胞增殖实验
4.1)受试药物
受试药物1：茯苓多糖(静脉注射)
受试药物2：茯苓多糖(灌胃口服)
受试药物3：聚-β-羟丁酸纳米粒(静脉注射)
受试药物:4：聚-β-羟丁酸纳米粒(灌胃口服)
受试药物5：灵芝多糖聚-β-羟丁酸纳米粒(静脉注射)
受试药物6：灵芝多糖聚-β-羟丁酸纳米粒(灌胃口服)
受试药物7：茯苓多糖聚乳酸纳米粒(静脉注射)
受试药物8：茯苓多糖聚乳酸纳米粒(灌胃口服)
受试药物9：茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒(静脉注射)
受试药物10：茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒(灌胃口服)
4.2)实验方案及结果
按1×107个细胞每只将对数期人结肠癌细胞(HT-29)接种于体重18-20g，周龄5-6周的雌性BABL/c裸鼠腋下。观察测量，当移植瘤长至50～100mm3后开始随机分组，分别为受试药物1组、受试药物2组、受试药物3组、受试药物4组、受试药物5组、受试药物6组、受试药物7组、受试药物8组、受试药物9组、受试药物10组和阴性组。受试药物1、3、5、7、9组：静脉注射受试药物组，每2天一次，10mg/kg/次。受试药物2、4、6、8、10组：口服灌胃受试药物组，每2天一次，20mg/kg/次。阴性组：腹腔注射给生理盐水，每2天一次。连续给药21天。
在给药结束后停止实验，脱颈椎处死小鼠并称重，剥取肿瘤并称重，计算抑瘤率：抑瘤率％＝[1-(给药组平均瘤重/阴性组平均瘤重)]×100％。
表2本发明茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒对结肠癌小鼠移植瘤瘤重和抑瘤率的影响
在该实验期间，受试药物各组的裸鼠给药期间全部存活，体重正常增长，一般行为学观察未见明显异常，表明各组受试药物在给药剂量下无明显毒性。研究表明，聚-β-羟丁酸纳米粒自身具有一定的肿瘤抑制作用。本发明的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的药物作用明显优于茯苓多糖、聚-β-羟丁酸纳米粒及其他各实验组。
实施例5：茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒与化疗协同治疗结肠癌
5.1)受试药物
受试药物1：5-氟尿嘧啶
受试药物2：5-氟尿嘧啶+茯苓多糖
受试药物3：5-氟尿嘧啶+聚-β-羟丁酸纳米粒
受试药物4：5-氟尿嘧啶+灵芝多糖聚-β-羟丁酸纳米粒
受试药物5：5-氟尿嘧啶+茯苓多糖聚乳酸纳米粒
受试药物6：5-氟尿嘧啶+茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒
5.2)实验方案及结果
按1×107个细胞每只将对数期人结肠癌细胞(HT-29)接种于体重18-20g，周龄5-6周的雌性BABL/c裸鼠腋下。观察测量，当移植瘤长至50～100mm3后开始随机分组，分别为受试药物1组、受试药物2组、受试药物3组、受试药物4组、受试药物5组、受试药物6组和阴性组。受试药物组：静脉注射5-氟尿嘧啶，每3天一次，5mg/kg/次。同时受试药物2、3、4、5、6组，分别静脉注射茯苓多糖、聚-β-羟丁酸纳米粒、灵芝多糖聚-β-羟丁酸纳米粒、茯苓多糖聚乳酸纳米粒和茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒，每2天一次，10mg/kg/次。连续给药21天。
在给药结束后停止实验，脱颈椎处死小鼠并称重，剥取肿瘤并称重，计算抑瘤率：抑瘤率％＝[1-(给药组平均瘤重/阴性组平均瘤重)]×100％。
表3本发明茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒对结肠癌小鼠移植瘤瘤重和抑瘤率的影响
在实验中，受试组1的5-氟尿嘧啶给药组的实验裸鼠明显精神萎靡，皮毛无光泽，行动迟缓。而受试组2的裸鼠得到明显改善，精神较好，皮毛光泽，但是肿瘤依然发展迅速，并未得到改善。而受试组3和4，联合给药的抗肿瘤作用得到加强，但是裸鼠状态不佳，精神萎靡，皮毛无光泽。受试组4和受试组5的裸鼠状态有所改善，且具有一定的抗肿瘤作用改善。在所有受试组中，受试组6中，5-氟尿嘧啶和茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒联合给药后，实验裸鼠明显精神改善，皮毛有光泽，行动正常，更为重要的是，其抑瘤率从单纯5-氟尿嘧啶给药组的57.00％提高至87.56％。该结果表明本发明制备的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒可显著增强化疗药物5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用，且能抑制药物5-氟尿嘧啶的毒性。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的。
Claims (8)
1.一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将茯苓多糖溶于纯水中，得到内水相；将聚-β-羟丁酸溶于氯仿中，得到油相；将磷脂溶于纯水中，得到外水相；
2)将步骤1)制备得到的内水相加入步骤1)制备得到的油相中，经超声得到稳定的油包水型初乳；将油包水型初乳加入步骤1)制备得到的外水相中，经超声得到水包油包水型复乳；水包油包水型复乳经减压蒸发和离心去除较大沉淀后，收集上清液，即得茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒。
2.根据权利要求1所述的一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的内水相中，茯苓多糖的浓度为3-10mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的油相中，聚-β-羟丁酸的浓度为15-25mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的外水相中，磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱中的至少一种；磷脂的质量百分比为0.05-0.20％。
5.根据权利要求1所述的一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的内水相和油相的体积比为1:(3-10)。
6.根据权利要求1所述的一种茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的将油包水型初乳加入步骤1)制备得到的外水相这一过程中，油包水型初乳和外水相的体积比为1:(3-10)。
7.采用权利要求1-6任一制备方法得到的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的应用，其特征在于，茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒用于制备抗结肠癌药物。
8.根据权利要求7所述的茯苓多糖聚-β-羟丁酸纳米粒的应用，其特征在于，所述的抗结肠癌药物为注射剂、口服液、胶囊剂或片剂。
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