CN109811058B - 与宫颈疾病发生发展相关的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与宫颈疾病发生发展相关的生物标志物及其应用，具体的涉及生物标志物EPS8L2在宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞癌诊断和治疗中的应用；本发明同时公开了EPS8L2在筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物中的应用以及在构建预测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞癌的计算模型中的应用。

Description

与宫颈疾病发生发展相关的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及与宫颈疾病发生发展相关的生物标志物及其应用，具体涉及的生物标志物为EPS8L2。

背景技术

宫颈癌(Cervical cancer,CC)是全球范围内，特别是在中国，最常见的女性癌症疾病之一(Sun R,Zhang H,Liu K,et al.Clinicopathologic Predictive Factors ofCervical Lmph Node Metastasis in Differentiated Thyroid Cancer[J].ActaOtorrinolaringol Esp,2017:24(4):592-95)。据世界卫生组织不完全统计，全球每年新增约53万左右的宫颈癌患者，即以总女性人口的5％的比例增长速度逐年递增，且存在患病年轻化趋势(Mazdziarz A,Wygledowski J,Osuch B,et al.New directions in cervicalcancer prophylaxis worldwide and in Poland一Case study of the Polish ruralfemale population[J].Ann Agric Environ Med,2017:24(4):592-95)。与此同时，每年约有近27万人因患宫颈癌病发而死亡，高居癌症死亡率第三(Ma C,ZhangY，Li R,et al.Riskof parametrial invasion in women with early stage cervical cancer:a meta-analysis[J].Arch Gynecol Obstet,2017:55(6):414-419)。虽然在临床人为诱发宫颈癌的主要危险因素是高危型人乳头状瘤病毒(high-risk human papillomaviruses,HPV)的持续感染(Liu G,Sharma M,Tan N,et al.HIV-positive women have higher risk ofHPV infection,precancerous lesions,and cervical cancer:a systematic reviewand meta-analysis[J].AIDS,2018:18(1):21)，如HPV16,18,31和33促进宫颈癌的发病机制。在所有这些类型的HPV中，16型和18型是宫颈癌中最危险的因素，约为70％，然而，越来越多的证据表明，单纯HPV感染是不足以诱发正常宫颈恶性转化，其有可能是宫颈癌变中的其他基因的改变且HPV疫苗不能有效地预防已存在的HPV感染和HPV相关病变的进展。因此，宫颈癌侵袭性的分子机制仍有待进一步阐明，需要更多的肿瘤特异性分子标记物来证实。

目前，在临床医疗服务中的宫颈癌的预诊和治疗都非常有限。临床数据表明，由于缺乏有效、准确的诊断而死亡的宫颈癌患者数量占到总宫颈癌患者数量的20％(Jassim G,Obeid A,A1 Nasheet HA.Knowledge,attitudes,and practices regarding cervicalcancer and screening among women visiting primary health care Centres inBahrain[J].BMC Public Health,2018:18(1):128)。因此，由于缺乏有效的生物标记物而导致的逐渐增加的宫颈癌患者数量成为众多研究学者着重关注的问题(Li X,Zheng R,LiX,et al.Trends of incidence rate and age at diagnosis for cervical cancer inChina,from 2000to 2014[J].Chin J Cancer Res,2017:29(6):477-86)。以手术和放化疗为主的通例宫颈癌的医治方略。早期宫颈癌的妇女可能通过子宫切除术或放化疗治疗治愈，虽然可以显著延长宫颈癌病患的生存率和生命体征，不幸的是，多达17％的妇女通常在完成治疗后的前2年会产生原位复发和转移，且对于晚期或已经发生远处转移的宫颈癌高龄患者术后5年生存率不足20％(Amkreutz LCM,Pijnenborg JMA,cervical cytology inthe diagnostic work-up Cytopathology,2018:29(1):63-70Joosten DWL_etal.Contribution of of patients with endometrial cancer[J])。而且这些治疗方式往往因为特异性差、病患体质不一而剂量难控，导致病患损伤大、副反应重，缺乏长久应用治疗的潜在价值(Ye GL,Du DL,Jin LJ,et al.Sensitization of TRAIL-resistantcervical cancer cells through combination of TRAIL,and fucoxanthin treatments[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017:21(24):5594-601)。因此，为了进一步改变宫颈癌的快速增长的高发病率，完善宫颈癌的临床靶向性治疗方案，寻找组织特异性的宫颈癌相关肿瘤基因的鉴定成为其在理论和技术上的预诊、治疗的新手段。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与宫颈疾病相关的生物标志物用于宫颈疾病的精准化诊断和治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测EPS8L2的试剂在制备早期诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的产品中的应用。

进一步，所述产品包括：通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测EPS8L2基因的表达水平的试剂。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。

本发明提供了一种体外检测样品中EPS8L2表达水平的产品，所述产品包括芯片或试剂盒。

进一步，所述芯片或试剂盒包括针对EPS8L2的特异性引物对、探针或抗体。

进一步，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了上述产品在制备早期诊断宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的工具中的应用。

本发明提供了EPS8L2在构建预测宫颈上皮内瘤样病变或宫颈鳞癌的计算模型中的应用。

本发明提供了EPS8L2在制备治疗宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括EPS8L2的促进剂，所述促进剂包括提高EPS8L2基因或其表达产物稳定性、上调EPS8L2基因或其表达产物的表达水平、增加EPS8L2基因或其表达产物有效作用时间的物质。

本发明提供了一种筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物的方法，包括步骤：

用待筛选物质处理表达或含有EPS8L2基因或其编码的蛋白的培养体系；和

检测所述体系中EPS8L2基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述待筛选物质可以促进EPS8L2基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗宫颈鳞癌的候选药物。

在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择可以治疗宫颈鳞癌的药物。

附图说明

图1是利用QPCR检测EPS8L2基因在宫颈鳞癌患者中的表达情况图；

图2是EPS8L2基因表达水平图；

图3是CCK-8法检测EPS8L2对细胞增殖活性的影响图；

图4是利用Transwell小室检测EPS8L2基因对细胞迁移侵袭的影响图，其中图A是对细胞迁移的影响图；图B是对细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明通过高通量测序技术以及进行高通量测序分析，检测宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌患者组织中的基因表达水平，发现其中表达具有明显差异的基因，探讨其与宫颈上皮内瘤样病变、宫颈鳞癌的发生之间的关系，从而为宫颈鳞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了EPS8L2在宫颈鳞癌患者中表达下调，并通过基因过表达技术进一步验证了EPS8L2参与宫颈癌细胞的增殖、侵袭过程，提示EPS8L2可作为宫颈鳞癌的独立预测因子，也可以和其他的基因标志物联合应用。

本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定mRNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物mRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。“差异表达的”还可以包括与第二种样品或样品群中蛋白质表达量或水平比较，对样品或样品群中本发明生物标志物编码的蛋白质的测定。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量和/或蛋白质的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时，当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时，如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0，则RNA或蛋白质是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0，则核酸转录本是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0，例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，则核酸转录本是差异表达的。

“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的mRNA或蛋白质的表达相比，从以患有宫颈病变疾病为特征的个体分离的组织中mRNA或蛋白质表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的组织相比，从以患有宫颈病变疾病为特征的个体分离的组织中mRNA或蛋白质表达水平降低的基因。

EPS8L2基因

术语“EPS8L2”指EPS8like 2基因与蛋白且涵盖其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的EPS8L2，以及源自细胞中加工的任何形式的EPS8L2。该术语涵盖EPS8L2的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如EPS8L2基因，人EPS8L2的mRNA序列(例如GenBank登录号NM_022772.4)，和人EPS8L2的氨基酸序列(GenBank登录号NP_073609.2)以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的EPS8L2DNA，mRNA，和氨基酸序列。在本发明的具体实施方式中，EPS8L2为人的EPS8L2基因及其表达产物。

本发明的EPS8L2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平或翻译水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的基因和蛋白使用本领域普通技术人员已知的多种技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。

本发明的蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

检测EPS8L2蛋白的试剂为EPS8L2蛋白的特异性结合剂。特异性结合剂是例如蛋白质EPS8L2的受体、结合蛋白质EPS8L2的凝集素、针对蛋白质EPS8L2的抗体、针对蛋白质EPS8L2的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为EPS8L2特异性抗体。

本发明提供了检测EPS8L2的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针或抗体，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于EPS8L2所示的部分或全部序列，所述抗体特异性的结合EPS8L2蛋白。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测EPS8L2基因或蛋白的试剂。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测。

在某些实施方案中，本文提供的是用于检测一种或多种生物标志物的蛋白质水平的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含用识别蛋白质生物标志物的抗体包被的试纸条、洗涤溶液、进行该试验的试剂、蛋白质分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。

促进剂和药物组合物

本发明提供了一种药物(组合物)，它含有有效量的所述的EPS8L2的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗宫颈鳞癌。

作为本发明的一种优选方式，所述的EPS8L2的促进剂是一种EPS8L2的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

在本发明中，药学上可接受的载体，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

其中，稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗宫颈鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将EPS8L2的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带EPS8L2的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与宫颈鳞癌相关的基因标志物

1、样本收集

收集32例宫颈鳞癌(CESC)组织和18正常组织(N)，24例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组织，所有病例术前未做任何免疫抑制剂治疗、放疗以及化疗，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取4例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部病例标本中进行验证实验。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取各组组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、cDNA文库的构建

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，采用metaMA包分析，meta分析中p值合并所用方法为inverse normal method，差异表达基因的筛选标准是FDR<0.05。

7、结果

RNA-seq结果显示，与正常对照相比，EPS8L2基因在宫颈鳞癌组织、以及在宫颈上皮内瘤样病变组织中的表达量显著下调，其中宫颈鳞癌组织中的表达量与宫颈上皮内瘤样病变组织相比，表达量也显著下调，差异具有统计学意义，因此对EPS8L2进行进一步的大样本验证。

实施例2 QPCR测序验证EPS8L2基因的差异表达

1、对EPS8L2基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取各组组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。

3、QPCR

1)逆转录反应

采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行lncRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加RNase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min.

将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据Genebank中EPS8L2基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

EPS8L2基因：

正向引物为5’-AGCAGAGGAAGAAGTATT-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-TTGTCCATGATGAATGTG-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

3)QPCR扩增检验

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROX Reference Dye^△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。

4)cDNA模板浓度的筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cDNA的进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品RealTime PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

结果如图1所示，与正常组织相比，宫颈鳞癌组织和宫颈上皮内瘤样病变组织中的EPS8L2表达量显著下调，其中宫颈上皮内瘤样病变组织与正常组织相比，呈现显著性下调，宫颈鳞癌组织与宫颈上皮内瘤样病变组织相比，呈现显著性下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3 EPS8L2基因的过表达

根据NCBI中EPS8L2基因序列信息设计特异性引物，进行扩增获得相应基因，将基因片段胶回收后分别与表达载体pEGFP-C1进行连接后转化入DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆经PCR和测序鉴定后获得pEGFP-C1-EPS8L2重组质粒。

1、细胞培养

宫颈鳞癌细胞(Hela)用含10％胎牛血清和1％P/S的RPIM-1640培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，当细胞长至80％～90％时，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、转染

将实验分为3组，分别为对照组(Hela)、空白对照组(转染pEGFP-C1)、实验组(转染pEGFP-C1-EPS8L2)，按照invitrogen公司的lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。步骤如下：

1)对数生长期的细胞消化轻轻吹打成单细胞悬液，用不含抗生素的培养基接种于6孔板，6孔板的细胞密度达2×10⁵个/孔，当细胞融合率达40％-60％进行转染试验；

2)次日转染，取10μl Lipofectamine 2000稀释于200μl不含血清的Opti-MEM I培养基，室温静置5min；

3)取4μg质粒溶于200μl无血清的Opti-MEM I培养基；

4)将上述两种稀释液混合均匀，室温孵育20分钟；质粒和转染试剂的比例为每孔4μg:10μl；

5)将6孔板中细胞更换1.6ml新鲜RPIM-1640培养基。将上述混悬液分别加入到6孔板中，每孔培养液终体积为2ml；

6)转染6小时后更换2ml新鲜完全培养液继续培养；

7)72h收集细胞，提取RNA，进行QPCR检测。

3、QPCR检测EPS8L2基因的转录水平

1)细胞总RNA的提取

采用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，具体步骤详见试剂盒说明书

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，过表达EPS8L2基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，相比对照组Hela和转染空载pEGFP-C1的空白对照组，转染pEGFP-C1-EPS8L2的实验组能够显著增加EPS8L2基因的表达水平，差异具有统计学意义。

实施例4 CCK-8法检测宫颈鳞癌细胞增殖活性

1、转染6小时后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液(1×10⁴/孔)，接种于96孔培养板中(100μl/孔)，每组各设6个复孔，同时设立无细胞的培养液空白对照。

2、于检测时间点(0h，24h，48h，72h，96h，120h)分别加入细胞增殖检测试剂CCK-8，工作浓度为1:10，即100μl培养液加入10μl CCK-8；

3、在37℃，5％CO₂孵育箱中孵育1h后，进行检测，酶标仪读数OD 450nm。

4、结果判断：转染后0h，24h，48h，72h，96h，120h使用酶标仪观察Hela细胞的增殖活性，细胞在波长450nm处的吸光光度值(OD值)表示处于增殖状态的细胞数量，以无细胞的培养液组OD值为对照。

5、结果

结果如图3所示，转染pEGFP-C1-EPS8L2的实验组的细胞增殖显著减少，提示改变EPS8L2的表达水平可以改变宫颈鳞癌细胞的增殖能力，说明EPS8L2与宫颈鳞癌细胞的增殖相关。

实施例5 Transwell方法检测宫颈鳞癌细胞迁移和侵袭

1、细胞迁移能力检测

1)迁移前一天将完全培养基加入孔板中，放入小室置于培养箱中过夜；

2)将转染48h后的细胞进行饥饿处理，收集细胞计数，用0.2％BSA的无血清培养基制成1×10⁵的悬液。

3)取200μl细胞悬液接种于Transwell小室内培养。

4)取出小室，吸干剩余液体后置于70％甲醇固定30min，用棉签擦去上室面的细胞。

5)小室浸入0.4％结晶紫染色10min，PBS清洗两遍，显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

2、细胞侵袭能力检测

1)侵袭实验前一天在冰上用RPIM 1640 1:8稀释基质胶，每个24孔悬挂式小室底部膜上室面加稀释后的基质胶60μl干燥待用。

2)水化基底膜：每孔加入50μl含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min，吸出培养板中残余液体。

3)将转染48h后的细胞进行饥饿处理，收集细胞计数，用0.2％BSA的无血清培养基制成1×10⁵的悬液。

4)取出小室，吸干剩余液体后置于70％甲醇固定30min，用棉签擦去上室面的细胞。

5)小室浸入0.4％结晶紫染色10min，PBS清洗两遍，显微镜下随机选取视野计数膜底面的细胞数。

3、数据处理

用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

4、结果

结果如图4所示，实验组的细胞迁移和侵袭数分别较转染空白质粒的少，说明过表达EPS8L2基因降低宫颈鳞癌细胞的迁移和侵袭能力，提示EPS8L2可作为分子靶标应用于宫颈鳞癌的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 与宫颈疾病发生发展相关的生物标志物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcagaggaa gaagtatt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtccatga tgaatgtg 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

Claims (2)

1.EPS8L2的mRNA促进剂在制备治疗宫颈鳞癌的药物组合物中的应用。

2.一种筛选治疗宫颈鳞癌的候选药物的方法，其特征在于，

用待筛选物质处理表达或含有EPS8L2 基因mRNA的培养体系；和

检测所述体系中EPS8L2 基因的mRNA表达水平；

其中，若所述待筛选物质可以促进EPS8L2基因mRNA的表达，则表明该待筛选物质是治疗宫颈鳞癌的候选药物。

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