CN109804087A

CN109804087A - 使用猝灭剂的基于光学的纳米孔测序

Info

Publication number: CN109804087A
Application number: CN201780062870.3A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬·C·梅斯维兹; 史蒂文·孟肯
Original assignee: Quantapore Inc
Current assignee: Quantapore Inc
Priority date: 2016-08-19
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-05-24
Also published as: WO2018034807A1; EP3500684A4; EP3500684A1; AU2017312746A1; JP2019528065A; CA3031812A1

Abstract

本发明涉及用于使用纳米孔的基于光学的多核苷酸分析的方法和组合物，其中猝灭剂用于减少或消除由检测区外的多核苷酸标记物产生的杂散光学信号。在一些实施方案中，本发明可以通过下步骤来实施：使多核苷酸易位通过纳米孔，其中多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，并且其中所述纳米孔将核苷酸限制为依次移动通过检测区；激发所述荧光标记物；使用一种或更多种非荧光猝灭剂猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；当荧光标记物通过检测区时，检测从荧光标记物发射的荧光信号；以及根据检测到的荧光信号确定核苷酸的序列。

Description

使用猝灭剂的基于光学的纳米孔测序

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年8月19日提交的美国临时专利申请第62/377,409号的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

发明背景

核苷酸的光学检测已经作为对于纳米孔测序领域中一些技术困难诸如，例如同时从大规模纳米孔阵列收集独立信号的困难的可能解决方案被提出。然而，实施光学方法存在许多挑战，特别是相对于明显的光学噪声背景测量来自易位的多核苷酸上的单分子标记物的光学信号的困难。来自单分子的荧光信号的测量已经在多种情况下进行，例如Lackowitz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第三版(Springer,2006)；Moerner等人，Review of Scientific Instruments,74(8):3597-3619(2003)；Michalet等人Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,32:161-182(2003)；包括与基于流(flow-based)的高速DNA测序相关的那些情况，例如Jett等人，J.Biomol.Struct.Dyn.,7(2):301-309(1989)。然而，基于光学的纳米孔测序呈现新的挑战，因为它需要测量来自快速通过纳米级检测区的完整多核苷酸上的标记物的连续光学信号。特别地，检测区外的光学标记物可能对收集的信号中的噪声有显著贡献。

鉴于以上情况，如果方法可用于消除或减少来自检测区外的标记物的光学噪声，基于光学的纳米孔测序将会得到改进。

发明概述

本发明涉及用于使用纳米孔的基于光学的多核苷酸分析的方法和组合物。在一个方面，本发明涉及猝灭剂减少或消除由检测区外的多核苷酸标记物产生的杂散光学信号(spurious optical signals)的用途。

在一个方面，本发明涉及一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤:(a)使多核苷酸易位通过纳米孔，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，并且其中纳米孔将核苷酸限制为依次移动通过检测区；(b)激发所述荧光标记物；(c)使用非荧光猝灭剂猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；(d)当荧光标记物通过检测区时，检测从所述荧光标记物发射的荧光信号；以及(e)根据检测到的荧光信号确定核苷酸的序列。

在另一个方面，本发明涉及一种确定多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供纳米孔阵列，所述纳米孔阵序列包含具有第一侧、第二侧和从其穿过的多于一个(a plurality of)纳米孔的固相膜，所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个纳米孔提供第一室和第二室之间的流体连通，并且每个纳米孔具有通向第二室的出口并且被定制尺寸以使单链核酸通过而双链核酸无法通过，并且每个纳米孔将易位的多核苷酸的核苷酸限制为依次移动通过在其出口处的检测区；(b)使多核苷酸从第一室通过纳米孔易位至第二室，每个多核苷酸具有被附接至其核苷酸的一个或更多个荧光标记物，使得不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记；(c)用激发光束照射荧光标记物；(d)用与多核苷酸结合的非荧光猝灭剂猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；(e)检测来自检测区内的荧光标记物的荧光信号；(f)根据检测到的荧光信号确定多核苷酸的核苷酸序列。

本发明通过提供猝灭剂来抑制或消除由检测区外的荧光标记物产生的荧光信号形式的不想要的光学噪声，有利地克服了基于光学的纳米孔测序领域的以上问题。本发明的这些优点和其他优点在许多实施方式和应用中被例示，其中的一些被总结如下并且贯穿本说明书。

附图简述

图1A-1B示出了具有荧光标记物的多核苷酸和当使用纳米孔分析此类多核苷酸时的光学噪声的来源。

图2A-2C示出了在反式室、顺式室以及顺式室和反式室两者中采用猝灭剂的本发明的实施方案。

图3示出了使用蛋白纳米孔和落射照明(epi-illumination)的本发明的实施方案，在纳米孔阵列上具有金属层以减少背景或TIR与FRET激发。

图4示出了共焦落射照明系统的基本组件。

图5示出了用于激发纳米孔阵列中或纳米孔阵列附近的光学标记物而无FRET信号产生的TIRF系统的元件。

图6为示出了基于测量包含来自多个(multiple)光学标记物的光的光学信号来调用核苷酸序列的步骤的流程图。

图7A-7C示出了采用两个和三个荧光标记物的实施方案。

发明详述

虽然本发明适用于各种修改和替代形式，这些修改和提代形式的细节已通过举例的方式在附图中被显示并且将被详细描述。然而，应该理解的是，意图并非将本发明限制于所描述的特定的实施方案。相反，意图涵盖落入本发明精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。例如，出于说明的目的，显示了本发明的特定的纳米孔类型和数目、特定的标记物、FRET对、检测方案、制造方法。然而，应该理解的是，本公开内容不意图在这方面是限制性的，因为可以利用其他类型的纳米孔、纳米孔的阵列和其他制造技术来实施本文讨论的系统的各个方面。对于本发明各方面的指导见于本领域普通技术人员熟知的许多可用的参考文献和论文，包括，例如，Cao,Nanostructures&Nanomaterials(Imperial College Press,2004)；Levinson，Principles of Lithography，第二版(SPIE Press,2005)；Doering和Nishi编辑，Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology，第二版(CRCPress,2007)；Sawyer等，Electrochemistry for Chemists，第二版(Wiley Interscience,1995)；Bard和Faulkner，Electrochemical Methods:Fundamentals and Applications，第二版(Wiley,2000)；Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第三版(Springer,2006)；Hermanson,Bioconjugate Techniques，第二版(Academic Press，2008)等，其相关部分在此通过引用并入。

本发明涉及用于使用纳米孔和光学检测分析多核苷酸诸如DNA、RNA等的方法和装置。更特别地，本发明涉及使用纳米孔和光学检测来确定一种或更多种多核苷酸的核苷酸序列。在一个方面，本发明涉及并包括通过使用非荧光猝灭剂来抑制和/或消除来自在期望的检测区外被激发的荧光标记物的荧光信号，来减少收集的信号中的光学噪声。图1A和1B示意性地示出了由本发明的这方面解决的问题。在基于光学的纳米孔测序的一些实施方案中，诸如由(100)所示的被标记的多核苷酸是由可从样品中获得的靶多核苷酸产生的。如所呈现的，标记的多核苷酸(100)的核苷酸的一部分已被附接(例如)两个荧光标记物“f”(102)或“g”(104)中的一个。

被标记的多核苷酸(100)和/或类似地标记的多核苷酸被易位通过纳米孔，诸如由固相膜(108)中的纳米孔(106)表示的纳米孔。如下文更充分地描述的，虽然纳米孔可以具有各种各样的形式和组成，但被用于实现基本相同的功能，即，将标记物多核苷酸的核苷酸限制为依次移动通过检测区。在一些实施方案中，纳米孔可以执行另外的功能，包括(i)使单链多核苷酸通过而双链多核苷酸无法通过，和/或(ii)抑制和/或限制荧光标记物在纳米孔运送期间的荧光发射。图1B示出了标记的多核苷酸(100)从顺式室(110)通过纳米孔(106)易位至反式室(112)，并被激发光束(114)照射，所述激发光束(114)可以是通过落射照射或倏逝波照射的直接照射。在任一配置中，期望检测区，例如检测区(124)外的大量荧光标记物被激发以使得收集的信号可包括来自检测区(124)外诸如包含将要进入纳米孔(106)的核苷酸的荧光标记物的区域(120)和包含已经离开检测区(124)的核苷酸的荧光标记物的区域(126)的潜在的许多荧光标记物的贡献。结果是，来自收集的信号(128)的辨识性序列信息面临重大挑战。在一个方面，本发明通过提供对标记的单链多核苷酸具有亲和力的非荧光猝灭剂以减少或消除来自期望检测区域或检测区(124)外的区域的荧光信号来解决这一挑战。在其他方面，可以提供对标记的双链多核苷酸具有亲和力的非荧光猝灭剂以减少或消除来自期望检测区或检测区域外的区域的荧光信号。

图2A-2C示出了对应于其中在纳米孔装置中应用猝灭剂的本发明的不同实施方案：仅反式室(图2A)、仅顺式室(图2B)或顺式室和反式室两者(图2C)。在图2A中，示出了标记的多核苷酸(200)从顺式室(202)易位固相膜(208)的纳米孔(206)而到达反式室(204)。浸渍在反式室(204)中的是用“Q”表示的非荧光猝灭剂(205)。本发明的猝灭剂在对于标记的单链多核苷酸(200)的易位条件下是可溶性的，并且在相同条件下，猝灭剂与单链多核苷酸诸如(200)没有充分序列特异性地结合。同样，在可选的实施方案中，本发明的猝灭剂在对于标记的双链多核苷酸的易位条件下是可溶性的，并且在相同条件下，猝灭剂与这样的双链多核苷酸没有充分的序列特异性地结合。如下文更充分解释的，各种各样的非荧光猝灭剂是可获得的以用于本发明，所述多种非荧光猝灭剂包括许多众所周知的有机染料，诸如不对称花青染料的衍生物，以及这样的化合物与寡核苷酸和/或其类似物的缀合物。在该实施方案中，猝灭剂的类型和浓度以及易位速度的选择限定了检测区(210)。在一些实施方案中，“检测区”意指从其中收集荧光信号以形成原始数据(raw data)的区域或体积(其可以是连续的或不连续的)，由所述原始数据确定关于标记的多核苷酸的信息诸如序列信息。在一些实施方案中，“检测区”是连续的区域或体积。检测区(210)外的反式室(204)中的荧光标记物基本上被与反式室(204)中标记的多核苷酸(200)的部分结合的猝灭剂(205)猝灭。在一些实施方案中，猝灭剂包含与基于如下文更充分描述的有机染料的一个或更多个猝灭部分缀合的寡核苷酸或类似物。例如，当固相膜(208)是或包括不透明层时，可以采用图2A的实施方案，使得顺式室(202)中的荧光标记物基本上不被激发。在这样的实施方案中，例如，邻近通向反式室的纳米孔出口的检测区的体积，可能取决于包括但不限于以下的因素：标记的多核苷酸的易位速度、反式室中猝灭剂的浓度、猝灭剂对多核苷酸的亲和力、猝灭剂的猝灭效率等。

图2B示出了与图2A中的元件基本相同的元件，除了猝灭剂(205)被设置在顺式室(202)中。在不期望的倏逝波或类似的非辐射光能延伸至顺式室(202)并激发产生被收集的荧光信号的荧光标记物的情况下，这种配置可能是期望的。在顺式室(202)中与标记的多核苷酸(200)结合的猝灭剂(205)减少或消除这样的荧光信号。在一些实施方案中，选择猝灭剂(205)和纳米孔(206)的横截面，使得猝灭剂(205)被排除而不易位通过纳米孔(206)。在一些实施方案中，这可以通过使用蛋白纳米孔α-溶血素和猝灭剂来实现，所述猝灭剂包含寡核苷酸或其类似物的与如下文更充分描述的一种或更多种猝灭化合物的缀合物。

图2C示出了其中猝灭剂(205)存在于顺式室(202)和反式室(204)两者中的实施方案，该实施方案提供了关于图2A和2B两者的实施方案描述的优点。

图3示出了包括以下元件的实施方案：设置在脂质双层(302)中的蛋白纳米孔(300)；荧光标记物的落射照明元件，在固相膜(306)中具有防止或减少背景荧光的不透明层(308)；和设置在反式室(326)中的猝灭剂(310)。如上，带有荧光标记的核苷酸(标记物由“f”表示，如(322))的多核苷酸(320)从顺式室(324)通过纳米孔(300)易位至反式室(326)。寡核苷酸猝灭剂(310)在允许寡核苷酸猝灭剂(328)与多核苷酸(320)从纳米孔(300)中露出的部分杂交的条件(例如浓度、温度、盐浓度等)下被设置于反式室(326)中。可以选择纳米孔(300)以使得来自荧光标记物的信号在纳米孔运送期间被抑制，如Huber等人的美国专利公布US 2016/0076091中所描述的，其通过引用并入本文。因此，当标记的核苷酸在区域(328)中从纳米孔(300)中露出时，它们变得不受抑制并且能够产生信号。对于大多数(Withmost)(如果不是所有)形式的直接照明(例如，非FRET)，当这样的露出的标记物进一步行进进入反式室(326)时，它们将继续发射荧光，从而极大地贡献到被收集的信号。有了在反式室(326)中与露出的多核苷酸结合的猝灭剂，这样的发射可以被极大地减少，并且可以界定检测区(328)，来自该检测区(328)的收集的信号可以被分析以给出关于多核苷酸(320)的核酸序列信息。在一些实施方案中，当标记的多核苷酸移动通过检测区(328)时，在检测时间段从检测区检测来自单个荧光标记物的荧光信号。在其他实施方案中，在预定的时间段内，从检测区(328)中的多于一个荧光标记物收集多于一个荧光信号。在一些实施方案中，这样的检测时间段小于1毫秒、或小于0.1毫秒、或小于0.01毫秒。在一些实施方案中，这样的检测时间段为至少0.01毫秒、或至少0.1毫秒、或至少0.5毫秒。

猝灭剂

本发明的猝灭剂包括在纳米孔测序条件下(i)基本上是非荧光的，(ii)与单链核酸，特别是单链DNA结合，以及(iii)无辐射地吸收来自其他分子的激发能量并且无辐射地释放能量的任何化合物(或化合物的集合)。在一些实施方案中，猝灭剂还与单链DNA非共价结合。各种各样的猝灭化合物是可获得的以用于本发明，包括但不限于如下文更充分描述的常见合成染料诸如花青染料和呫吨染料的非荧光衍生物。在选择猝灭化合物方面的指导可以见于美国专利6,323,337；6,750,024等参考文献中，这些参考文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，猝灭剂可以是用已知猝灭荧光的重原子(诸如溴或碘)共价修饰的，或者用已知猝灭荧光的其他基团(诸如硝基基团或偶氮基团)共价修饰的单链DNA结合染料。已知结合单链DNA的染料的一个实例是Sybr Green(Zipper等人，(2004)，NucleicAcids Research.32(12))。将硝基、溴、碘和/或偶氮基团掺入花青Sybr Green结构中提供了单链DNA结合基团部分，所述单链DNA结合基团部分将猝灭可能存在于DNA上的荧光标记物。

在一些实施方案中，猝灭剂包含结合部分和一个或更多个猝灭部分。结合部分可以包括无充分序列特异性地与单链核酸结合的任何化合物。结合部分可以包括具有修饰的键(linkage)和/或单体的肽或寡核苷酸或其任一者的类似物。寡核苷酸及其类似物可以通过双链体形成或通过非碱基配对适配子结合提供与多核苷酸的结合。在一些实施方案中，结合部分包含具有在6至60个核苷酸的范围内的长度的寡核苷酸或其类似物。这样的寡核苷酸或类似物可以与一个猝灭部分或与多于一个猝灭部分缀合。在一些实施方案中，与每个寡核苷酸或类似物缀合的多于一个猝灭部分是2或3。与结合部分缀合的猝灭部分可以相同或不同。在一些实施方案中，每当结合部分是寡核苷酸或类似物时，两个猝灭部分就与其缀合，一个在寡核苷酸的5’末端且一个在寡核苷酸的3’末端。具有2至3个猝灭部分的寡核苷酸或类似物可以使用常规连接和合成化学合成，例如，如在本文引用的参考文献中公开的。

包含在顺式室中结合单链寡核苷酸的猝灭剂可以是有利的，因为在一些纳米孔配置中，诸如图3中以蛋白纳米孔(300)所示的配置中，可以选择是足够窄的以使其仅易位单链核酸的纳米孔；因此，在纳米孔易位期间，纳米孔实际上随着易位进行剥离已结合的猝灭剂。在一些实施方案中，可以选择在纳米孔运送期间抑制荧光标记物的信号产生(或检测)，随后在离开纳米孔进入检测区时自由地产生信号(或可检测性)(例如图3中的(328))的纳米孔。

寡核苷酸或类似物可以以单一种类提供，或者它们可以以具有不同序列并且因此具有不同的结合特异性的多于一种寡核苷酸或类似物的混合物提供。在一些实施方案中，寡核苷酸或类似物是随机序列聚合物(random sequence polymer)；即，它们以给定长度的每个可能序列的混合物提供。例如，这样的寡核苷酸或类似物可以由式对于6-聚体的“NNNNNN”，或者对于8-聚体的“NNNNNNNN”来表示，其中N可以是A、C、G或T，或者其类似物。

提及寡核苷酸的“类似物”意指包含一种或更多种核苷酸类似物的寡核苷酸。如定义部分描述的，“核苷酸类似物”是可以具有修饰的键部分、糖部分或碱基部分的核苷酸。可用于本发明的示例性寡核苷酸类似物包括但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)(2’-O-甲基RNA)、硫代磷酸寡核苷酸、桥接核酸(BNA)等。

在一些实施方案中，寡核苷酸结合部分包含通用碱基；即，它们包含可以取代四种天然核苷酸中的任何一种而不破坏碱基对相互作用的一种或更多种核苷酸类似物。具有通用碱基特性的核苷酸类似物被描述于Loakes,Nucleic Acids Research,29(12):2437-2447(2001)中，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，寡核苷酸结合部分包含2’-脱氧肌苷、7-脱氮-2’-脱氧肌苷、2-氮杂-2’-脱氧肌苷、3-硝基吡咯核苷酸、5-硝基吲哚核苷酸等。

在一些实施方案中，猝灭剂可以包含一起作用以猝灭标记的单链多核苷酸的不期望的荧光信号的两种或更多种化合物的组合。例如，猝灭剂可以包含可以与标记的多核苷酸形成双链体的寡核苷酸(例如多脱氧肌苷)和单独地是猝灭剂的双链嵌入剂。因此，每当聚脱氧肌苷与标记的多核苷酸结合时，该猝灭嵌入剂与所得双链体结合并猝灭来自多核苷酸的荧光信号。

任何能够可检测地猝灭标记的多核苷酸的荧光标记物的荧光信号的合成染料都是对于本发明的目的可接受的猝灭部分。具体地，如在本发明中使用的，猝灭部分具有表现出与标记的多核苷酸上的荧光标记物的发射带至少一些光谱重叠的吸收带。如果存在足够的光谱重叠，这种重叠可能伴随荧光标记物(供体)发射而发生，荧光标记物(供体)在比猝灭部分(受体)的最大吸收波长低或甚至高的波长发射最大值发生。能量转移也可以通过将供体的发射转移成受体的更高电子态而发生。本领域普通技术人员通过检查该染料相对于所用的荧光标记物的发射光谱的激发带来确定给定猝灭部分的效用。

通常，本发明中的荧光猝灭通过本发明的荧光标记物和猝灭部分之间的荧光共振能量转移(FRET或通过电荷转移复合物的形成)发生。供体和受体化合物的光谱特性和电子特性对观察到的能量转移的程度具有强烈影响，标记的多核苷酸上的荧光标记物和猝灭部分之间的分隔距离也是如此。随着分隔距离的增加，荧光猝灭的程度降低。

猝灭部分可以任选地是荧光的，条件是当与标记的多核苷酸结合时染料的最大发射波长与荧光标记物的最大发射波长适当地分离。然而，优选地，当与寡核苷酸或类似物共价缀合时，猝灭部分是仅微弱荧光的，或者是基本上非荧光的。如本文使用的，基本上非荧光的表示，在如本文对于任何方法描述的测定溶液中，猝灭部分的荧光效率小于或等于5％，优选地小于或等于1％。在其他实施方案中，共价结合的猝灭部分表现出小于约0.1，更优选地小于约0.01的量子产率。在一些实施方案中，与本发明的猝灭寡核苷酸缔合的荧光标记物的荧光相对于在共价结合的猝灭部分的不存在下与相同的荧光标记物缔合的相同寡核苷酸被猝灭多于50％。在另一个实施方案中，荧光标记物相对于未标记的寡核苷酸被猝灭多于90％。在又另一个实施方案中，核酸染色相对于未标记的寡核苷酸被猝灭多于95％。

在一些实施方案中，猝灭部分可以是芘、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-l,3-二唑(NBD)、花青、羰花青、喹诺酮(carbostyryl)、卟啉、水杨酸酯(salicylate)、邻氨基苯甲酸酯(anthranilate)、薁(azulene)、二萘嵌苯(perylene)、吡啶、喹啉、香豆素(包括羟基香豆素和氨基香豆素(aminocoumarin)以及其氟化和磺化衍生物)(如Gee等人的美国专利第5,830,912号(1998)和Wang等人的美国专利第5,696,157号(1997)中描述的,通过引用并入)、聚氮杂引达省(polyazaindacene)(例如Haugland等人的美国专利第4,774,339号(1988)；Kang等人的美国专利第5,187,288号(1993)；Haugland等人的美国专利第5,248,782号(1993)；Kang等人的美国专利第5,274,113号(1993)；Kang等人的美国专利第5,433,896号(1995)；Wu等人的美国专利第6,005,113号(1999)，全部通过引用并入)、呫吨、噁嗪或苯并噁嗪、卡巴嗪(Corey的美国专利第4,810,636号(1989)，通过引用并入)、或芴酮(phenalenone)或苯并芴酮(benzphenalenone)(Babb等人的美国专利第4,812,409号(1989)，通过引用并入)。

在其他实施方案中，基本上是非荧光染料的猝灭部分特别地包括偶氮染料(诸如DABCYL或DABSYL染料及它们的结构类似物)、三芳基甲烷染料诸如孔雀石绿或酚红，4’,5z-二醚取代的荧光素(美国专利第4,318,846号(1982))，或不对称花青染料猝灭剂(PCT国际申请WO 9937,717(1999))。

在猝灭部分是呫吨的实施方案中，合成染料任选地是荧光素、对甲氨基酚(rhodol)(Haugland等人的美国专利第5,227,487号(1993)，通过引用并入)或罗丹明。如本文使用的，荧光素包括苯并-或二苯并荧光素(dibenzofluorescein)、半萘并荧光素(seminaphthofluorescein)或萘并荧光素(naphthofluorescein)。类似地，如本文使用的，对甲氨基酚包括半萘酚罗丹荧(seminaphthorhodafluor)(Haugland等人的美国专利第4,945,171号(1990)，通过引用并入)。呫吨包括呫吨染料的氟化衍生物(国际公布第WO 97/39064号，Molecular Probes,Inc.(1997)，通过引用并入)、以及呫吨染料的磺化衍生物(国际公布第WO 99/15517号，Molecular Probes,Inc.(1999)，通过引用并入)。如本文使用的，噁嗪包括异吩唑酮(resorufm)、氨基噁嗪酮(aminooxazinone)、二氨基噁嗪(diaminooxazine)及其苯并取代的类似物。

在另外的实施方案中，猝灭部分是3-和/或6-氨基呫吨的基本上非荧光的衍生物，其在一个或更多个氨基氮原子上被芳族或杂芳族环系统取代，例如，如美国专利6,399,392中描述的，该专利通过引用并入本文。这些猝灭染料通常具有高于530nm的吸收最大值，具有很少或没有可观察到的荧光，并有效地猝灭广谱的发光性发射，诸如由化学发光剂、磷光体或荧光团发射的发光发射。在一个实施方案中，猝灭染料是取代的罗丹明。在另一个实施方案中，猝灭化合物是取代的对甲氨基酚。

仍在其他实施方案中，猝灭部分可以包含以下专利中描述的称为Black HoleQuenchers^TM化合物(BHQ)的一种或更多种非荧光猝灭剂：7，019，129；7,109,312；7,582,432；8,410,025；8,440,399；8,633,307；8,946,404；9,018,369；或9,139,610；这些专利通过引用并入本文。

以下公开另外的猝灭部分，这些猝灭部分通过引用美国专利6,699,975；6,790,945和8,114,979并入本文。

光学信号检测

在一些实施方案中，其中激发光束递送和光学信号收集通过单个物镜发生的落射照明系统可以被用于直接照射聚合物分析物上的标记物或纳米孔上的供体。用于本发明的共焦落射照明系统的基本组件示于图4中。激发光束(402)被导向二向色镜(dichroic)(404)并且到达物镜(406)上，物镜(406)将激发光束(402)聚焦(410)到层状膜(400)上，其中标记物被直接激发以发射光学信号诸如荧光信号，或者通过FRET相互作用被间接地激发以发射光学信号。这样的光学信号通过物镜(406)被收集并且导向二向色镜(404)，二向色镜(404)被选择使得其通过光学信号(411)的光但反射激发光束(402)的光。光学信号(411)通过透镜(414)，透镜(414)将其聚焦通过针孔(416)并且聚焦到检测器(418)上。当光学信号(411)包括来自多于一个荧光标记物的荧光信号时，可以提供另外的光学组件、滤光器、分束器、单色器等，用于进一步分离来自从不同的荧光标记物的不同荧光信号。

在一些实施方案中，核苷酸上的标记物可以使用与图5中所示的设备类似的如在Soni等人的Review of Scientific Instruments,81:014301(2010)；以及在美国专利公布2012/0135410(通过引用并入本文)中描述的设备通过倏逝场激发。在该设备中，在纳米孔或纳米孔阵列的反式侧上的非常窄的第二室允许倏逝场从下面的玻璃载玻片的表面延伸，以在纳米孔的入口和出口处建立检测区，使得与纳米孔关联的每个光学测量都包含来自多于一个标记的核苷酸的贡献。孔阵列(500)(其可包括插入于脂质双层中的蛋白纳米孔)可以在氮化硅层(502)中形成，所述氮化硅层(502)可以具有在20-100nm的范围内的厚度。氮化硅层(502)可以在硅支撑层(503)上形成。第二室(506)可以由氮化硅层(502)、确定第二室(506)的高度的二氧化硅层(504)和玻璃载玻片(510)的表面(508)形成。二氧化硅层(504)可以具有在50-100nm范围内的厚度。从表面(508)延伸跨越氮化硅层(502)的期望的倏逝场(507)可以通过在相对于玻璃载玻片(510)的适当角度处直射光束(512)来建立，使得发生TIR。为了驱动标记的多核苷酸分析物通过阵列(500)，可以在第一室(516)中建立顺式(-)条件，并且可以在第二室(506)中建立反式(+)条件，其中电极可操作地连接至第一和第二室(506和521)。

通过混合的光学信号的序列确定

在一些实施方案中，可以测量来自分辨受限区域的一系列光学信号，其中每次光学测量包含来自不同邻近核苷酸的多于一个分量信号(component signal)(所述核苷酸在多核苷酸中的顺序不能由单次测量来确定，因为，例如分量信号在衍射受限区域内产生)。在这些情况下，对多核苷酸的基于光学的纳米孔分析(i)产生光学测量的时间序列(timeseries)，该时间序列包括来自多于一个标记的核苷酸的序列的重叠贡献，从而使得难以(如果不是不可能的话)确定来自单次测量的核苷酸的顺序；并且(ii)通过为核苷酸选择产生可区分的信号的光学标记物，光学测量可以被分离到来自不同种类的核苷酸上的不同标记物的贡献里，这允许重叠测量被转换为序列信息。

在一个方面，本发明的方法可以通过以下步骤实施：(a)将多核苷酸易位通过纳米孔，其中多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的光学信号的不同光学标记物标记，并且其中纳米孔将核苷酸限制为依次移动通过检测区，所述检测区包括多于一个核苷酸，其中检测区的特征在于不存在与多核苷酸结合的猝灭剂；(b)当多核苷酸通过检测区时，检测来自核苷酸的光学信号的时间序列；(c)区分来自不同种类的核苷酸的光学信号；以及(d)根据来自多核苷酸的区分的光学信号的时间序列确定核苷酸的序列。

根据本发明，当标记的多核苷酸易位通过纳米孔及其相关的检测区时，光学测量的时间顺序集(time-ordered set)被记录。从每次光学测量包含来自邻近核苷酸的标记物的贡献的意义上说，在邻近时间点的光学测量是重叠的。因此，例如，如果三个核苷酸在每个时间点产生信号(例如，多核苷酸-A-(B-C-D)-...的B、C和D...从左向右移动通过检测区)，并且如果在连续测量之间一个核苷酸离开检测区且另一个核苷酸进入检测区(通过括号表示)(例如，A进入且D离开:-(A-B-C)-D...)，则两次连续的光学测量将包含来自相同核苷酸的贡献(在该实例中，两次测量都包括来自B和C的贡献)。以上实例是基于多核苷酸易位通过纳米孔的非常简化的模型；然而，连续重叠光学测量的概念可适用于更复杂的多核苷酸易位的描述。

由于来自纳米孔处的多于一个不同标记的核苷酸的发射源自同一分辨受限区域，关于核苷酸的相对位置信息(特别是序列信息)不能由单次光学测量来确定。然而，由于重叠和产生核苷酸特异性信号的标记物的使用，在一些实施方案中，当序列信息被分离到核苷酸特异性信号的多于一个时间顺序集中时，可以由光学信号测量的时间顺序集确定序列信息。类似于在杂交测序(SBH)中使用以根据杂交数据重构靶多核苷酸序列的那些算法的算法可以在此处被用于重构靶多核苷酸，例如美国专利5,002,867；Timp等人的Biophys,J.,102:L37-L39(2012)等，其通过引用并入。在光学检测情的况下：(i)时间顺序重叠信号和信号以及(ii)它们分离为核苷酸特异性组分的限制显著简化了确定步骤。

图6示出了基于纳米孔易位的简单模型由重叠光学信号的时间顺序集确定核苷酸序列信息的步骤的一个实施方案。该简单模型假定，在每个时间步骤(除了多核苷酸进入纳米孔以及从纳米孔离开时)的光学测量各自包含来自相同数目的核苷酸的信号贡献(图6中被称为“n元组”，表示测量将包含来自n个核苷酸的贡献)。应当理解，由于易位速度的局部变化、核苷酸的线性移动的偏差及其他类似现象，更复杂的模型可以允许在每次测量中贡献核苷酸的数目不同。即，在一些实施方案中，在不同时间的光学测量可以具有来自不同数目的核苷酸的贡献。在一些实施方案中，不同数目的核苷酸沿着靶多核苷酸的区段排序。图6所示的确定步骤假定标记的多核苷酸已经通过纳米孔，并且已经获得了光学测量的时间顺序集，包括将光学信号分离为核苷酸特异性信号(600)。多核苷酸的进入和离开被不同地处理，因为在进入和离开时在检测区中必然存在不同数目的核苷酸。在该实施方案中，假定在这些条件下的初始和最后的光学测量允许初始和最后的核苷酸直接根据其核苷酸特异性信号确定。在其他实施方案中，用于分析的标记的核苷酸的制备可以包括将多于一个预定标记的核苷酸插入这样的标记的多核苷酸的一个末端或两个末端，用于产生光学信号的已知序列以辅助序列确定步骤的目的。这样的预定标记的核苷酸将类似于Ion Torrent或454测序，例如美国专利7,575,865中的关键序列，该专利通过引用并入。

回到图6，在确定步骤开始时，时间指数i被设置为零；在当前时间i的候选序列的指数j被设置为1(602)；并且检查核苷酸特异性时间顺序光学信号集的初始n元组(604)。这样的检查包括，首先根据在时间i的测量确定与测量一致的所有可能的核苷酸的n元组，然后根据这些n元组确定哪些与候选序列Si正确重叠。新候选序列Si+1通过与测量一致的集的各自正确重叠的n元组形成(并且序列Si被延伸)(606)。新延伸的候选序列Si+1被存储，并且给予在时间i+1的候选序列的编号的指数Ji+1被更新(608)。重复该步骤，直到检查了每个候选序列Si(610)，并且在每个时间i进行类似的检查，直到已经检查了时间顺序集中的每次光学测量。

纳米孔和纳米孔阵列

用于本发明的纳米孔可以是固态纳米孔、蛋白纳米孔或包含被配置在固态膜或类似的框架中的蛋白纳米孔或有机纳米管诸如碳纳米管或石墨烯纳米管的杂化纳米孔。纳米孔的重要特征包括限制多核苷酸分析物，诸如标记的多核苷酸，使得它们的单体按顺序通过信号产生区(或等同地，激发区或检测区等)。即，纳米孔限制多核苷酸分析物诸如多核苷酸的移动，使得核苷酸依次地通过检测区(或激发区)。在一些实施方案中，纳米孔的另外功能包括(i)使单链核酸通过而双链核酸或等同的大分子无法通过，和/或(ii)限制核苷酸上的荧光标记物，使得荧光信号产生被抑制或引导使得其不被收集。

在一些实施方案中，结合本发明的方法和装置使用的纳米孔以阵列的形式提供，诸如纳米孔簇的阵列，其可被规则地布置在平坦表面上。在一些实施方案中，簇各自处于单独的分辨受限区域中，使得来自不同簇的纳米孔的光学信号是所采用的光学检测系统能够区分的，但来自同一簇内的纳米孔的光学信号不一定能被所采用的光学检测系统分配到该簇内的特定纳米孔。

固态纳米孔可以用多种材料制造，包括但不限于氮化硅(Si₃N₄)、二氧化硅(SiO₂)等。用于分析应用诸如DNA测序的纳米孔的制造和操作在以下示例性参考文献中公开(这些参考文献通过引用并入)：Ling，美国专利7,678,562；Hu等人的美国专利7,397,232；Golovchenko等人的美国专利6,464,842；Chu等人的美国专利5,798,042；Sauer等人的美国专利7,001,792；Su等人的美国专利7,744,816；Church等人的美国专利5,795,782；Bayley等人的美国专利6,426,231；Akeson等人的美国专利7,189,503；Bayley等人的美国专利6,916,665；Akeson等人，美国专利6,267,872；Meller等人的美国专利公布2009/0029477；Howorka等人的国际专利公布WO2009/007743；Brown等人的国际专利公布WO2011/067559；Meller等人的国际专利公布WO2009/020682；Polonsky等人的国际专利公布WO2008/092760；Van der Zaag等人的国际专利公布WO2010/007537；Yan等人，Nano Letters，5(6):1129-1134(2005)；Iqbal等人，Nature Nanotechnology,2:243-248(2007)；Wanunu等人，Nano Letters,7(6):1580-1585(2007)；Dekker,Nature Nanotechnology,2:209-215(2007)；Storm等人，Nature Materials,2:537-540(2003)；Wu等人，Electrophoresis,29(13):2754-2759(2008)；Nakane等人，Electrophoresis,23:2592-2601(2002)；Zhe等人，J.Micromech.Microeng.,17:304-313(2007)；Henriquez等人，The Analyst,129:478-482(2004)；Jagtiani等人，J.Micromech.Microeng.,16:1530-1539(2006)；Nakane等人，J.Phys.Condens.Matter,15R1365-R1393(2003)；DeBlois等人，Rev.Sci.Instruments,41(7):909-916(1970)；Clarke等人，Nature Nanotechnology,4(4):265-270(2009)；Bayley等人，美国专利公布2003/0215881等等。

在一些实施方案中，本发明包括具有一个或更多个阻光层，即，一个或多个不透明层的纳米孔阵列。通常，纳米孔阵列用诸如硅、氮化硅、氧化硅、氧化铝等的薄片材料制造，它们容易传播光，特别是在所使用的厚度，例如少于50-100nm容易传播光。对于分析物的电学检测，这不成问题。然而，在易位通过纳米孔的标记的分子的基于光学的检测中，通过阵列传播的光总是激发预期的反应位点外的材料，因此产生光学噪声，例如来自非特异性背景荧光的光学噪声、来自尚未进入纳米孔的分子的标记物的荧光等等。在一个方面，本发明通过提供具有反射和/或吸收来自激发光束的光的一个或更多个阻光层的纳米孔阵列，从而减少在与阵列的纳米孔相关的预期反应位点处产生的光学信号的背景噪声来解决该问题。在一些实施方案中，这允许在预期反应位点中的光学标记物通过直接照射被激发。在一些实施方案中，不透明层可以是金属层。这样的金属层可以包括Sn、Al、V、Ti、Ni、Mo、Ta、W、Au、Ag或Cu。在一些实施方案中，这样的金属层可以包括Al、Au、Ag或Cu。仍在其他实施方案中，这样的金属层可以包括铝或金，或者可以仅包括铝。不透明层的厚度可以广泛地变化，并取决于构成该层的材料的物理和化学特性。在一些实施方案中，不透明层的厚度可以是至少5nm、或至少10nm、或至少40nm。在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从5-100nm的范围内；在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从10-80nm的范围内。不透明层不需要阻挡(即反射或吸收)100％的来自激发光束的光。在一些实施方案中，不透明层可以阻挡至少10％的来自激发光束的入射光；在其他实施方案中，不透明层可以阻挡至少50％的来自激发光束的入射光。

不透明层或涂层可以通过本领域已知的各种技术被制造在固态膜上。可以使用包括化学气相沉积、电沉积、外延、热氧化、物理气相沉积(包括蒸发和溅射)、铸造等的材料沉积技术。在一些实施方案中，可以使用原子层沉积，例如美国专利6,464,842；Wei等人，Small，6(13):1406-1414(2010)，其通过引用并入。

在一些实施方案中，1-100nm的通道或孔可以通过固态基质，通常为平面基质诸如膜而形成，分析物诸如单链DNA被诱导易位通过所述通道或孔。在其他实施方案中，2-50nm的通道或孔通过基质而形成；并且仍在其他实施方案中，2-30nm、或2-20nm、或3-30nm、或3-20nm、或3-10nm的通道或孔通过基质而形成。产生纳米孔的固态方法提供稳健性和耐久性以及调整纳米孔的尺寸和形状的能力、在晶片规模上制造高密度纳米孔阵列的能力、与基于脂质的系统相比优异的机械、化学和热学特性，以及与电学或光学读出技术整合的可能性。另一方面，通过常规蛋白工程方法，生物纳米孔提供可再现的窄的钻孔或腔，特别是在1-10nm范围内的钻孔或腔，以及用于定制纳米孔的物理和/或化学特性的技术和用于直接地或间接地附接基团或元件诸如荧光标记物(其可以是FRET供体或受体)的技术。蛋白纳米孔通常依赖于精致的脂质双层获得机械支撑，并且具有精确尺寸的固态纳米孔的制造仍然具有挑战性。在一些实施方案中，可以将固态纳米孔与生物纳米孔组合以形成克服这些缺点中的一些的所谓的“杂化”纳米孔，从而提供生物孔蛋白的精确度与固态纳米孔的稳定性。对于光学读出技术，杂化纳米孔提供纳米孔的精确位置，这大大简化了数据采集。

在一些实施方案中，簇还可以通过将蛋白纳米孔布置在由包含孔阵列的固相膜支撑的脂质双层中来形成。例如，这样的阵列可以包括在固相支撑物中制造(例如钻、蚀刻等)的孔。这些孔的几何结构可以根据所采用的制造技术而变化。在一些实施方案中，每个这样的孔与单独的分辨受限区域关联或被其包围；然而，在其他实施方案中，多于一个孔可以处于同一分辨受限区域内。尽管这些区域通常由于常规制造方法而基本上相同，但不同簇之间的孔的横截面积可以广泛地变化并且可以相同或可以不同。在一些实施方案中，孔具有在从10nm至200nm范围内的最小线性尺寸(例如在圆孔的情况下为直径)，或者具有在从约100nm²至3×10⁴nm²范围内的面积。跨越孔可以布置脂质双层。例如，通过在插入步骤期间控制蛋白纳米孔的浓度，可以改变每个孔的蛋白纳米孔的分布。在这样的实施方案中，纳米孔的簇可以包括随机数目的纳米孔。在蛋白纳米孔随机插入孔中的一些实施方案中，包含一个或更多个孔的簇具有平均大于零的蛋白纳米孔数目；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.25的蛋白纳米孔数目；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.5的蛋白纳米孔数目；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.75的蛋白纳米孔数目；在其他实施方案中，这样的簇具有大于1.0的蛋白纳米孔数目。

在一些实施方案中，本发明的方法和装置包括固相膜，诸如SiN膜，其具有孔阵列从中穿过，所述孔阵列提供第一室和第二室(有时也被称为“顺式室”和“反式室”)之间的连通并在面向第二室或反式室的表面上支撑脂质双层。在一些实施方案中，这样的固相膜中孔的直径可以在10nm至200nm的范围内，或者在20nm至100nm的范围内。在一些实施方案中，这样的固相膜还包括被插入到脂质双层中的蛋白纳米孔，所述蛋白纳米孔被插入在该双层在面向反式室的表面上跨越孔的区域中。在一些实施方案中，这些蛋白纳米孔使用本文所描述的技术从固相膜的顺式侧插入。在一些实施方案中，这样的蛋白纳米孔具有与α溶血素相同或相似的结构，因为它沿着轴线包括桶或钻孔，并且在一个末端处具有“帽”结构并且在另一个末端处具有“茎”结构(使用来自Song等，Science,274:1859-1866(1996)的术语)。在使用这样的蛋白纳米孔的一些实施方案中，向脂质双层的插入导致蛋白纳米孔被取向成使得其帽结构暴露于顺式室而其茎结构暴露于反式室。

在一些实施方案中，本发明可以采用成簇的杂化纳米孔，特别地用于多核苷酸的基于光学的纳米孔测序。这样的纳米孔包括固态孔口(orifice)或孔，蛋白生物传感器诸如蛋白纳米孔被稳定地插入固态孔口或孔中。带电荷的多核苷酸可以通过常规蛋白工程技术被附接至蛋白纳米孔(例如α-溶血素)，此后可以使用施加的电场将蛋白纳米孔引导至固态膜中的孔中。在一些实施方案中，固态基质中的孔被选择为略小于蛋白，从而防止其易位通过孔。相反，蛋白将被嵌入到固态孔口中。

固态纳米孔或合成纳米孔可以以多种方式被制备，如以上引用的参考文献所示例的。在一些实施方案中，可以使用氦离子显微镜在多种材料中钻出合成纳米孔，例如如Yang等，Nanotechnolgy,22:285310(2011)所公开的，其通过引用并入本文。支撑薄膜材料例如氮化硅(其已经被加工成自持式膜(a free-standing membrane))的一个或更多个区域的芯片被引入到氦离子显微镜(HIM)室中。HIM马达控制器用于在显微镜被设置为低放大率时将自持式膜带入离子束的路径。在靠近自持式膜但在固体基质上的区域，调节包括焦点和消像散(stigmation)的光束参数。在参数被适当地固定后，移动芯片位置使得自持式膜区域被集中在离子束扫描区域上并且光束被消隐。HIM视野被设置为足以包含整个预期的纳米孔图案并且足以在未来的光学读出(即，取决于光学放大率、相机分辨率等)中有用的尺寸(以μm计)。然后，一旦离子束在导致足以移除所有或大部分的膜自体荧光的总离子剂量的像素停留时间(pixel dwell time)通过整个视野，将离子束光栅化。然后将视野设置为适当的值(小于以上使用的值)以进行单个纳米孔或纳米孔阵列的光刻定义的碾磨。图案的像素停留时间被设置为导致在样品加工之前通过使用校准样品确定的一个或更多个预定直径的纳米孔。对于单个芯片上的每个期望的区域和/或对于被引入到HIM室中的每个芯片重复这一完整过程。

在一些实施方案中，用于实施以上用于分析多核苷酸(诸如单链多核苷酸)的方法的装置通常包括一组电极，所述电极用于建立跨越层状膜和纳米孔的电场。通过将单链核酸放置在第一室中的电解质中而将单链核酸暴露于纳米孔，所述第一室通过在该室中放置负电极被配置为层状膜的“顺式”侧。当施加电场时，带负电荷的单链核酸被纳米孔捕获，并且被易位至层状膜的另一侧上的第二室，所述第二室通过在该室中放置正电极被配置为膜的“反式”侧。易位速度部分取决于第一室和第二室中电解质的离子强度以及施加的跨越纳米孔的电压。在基于光学的检测中，可以通过初步校准测量，例如，使用对于不同电压以不同的预期速率/纳米孔产生信号的标记的单链核酸的预定标准品来选择易位速度。因此，对于DNA测序应用，可以基于来自这样的校准测量的信号速率来选择易位速度。因此，根据这样的测量，可以选择例如允许或最大化可靠的核苷酸鉴定的跨越纳米孔阵列的电压。在一些实施方案中，可以使用来自被分析的模板样品的核酸(代替预定标准序列或除预定标准序列之外被使用)进行这样的校准。在一些实施方案中，例如，可以在测序运行期间实时进行这样的校准，并且可以基于这样的测量实时修改所施加的电压，以最大化核苷酸特异性信号的获取。

控制多核苷酸通过纳米孔的易位速度是必需的以允许收集数据，从该数据中可以获得序列信息。易位速度部分取决于跨越纳米孔的电压差(或电场强度)和第一室的反应混合物中的条件，在该第一室中核酸多核苷酸被暴露于纳米孔(例如被布置在构成第一室的一个壁的固相膜中)。纳米孔的核酸多核苷酸捕获率取决于此类多核苷酸的浓度。在一些实施方案中，用于纳米孔测序的常规反应混合物条件可以被本发明采用，例如，1M KCl(或等效的盐，诸如NaCl、LiCl等)和pH缓冲系统(其例如确保正被使用的蛋白，例如蛋白纳米孔、核酸酶等不变性)。在一些实施方案中，可以使用pH缓冲系统保持pH基本上恒定在6.8至8.8范围内的值。在一些实施方案中，跨越纳米孔的电压差可以在从70mV至200mV的范围内。在其他实施方案中，跨越纳米孔的电压差可以在从80mV至150mV的范围内。可以使用常规测量技术来选择适当的操作电压。可以使用商购可得的仪器容易地测量跨越纳米孔的电流(或电压)。可以选择电压差使得易位速度在期望的范围内。在一些实施方案中，易位速度的范围包括小于1000个核苷酸/秒的那些速度。在其他实施方案中，易位速度的范围为从10个核苷酸/秒至800个核苷酸/秒；在其他实施方案中，易位速度的范围为从10个核苷酸/秒至600个核苷酸/秒；在其他实施方案中，易位速度的范围为从200个核苷酸/秒至800个核苷酸/秒；在其他实施方案中，易位速度的范围为从200个核苷酸/秒至500个核苷酸/秒。

采用相互猝灭和自猝灭标记物的实施方案

如以上所提及的，在一些实施方案中，除了猝灭剂之外，还可以使用自猝灭和相互猝灭的荧光标记物，以减少来自离开纳米孔的核苷酸上的标记物的那些荧光发射外的荧光发射。这样的荧光标记物的使用被公开于美国专利公布2016/0122812中，该专利通过引用并入。在一些实施方案中，单体用能够具有以下至少三种状态同时被附接至靶多核苷酸的荧光标记物来标记:(i)基本上猝灭的状态，其中附接的荧光标记物的荧光被紧邻的单体上的荧光标记物猝灭；例如，当标记的多核苷酸在用于研究和操作该多核苷酸的常规水溶液中是游离的时，根据本发明的附接至多核苷酸的荧光标记物基本上被猝灭，(ii)空间受限状态，其中标记的多核苷酸易位通过纳米孔，使得附接的荧光标记物的自由溶液运动(free-solution movement)或对齐被破坏或被限制，使得由荧光标记物产生很少或没有可检测的荧光信号，(iii)过渡状态，其中，当荧光标记物离开纳米孔(在“过渡间隔”期间)而多核苷酸易位通过纳米孔时，附接至多核苷酸的荧光标记物从空间受限状态过渡为猝灭状态。

部分地，该实例是对这一发现的应用，在过渡间隔期间，(在本来基本上完全被标记且自猝灭的多核苷酸上的)荧光标记物能够产生可检测的荧光信号。意图不受奠定本发现的任何理论的限制，认为，在过渡间隔期间产生的荧光信号是由于可自由旋转的偶极子在从纳米孔露出的荧光标记物中的存在，这使荧光标记物短暂地能够产生荧光信号，例如在直接激发后或通过FRET。在空间受限状态和猝灭状态两者中，偶极子在其旋转自由度方面被限制，从而减少或限制发射的光子的数目。在一些实施方案中，多核苷酸是通常是单链多核苷酸的多核苷酸，诸如DNA或RNA，但特别是单链DNA。在一些实施方案中，本发明包括通过记录当附接的荧光标记物在多核苷酸易位通过纳米孔时一次一个地离开纳米孔时产生的信号来确定多核苷酸的核苷酸序列的方法。在离开时，游离溶液中的多核苷酸上的每个附接的荧光标记物在过渡间隔期间从纳米孔中的受限状态过渡为猝灭状态。换言之，在一些实施方案中，本发明的方法的步骤包括在游离溶液中的多核苷酸上的每个荧光标记物由纳米孔内的受限状态过渡为猝灭状态时激发它们。如以上所提及的，在这个过渡间隔或时间段内荧光标记物能够发射指示其所附接的核苷酸的可检测荧光信号。

在一些实施方案中，本发明包括以下发现的应用：可以选择荧光标记物和纳米孔，使得在多核苷酸易位通过纳米孔期间，附接至单体的荧光标记物被迫使进入受限状态，在这种状态下，它们不能够(或基本上不能够)产生可检测的荧光信号。在一些实施方案中，选择具有直径在从1nm至4nm范围内的钻孔或腔的纳米孔；在其他实施方案中，选择具有直径在从2nm至3nm范围内的钻孔或腔的纳米孔。在一些实施方案中，这样的钻孔的直径通过蛋白纳米孔提供。在一些实施方案中，这样的纳米孔被用于迫使荧光标记物进入根据本发明的受限状态，以使每当荧光标记物离开纳米孔时，其由基本上不能够产生荧光信号过渡为可被其被诱导而发射的荧光信号所检测和鉴定。因此，附接至多核苷酸的单体序列的每个单体的荧光标记物当其突然产生荧光信号时可以在紧邻纳米孔出口的区域(“过渡区”或“过渡体积”或“检测区”)被顺序地检测。在一些实施方案中，有机荧光染料被用作具有以上直径的纳米孔的荧光标记物。在一些实施方案中，至少一种这样的有机荧光染料选自由呫吨染料、罗丹明染料和花青染料组成的集合。用于确定多核苷酸的单体序列的一些实施方案可以通过以下步骤进行：(a)使聚合物易位通过纳米孔，其中多核苷酸的单体被荧光标记物标记，其中纳米孔将其钻孔内的荧光标记物限制为受限状态使得在其中基本上不产生可检测的荧光信号；(b)在每个单体离开纳米孔时激发每个单体的荧光标记物；(c)测量由正在离开的荧光标记物在检测区产生的荧光信号以鉴定荧光标记物所附接的单体；(d)猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号，以及(d)根据荧光信号的顺序确定多核苷酸的单体序列。在另外的实施方案中，荧光标记物是FRET对的受体并且FRET对的一个或更多个供体被附接至在出口的FRET距离内纳米孔上。

在一些实施方案中，如以上使用的“基本上猝灭的”意指荧光标记物产生的荧光信号比在相同条件下但没有邻近的相互猝灭标记物时产生的信号减少至少百分之三十。在一些实施方案中，如以上使用的“基本上猝灭的”意指荧光标记物产生的荧光信号比在相同条件下但没有邻近的相互猝灭标记物时产生的信号减少至少百分之五十。

在一些实施方案中，靶多核苷酸的核苷酸序列通过进行四个单独的反应来确定，其中靶多核苷酸的拷贝的四种不同种类的核苷酸(A、C、G和T)中的每一种用单一荧光标记物来标记。在这样的实施方案的变化形式中，靶多核苷酸的核苷酸序列通过进行四种单独的反应来确定，其中靶多核苷酸的拷贝的四种不同种类的核苷酸(A、C、G和T)中的每一种用一种荧光标记来标记，而同时该相同靶多核苷酸上的其他核苷酸用第二荧光标记物来标记。例如，如果在第一反应中第一荧光标记物被附接至靶多核苷酸的A，那么在该第一反应中第二荧光标记物被附接至靶多核苷酸的C、G和T(即，被附接至“非A的核苷酸”)。同样地，继续该实例，在第二反应中，第一标记物被附接至靶多核苷酸的C，而第二荧光标记物被附接至靶多核苷酸的A、G和T(即被附接至“非C”核苷酸)。对于核苷酸G和T，依此类推。

对于核苷酸类型的子集，相同的标记方案可以按照常规术语表达；因此，在以上实例中，在第一反应中，第一荧光标记物被附接至A，而第二荧光标记物被附接至B；在第二反应中，第一荧光标记物被附接至C，而第二荧光标记物被附接至D；在第三反应中，第一荧光标记物被附接至G，而第二荧光标记物被附接至H；并且在第四反应中，第一荧光标记物被附接至T，而第二荧光标记物被附接至V。

在一些实施方案中，聚合物诸如多核苷酸或肽可被标记，其中单一荧光标记物附接至单一种类的单体，例如，多核苷酸的每个T(或基本上每个T)用荧光标记物，例如花青染料标记。在这样的实施方案中，来自多核苷酸的荧光信号的集合或顺序可以形成对于特定多核苷酸的特征或指纹。在一些这样的实施方案中，这样的指纹可以提供或可以不提供足以确定单体序列的信息。

在一些实施方案中，本发明的特征是用作为相互猝灭集合的成员的荧光染料或标记物来标记多核苷酸分析物的基本上所有单体。关于标记多核苷酸分析物的术语“基本上全部”的使用是指承认化学标记技术和酶标记技术通常低于100％有效。在一些实施方案中，“基本上全部”意指全部单体的至少80％具有附接的荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上全部”意指全部单体中至少90％具有附接的荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上全部”意指全部单体中至少95％具有附接的荧光标记物。相互猝灭的荧光染料的集合具有以下特性：(i)每个(each)成员猝灭每一个(every)成员的荧光(例如，通过FRET或通过静态或接触机制)，以及(ii)每个成员当被激发时且当处于非猝灭状态时产生不同的荧光信号。即，如果相互猝灭集合由两种染料D1和D2组成，则(i)D1是自猝灭的(例如通过与另一个D1分子接触猝灭)并且其被D2猝灭(例如通过接触猝灭)以及(ii)D2是自猝灭的(例如通过与另一个D2分子接触猝灭)并且其被D1猝灭(例如通过接触猝灭)。关于选择用于相互猝灭集合的荧光染料或标记物的指导可见于以下参考文献，这些参考文献通过引用合并入本文：Johansson,Methods in Molecular Biology,335:17-29(2006)；Marras等人，NucleicAcids Research,30:el22(2002)等等。在一些实施方案中，相互猝灭集合的成员包括有机荧光染料，其组分或部分诸如芳族环结构胜任堆叠相互作用。荧光染料或标记物的示例性相互猝灭集合可以选自罗丹明染料、荧光素染料和花青染料。在一个实施方案中，相互猝灭集合可以包括罗丹明染料TAMRA和荧光素染料FAM。在另一个实施方案中，可以通过从由以下组成的组中选择两种或更多种染料形成荧光染料的相互猝灭集合：Oregon Green 488、荧光素-EX、异硫氰酸荧光素、罗丹明红-X(Rhodamine Red-X)、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素、荧光素、罗丹明、一种或更多种BODIPY染料、德克萨斯红(Texas Red)、俄勒冈绿(OregonGreen)514、以及一种或更多种Alexa Fluor。代表性BODIPY染料包括BODIPY FL、BODIPYR6G、BODIPY TMR、BODIPY581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650和BODIPY 650/665。代表性Alexa Fluor包括Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、AlexaFluor488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor680、AlexaFluor 700、Alexa Fluor 750和Alexa Fluor 790。

如上所述，在一些实施方案中，靶多核苷酸的单体序列通过进行单独的反应(每种单体一种反应)来确定，其中靶多核苷酸的拷贝的每个不同种类的单体被相互猝灭或自猝灭的荧光标记物标记。在其他实施方案中，靶多核苷酸的单体序列通过进行单独的反应(每种单体一种反应)来确定，其中靶多核苷酸的拷贝的每个不同种类的单体被选自同一相互猝灭集合的不同的相互猝灭的荧光标记物标记。在其中相互猝灭集合包含仅两种染料的实施方案中，则被选择的单体(例如单体X)用第一相互猝灭的染料标记，而每一其他种类的单体(即，非-单体X)用来自同一集合的第二相互猝灭的染料标记。因此，该实施方案的步骤产生了两个不种的荧光信号的顺序，一个指示单体X，并且另一个指示非-单体X。

在一些实施方案中，可以使用单一荧光标记物(例如，附接至包含多于一种类型单体的多核苷酸的单一种类的单体上)，当其被附接至多核苷酸上的(同种类型的)邻近单体，诸如多核苷酸的邻近核苷酸时，是自猝灭的。示例性自猝灭荧光标记物包括但不限于俄勒冈绿488、荧光素-EX、FITC、罗丹明红-X、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素、荧光素、罗丹明、BODIPY和德克萨斯红，例如它们被公开在Molecular Probes Handbook,2010年第11版中。

采用两种或三种光学标记物的实施方案

在一些实施方案中，少至两种不同种类的核苷酸用不同的光学标记物标记，所述不同的光学标记物针对靶多核苷酸的有义链和反义链两者中被选择的种类的核苷酸产生可区分的光学信号。例如，每个靶多核苷酸的互补链上的C和T可以被标记的类似物代替，其中C和T类似物的标记物能够产生不同的光学信号。然后通过使标记的链易位通过纳米孔来产生光学特征，其中所述链的核苷酸被限制为顺序地通过光学检测区，在所述光学检测区中，它们的标记物被致使产生光学信号。在一些实施方案中，将来自有义链和反义链两者的光学特征的信息组合以确定靶多核苷酸的核苷酸序列。

在一些实施方案中，靶核苷酸的被选择种类的核苷酸在使用核酸聚合酶的延伸反应中被标记的核苷酸类似物代替。使靶多核苷酸的标记的链易位通过纳米孔，所述纳米孔限制链的核苷酸以便依次移动通过光学检测区，在光学检测区中链的核苷酸被激发使得它们产生光学信号。个体链的光学信号的集合在本文中被称为该链的光学特征。在一些实施方案中，在链和其互补链(即有义链和反义链)例如通过发夹衔接子被连接的情况下，单个光学特征可以包括来自有义链和反义链两者的核苷酸上的光学标记物的光学信号。在其他实施方案中，靶多核苷酸的不同的链可以单独产生两种不同的光学特征，所述两种不同的光学特征可以被组合或者一起用于分析，如以上所提及的。这样的单独分析的链可以在产生光学特征之后例如通过使用分子标签(其可以是例如以已知的位置、长度和序列模式以及允许容易关联的多样性附接至靶多核苷酸的寡核苷酸区段)被关联。如下文所提到的，本发明的光学特征可以包括混合的光学信号，因为在每个检测间隔中检测到的信号可以包括来自在分辨受限区域或体积内发射的多于一个光学标记物的贡献；即，它们可以(例如)是混合的FRET信号，如Huber等人的美国专利公布US20160076091所描述的，其通过引用并入本文。

如以上所提及的，在一些实施方案中，本发明的方法可以通过以下步骤来实施：(a)拷贝双链多核苷酸的一条链，使得具有不同光学标记物的核苷酸类似物取代至少两种核苷酸，以形成标记的链；(b)拷贝所述链的互补链，使得所述核苷酸类似物取代相同的至少两种核苷酸，以形成标记的互补链；(c)使所述标记的链易位通过纳米孔，使得所述标记的链的核苷酸依次通过检测区，在所述检测区中光学标记物被激发以产生光学信号；(d)猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；(e)当所述标记的链易位通过纳米孔时，检测来自光学标记物的光学信号的时间序列以产生链的光学特征；(f)使所述标记的互补链易位通过纳米孔，使得所述标记的互补链的核苷酸依次通过激发区，在所述激发区中光学标记物被激发以产生光学信号；(g)猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；(h)当所述标记的互补链易位通过纳米孔时，检测来自光学标记物的光学信号的时间序列以产生互补链的光学特征；(i)根据所述链的光学特征和所述互补链的光学特征确定所述双链多核苷酸的序列。在一些实施方案中，两种核苷酸被标记，其可以是C和T、C和G、C和A、T和G、T和A、或G和A。在一些实施方案中，嘧啶核苷酸被标记。在其他实施方案中，嘌呤核苷酸被标记。在一些实施方案中，链的被选择种类的核苷酸通过使用核酸聚合酶在引物延伸反应中掺入所述被选择种类的核苷酸的标记的类似物dNTP来标记。在其他实施方案中，链的被选择种类的核苷酸通过在延伸反应中掺入所述被选择种类的核苷酸的类似物dNTP来标记，其中类似物dNTP被衍生具有正交反应官能性，其允许在随后的反应中将不同的标记物附接至不同种类的核苷酸。该后一标记方法在Jett等人的美国专利5,405,747中被公开，该专利通过引用并入本文。

在一些实施方案中，三种核苷酸被标记，其可以包括用第一光学标记物标记C，用第二光学标记物标记T，以及用第三光学标记物标记G和A。在其他实施方案中，可以如下所示标记以下核苷酸的组：分别用第一光学标记物和第二光学标记物标记C和G，并且用第三光学标记物标记T和A；分别用第一光学标记物和第二光学标记物标记C和A，并且用第三光学标记物标记T和G；分别用第一光学标记物和第二光学标记物标记T和G，并且用第三光学标记物标记C和A；分别用第一光学标记物和第二光学标记物标记A和G，并且用第三光学标记物标记T和C。

在一些实施方案中，光学标记物是在来自与纳米孔缔合的供体的能量转移之后产生荧光共振能量转移(FRET)信号的荧光受体分子。在一些实施方案中，如下文进一步描述的，供体可以是光学活性纳米颗粒，诸如量子点、纳米金刚石等。受体分子和供体的特定组合的选择是本领域普通技术人员的设计选择。在一些实施方案(其中的一些在下文被更充分地描述)中，单个量子点被附接至纳米孔并且使用激发光束被激发以发出荧光，所述激发光束的波长被充分分离，通常更低(即更蓝)，使得激发光束对由受体产生的FRET信号没有贡献。同样，选择其发射波长与两个受体分子的吸收带重叠的量子点以促进FRET相互作用。在一些实施方案中，两个供体可以被用于纳米孔的每个激发区，其中每个供体的发射波长被选择为最佳地与不同的一个受体分子的吸收带重叠。

在图7A中，双链靶多核苷酸(700)(SEQ ID NO:1)由有义链(701)和互补反义链(702)组成，使用常规方法将“Y”衔接子(704)和衔接子(706)连接(703)至双链靶多核苷酸，所述常规方法例如Weissman等人的美国专利6,287,825；Schmitt等人的美国专利公布US2015/004468；其通过引用并入本文。衔接子(分别为704和706)的臂(708)和臂(710)包含引物(716)和引物(718)退火(705)至其的引物结合位点。双链部分(712)和双链部分(714)可以包含标签序列，例如，一个或两个双链部分可以包含预定长度和组成的随机分子(randomer)，其可以用于随后的链的再关联，例如，以获得来自各自的链的光学特征的序列信息。在使引物(716)和引物(718)退火之后，它们可以在(例如，如所示出的)标记的dUTP类似物(在掺入的核苷酸中显示为空心圆圈的标记物)和标记的dCTP类似物(在掺入的核苷酸中显示为实心圆圈的标记物)和天然未标记的dGTP和dATP(既没有未标记的dTTP也没有未标记的dCTP存在，使得在延伸的链中类似物被完全取代)存在的情况下通过核酸聚合酶被延伸(707)。G和A上标记物的不存在在掺入的核苷酸上方用破折号表示。在没有噪声的理想检测系统中，空心圆圈、实心圆圈和破折号的顺序将是由示出的有义链和反义链在它们通过纳米孔的激发区时产生的光学特征的良好表示。

在图7B中，示出了采用三种标记物的可选实施方案的延伸产物(720)和延伸产物(722)。如上所示，掺入的标记的dUTP类似物被显示为空心圆圈，并且掺入的标记的dCTP类似物被显示为实心圆圈。掺入的标记的dATP类似物和dGTP类似物被显示为实心菱形。

关于选择待标记的核苷酸的种类、标记物的种类和用于将标记物附接至碱基的接头的种类、以及用于在dNTP类似物的存在下的延伸反应的核酸聚合酶的指导可见于以下参考文献，这些参考文献通过引用并入：Goodman等人的美国专利5,945,312；Jett等人的美国专利5,405,747；Muehlegger等人的美国专利公布US2004/0214221；Giller等人，NucleicAcids Research，31(10):2630-2635(2003)；Tasara等人，Nucleic Acids Research,31(10):2636-2646(2003)；Augustin等人，J.Biotechnology,86:289-301(2001)；Brakmann,Current Pharmacuetical Biotechnology,5(1):119-126(2004)等。用于本发明的示例性核酸聚合酶包括但不限于Vent exo-、Taq、大肠杆菌(E.coli)Pol I、Tgo exo-、Klenow片段exo-、Deep Vent exo-等。在一些实施方案中，示例性核酸聚合酶包括但不限于Vent exo-和Klenow片段exo-。用于dNTP类似物的示例性荧光标记物包括但不限于Alexa 488、AMCA、Atto 655、Cy3、Cy5、Evoblue 30、荧光素、Gnothis蓝1、Gnothis蓝2、Gnothis蓝3、Dy630、Dy635、MR121、罗丹明、罗丹明绿(Rhodamine Green)、俄勒冈绿、TAMRA等。用于dUTP类似物的示例性荧光标记物包括但不限于Alexa 488、AMCA、Atto 655、Cy3、Cy5、Dy630、Dy665、Evoblue 30、Evoblue 90、荧光素、Gnothis蓝1、Gnothis蓝2、Gnothis蓝3、MR121、俄勒冈绿、罗丹明、罗丹明绿、TAMRA等。用于dCTP类似物的示例性荧光标记物包括但不限于Atto 655、Cy5、Evoblue 30、Gnothis蓝3、罗丹明、罗丹明绿、TAMRA等。用于dATP类似物的示例性荧光标记物包括但不限于Atto 655、Cy5、Evoblue 30、Gnothis蓝3、罗丹明绿等。用于dGTP类似物的示例性荧光标记物包括但不限于Evoblue 30、Gnothis蓝3、罗丹明绿等。用于dUTP类似物和dCTP类似物的示例性荧光标记物对包括但不限于(TAMRA，罗丹明绿)、(Atto 655，Evoblue 30)、(Evoblue 30，Atto 655)、(Evoblue 30，Gnothis蓝3)、(Evoblue30，罗丹明绿)、(Gnothis蓝1，罗丹明绿)、(Gnothis蓝2，Atto 655)、(Gnothis蓝3，Cy5)等。

图7C示出了一个实施方案，其中使用两种标记物，并且通过发夹衔接子(730)连接有义链和反义链，例如如美国专利公布US 2015/0152492和US 2012/0058468中所教导的，其通过引用并入本文。将加尾的衔接子(732)和发夹衔接子(730)与靶多核苷酸(700)(SEQID NO:1)连接。在变性和引物(734)退火之后，延伸反应产生延伸产物(735)，其包含区段(736)(其为链(701)的标记的互补链)和区段(738)(其为链(701)的标记的反向互补链)。在延伸产物(735)易位通过纳米孔并产生光学特征之后，可以确定靶多核苷酸(700)(SEQ IDNO:1)的序列。任选地，可以选择发夹(730)的序列使得在延伸反应期间掺入预定的模式的标记物，其可以被用于例如通过指示区段(736)结束于何处以及区段(738)开始于何处等辅助光学特征的分析。

试剂盒

本发明可以包括用于进行本发明的方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括适于猝灭由附接至靶多核苷酸的荧光标记物产生的荧光信号的一种或更多种猝灭剂。例如，试剂盒可以被设计成包含其的吸收带最大限度地与靶多核苷酸上荧光标记物的发射带重叠的猝灭剂。在一些实施方案中，试剂盒的猝灭剂包含缀合至猝灭部分的多核苷酸结合部分。在一些实施方案中，多核苷酸结合部分包含一种或更多种寡核苷酸或其类似物。在一些实施方案中，试剂盒的猝灭剂以预定的浓度提供。在一些实施例中，选择这样的预定的浓度的猝灭剂来确定检测区的体积。

定义

“倏逝场(evanescent field)”意指非传播电磁场；即，它为坡印亭矢量的平均值为零的电磁场。

“FRET”或“或荧光共振能量转移”意指从激发的供体荧光团至处于基态的受体荧光团的非辐射偶极-偶极能量转移机制。FRET相互作用中的能量转移速率取决于供体的发射光谱与受体的吸收光谱的光谱重叠的程度、供体的量子产率、供体和受体跃迁偶极的相对取向、以及供体分子和受体分子之间的距离，Lakowitz,Principles ofFluorescence Spectroscopy，第三版(Springer，2006)。特别感兴趣的FRET相互作用是那些导致一部分能量被转移到受体，继而作为光子被受体发射(其频率低于激发其供体的光的频率(即“FRET信号”))的FRET相互作用。“FRET距离”意指在其内可以发生FRET相互作用并且FRET受体可以产生可检测的FRET信号的FRET供体和FRET受体之间的距离。

“试剂盒”指用于递送进行本发明的方法的物质或试剂的任何递送系统。在反应测定的情况下，这样的递送系统包括允许反应试剂(例如在适当的容器中的荧光标记物诸如相互猝灭的荧光标记物、荧光标记物连接剂、酶、猝灭剂等)和/或支持物质(例如，缓冲剂，用于进行测定的书面说明等)从一个位置到另一个位置的储存、运输或递送的系统和/或化合物(诸如稀释剂、表面活性剂、载体等)。例如，试剂盒包括包含相关反应试剂和/或支持物质的一个或更多个附件(例如盒)。这样的内含物可以一起或单独地被递送到预期的接受者。例如，第一个容器可以包含用于测定的酶，而第二或更多个容器包含相互猝灭的荧光标记物和/或猝灭剂。

“纳米孔”意指位于基质中的任何开口，其允许分析物以预定的或可辨别的顺序通过基质，或者在聚合物分析物的情况下，允许聚合物分析物的单体单元以预定的或可辨别的顺序通过基质。在后一种情况下，预定的或可辨别的顺序可以是聚合物中单体单元的一级序列。纳米孔的实例包括蛋白的(proteinaceous)纳米孔或基于蛋白的纳米孔，合成纳米孔或固态纳米孔，并且包括其中嵌入有蛋白纳米孔的固态纳米孔的杂化纳米孔。纳米孔可以具有1-10nm或1-5nm或1-3nm的内径。蛋白纳米孔的实例包括但不限于，α-溶血素、电压依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、OmpF、OmpC、MspA和LamB(麦芽糖孔蛋白(maltoporin))，例如在Rhee,M.等人，Trends in Biotechnology,25(4)(2007):174-181；Bayley等人(以上引用的)；Gundlach等人的美国专利公布2012/0055792等中公开的，其通过引用合并于本文。可以采用任何允许单个核酸分子易位的蛋白孔。纳米孔蛋白可以在孔外部的特定位点处或在构成孔形成蛋白(pore forming protein)的一个或更多个单体单元的外部的特定位点处被标记。孔蛋白选自例如但不局限于以下的蛋白的组：α-溶血素、MspA、电压依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、炭疽孔蛋白、OmpF、OmpC和LamB(麦芽糖孔蛋白)。通过将带电荷的聚合物附接至孔蛋白来实现孔蛋白到固态孔洞中的整合。在施加电场后，带电荷的复合物通过电泳被拉入固态孔洞中。合成的纳米孔或固态纳米孔可以被创建在各种形式的固态基质中，固态基质的实例包括但不局限于硅酮(例如Si₃N₄、SiO₂)、金属、金属氧化物(例如Al₂O₃)、塑料、玻璃、半导体材料及其组合。合成纳米孔可以比位于脂质双层膜中的生物蛋白孔更稳定。合成纳米孔还可以通过使用嵌入合适的基质诸如但不限于聚合的环氧树脂的碳纳米管来创建。碳纳米管可以具有一致和充分确定的化学和结构特性。可以获得各种尺寸的碳纳米管，范围从一纳米到几百纳米。已知碳纳米管的表面电荷约为零，并且因此，核酸通过纳米孔的电泳转运变得简单且可预测(Ito,T.等人，Chem.Commun.12(2003):1482-83)。合成纳米孔的基质表面可以被化学修饰以允许蛋白孔的共价附接或使得表面特性适于光学纳米孔测序。这样的表面修饰可以是共价的或非共价的。大多数共价修饰包括有机硅烷沉积，其最常用的方案被描述为：1)从含水醇中沉积。这是用于制备甲硅烷基化表面的最容易的方法。用乙酸将95％乙醇-5％水溶液调节至pH 4.5-5.5。在搅拌下添加硅烷以产生2％的最终浓度。水解和硅烷醇基团形成之后，持续2-5min添加基质。通过在乙醇中简单浸渍来冲洗掉过量的材料。硅烷层的固化在110摄氏度持续5-10min。2)气相沉积。硅烷可以通过化学气相沉积方法在干燥的质子惰性条件下被施加到基质上。这些方法有利于单层沉积。在封闭的室设计中，将基质加热至足以达到5mm蒸汽压的温度。可选地，可以施加真空，直到观察到硅烷蒸发。3)旋涂沉积(spin-on deposition)。旋涂应用可以在有利于最大官能化和多层沉积的水解条件下或在有利于单层沉积的干燥条件下进行。在一些实施方案中，本发明的方法采用单个纳米孔。在其他实施方案中，采用多于一个纳米孔。在后面的一些实施方案中，多于一个纳米孔作为纳米孔阵列被采用，所述纳米孔阵列通常被布置在平面基质诸如固相膜中。纳米孔阵列的纳米孔可以被规则地，例如以直线模式间隔开，或者可以被随机地间隔开。在一个优选的实施方案中，在平面固相基质中纳米孔以直线模式被规则地间隔开。

“聚合物”意指连接为直链的多于一个单体。通常，聚合物包括多于一种类型的单体，例如，作为多核苷酸包括A、C、G和T，或作为多肽包括多于一种的氨基酸。单体可以包括但不限于核苷及其衍生物或类似物以及氨基酸及其衍生物和类似物。在一些实施方案中，聚合物是多核苷酸，其中核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物被连接。

“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换地使用，并且各自意指核苷酸单体或其类似物的线性聚合物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用诸如Watson-Crick型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen型的碱基配对等的规则模式特异性结合至天然多核苷酸。这样的单体及其核苷间键可以是天然存在的，或者可以是其类似物，例如天然存在的类似物或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括PNA、硫代磷酸核苷间连键、包含允许标记物(诸如荧光团或半抗原等)附接的连接基团的碱基等。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用要求酶促加工，诸如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等时，普通技术人员将理解，在那些情况下，寡核苷酸或多核苷酸在任何位置或某些位置处将不包含核苷间键、糖部分或碱基的某些类似物。多核苷酸的尺寸范围通常为从几个单体单元例如5-40个(此时多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”)至数千个单体单元。除非另有说明或从上下文中明显的，每当多核苷酸或寡核苷酸以字母(大写或小写)序列表示时，诸如“ATGCCTG”，应该理解核苷酸从左到右为5’→3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另有说明，术语和原子编号惯例将遵循在Strachan和Read,Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss，New York,1999)中公开的那些。通常多核苷酸包含通过磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如，用于DNA的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或用于RNA的它们的核糖对应物)；然而，它们还可以包含非天然的核苷酸类似物，例如包括修饰的碱基、糖或核苷间键。对于本领域技术人员清楚的是，在酶的活性具有对特定的寡核苷酸或多核苷酸底物例如单链DNA、RNA/DNA双链体等的要求的情况下，则对于寡核苷酸或多核苷酸底物的合适组成的选择完全在普通技术人员的知识范围内，特别是在来自论文，诸如Sambrook等人，Molecular Cloning，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)以及类似的参考文献的指导下。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其各自的互补链的双链体)。普通技术人员从术语使用的上下文将清楚哪个形式是期望的或是否两种形式都是期望的。

“引物”意指天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体时能够作为核酸合成的起始点并且能够从其3’末端沿模板延伸，从而形成延伸的双链体。引物的延伸通常用核酸聚合酶诸如DNA或RNA聚合酶来进行。在延伸过程中添加的核苷酸的顺序由模板多核苷酸的序列确定。引物通常通过DNA聚合酶延伸。引物通常具有在从14个核苷酸至40个核苷酸范围内或从18个核苷酸至36个核苷酸范围内的长度。引物被用于各种核酸扩增反应中，例如使用单一引物的线性扩增反应，或采用两种或更多种引物的聚合酶链式反应。对于选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导是本领域普通技术人员所熟知的，如通过以下参考文献所证明的：Dieffenbach编辑的PCR Primer:A Laboratory Manual,第二版(Cold Spring Harbor Press,New York,2003)，其通过引用并入。

“分辨受限区域”是纳米孔(nanopore)或纳米孔(nanowell)阵列的表面的个体特征或光发射源在其中不能够被光学信号检测系统区分的区域。不意图被理论限制，该分辨受限区域由光学系统的分辨极限(有时也被称为“衍射极限”或“衍射屏障”)决定。该极限由发射源的波长和光学部件决定，并且可以由d＝λ/NA被定义，其中d是可被分辨的最小特征，λ是光的波长，并且NA是用于聚焦光的物镜的数值孔径。因此，每当两个或更多个纳米孔在分辨受限区域内并且在各纳米孔处产生两个或更多个光学信号时，光学检测系统不能够区分或确定哪个光学信号来自哪个纳米孔。根据本发明，纳米孔阵列的表面可以被划分或细分为对应于分辨受限区域的非重叠区域或基本上非重叠区域。对应于分辨受限区域的这种细分的尺寸可以取决于所采用的特定光学检测系统。在一些实施方案中，每当光发射源在可见光谱内时，分辨受限区域在从300nm²至3.0μm²的范围内；在其他实施方案中，分辨受限区域在从1200nm²至0.7μm²的范围内；在其他实施方案中，分辨受限区域在从3×10⁴nm²至0.7μm²的范围内，其中前述区域的范围是关于纳米孔(nanopore)或纳米孔(nanowell)阵列的表面。在一些实施方案中，可见光谱意指在从约380nm至约700nm范围内的波长。

关于多核苷酸的“序列确定”、“测序”或“确定核苷酸序列”等术语包括对多核苷酸的部分以及全部序列信息的确定。即，这些术语包括四种天然核苷酸A、C、G和T的完整的集合的子集的序列，诸如例如靶多核苷酸的仅A和C的序列。即，这些术语包括靶多核苷酸内的四种类型的核苷酸中的一种、两种、三种或全部的身份、顺序和位置的确定。在一些实施方案中，这些术语包括靶多核苷酸内的四种类型的核苷酸中的两种、三种或全部的身份、顺序和位置的确定。在一些实施方案中，序列确定可以通过鉴定单一类型的核苷酸(例如胞嘧啶)在靶多核苷酸“catcgc…”内的顺序和位置，使得其序列被表示为二进制代码，例如“100101…”表示“c-(非c)(非c)c-(非c)-c”等来实现。在一些实施方案中，这些术语还可以包括靶多核苷酸的充当该靶多核苷酸的指纹的子序列；即独特地鉴定一组多核苷酸(例如由细胞表达的所有不同的RNA序列)内的一种靶多核苷酸或一类靶多核苷酸的子序列。

本公开内容不意图受限于所阐述的特定形式的范围，而意图覆盖本文描述的变化形式的替代形式、修改形式和等同形式。此外，本公开内容的范围完全包含鉴于本公开内容对于本领域技术人员而言可能变得明显的其他变化形式。本发明的范围仅由所附权利要求来限定。

序列表

<110> 昆塔波尔公司

斯蒂芬·C·梅斯维兹

史蒂文·孟肯

<120> 使用猝灭剂的基于光学的纳米孔测序

<130> QNTPZ02000WO

<150> 62/377409

<151> 2016-08-19

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 随机序列

<400> 1

accgtttaaa ggtttccccg tcgta 25

Claims

1.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：

使多核苷酸易位通过纳米孔，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，并且其中所述纳米孔将核苷酸限制为依次移动通过检测区；

激发所述荧光标记物；

使用非荧光猝灭剂猝灭来自所述检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；

当所述荧光标记物通过所述检测区时，检测从所述荧光标记物发射的荧光信号；以及

根据检测到的荧光信号确定核苷酸的序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述非荧光猝灭剂包含具有附接至其的至少一个猝灭部分的寡核苷酸，并且其中所述纳米孔仅易位单链核酸，使得在易位期间每当所述非荧光猝灭剂与所述多核苷酸结合时，所述非荧光猝灭剂被从所述多核苷酸移除。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述纳米孔具有出口，并且所述检测区包括邻近所述出口并且包围所述出口的体积。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述多核苷酸具有易位速度，并且所述检测区的所述体积由所述多核苷酸的易位速度和所述出口处所述非荧光猝灭剂的浓度确定。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述非荧光猝灭剂包括双链的嵌入剂，并且其中所述纳米孔仅易位单链核酸，使得在易位期间每当所述非荧光猝灭剂嵌入所述多核苷酸时，所述非荧光猝灭剂被从所述多核苷酸移除。

6.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：

使多核苷酸易位通过具有出口的纳米孔，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记，并且其中所述纳米孔将所述核苷酸限制为依次移动通过在所述纳米孔出口处的检测区；

激发所述荧光标记物；

使用与所述多核苷酸结合的非荧光猝灭剂猝灭来自所述检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；

根据检测到的荧光信号确定核苷酸的序列。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述非荧光猝灭剂包含具有附接至其的至少一个猝灭部分的寡核苷酸，并且其中所述纳米孔仅易位单链核酸，使得在易位期间每当所述非荧光猝灭剂与所述多核苷酸结合时，所述非荧光猝灭剂被从所述多核苷酸移除。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述检测区包括邻近所述出口并包围所述出口的体积。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述多核苷酸具有易位速度，并且所述检测区的所述体积由所述多核苷酸的所述易位速度和所述出口处所述非荧光猝灭剂的浓度确定。

10.一种确定多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)提供一种纳米孔阵列，所述纳米孔阵列包含具有第一侧、第二侧和从其穿过的多于一个纳米孔的固相膜，所述固相膜分隔第一室和第二室，使得每个纳米孔提供所述第一室和所述第二室之间的流体连通，并且每个纳米孔具有通向所述第二室的出口并且被定制尺寸以使单链核酸通过而双链核酸无法通过，并且每个纳米孔将易位的多核苷酸的核苷酸限制为依次移动通过在其出口处的检测区；

(b)使多核苷酸从所述第一室通过所述纳米孔易位至所述第二室，每个多核苷酸具有附接至其核苷酸的一个或更多个荧光标记物，使得不同种类的核苷酸用产生可区分的荧光信号的不同荧光标记物标记；

(c)用激发光束照射所述荧光标记物；

(d)用与所述多核苷酸结合的非荧光猝灭剂猝灭来自所述检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号；

(e)检测来自所述检测区内的荧光标记物的荧光信号；

(f)根据检测到的荧光信号确定所述多核苷酸的核苷酸序列。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述固相膜包含不透明层，所述不透明层基本上阻挡所述激发光束的透射，并且其中所述照明和检测的步骤包括落射照明系统。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述非荧光猝灭剂是用溴、碘、硝基、偶氮基团共价修饰的单链DNA结合染料。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述单链DNA结合染料是不对称花青染料。

14.如权利要求10所述的方法，其中所述非荧光猝灭剂包含结合部分和猝灭部分。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述结合部分是寡核苷酸或其类似物。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述猝灭部分是Black Hole Quencher^TM化合物、花青猝灭剂化合物、呫吨猝灭剂或蒽醌猝灭剂化合物。

17.如权利要求10所述的方法，其中所述检测区由所述多核苷酸的易位速度和所述第二室中所述非荧光猝灭剂的浓度确定。

18.如权利要求10所述的方法，其中所述第一室是顺式室，并且所述第二室是反式室。

19.如权利要求10所述的方法，其中所述固相膜包含不透明层，并且其中所述照明步骤通过落射照明系统实施。

20.如权利要求10所述的方法，其中所述纳米孔阵列的所述纳米孔各自包含固定在所述固相膜的孔中的蛋白纳米孔。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述不同种类核苷酸的至少两种用至少两种所述不同荧光标记物标记。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述检测和确定的步骤包括(i)当多核苷酸通过检测区时，检测来自所述荧光标记物的所述荧光信号的时间序列；(ii)分离来自不同种类的核苷酸的荧光信号；以及(iii)根据来自多核苷酸的分离的荧光信号的时间序列确定核苷酸的序列。