CN109700799A

CN109700799A - 牛樟芝素及其微纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN109700799A
Application number: CN201810739485.4A
Authority: CN
Inventors: 杨震; 曾耀铭; 林光; 叶淇台; 龚建贤; 吴骏翔; 张伟滨
Original assignee: Kaiyao Investment Co Ltd; Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Kaiyao Investment Co Ltd; Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明涉及一种牛樟芝素及其微纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。经证实牛樟芝素微纳米颗粒能够引起机体的抗肿瘤免疫应答，具有提升CD8+细胞、CD4+细胞、CD3+细胞、B220+细胞中性粒细胞、巨噬细胞、NK1+细胞及树突细胞等免疫细胞的数量以及活性，抑制肿瘤的生长，减小肿瘤的大小的作用，并且安全稳定。

Description

牛樟芝素及其微纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种牛樟芝素及其微纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

背景技术

随着人类对恶性肿瘤的深入了解，越来越多的研究表明肿瘤的发生发展与体内的免疫功能息息相关，寻找有效的策略提高体内抗肿瘤免疫已成为肿瘤免疫学研究的新靶点。

肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。肿瘤免疫治疗的思路主要是两个方向，一是靶标肿瘤细胞，二是活化免疫细胞。靶标肿瘤细胞通常采用细菌毒素、溶瘤病毒以及单克隆抗体来清除肿瘤细胞，但前两个具有较高的毒性以及不可控性。因此，目前常用的是单克隆抗体。活化免疫细胞通常是通过使用细胞因子、肿瘤抗原、免疫系统的激动剂及免疫检验点的抑制剂来激活机体的免疫系统来杀伤肿瘤。

牛樟芝素(Antrocin)是由姜宏哲(Hung-Chen Chiang)教授和他的合作者于1994年从中国台湾牛樟芝((Antrodia camphorata))中分离得到。研究发现，牛樟芝素具有选择性抑制人转移性乳腺癌细胞系、人非小细胞肺癌细胞系的生理活性，但目前仍缺乏牛樟芝素在肿瘤免疫治疗的研究。

发明内容

基于此，有必要提供一种牛樟芝素及其微纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

牛樟芝素在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用。

牛樟芝素微纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用。

一种肿瘤免疫治疗药物，包括活性组分，所述活性组分选自牛樟芝素及牛樟芝素微纳米颗粒中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述牛樟芝素微纳米颗粒通过以下步骤制得：

在25℃～30℃下，将牛樟芝素溶解在溶剂中，形成混合液；其中，所述牛樟芝素的结构为所述溶剂选自乙醇和二甲基亚砜中的至少一种，所述混合液中所述牛樟芝素的浓度为0.01mg/mL～0.08mg/mL；及

在25℃～30℃下，向所述混合液加入水，使得所述牛樟芝素形成微纳米颗粒，其中，所述混合液与所述水的体积比例为1:50～200。

在其中一个实施例中，所述牛樟芝素微纳米颗粒的制备步骤中，所述溶剂为二甲基亚砜，所述牛樟芝素在所述混合液中的浓度为0.01mg/mL～0.08mg/mL。

在其中一个实施例中，其特征在于，所述牛樟芝素为粉末状。

在其中一个实施例中，还包括抗癌药物。

在其中一个实施例中，还包括抗癌药物，所述抗癌药物选自PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂、5-氟尿嘧啶及奥沙利铂中的至少一种。

在其中一个实施例中，还包括PD-L1抑制剂。

在其中一个实施例中，所述牛樟芝素微纳米颗粒与所述PD-L1抑制剂的质量比例为500～50:1。

在其中一个实施例中，还包括药学上可接受的辅料或载体。

一种治疗肺癌的药物，包括牛樟芝素微纳米颗粒。

经证实，牛樟芝素能够引起机体的抗肿瘤免疫应答，具有提升CD8+细胞、CD4+细胞、CD3+细胞、B220+细胞中性粒细胞、巨噬细胞、NK1+细胞及树突细胞等免疫细胞的数量以及活性，抑制肿瘤的生长，减小肿瘤的大小的作用，并且安全稳定。

附图说明

图1为实施例1的牛樟芝素扫描电镜图；

图2为实施例1的牛樟芝素的单晶分析结果图；

图3为实施例2中以DMSO为溶剂制备的牛樟芝素微纳米颗粒的粒径分析图；

图4为实施例2中以乙醇为溶剂制备的牛樟芝素微纳米颗粒的粒径分析图；

图5为实施例4中Western blot检测牛樟芝素微纳米颗粒对肺癌细胞H441及H1299中致癌基因的蛋白表达影响结果图；

图6为实施例4中Western blot检测牛樟芝素微纳米颗粒对肺癌细胞H441及H1299中CD47和PD-L1蛋白表达影响结果图；

图7为实施例5中Western blot检测牛樟芝素微纳米颗粒对大肠癌细胞HCT116、DLD-1及HT29中CD47和PD-L1蛋白表达影响结果图；

图8为实施例6的牛樟芝素微纳米颗粒对乳腺癌干细胞的生长影响的定性结果图；

图9为实施例6的牛樟芝素微纳米颗粒对乳腺癌干细胞的生长影响的定量结果图；

图10为实施例7的牛樟芝素微纳米颗粒对乳腺癌细胞MCF7、乳腺癌干细胞MDA-MB-231中信息传导路径相关蛋白表达影响结果图；

图11为实施例8的小鼠血清中免疫细胞的占比图；

图12为实施例9的肿瘤生长曲线图；

图13为实施例9的时间体重曲线图；

图14为实施例9的CD3+细胞占比随时间变化图；

图15为实施例9的CD8+细胞占比随时间变化图；

图16为实施例9的CD4+细胞占比随时间变化图；

图17为实施例9的CD49b+细胞占比随时间变化图；

图18为实施例10的肿瘤生长曲线图；

图19为实施例10的时间体重曲线图；

图20为实施例10的小鼠血清中免疫细胞的占比图；

图21为实施例10的小鼠血清中免疫细胞含量随时间的变化图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的牛樟芝素微纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤S110～S150。

S110、制备牛樟芝素。

具体地，以有机溶剂萃取野生牛樟芝菌丝体，并经硅胶管柱纯化制备而得。

具体地，将牛樟芝粉末溶于溶剂中，然后超声提取，过滤，除去溶剂得到牛樟芝素，该牛樟芝素的结构为

进一步地，溶剂选自氯仿、甲醇、乙醇中的至少一种。优选地，溶剂选自氯仿、甲醇、95％乙醇中的至少一种。更进一步优选地，溶剂为95％乙醇。

进一步地，牛樟芝粉末与溶剂的质量比为1：3～10。优选地，牛樟芝粉末与溶剂的质量比为1：5～10。进一步优选地为1：8。

进一步地，超声的时间为0.5h～1.5h，优选为1h。

进一步地，将牛樟芝粉末与95％乙醇按照质量比1:8混合，得到牛樟芝乙醇混合物，然后将牛樟芝乙醇混合物置于冰浴中，室温下进行超声提取1h，然后将提取液4℃12000r/min离心10min，取上清液进行减压抽滤，收集滤液，除去乙醇，得到牛樟芝素。

可以理解的是，在其他一些实施方式中，牛樟芝素也可以通过人工合成，当然，也可以购得。无论是天然提取，还是人工合成，只要得到牛樟芝素，该牛樟芝素的结构为即可。

S130、在25℃～30℃下，将牛樟芝素溶解在溶剂中，形成混合液。其中，牛樟芝素的结构为溶剂选自乙醇和二甲基亚砜中的至少一种，混合液中牛樟芝素的浓度为0.01mg/mL～0.08mg/mL。

进一步地，在25℃～30℃下，将牛樟芝素溶解在溶剂中，形成混合液。其中，牛樟芝素的结构为溶剂选自乙醇和二甲基亚砜中的至少一种，混合液中牛樟芝素的浓度为0.01mg/mL～0.05mg/mL。

进一步地，温度为25℃。

进一步地，溶剂为乙醇，此时，牛樟芝素在混合液中的浓度为0.01mg/mL～0.05mg/mL。优选地，牛樟芝素在混合液中的浓度为0.02mg/mL～0.05mg/mL。更进一步优选地，牛樟芝素在混合液中的浓度为0.02mg/mL～0.04mg/mL。

S150、在25℃～30℃下，向上述混合液中加水混合，使得牛樟芝素形成微纳米颗粒，其中，混合液与水的体积比例为1:50～200。

微纳米颗粒是指尺寸在1nm～10μm间的粒子。

进一步地，在25℃～30℃下，将混合液与水混合，使牛樟芝素形成微纳米颗粒，其中，混合液与水的体积比为1：80～100。

更进一步地，混合液与水的体积比为1：100。

在25℃下，将混合液与水按照体积比1:100混合，得到牛樟芝素微纳米颗粒。

上述制备牛樟芝素微纳米颗粒的制备方法，操作简便，对设备要求低，可以广泛推广应用。

一实施方式的牛樟芝素微纳米颗粒，由上述牛樟芝素微纳米颗粒的制备方法制得。

单个牛樟芝素微纳米颗粒可拥有一或多个对称中心，因此，牛樟芝素微纳米颗粒具有各种立体异构物形式。本实施方式的牛樟芝素微纳米颗粒包括所有此等异构物。

上述牛樟芝素微纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

上述牛樟芝素微纳米颗粒，具有诱发癌症免疫治疗及选择性抑制癌症细胞生长的功效。经证实，上述牛樟芝素微纳米颗粒能够引起机体的抗肿瘤免疫应答，具有提升CD8+细胞、CD4+细胞、CD3+细胞、B220+细胞中性粒细胞、巨噬细胞、NK1+细胞及树突细胞等免疫细胞的数量以及活性，抑制肿瘤的生长，减小肿瘤的大小的作用，并且安全稳定。特别是对常见的癌症标志基因及免疫基因的表达有明显的抑制作用，如CXCR4、EGFR、mTOR、AKT、MEK、ERK、p-ERK、CD47和PD-L1等蛋白的量明显低于对照组。

癌症指细胞肿瘤。癌症细胞具有自主生长的能力，即在不正常的状态或条件下迅速增殖细胞生长。癌症包含所有种类的细胞不当增生或致癌过程、转移性的组织或恶性转换的细胞、组织或器官(与组织病理学型态无关)或侵入阶段。癌症的例子包括，但不限定于：癌症与恶性肉瘤，例如乳癌、血癌、恶性肉瘤、淋巴瘤、恶性骨肉瘤、神经胶质瘤、嗜铬细胞瘤、肝恶性肿瘤、黑色素瘤、卵巢癌皮肤癌、大肠癌、胃癌、胰脏癌、肾脏癌、前列腺癌、睪丸癌、头部与颈部的癌症、脑癌、食道癌、膀胱癌、肾上腺皮质癌、肺癌、支气管癌、子宫内膜癌、鼻咽癌、子宫颈癌、肝癌或未知起始位置的癌症。

在其中一个实施例中，上述肿瘤免疫治疗药物还包括药学上可接受的辅料或者载体。

在使用时，上述牛樟芝素微纳米颗粒与其医药上可接受盐类可同时给药，也可以分开给药。给药方式包括口服、非口服、经由吸入喷雾或通过植入贮存器的方式。此处所使用的非口服是指皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑囊(腔)内、胸骨内蜘蛛膜下腔内、疾病部位内与头颅内注射以及灌注技术。

将一有效量的肿瘤免疫治疗药物，用于抑制癌细胞、或投予所需的病患(此病患具有癌症、癌症的症状或倾向于癌症的体质)能够实现治愈、恢复、减轻、缓和、改变、治疗、改善、改进目的。此处使用的有效量(an effective amount)指具有抑制或治疗功效的量。有效量的改变是根据给药的途径、辅药使用以及与其他共同使用的活性药剂。

在其中一些实施例中，上述牛樟芝素微纳米颗粒的有效量为0.01μM至1000μM。优选为0.5μM至50μM。

施予个别病人的特定剂量是依所有可能存在因素而定，例如：所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、进食状况、施用时间与路径、排泄率、医药物质的组合、以及所欲治疗的疾病的严重程度等。

在其中一个实施例中，上述肿瘤免疫治疗药物由上述牛樟芝素微纳米颗粒与至少一种固体、液体或半液体状的赋形剂或辅助剂一同形成。

具体地，上述肿瘤免疫治疗药物的其形式包括但不限于药锭、胶囊、乳剂、水性悬浮液、分散液、溶液。

进一步地，上述肿瘤免疫治疗药物为药锭，药锭形式所使用的载体包括乳糖与玉米淀粉。

更进一步地，还包括润滑剂，例如硬脂酸镁。

进一步地，上述肿瘤免疫治疗药物为胶囊。用于胶囊形式的稀释剂包括乳糖与经干燥的玉米淀粉。

进一步地，上述肿瘤免疫治疗药物为口服给药。当口服给药为水性悬浮液或乳剂时，可悬浮或溶解有效成分于与乳化或悬浮剂结合的油相中。当然，还可加入特定甜味、调味与着色剂。

进一步地，上述肿瘤免疫治疗药物为无菌注射针剂。例如利用本技术领域中已知的技术使用适合的分散或增湿剂(例如Tween 80)与悬浮剂。无菌注射调剂也可以将无菌注射溶液或悬浮液加入无毒性非口服的稀释剂或溶剂，例如1,3丁二醇中。可使用的载体与溶剂包括甘露醣醇、水、林格氏液与等渗透压氯化钠溶液。此外，无菌固定油常作为溶剂或悬浮媒介(例如合成的单-或双-甘油酯)。脂肪酸，例如油酸与其甘油酯衍生物也可用在注射剂的调制，其为天然药学上可接受的油，例如橄栏油、蓖麻油，特别是于其聚氧乙基化的变化形式。这些油溶液或悬浮液也可包含一长链醇类稀释剂或分散剂，或者羧基甲基纤维素或类似的分散剂。

进一步地，上述肿瘤免疫治疗药物为吸入剂。具体地，将上述牛樟芝素微纳米颗粒采用本技术领域中所熟知的技术来配制成吸入成分。例如利用苯甲醇或其它防腐剂、增强生物可利用性的吸附促进剂、碳氟化合物或其它本技术领域中熟知的助溶或分散剂来配制盐类溶液。

药学上可接受的载体是指能够与配方的有效成分兼容以及不对病患有害。例如，助溶剂(例如环状糊精)(其与一个或多个萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的复合物)，为了有效成分的传送而作为药理学上的辅药。其它载体的例子包括胶状二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素与烷基硫酸盐。

在其中一个实施例中，上述肿瘤免疫治疗药物还包括抗癌药物，抗癌药物选自PD-L1抑制剂、5-氟尿嘧啶及奥沙利铂中的至少一种。

在其中一个实施例中，上述肿瘤免疫治疗药物还包括PD-L1抑制剂。

进一步地，PD-L1抑制剂包括PD-L1抗体。经证实，PD-L1抗体与上述牛樟芝素微纳米颗粒具有无拮抗作用，两者可以在抗肿瘤治疗中联合使用。

进一步地，牛樟芝素微纳米颗粒与PD-L1抑制剂的质量比为500～50:1。优选地，牛樟芝素微纳米颗粒与PD-L1抑制剂的质量比为400～200:1。更进一步优选为300～250：1。

上述肿瘤免疫治疗药物能够制备成小分子药物，小分子药物相对于生物免疫疗法具有许多的优点，从小分子类药物的临床应用历史和发展来看患者更易接受，而且小分子类药物口服生物利用度高，制备成本低、负担小、生产、运输、保存条件和技术要求低。

一种治疗肺癌的药物，包括上述牛樟芝素微纳米颗粒。

上述治疗肺癌的药物，能够引起机体的抗肿瘤免疫应答，抑制肺癌细胞的生长。

以下为具体实施例。

实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)将结构式为的鼠尾草酸溶解于二氯甲烷中，然后冷却到-78℃，鼓气通入臭氧，充分反应后得到第一反应液；

(2)向所述第一反应液中加入硼氢化钠，剧烈搅拌并充分反应，反应完成后纯化得到结构式为的化合物A，其中，所述鼠尾草酸与所述硼氢化钠的摩尔比为1：3；

(3)在-78℃的条件下，将所述化合物A溶解于液氨中，分批次投入碎钠块，搅拌并充分反应，得到含有结构式为的化合物B和结构式为的化合物C的第二反应液，其中，所述化合物A与所述碎钠块的摩尔比为1：5；

(4)除去所述第二反应液中的有机溶剂后酸化并萃取所得产物，接着除去萃取剂并加入四氢呋喃，然后加入对甲苯磺酸，于60℃下充分反应，反应完成后纯化得到结构式为的化合物D，其中，所述对甲苯磺酸和所述化合物A的摩尔比为0.1：1；

(5)将所述化合物D溶解于二氯甲烷中，加入碘、三苯基膦和咪唑，搅拌并充分反应，反应完成后纯化得到结构式为的化合物D1，其中，所述碘与所述化合物D的摩尔比为1.1：1，所述三苯基膦与所述化合物D的摩尔比为1：1，所述咪唑与所述化合物D的摩尔比为1.2：1；以及

(6)将所述化合物D1溶解于第五有机溶剂中，加入乙醇钠，在80℃下搅拌并充分反应，反应完成后纯化得到牛樟芝素。

(7)将牛樟芝素溶解于DCM中，旋干后抽真空并加热至60℃，得到用于上样的牛樟芝素。然后取少量上样的牛樟芝素进行扫描电镜喷金测试。测试结果如图1所示。

(8)将牛樟芝素进行单晶测试。具体地，将牛樟芝素的羟基前体同右旋樟脑-10-磺酰氯反应获得连接的产物，进行单晶培养和衍射试验，测试结果如图2所示。在图2中，A部分为牛樟芝素的羟基前体同右旋樟脑-10-磺酰氯反应获得连接的产物的构型，B部分为天然牛樟芝素的构型。

由图1可知，牛樟芝素呈片状聚集，形状规整，片层厚度均一，呈有序排列，形成微纳米结构。牛樟芝素在水中的溶解度不高。牛樟芝素有纳米级聚集的可能性。

由图2可知，通过右旋樟脑磺酰氯的绝对构型比对，合成的牛樟芝素与同天然的牛樟芝素的构型一致。因此，合成的牛樟芝素在应用方面可以替代天然的牛樟芝素。

实施例2

制备牛樟芝素微纳米颗粒

(1)以DMSO为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒的制备。具体为：在25℃下，将牛樟芝素溶解在DMSO中，形成混合液，其中，牛樟芝素在混合液中的浓度为0.04mg/mL。然后在25℃下，向混合液加入水混合，得到牛樟芝素微纳米颗粒，其中，混合液与水的体积比为1：100。最后，将得到的牛樟芝素微纳米颗粒进行粒径分析，结果如图3所示。

(2)以乙醇为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒的制备。在25℃下，将牛樟芝素溶解在乙醇中，形成混合液，其中，牛樟芝素在混合液中的浓度为0.02mg/mL。然后向混合液加入水混合，得到牛樟芝素微纳米颗粒，其中，混合液与水的体积比为1：100。然后将得到的牛樟芝素微纳米颗粒进行粒径分析，结果如图4所示。

由图3、图4的粒径分析可知，无论是乙醇组还是DMSO组，将其用水稀释100倍后，都会形成牛樟芝素聚集的悬浮颗粒，且牛樟芝素微纳米颗粒的粒径分布也比较集中，全部集中在1μm区间。与实施例1的扫描电镜的结果呼应，间接证明牛樟芝素微纳米颗粒已经制备成功。

实施例3

(1)活化细胞：将来自American Type Culture Collection(ATCC)的H441细胞、H1299细胞、HCT116细胞、DLD-1细胞、HT29细胞、MDAMB231细胞及MCF7细胞按照以下步骤活化：从冷冻管由液氮或干冰容器中取出，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在3分钟内全部融化，以70％酒精擦拭保存管的外部，移入无菌操作台内。取出解冻的细胞悬浮液，缓缓加入有培养液的培养容器内(稀释比例为1：10～1：15，本实施例稀释比例为1：10)，细胞培养液为DMEM培养液(GIbco，16600-082)加上1％抗生素(Gibco，15140)以及10％胎牛血清(FBS，Sigma，F7524)，混合均匀，放入CO₂培养箱(Sheldon Manufacturing，USA)以37℃和5％CO₂培养。在解冻培养后隔日更换培养基。冷冻细胞的活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞的死亡。细胞活化48小时后，或继代一至二代，其细胞生长或特性表达才会恢复正常﹙例如产生单株抗体或是其他蛋白质﹚。

(2)细胞药物处理：

1)待细胞恢复正常且长到约八成满时，将旧培养液抽干并以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)溶液清洗细胞后，加入10mL不含血清的DMEM培养液。依实验目的不同加入不同的药物，于37℃恒温培养箱中进行反应。

2)将H441细胞、H1299细胞、HCT116细胞、DLD-1细胞、HT29细胞、MDAMB231细胞及MCF7细胞分别放置于96孔培养盘(2000细胞/孔)，隔夜培养于100μL的完全DMEM中。分别将50μL含有0.5μM～200μM牛樟芝素微纳米颗粒(以DMSO为溶剂，具体制备方法大致与实施例2相同，其不同在于，加入的牛樟芝素的量不同)的完全DMEM加入培养盘的不同孔中。另外以加入50μL DMSO组为对照组。培养2天之后，以磺酰罗丹明B分析测定每孔中的细胞数目，观察上述各种细胞对牛樟芝素微纳米颗粒的敏感性。其具体为：将细胞加入10％三氯醋酸中，与以0.4％磺酰罗丹明B将其染色，染色20分钟后再以1％乙酸清洗，之后，将与细胞结合的磺酰罗丹明B溶解于10mM的Tris base中。用微量滴定盘检测器在562nm下测定吸光值(optical density)以确定细胞密度。

实施例4

对肺癌细胞H441及H1299的致癌基因的蛋白表达影响

用Western blot检测牛樟芝素微纳米颗粒处理后肺癌细胞中致癌基因的蛋白表达水平。具体为：对肺腺癌细胞H441及H1299细胞用50μL 100μM的以DMSO为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒处理2天后，以PBS清洗两次后加入细胞溶解液，离心去除细胞碎片，然后收集蛋白质降解物。另外设置对照组：以DMSO替代以DMSO为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒处理肺腺癌细胞H441及H1299，其他相同。并以BCA assay kit(Pierce，Thermo Scientific，USA)定量，每个样本取等量的蛋白质降解物至10％SDS-PAGE电泳，再转印至PVDF膜，之后分别加入抗致癌标记基因蛋白CXCR4(癌细胞转移重要指标之一)、EGFR(肺癌标靶治疗中主要标)、mTOR、p-mTOR(磷酸化mTOR)、AKT、p-AKT(磷酸化AKT)、MEK、ERK、p-ERK(磷酸化ERK)、CD47和PD-L1的抗体以检测目的蛋白CXCR4、EGFR、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、MEK、ERK、p-ERK、CD47和PD-L1，并以抗β-actin的抗体作为内参组，致癌标记基因蛋白和一级抗体隔夜反应后加入连接HRP的二级抗体，最后以冷光照胶系统(UVP，LLC，USA)测定。

结果如图5及图6所示。在图5及图6中，“+”指以DMSO为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒处理组，“-”指对照组。

由图5及图6可知，牛樟芝素微纳米颗粒组的肺癌细胞H441中的CXCR4、EGFR、mTOR、AKT、MEK、ERK、p-ERK、CD47和PD-L1的量都明显低于对照组。牛樟芝素微纳米颗粒组的肺癌细胞H1299中的CXCR4、p-AKT、MEK、p-ERK、CD47和PD-L1的量都明显低于对照组。

实施例5

对大肠癌细胞HCT116、DLD-1及HT29中CD47和PD-L1表达的影响

用Western blot检测牛樟芝素微纳米颗粒处理后肠癌细胞中CD47和PD-L1表达的影响。具体操作与实施例3大致相同，其不同在于，本实施例检测的目的蛋白为CD47和PD-L1，对应的抗体也相应为抗CD47和PD-L1的抗体。

实施例5的结果如图7所示。在图7中，“+”指以DMSO为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒处理组，“-”指对照组。

由图7可知，牛樟芝素微纳米颗粒组的大肠癌细胞HCT116、DLD-1及HT29中的CD47和PD-L1的表达量都明显低于对照组。

实施例6

对乳腺癌干细胞MDA-MB-231的生长的影响

将乳腺癌干细胞MDA-MB-231放置于96孔培养盘(2000细胞/孔)，隔夜培养于100μL的完全DMEM中，然后加入50μL实施例2制备的以DMSO为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒。同时设置对照组：以DMSO替代以DMSO为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒。培养2天之后，以细胞观察培养仪(SCREEN Cell³iMager)测定细胞生长情况。

实施例6的结果如图8及图9所示。

图8中，左边均为对照组的乳腺癌干细胞MDA-MB-231培养两天后的生长情况，右边均为牛樟芝素微纳米颗粒组的乳腺癌干细胞MDA-MB-231培养两天后的生长情况。由图8及图9可知，牛樟芝素微纳米颗粒组的乳腺癌干细胞MDA-MB-231平均大小明显小于对照组。

实施例7

对乳腺癌细胞MCF7、乳腺癌干细胞MDA-MB-231的信息传导路径相关蛋白表达的影响

用Western blot检测牛樟芝素微纳米颗粒处理后乳腺癌细胞中信息传导路径相关的蛋白表达量。具体操作与实施例3大致相同，其不同在于，本实施例检测的目的蛋白为mTOR、NOTCH1、β-catenin、STAT3、AKT、EGFR、cMYC、PD-L1和CD47，对应的抗体也相应改变。另外，蛋白内参为GAPDH。

实施例7的结果如图10所示。在图10中，“+”指以DMSO为溶剂的牛樟芝素微纳米颗粒处理组，“-”指对照组。

由图10可知，牛樟芝素微纳米颗粒组的乳腺癌细胞MCF7中NOTCH1、β-catenin、AKT、EGFR、cMYC和CD47的表达量都明显低于对照组。牛樟芝素微纳米颗粒组的乳腺癌干细胞MDA-MB-231中mTOR、NOTCH1、β-catenin、STAT3、AKT、EGFR、cMYC、PD-L1和CD47的表达量都明显低于对照组。

实施例8

(1)由乐斯科生物科技股份公司购得C57BL/6免疫健全小鼠，鼠龄6周～8周，母鼠，体质量(20±2)g，动物级别SPF级，经驯养一周后，开始进行试验。

(2)注射药物：将小鼠随机分组，分为牛樟芝素微纳米颗粒组、对照组。牛樟芝素微纳米颗粒组注射量为每千克体重3毫克的牛樟芝素微纳米颗粒(3mg/kg，体重)，对照组以等量生理食盐水灌食，共持续7周。

(3)分别取牛樟芝素微纳米颗粒组、对照组对的小鼠的脾脏单核球，经过伴刀豆凝集素A(Concanavalin A)刺激，采用实施例7中流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血T细胞亚群水平的方法分别检测各免疫细胞的含量，结果如图11所示。

由图11可知，牛樟芝素微纳米颗粒组明显比对照组的T细胞数量多而且被激发的程度也明显比较高。明显有差异的是：辅助性T细胞(helper T(CD4+)cells)、总T细胞(Total T cells)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells(CD8+))、中性粒细胞(granulocytes，Gr-1+)、树突细胞(dendritic cells CD11c+)。表明牛樟芝素微纳米颗粒在活体可以提升免疫细胞数以及其活性。

实施例9

(1)由乐斯科生物科技股份公司购得C57BL/6免疫健全小鼠，鼠龄6～8周,母鼠，体质量(20±2)g，动物级别SPF级，经驯养一周后，开始进行试验。

(2)将肿瘤细胞LLC细胞株(小鼠肺癌细胞株，来自台湾生物资源研究及保存中心，为一贴附型的细胞株，且具很强的转移能力)以含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸(NEAA)和1％抗生素的培养液DMEM于37℃、5％二氧化碳的培养箱中内培养，约3天～4天传代一次。

(3)将肿瘤细胞LLC以0.05％胰蛋白酶-EDTA作用3分钟～5分钟，使呈悬浮状态，加入含血清的培养基中和胰蛋白酶的作用，1000rpm、20℃、离心5分钟。去除上清液，轻轻打散细胞沉淀，将细胞回溶于适当体积的培养液，混合均匀后，取少许细胞液，以血球计数器进行细胞计数。将细胞稀释成每毫升含10⁷个细胞的浓度，取约0.15毫升分装于1.5毫升小离心管中。

(4)以DMSO为溶剂，将牛樟芝素微纳米颗粒配置成每毫升250毫克的溶液，待完全溶解后，进行分装，保存于4℃，取上述溶液加入无菌的生理实验水做500倍稀释，混合均匀，即可进行腹腔注射。目前临床标准化学疗法用药顺铂(茂祥万仙品牌)为针剂，其浓度分别为每毫升50毫克及每毫升5毫克。两药物皆取原液进行静脉注射。

(5)注射肿瘤细胞的前一天，将C57BL/6免疫健全小鼠以10倍稀释的舒泰50及若朋2％经体积比1：1混合后，每只小鼠腹腔注射0.25毫升进行麻醉，待其完全睡着后，进行放射线照射，以抑制其免疫力，照射剂量为0.75Gy。

(6)将按照步骤(5)处理后的小鼠以2.5％的异氟烷(isoflurane)进行麻醉，并将欲注射部位的毛发剔除，注射前用75％酒精及优碘消毒注射部位，选用29G胰岛素针进行LLC细胞株肿瘤细胞注射，注射时，先用镊子将小鼠表皮拉起，再将LLC细胞株肿瘤细胞注射到皮下，注射细胞数为10⁶个，体积为0.1毫升，注射完毕后，确认细胞液无漏出，即可将小鼠移回笼中，待其苏醒，注意其保温。持续观察肿瘤生长状况。

(7)注射肿瘤细胞及药物：取对数生长期的LLC细胞株混合于血清悬浮液0.1ml(2x106个细胞数)皮下注射接种于C57BL/6免疫健全小鼠后腿下形成肿瘤皮丘，48小时之后随机分成对照组、PD-L1抗体组、牛樟芝素微纳米颗粒组、合并组，每组5只小鼠。PD-L1抗体组的注射量为每千克体重100微克的PD-L1抗体(100μg/kg，体重)。牛樟芝素微纳米颗粒组注射量为每千克体重30毫克的牛樟芝素(30mg/kg，体重)。将合并组是PD-L1抗体(80μg/kg，体重)和牛樟芝素微纳米颗粒(20mg/kg，体重)均注射。对照组以等量生理食盐水灌食。需要说明的是，注射牛樟芝素时，是先将牛樟芝素先溶于DMSO中形成牛樟芝素微纳米颗粒后再注射。

PD-L1抗体组为每周周三腹腔注射一次100μg/kg(体重)的PD-L1抗体。牛樟芝素微纳米颗粒组为每周周一、周二及周三各腹腔注射一次30mg/kg(体重)的牛樟芝素。合并组的注射频率为每周周一、周二及周三各腹腔注射一次20mg/kg(体重)的牛樟芝素，且每周周三还腹腔注射80μg/kg(体重)的PD-L1抗体一次，共持续44周。在此44周期间分别进行如下检测：

1)测量各组肿瘤大小：每周测量一次肿瘤大小，利用光标量尺测量肿瘤的最长径和最短径，为确保量测的准确度，实验期间由同一人进行肿瘤大小的测量。然后按照肿瘤体积计算公式计算肿瘤大小，其中，肿瘤大小＝(a*b²)/2，最长径为a、最短径为b，并绘制肿瘤生长曲线。绘制的肿瘤生长曲线如图12所示。

2)测量各组小鼠的体重：每周对各组小鼠的体重进行测量，并绘制时间体重曲线。绘制的时间体重曲线如图13所示。

3)测量各组小鼠的CD3+、CD8+、CD4+、CD49b+的含量。具体地，采用流式细胞仪每周检测各组小鼠的CD3+、CD8+、CD4+、CD49b+的含量：每周取事先分组标记好的1.5mLEP管，加入小鼠抗凝全血100uL，移液枪吸取相应抗体(PE anti-mouse CD3/FITC anti-mouse CD4/APC anti-mous-eCD8a Antibody)1.5uL于管内，充分混匀后室温避光孵育染色30min,加入RBC裂解液200uL，充分混匀，室温避光孵育30min，3500rpm离心10min，弃上清。然后加入1.5mL PBS溶液洗涤，再以3500rpm离心10min，弃上清，加入400uL PBS溶液重悬，上流式细胞仪检测。结果如14～17所示。

由图12可知，牛樟芝素微纳米颗粒可抑制肺癌肿瘤生长，并增强癌症免疫疗法的抗肿瘤功效。在图12中，抑制肿瘤生长能力最高为合并组，次为PD-L1抗体，最后是牛樟芝素微纳米颗粒组。

由图13可知，牛樟芝素微纳米颗粒用于治疗时，安全稳定。实验小鼠的体重每周进行测量记录，作为治疗安全性的指标，所有小鼠的体重接随着时间而增加，并无突然增加或是下降之现象。此结果表明在此实验中牛樟芝素的剂量没有造成明显的系统毒性。

由图14～17可知，牛樟芝素微纳米颗粒组的动物活体内CD3+细胞总数比例明显高于对照组，CD8+细胞(杀手T细胞)比例明显高于对照组，CD4+细胞(辅助T细胞)比例明显高于对照组，CD49b+细胞(自然杀手细胞)比例明显高于对照组。合并组的效果明显好于牛樟芝素微纳米颗粒组、PD-L1抗体组。

实施例10

(1)由乐斯科生物科技股份公司购得Balb/c免疫健全小鼠，鼠龄6周～8周，母鼠，体质量(20±2)g，动物级别SPF级，经驯养一周后，开始进行试验。

(2)将肿瘤细胞CT26细胞株(小鼠结肠癌细胞株，来自美国菌种中心ATCC，为一贴附型的细胞株)以含10％胎牛血清和1％抗生素的培养液DMEM于37℃、5％二氧化碳的培养箱中内培养，约3天～4天传代一次。

(3)将肿瘤细胞CT26以0.05％胰蛋白酶-EDTA作用3分钟～5分钟，使呈悬浮状态，加入含血清的培养基中和胰蛋白酶的作用，1000rpm、20℃、离心5分钟。去除上清液，轻轻打散细胞沉淀，将细胞回溶于适当体积的培养液，混合均匀后，取少许细胞液，以血球计数器进行细胞计数。将细胞稀释成每毫升含10⁷个细胞的浓度，取0.15毫升分装于1.5毫升小离心管中。

(4)以乙醇为溶剂，将牛樟芝素配置成每毫升75毫克的溶液，待完全溶解后，形成牛樟芝素微纳米颗粒溶液，然后进行分装，保存于室温，取上述牛樟芝素微纳米颗粒溶液加入食用橄榄油做6倍稀释，混合均匀，即可进行腹腔注射。

(5)Balb/c免疫健全小鼠在注射肿瘤细胞的前一周，以每公斤5毫克浓度剂量的环孢素(Cyclosporia A)连续腹腔注射一周，每只小鼠每天腹腔注射0.1毫升，以抑制其免疫力，环孢素以每毫升50毫克的浓度溶于DMSO中，待完全溶解后形成环孢素母液，进行分装，保存于-20℃，取环孢素母液加入食用橄榄油做40倍稀释，混合均匀，即可进行腹腔注射。

(6)将按照步骤(5)处理后的小鼠以3％的异氟烷(isoflurane)进行麻醉，并将欲注射部位的毛发剔除，注射前用75％酒精及优碘消毒注射部位，选用26G胰岛素针进行CT26细胞株肿瘤细胞注射，注射时，先用镊子将小鼠表皮拉起，再将CT26细胞株肿瘤细胞注射到皮下，注射细胞数为2x10⁶个，体积为0.1毫升，注射完毕后，确认细胞液无漏出，即可将小鼠移回笼中，待其苏醒，注意其保温。持续观察肿瘤生长状况。

(7)注射肿瘤细胞及药物：取对数生长期的CT26细胞混合于血清悬浮液0.1ml(2x10⁶个细胞数)皮下注射接种于Balb/c免疫健全小鼠后腿下形成肿瘤皮丘，1周之后随机分成5-氟尿嘧啶组(5-FU)及联合给药组，每组5只小鼠。5-氟尿嘧啶组每周一、周三及周五各以喂食管喂食一次100毫升的食用橄榄油，并且每周一及周四腹腔注射一次5-氟尿嘧啶(每千克体重注射10mg的5-氟尿嘧啶，10mg/kg)。联合给药组每周一及周四腹腔注射一次5-氟尿嘧啶(每千克体重注射10mg的5-氟尿嘧啶，10mg/kg)，并且每周一、周三及周五各以喂食管喂食一次牛樟芝素(每千克体重喂食50mg的牛樟芝素，50mg/kg)。需要说明的是，喂食牛樟芝素时，是先将牛樟芝素与乙醇混合形成牛樟芝素纳米颗粒之后再进行喂食。上述处理共持续5周，在此5周期间分别进行如下检测：

1)测量各组肿瘤大小：每周测量一次肿瘤大小，利用光标量尺测量肿瘤的最长径和最短径，为确保量测的准确度，实验期间由同一人进行肿瘤大小的测量。然后按照肿瘤体积计算公式计算肿瘤大小，其中，肿瘤大小＝(a*b²)/2，最长径为a、最短径为b，并绘制肿瘤生长曲线。绘制的肿瘤生长曲线如18所示。

2)测量各组小鼠的体重：每周对各组小鼠的体重进行测量，并绘制时间体重曲线。绘制的时间体重曲线如图19所示。

3)测量各组小鼠白血球的CD3+、CD8+、CD4+、B220+、Gr-1+、CD11c+、F4/80+、NK1.1+等表面抗原的含量。具体地，采用流式细胞仪每周对各组小鼠白血球细胞的CD3+、CD8+、CD4+、B220+、Gr-1+、CD11c+、F4/80+、NK1.1+等表面抗原的表现量进行测量：每周取事先分组标记好的1.5mL微量离心管，加入小鼠抗凝全血20μL，移液枪吸取相应抗体1.5μL于管内，充分混匀后室温避光孵育染色30min，加入RBC裂解液500μL，充分混匀，1500rpm离心5min，弃上清。然后加入500μL荧光启动细胞分选缓冲液溶液洗涤，再1500rpm离心5min，弃上清，加入500μL荧光启动细胞分选缓冲液溶液洗涤第二次，1500rpm离心5min，弃上清。加入100μL荧光启动细胞分选缓冲液溶液重悬，上流式细胞仪检测。检测结果如图20、图21所示。图20为药物处理4周的小鼠血液中免疫细胞的占比图。图21为药物处理期间小鼠血液中免疫细胞的含量变化趋势图。

由图18可知，5-氟尿嘧啶合联合牛樟芝素微纳米颗粒可抑制结肠癌肿瘤细胞生长速度。在图18中，联合给药组肿瘤的体积明显低于5-氟尿嘧啶组。

由图19可知，5-氟尿嘧啶联合牛樟芝素微纳米颗粒的给药方式安全稳定。实验小鼠的体重每周进行测量记录，作为治疗安全性的指标，所有小鼠的体重皆维持在稳定的水平，并无突然增加或是下降之现象。此结果表明在此实验中牛樟芝素的剂量没有造成明显的系统毒性。

由图20可知，联合给药组的小鼠体内CD3+细胞总数比例明显高于5-氟尿嘧啶组，CD8+细胞(杀手T细胞)比例高于对照组(药物处理两周时，CD8+细胞比例高于5-氟尿嘧啶组，具有显著差异，可参照图21)，CD4+细胞(辅助T细胞)比例明显高于5-氟尿嘧啶组，B220+细胞(B细胞)比例明显高于5-氟尿嘧啶组。联合给药组的效果明显好于只接受5-氟尿嘧啶处理的5-氟尿嘧啶组。

由图21可知，联合给药组BALB/c小鼠二星期、四星期后可显著提升小鼠白血球的D3+细胞、CD8+细胞及CD4+细胞免疫细胞比例，B220+细胞在联合给药处理三周时与5-氟尿嘧啶组有显著差异)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.牛樟芝素在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用。

2.牛樟芝素微纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗的药物中的应用。

3.一种肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，包括活性组分，所述活性组分选自牛樟芝素及牛樟芝素微纳米颗粒中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述牛樟芝素微纳米颗粒通过以下步骤制得：

5.根据权利要求4所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述牛樟芝素微纳米颗粒的制备步骤中，所述溶剂为二甲基亚砜，所述混合液中所述牛樟芝素的浓度为0.01mg/mL～0.08mg/mL。

6.根据权利要求4所述的牛樟芝素微纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述牛樟芝素为粉末状。

7.根据权利要求3所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，还包括抗癌药物，所述抗癌药物选自PD-L1抑制剂、PD-1抑制剂、5-氟尿嘧啶及奥沙利铂中的至少一种。

8.根据权利要求3所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，还包括PD-L1抑制剂。

9.根据权利要求8所述的肿瘤免疫治疗药物，其特征在于，所述牛樟芝素微纳米颗粒与所述PD-L1抑制剂的质量比为500～50：1。

10.一种治疗肺癌的药物，其特征在于，包括牛樟芝素微纳米颗粒。