CN109706177A - 一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及应用，所述痘苗载体质粒展示系统的表达框核心组分包括修饰的痘苗病毒H5启动子、大肠杆菌EM7启动子、串联的组氨酸标签、能结合链霉亲和素的多肽片段Nano‑tag15、红荧光蛋白mCherry、Zeocin抗性蛋白、痘苗病毒D8蛋白穿膜区。本发明基于上述质粒构建的重组痘苗病毒能够在病毒外膜表面展示Nano‑tag15，并籍此将重组病毒被链霉亲和素磁珠捕获，以及表面展示红荧光蛋白mCherry与Zeocin抗性标志物，为通过磁珠分选、荧光标记示踪和流式细胞仪分选及药物抗性等方法单独使用或联合使用而快速筛选重组痘苗病毒提供了新的有力手段。

Description

一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及其应用。

背景技术

痘苗病毒(vaccinia virus)是迄今发现的最大、最复杂的病毒之一，它是预防天花的活疫苗病毒。天花在全球根除后，痘苗病毒作为基因工程表达载体得到深入研究和广泛应用。基于该病毒以下特点，使得它在肿瘤基因治疗领域得到越来越广泛的应用：①安全：痘苗病毒是唯一能在胞浆内复制的DNA病毒，它不会整合进宿主细胞基因组，无致癌性等安全问题；②表达效率高：痘苗病毒可培养到很高滴度(＞10⁹pfu/ml)，通常感染1-3小时，无需任何药物抗性筛选，可使90％以上的受感染细胞表达目的基因产物；③感染细胞范围广泛：可感染几乎所有类型的哺乳动物细胞；④对分裂和非分裂细胞均能感染/转导；⑤基因组容量大：至少可插入25kb的外源基因而不影响其遗传稳定性；⑥对热稳定：方便现场使用和运输；⑦成本低廉；⑧表达产物近乎天然构型：它表达的产物能经历正确的糖基化，翻译后加工，接近天然构型，而这些对于疫苗载体激发免疫反应是至关重要的；⑨产生有效免疫应答：重组痘苗病毒产生活病毒自然感染过程，使所表达的外源抗原连同病毒自身蛋白一起，为宿主MHC共提呈，不但能产生体液免疫，还能激发细胞免疫，且免疫应答强效、持久，一般不需复种。更重要的是，痘苗感染能给宿主提供“危险信号”，激发机体有效产生针对载体本身及其所表达抗原的T细胞免疫反应，甚至还能激发机体对原本天然抗原性很弱的免疫原(如CEA)也产生强烈的免疫反应。

在上述和其它痘苗病毒相关研究与应用中，限速步骤是构建和筛选重组痘苗病毒。自从上世纪八十年代痘苗病毒首次用作基因工程表达载体并开展相关研究以来，构建和筛选重组痘苗病毒的主流方法一直是基于同源重组原理，即首先构建重组痘苗病毒表达载体质粒，将外源目的基因置于天然或人工合成的痘苗病毒启动子控制之下，将该表达盒插入某个痘苗病毒非必需基因(最常用的是痘苗病毒TK基因)片段中间，当该重组质粒转染已经被野型痘苗病毒感染的细胞时，通过在细胞内重组质粒中目的基因左、右旁侧非必需基因序列与野型痘苗病毒基因组内同样的非必需基因序列发生同源重组，从而将外源目的基因插入痘苗病毒相应的非必需基因中，完成重组痘苗病毒的构建。

然而，如果不加特别处理，上述同源重组产生重组痘苗病毒的几率仅有0.1％，因此，为提高重组痘苗病毒的筛选效率，都需要附加其它处理。经典的筛选重组痘苗病毒的方法如：化学试剂5-溴脱氧尿苷(5-BrdU)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在病毒TK基因编码的胸苷激酶催化下被磷酸化而渗入子代病毒基因组DNA，导致致死性效应，故TK基因完整的野型痘苗病毒在5-BrdU存在下不能复制存活，而在重组痘苗病毒中，目的基因已经将TK基因插入失活，故不受5-BrdU的致死性效应影响而可以持续复制扩增，通过5-BrdU的选择性压力，而将具有TK阴性表型的重组痘苗病毒从占多数的具有TK阳性表型的野型痘苗病毒混合物中筛选出来。然而，该经典方法除了步骤繁多以外，需要特殊的细胞株即TK表型阴性的TK—143细胞株。此外，5-BrdU选择性压力只能够筛选出TK阴性表型的痘苗病毒，但野型痘苗病毒的TK基因具有一定频率的自发性突变，也产生TK阴性表型，而5-BrdU筛选不能区分之，故5-BrdU选择性压力只能够筛选出TK阴性表型的痘苗病毒但不一定就是重组病毒，也包括因为自发性突变而产生的非重组病毒。

除了上述5-BrdU压力筛选法外，其它经典筛选重组痘苗病毒的方法还有：将目的基因表达盒与某种药物抗性基因如gpt表达盒串联，或者与能够作用于底物显色的酶基因(如LacZ)串联，或者与产生荧光的基因(如GFP)串联，通过药物抗性筛选，或酶显色筛选，或荧光筛选来分离重组痘苗病毒。然而，这些方法均有一定的局限性，如操作步骤繁复和筛选效率不高等。此外，某些筛选标志基因如LacZ比较大，会挤占常用的酶切位点，造成构建转移载体质粒的困难。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒pVTK-CZ及应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种重组痘苗病毒表面展示质粒表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；包括依次连接的修饰的痘苗病毒H5启动子、大肠杆菌EM7启动子、串联的组氨酸标签、能结合链霉亲和素的多肽片段Nano-tag15、红荧光蛋白mCherry、Zeocin抗性蛋白、以及痘苗病毒D8蛋白穿膜区；所述修饰的痘苗病毒H5启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，大肠杆菌EM7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，串联的组氨酸标签的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，能结合链霉亲和素的多肽片段Nano-tag15的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，红荧光蛋白mCherry的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示，Zeocin抗性蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，痘苗病毒D8蛋白穿膜区的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

进一步地，还包括连接在痘苗病毒D8蛋白穿膜区后面的用于驱动目的基因表达的人工合成的痘苗病毒早-晚期启动子P-s/l及其下游的克隆位点。人工合成的痘苗病毒早-晚期启动子P-s/l的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

进一步地，所述串联的组氨酸标签的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，能结合链霉亲和素的多肽片段Nano-tag15的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。红荧光蛋白mCherry的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，Zeocin抗性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，痘苗病毒D8蛋白穿膜区的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

本发明还公开了上述重组痘苗病毒表面展示质粒表达载体在重组痘苗病毒构建和重组痘苗病毒分离中的应用。

本发明的有益效果是：本发明重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒pVTK-CZ的表达框核心组分包括(5’→3’)：修饰的痘苗病毒H5启动子(mH5)，大肠杆菌EM7启动子，串联的组氨酸标签(6×His-tag)，能结合链霉亲和素的多肽片段Nano-tag15，红荧光蛋白(mCherry)，Zeocin抗性蛋白，以及痘苗病毒D8蛋白穿膜区。此外，与上述展示系统表达框串联的还有用于驱动目的基因表达的人工合成的痘苗病毒早-晚期启动子P-s/l及其下游的克隆位点。基于上述质粒构建的重组痘苗病毒能够在病毒外膜表面展示Nano-tag15，并籍此将重组病毒被链霉亲和素磁珠捕获，以及表面展示红荧光蛋白mCherry与Zeocin抗性标志物。本发明为通过磁珠分选、荧光标记示踪和流式细胞仪分选及药物抗性等方法单独使用或联合使用而快速筛选重组痘苗病毒提供了新的有力手段。

附图说明

图1重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒pVTK-CZ图谱；

图2重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒pVTK-CZ核心成分模式图，图中，mH5为修饰的痘苗病毒H5启动子，EM7为大肠杆菌EM7启动子，6×His为串联组氨酸标签，Nano-tag15为链霉亲和素结合肽，mCherry为红荧光蛋白，Zeocin为Zeocin抗性蛋白，D8-TMD为痘苗病毒D8蛋白穿膜区，P-se/l为合成的痘苗病毒早/晚期启动子；

图3为ELISA检测VV-mC/Z-D8病毒表面展示His-tag多肽柱状图，图中，Histag+D8+：表面展示His-tag多肽的重组痘苗病毒VV-mC/Z-D8，Histag+D8-：包膜内表达His-tag多肽的重组痘苗病毒VV-GFP；

图4为重组痘苗病毒VV-mC/Z-D8表面展示融合蛋白对胰酶消化的敏感性示意图；图中，VV-mC/Z-D8：表面展示红荧光蛋白的重组痘苗病毒，VV-GFP：包膜内表达绿荧光蛋白的重组痘苗病毒，VV-WR：野型痘苗病毒(WR株)。

具体实施方式

本发明重组痘苗病毒表面展示质粒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，其表达框依次包括如下核心组分(5’→3’)及其功能：修饰的痘苗病毒H5启动子(mH5)，用于驱动标志基因的表达；大肠杆菌EM7启动子，用于驱动外源目的融合基因表达，特别地，用于驱动融合基因中的标志基因即红荧光蛋白(mCherry)和Zeocin抗性蛋白基因的表达，以方便重组质粒构建；串联的组氨酸标签(6×His-tag)，用于检测融合基因的表达；能结合链霉亲和素的多肽片段Nano-tag15，用于结合偶联链霉亲和素的磁珠，以快捷分离重组痘苗病毒；红荧光蛋白(mCherry)，用于重组痘苗病毒示踪、流式细胞仪分离及噬斑纯化；Zeocin抗性蛋白，用于重组痘苗病毒抗性筛选；以及痘苗病毒D8蛋白穿膜区，用于将上述所有元件表面展示表达于重组痘苗病毒外包膜。此外，与上述展示系统表达框串联的还有用于驱动目的基因表达的人工合成的痘苗病毒早-晚期启动子P-s/l及其下游的克隆位点。

所述重组痘苗表面展示表达载体质粒的核心成分编码基因核苷酸序列分别为：修饰的痘苗病毒H5启动子(mH5)序列如SEQ ID No.1所示，大肠杆菌EM7启动子序列如SEQ IDNo.2所示，串联的组氨酸标签(6×His-tag)序列如SEQ ID No.3所示，Nano-tag15序列如SEQ ID No.4所示。mCherry基因序列如SEQ ID No.5所示，Zeocin抗性蛋白基因序列如SEQID No.6所示，痘苗病毒D8蛋白穿膜区基因序列如SEQ ID No.7所示。人工合成的痘苗病毒早-晚期启动子P-s/l序列如SEQ ID No.8所示。

所述重组痘苗表面展示表达载体质粒的核心成分氨基酸序列分别为：串联的组氨酸标签(6×His-tag)序列如SEQ ID No.9所示，Nano-tag15序列如SEQ ID No.10所示。mCherry序列如SEQ ID No.11所示，Zeocin抗性蛋白序列如SEQ ID No.12所示，痘苗病毒D8蛋白穿膜区序列如SEQ ID No.13所示。

本发明通过重叠PCR方法，首先扩增出包含各核心组分的PCR片段，然后逐次叠加延伸，组装出融合基因，再克隆进包含有痘苗病毒TK基因左、右旁测序列的基础痘苗载体质粒pVTK，具体步骤阐述如下。

本发明提供了采用pVTK-CZ质粒构建重组痘苗病毒并采用磁珠分选法快捷筛选分离重组痘苗病毒的方法。

实施例1：重组质粒pVTK-CZ的构建

(1)PCR引物

HN-1(SEQ ID No.14)：atcatgatgtagaagcttggttaggagctagagtaccattagtagaaactgtgagcaagggcgaggag

HN-2(SEQ ID No.15)：taatacgactcactataggagggccaccccaccatgcaccatcatcatcatcatgatgtagaagcttg

HN-3(SEQ ID No.16)：gctgcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgactcactatag

HN-4(SEQ ID No.17)：aggttcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaataagctgcagcacgtgttgac

HN-5(SEQ ID No.18)：gtctagaactagtaaaaattgaaaataaatacaaaggttcttgagggttgtg

TMD-1(SEQ ID No.19)：ctatggcaataattgcgaatgttttattctcttcgatatatttttggtcctgctcctcggccacgaag

TMD-2(SEQ ID No.20)：tcgtcgactcataaaaaagagaatagcggtaagtataaacacgaatactatggcaataattgcgaatg

TMD-3(SEQ ID No.21)：tcgactagatctattagttttgtttttctcgcgaatatcgtcgactcataaaaaagag

(2)一般PCR反应体系如下：

(3)PCR反应过程为：94℃预变性2min；94℃变性50s，55℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃延伸10min。取PCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪观察记录结果，目的条带切胶回收。使用胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收目的基因片段。

(4)重组质粒pVTK-CZ的构建步骤

1)以LeGO-C/Zeo质粒(含mCherry-Zeocin融合基因)为模板，用引物HN-1与TMD-1及pfu酶作PCR，运行18循环，扩增出约1170bp片段(片段-1)，电泳验证之。

2)以上述片段-1为模板，用引物HN-2与TMD-2及pfu酶作PCR，运行18循环，扩增出约1266bp片段(片段-2)，电泳验证之。

3)以上述片段-2为模板，用引物HN-3与TMD-3及pfu酶作PCR，运行18循环，扩增出约1339bp片段(片段-3)，电泳验证之。

4)以上述片段-3为模板，用引物HN-4与TMD-3及pfu酶作PCR，运行18循环，扩增出约1389bp片段(片段-4)，电泳验证之。

5)以上述片段-4为模板，用引物HN-5与TMD-3及pfu酶作PCR，运行30循环，扩增出约1423bp片段(片段-5)，切胶纯化。

6)用Bgl II和Spe I分别双酶切片段-5和痘苗表达基础载体pVTK质粒，片段-5酒精沉淀纯化，载体质粒切胶纯化，再连接目的片段与载体。

7)将连接物转化感受态菌，在Amp和Zeocin双抗性平板中挑选菌落。重组质粒命名为pVTK-CZ

(5)重组质粒pVTK-CZ的鉴定：

1)用Bgl II和Spe I双酶切重组质粒后，可得到1.4kb与4.9两个片段。

2)重组菌在紫外线甚至白光下可见红色荧光。

3)重组质粒转染已经被痘苗病毒感染的293细胞，可见红色荧光。

实施例2：重组痘苗病毒构建与筛选

方法一：经典抗性-荧光噬斑纯化筛选

在6孔板接种Vero细胞，使其次日长至80％成片。Lipofectamine2000脂质体转染pVTK-CZ重组质粒，取4μg pVTK-CZ质粒稀释于250μL无血清的DMEM培养基中，作为A液，取10μL脂质体稀释于250μL无血清的DMEM培养基中，作为B液，将A液和B液混匀后，室温下孵育20min，再加入300μL无血清DMEM，混匀，混合液加入经HanKs液洗过2遍的细胞中，37℃、5％CO₂培养箱中培养4h后，每孔加入10μL野型痘苗病毒WR株，37℃、5％CO₂培养箱中继续孵育2h后，每孔加入2mL含2％FCS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，48h后收集感染痘苗病毒的细胞，于－80℃和37℃反复冻融3次，即为含重组病毒的感染细胞裂解液，保存于－80℃，备用。

随后，首先盲筛重组病毒2次。在6孔板中接种Vero细胞，待次日细胞生长至80％-90％时弃去培养基，用Hank’s液洗两遍，加入0.2mL上述步骤中产生的病毒裂解液，37℃、5％CO₂培养箱中培养2h弃上清，用Hank’s液洗两遍，加入含1×gpt(初始浓度：400×次黄嘌呤10mg/ml，40×黄嘌呤10mg/ml，670×霉酚10mg/ml)及200μg/mL Zeocin的2％FCS的DMEM培养基。于荧光倒置显微镜下观察Vero细胞红色荧光表达情况，待细胞完全病变后，收集病毒液。重复上述步骤一次。

重组痘苗病毒噬斑纯化筛选：在6孔板中接种Vero细胞，待次日细胞生长至80-90％时弃去培养基，用Hank’s液洗两遍，加入经10倍系列稀释的病毒液200μl，37℃、5％CO₂培养箱中培养2h，期间每隔15min晃动数秒，以分散病毒团块，然后弃上清，用Hank’s液洗两遍，加入含1×gpt及200μg/mL Zeocin和2％FCS的DMEM培养基。于荧光倒置显微镜下观察Vero细胞红色荧光表达情况，待有典型蚀斑形成后用琼脂固定。预设45℃水浴备用，将浓度为2％的低熔点琼脂糖(每孔需1.5mL)置微波炉融化后，与等体积2×DMEM培养液混匀，置45℃水浴待用。将上述配制好的琼脂糖每孔2mL小心加入各孔，室温或4℃凝固后，挑取表达红色荧光处的单个噬斑于500μL 2％FCS的DMEM培养基中，于-80℃和37℃反复冻融3次。此后，每个蚀斑感染一个孔，其余步骤同上，重复以上步骤，直至得到纯化的重组痘苗病毒，命名为VV-mC/Z-D8。

方法二：磁珠筛选法分离重组痘苗病毒

以下实验步骤要求无菌操作，实验中采用NEB公司的产品Streptavidin MagneticBeads试剂盒(货号：S1420S；含量：4mg/ml)。

1、按常规用痘苗表达质粒pVTK-CZ及相关质粒(含有与D8蛋白融合的Nano-tag15多肽)转染6孔培养板内野型痘苗病毒已感染细胞，48小时后收集细胞，－70℃/37℃冻融细胞3次裂解细胞，该冻融裂解液将含有重组痘苗病毒，立即使用或冻存备用。

2、配制磁珠分选缓冲液：无Ca无Mg的PBS缓冲液，含0.1％BSA，2mM EDTA，pH7.4，或者直接采用NEB公司试剂盒的Wash/Binding Buffer

3、将Streptavidin Magnetic Beads瓶摇匀，吸取10-30μL，加入已经有0.5ml分选缓冲液的小离心管，摇动混匀30秒后，将EP管放置在磁铁架上1分钟，吸去缓冲液，再重复上述步骤洗一遍。

4、将上述含病毒冻融裂解液约0.5-1ml转移至一无菌EP管，在EDTA缓冲液中超声3次，每次15秒，再加入上述洗好的磁珠，缓慢摇动孵育10分钟。

5、将小离心管放置在磁铁架上1分钟，小心吸去上清，加1ml分选缓冲液，重悬磁珠，重复放置磁铁架上1分钟后洗一遍。

6、用无血清DMEM培养液200ul悬起吸附重组痘苗病毒的磁珠，加至6孔板内已经约80％成片的细胞，6孔板底部可放置磁铁架以增强病毒的感染性，培养24-48小时，每天观察病毒指标(病毒噬斑或荧光等)。

7、重复上述步骤1-2遍，直到重组痘苗病毒进行性浓缩、纯化。

实施例3：表面展示目的基因的重组痘苗病毒验证

以下以重组痘苗病毒VV-mC/Z-D8为例阐述。

(1)ELISA检测VV-mC/Z-D8病毒表面展示His-tag多肽

Vero细胞扩增重组痘苗病毒VV-mC/Z-D8，使之达到病毒滴度为10⁸pfu/mL，用终浓度为0.4％的福尔马林37℃灭活病毒，pH9.6碳酸盐缓冲液重悬，包被96孔ELISA板，100μL/孔，4℃过夜，PBST洗3次，每次2min，拍干，每孔加入含5％FCS的PBST封闭液300μL，室温封闭4h，PBST洗3次，每次2min，拍干，每孔加入含0.5％FCS的PBST稀释(1:200)的鼠抗His-tag抗体(“一抗”)，37℃作用2h，PBST洗3次，每次2min，拍干，加入含0.5％FCS的PBST稀释(1:1000)HRP标记羊抗鼠IgG抗体(“二抗”)，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗5次，每次2min，拍干，EL-ABTS显色试剂盒显色，酶标仪405nm波长检测。实验中设置Histag+D8-对照，即重组痘苗病毒表达His-tag标签，但无基于D8-TMD的病毒外膜表面展示表达。实验结果如图3所示，ELISA检测VV-mC/Z-D8病毒的His-tag读数显著高于对照病毒(表达His-tag但非表面展示)，提示含His-tag的融合蛋白已经在VV-mC/Z-D8病毒表面展示表达。

(2)重组痘苗病毒VV-mC/Z-D8表面展示融合蛋白对胰酶消化的敏感性

Vero细胞扩增VV-mC/Z-D8病毒，使之达到病毒滴度为10⁸pfu/mL，取10μL病毒液加入EP管中，加入300μL胰酶(含0.25％胰酶和0.02％EDTA)，37℃分别作用4min，30min，60min，90min，加10％FCS细胞培养液终止反应，高速离心，弃上清，PBS洗一次，580nm/610nm测荧光强度。并以携带荧光标记的重组痘苗病毒但荧光蛋白没有展示于病毒表面作对照，结果如图4所示，VV-mC/Z-D8病毒的荧光强度随时间延长而进行性下降，而对照病毒的荧光几乎不受胰酶消化的影响，强烈提示含荧光蛋白的融合蛋白被展示于VV-mC/Z-D8病毒表面而非病毒包膜内部。

(3)混合病毒的磁珠分选实验

重组痘苗病毒VV-mC/Z-D8表面展示的融合蛋白中含有Nano-tag15多肽，它可与链霉亲和素高亲和力结合，因此，可采用偶联有链霉亲和素的磁珠，将VV-mC/Z-D8病毒从混杂溶液中“捕获”分选出来。将相同滴度(10⁶pfu/mL)的表面展示红荧光蛋白的重组痘苗病毒VV-mC/Z-D8与表达绿荧光蛋白(但非表面展示)的重组痘苗病毒vvGFP经0.02％EDTA消化(不用胰酶消化以免破坏表面蛋白)结合超声处理以分散病毒颗粒，然后分别按1:1、1:10和1:100将红、绿两种病毒混合，再用链霉亲和素磁珠筛选混合病毒中的VV-mC/Z-D8病毒，参考NEB公司的链霉亲和素磁珠(货号S1420S)产品说明书进行操作。取30μL磁珠经Wash/Binding Buffer洗涤2次，用30μL Wash/Binding Buffer重悬后，向上述3管装有混合病毒的EP管中各加入10μL，室温震摇30min，充分混匀，再将EP管放置到磁力架上，固定磁珠，弃去上清，用Wash/Binding Buffer洗磁珠2遍，用200μL DMEM培养液重悬磁珠后，感染Vero细胞。另按上述同样比例配制混合病毒液，但不经磁珠分选处理而是直接用混合病毒感染Vero细胞。病毒感染24h后，于荧光显微镜下观察荧光情况并拍照。结果显示，在目标病毒与非目标病毒1:1混杂情况下，仅仅经一次磁珠分选，即可以几乎100％的纯度分选出目标病毒，即使以1:100高度混杂(即目标病毒仅占混合病毒的1％)，也可仅仅经一次磁珠分选，即可将绝大多数目标病毒分选出来。

序列表

<110> 浙江省医学科学院

<120> 一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 1

aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60

atcataaata a 71

<210> 2

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 2

ctgcagcacg tgttgacaat taatcatcgg catagtatat cggcatagta taatacgact 60

cactatagga gggccacc 78

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 3

caccatcatc atcatcat 18

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 4

gatgtagaag cttggttagg agctagagta ccattagtag aaact 45

<210> 5

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 5

gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 60

cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 120

ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc 180

gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 240

gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 300

atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc 360

gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 420

cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 480

ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag 540

gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 600

atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 660

gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaag 705

<210> 6

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 6

gccaagttga ccagtgccgt tccggtgctc accgcgcgcg acgtcgccgg agcggtcgag 60

ttctggaccg accggctcgg gttctcccgg gacttcgtgg aggacgactt cgccggtgtg 120

gtccgggacg acgtgaccct gttcatcagc gcggtccagg accaggtggt gccggacaac 180

accctggcct gggtgtgggt gcgcggcctg gacgagctgt acgccgagtg gtcggaggtc 240

gtgtccacga acttccggga cgcctccggg ccggccatga ccgagatcgg cgagcagccg 300

tgggggcggg agttcgccct gcgcgacccg gccggcaact gcgtgcactt cgtggccgag 360

gagcaggac 369

<210> 7

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 7

caaaaatata tcgaagagaa taaaacattc gcaattattg ccatagtatt cgtgtttata 60

cttaccgcta ttctcttttt tatgagtcga cgatattcgc gagaaaaaca aaac 114

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 8

aagcttaaaa attgaaattt tatttttttt ttttggaata taaataagct cga 53

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 9

His His His His His His

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 10

Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg Val Pro Leu Val Glu Thr

1 5 10 15

<210> 11

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 11

Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met

1 5 10 15

Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu

20 25 30

Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala

35 40 45

Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile

50 55 60

Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro

65 70 75 80

Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys

85 90 95

Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr

100 105 110

Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu

115 120 125

Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr

130 135 140

Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala

145 150 155 160

Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His

165 170 175

Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln

180 185 190

Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His

195 200 205

Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg

210 215 220

His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 12

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 12

Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val Ala

1 5 10 15

Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg Asp Phe

20 25 30

Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu Phe

35 40 45

Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala Trp

50 55 60

Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser Glu Val

65 70 75 80

Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu Ile

85 90 95

Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala Gly

100 105 110

Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln Asp

115 120

<210> 13

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 13

Gln Lys Tyr Ile Glu Glu Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val

1 5 10 15

Phe Val Phe Ile Leu Thr Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr

20 25 30

Ser Arg Glu Lys Gln Asn

35

<210> 14

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 14

atcatgatgt agaagcttgg ttaggagcta gagtaccatt agtagaaact gtgagcaagg 60

gcgaggag 68

<210> 15

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 15

taatacgact cactatagga gggccacccc accatgcacc atcatcatca tcatgatgta 60

gaagcttg 68

<210> 16

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 16

gctgcagcac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac 60

tcactatag 69

<210> 17

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 17

aggttcttga gggttgtgtt aaattgaaag cgagaaataa tcataaataa gctgcagcac 60

gtgttgac 68

<210> 18

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 18

gtctagaact agtaaaaatt gaaaataaat acaaaggttc ttgagggttg tg 52

<210> 19

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 19

ctatggcaat aattgcgaat gttttattct cttcgatata tttttggtcc tgctcctcgg 60

ccacgaag 68

<210> 20

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 20

tcgtcgactc ataaaaaaga gaatagcggt aagtataaac acgaatacta tggcaataat 60

tgcgaatg 68

<210> 21

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 21

tcgactagat ctattagttt tgtttttctc gcgaatatcg tcgactcata aaaaagag 58

<210> 22

<211> 1400

<212> DNA

<213> 人工设计(Unknown)

<400> 22

aaaaattgaa aataaataca aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata 60

atcataaata actgcagcac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt 120

ataatacgac tcactatagg agggccaccc accatcatca tcatcatgat gtagaagctt 180

ggttaggagc tagagtacca ttagtagaaa ctgtgagcaa gggcgaggag gataacatgg 240

ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg 300

agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc 360

tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca 420

tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt 480

ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga 540

ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg 600

gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct 660

cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga 720

agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc 780

ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg 840

aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca 900

tggacgagct gtacaaggcc aagttgacca gtgccgttcc ggtgctcacc gcgcgcgacg 960

tcgccggagc ggtcgagttc tggaccgacc ggctcgggtt ctcccgggac ttcgtggagg 1020

acgacttcgc cggtgtggtc cgggacgacg tgaccctgtt catcagcgcg gtccaggacc 1080

aggtggtgcc ggacaacacc ctggcctggg tgtgggtgcg cggcctggac gagctgtacg 1140

ccgagtggtc ggaggtcgtg tccacgaact tccgggacgc ctccgggccg gccatgaccg 1200

agatcggcga gcagccgtgg gggcgggagt tcgccctgcg cgacccggcc ggcaactgcg 1260

tgcacttcgt ggccgaggag caggaccaaa aatatatcga agagaataaa acattcgcaa 1320

ttattgccat agtattcgtg tttatactta ccgctattct cttttttatg agtcgacgat 1380

attcgcgaga aaaacaaaac 1400

Claims (4)

1.一种重组痘苗病毒表面展示质粒表达载体，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ IDNo.22所示。包括依次连接的修饰的痘苗病毒H5启动子、大肠杆菌EM7启动子、串联的组氨酸标签、能结合链霉亲和素的多肽片段Nano-tag15、红荧光蛋白mCherry、Zeocin抗性蛋白、以及痘苗病毒D8蛋白穿膜区。所述修饰的痘苗病毒H5启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，大肠杆菌EM7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，串联的组氨酸标签的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，能结合链霉亲和素的多肽片段Nano-tag15的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，红荧光蛋白mCherry的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，Zeocin抗性蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，痘苗病毒D8蛋白穿膜区的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒表面展示质粒表达载体，其特征在于，还可以包括连接在痘苗病毒D8蛋白穿膜区后面的用于驱动目的基因表达的人工合成的痘苗病毒早-晚期启动子P-s/l及其下游的克隆位点。人工合成的痘苗病毒早-晚期启动子P-s/l的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

3.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒表面展示质粒表达载体，其特征在于，所述串联的组氨酸标签的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，能结合链霉亲和素的多肽片段Nano-tag15的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。红荧光蛋白mCherry的氨基酸序列如SEQ IDNo.11所示，Zeocin抗性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，痘苗病毒D8蛋白穿膜区的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

4.一种权利要求1所述重组痘苗病毒表面展示质粒表达载体在重组痘苗病毒构建和重组痘苗病毒分离中的应用。