CN109627300B - Nisin溶液稳定剂开发及应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种在Nisin溶液的生产和储存过程中的长效稳定剂，属于微生物保存技术领域。将1～10g乳酸链球菌素即Nisin纯品与0.1～2g甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后，用0.02M盐酸定容至100mL，然后用200mM磷酸盐缓冲液调节pH为2.0～4.0；在Nisin生产过程中，5000L酸化罐加入0～10kg的甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后，再加入盐酸酸化调节pH1.9，80℃保温1h后降到50℃，随后陶瓷膜过滤除菌。本发明稳定剂性价比高，可用于维持食品、化妆品等领域中Nisin溶液的活性及长效，同时可用于Nisin生产过程，减少Nisin在酸化过程中的破坏。

Description

Nisin溶液稳定剂开发及应用

技术领域

本发明涉及微生物保存技术领域，尤其是涉及三种Nisin溶液稳定剂制备及应用。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin)亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3400Da。由于乳酸链球菌素可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。。

在工业生产中，乳酸链球菌素(Nisin)往往容易因在其制剂制备、贮存和释放过程中受外界条件影响而发生降解或破坏，导致较大的经济损失，所以提高蛋白质的稳定性十分重要。乳酸链球菌素(Nisin)是一种浅棕色固体粉末，使用时需溶于水或液体中，且于不同pH值下溶解度不同。如在水中(pH＝7)，溶解度为49.0mg/mL(Nisin)，若在0.02M盐酸中，溶解度为118.0mg/mL(Nisin)，在碱性条件下，几乎不溶解。在工业生产中采用盐酸调节pH，增加Nisin溶解度，在强酸条件下，Nisin中的肽键和二硫键可能发生多处断裂，致使Nisin的稳定性会发生一定的变化。

目前，增加多肽、蛋白质类药物稳定性的方法的途径主要有：用PEG(聚乙二醇)修饰多肽、蛋白质抵抗酶解、使用酶抑制剂、应用微乳制剂、应用纳米粒制剂、应用生物黏附性颗粒等。PEG虽然能对多肽进行修饰，但该聚合物在体内降解存在很大的问题，低分子量的有肾脏毒性，高分子量的体内降解机理目前尚不明确。微乳制剂、纳米粒制剂、生物黏附性颗粒等生产成本较高。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种在Nisin溶液的生产和储存过程中的长效稳定剂。本发明稳定剂性价比高，可用于维持食品、化妆品等领域中Nisin溶液的活性及长效，同时可用于Nisin生产过程，减少Nisin在酸化过程中的破坏。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的长效Nisin溶液稳定剂每100mL中包括以下原料：

1～10g Nisin纯品；

0.1～2g甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖；

采用0.02M盐酸定容至100mL；

采用200mM磷酸盐缓冲液调节pH为2.0～4.0。

所述的长效Nisin溶液稳定剂的制备方法为：将1～10g乳酸链球菌素即Nisin纯品与0.1～2g甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后，用0.02M盐酸定容至100mL，然后用200mM磷酸盐缓冲液调节pH为2.0～4.0，优选pH为3.5；所述乳酸链球菌素效价大于1000IU/mg。

所述的长效Nisin溶液稳定剂的应用方法为：在装有Nisin发酵液的酸化罐中，加入0.1～5％的甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖，再加入浓盐酸调节Nisin发酵液pH为1.5～2.0，搅匀，加热至70～85℃，保持0.5～2h后随后降温到45～60℃，随后陶瓷膜过滤，去除菌体及大分子蛋白。

另一种应用方法为：在Nisin生产过程中，含有5000L Nisin的酸化罐加入0～10kg的甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖混合后，再加入盐酸酸化调节pH 1.9，80℃保温1h后降到50℃，随后陶瓷膜过滤除菌。

优选的，在生产应用过程中陶瓷膜的截留分子量为2千～1万道尔顿。

优选的，所述甲硫氨酸、或低酯果胶、或壳聚糖的添加量均以乳酸链球菌的重量为基准。

本发明有益的技术效果在于：

本发明为增加Nisin在生产和储存过程中的稳定性，展开了Nisin溶液稳定剂的研究，通过改变pH和温度来加速Nisin溶液的破坏，同时加入供试稳定剂，并在实验室条件下模拟Nisin溶液生产过程和长期储存过程，进一步证明稳定剂对Nisin溶液的保护作用。

Nisin能有效抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌，如乳杆菌、明串珠菌、小球菌、葡萄球菌、李斯特菌等，特别是对产芽孢的细菌如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌有很强的抑制作用。Nisin可被消化道蛋白酶降解为氨基酸，无残留，不影响人体益生菌，不产生抗药性，不与其它抗生素产生交叉抗性。常温下储存蛋白和多肽仍是目前比较棘手的问题，虽然Nisin与其他多肽和蛋白相比，具有较好的耐酸、耐热性能，但在生产和长期的存储过程中，亦会发生降解和破坏，导致活性降低。目前食品工业应用中，为了改善Nisin的抑菌稳定性，采用钠磷酸盐、EDTA二钠和柠檬酸钠等对乳酸链球菌素抗菌活性进行保护。

申请人的研究表明，甲硫氨酸、低酯果胶、壳聚糖均对Nisin溶液具有一定的保护效果。尤其是壳聚糖，可大幅提高Nisin在溶液中的稳定性，具有很好的应用价值。壳聚糖、低酯果胶在蛋白质和多肽保护过程中，主要发挥的是封闭剂的作用，维持其空间结构，而甲硫氨酸的保护机理目前尚不清楚，有待进一步深入研究。

本发明配置操作简单，可重复性好，生产成本低廉。本稳定剂对Nisin有很好地保护作用，且稳定性较长。在Nisin溶液添加保护剂，同时进行空白对照实验，置于55℃培养箱中，分别于7天和14天取样，Nisin的热稳定性相对于对照品都有所提升。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体描述。但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

准确称取0.5g Nisin纯品(含量98％)，加入0.1％、0.5％、1％、2％、5％的甲硫氨酸，溶解于50mL 0.02M盐酸，分别取10mL至具塞试管中，并室温搅拌15min，最后使用200mM，pH＝7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5，搅拌均匀后，将所有样品置于55℃培养箱中，同时进行对照实验。分别于7天和14天取样，Nisin的含量测定均使用生物效价法测定，测定方法依据国标NY/T392-2000操作，结果如表1所示。

表1在甲硫氨酸作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)

从表1数据中可见，甲硫氨酸对Nisin浓缩液有一定程度的保护效果，相对于对照品，浓缩中添加1％甲硫氨酸对稳定性有20～30％的保护效果。

实施例2：

准确称取0.5g Nisin纯品(含量98％)，加入0.1％、0.5％、1％、2％、5％的壳聚糖，溶解于50mL 0.02M盐酸，分别取10mL至具塞试管中，并室温搅拌15min，最后使用200mM，pH＝7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5，搅拌均匀后，将所有样品置于55℃培养箱中，同时进行对照实验。分别于7天和14天取样，Nisin的含量测定均使用生物效价法测定，测定方法依据国标NY/T392-2000操作，结果如表2所示。

表2在壳聚糖作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)

从表2数据中可见，壳聚糖对Nisin浓缩液有一定程度的保护效果，相对于对照品，浓缩中添加1％壳聚糖对稳定性有17～40％的保护效果。

实施例3：

准确称取0.5g正常Nisin产品(含量98％)，分别加入0.1％、0.5％、1％、2％、5％的低酯果胶，溶解于50mL 0.02M盐酸，分别取10mL至具塞试管中，并室温搅拌15min，CK加溶剂调节至同一体积，最后使用200mM，pH＝7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5，搅拌均匀后，将所有样品置于55℃培养箱中，同时进行对照实验。分别于7天和14天取样，Nisin的含量测定均使用生物效价法测定，测定方法依据国标NY/T392-2000操作，结果如表3所示。

表3在低酯果胶作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)

从表3数据中可见，低酯果胶均对Nisin有一定程度的保护作用，相对于对照品，浓缩中添加1％低酯果胶对稳定性有25～40％的保护效果。

实施例4：

准确称取0.5g Nisin纯品(含量98％)，分别加入1％的巯基乙醇和巯基叔糖醇，溶解于50mL 0.02M盐酸，分别取10mL至具塞试管中，同时进行对照实验。将所有样品置于80℃水浴中，隔一段时间采样，立即采用岛津高效液相色谱仪(LC-15C)装备C18色谱柱(Agelatechnology,C18 250*4.6；5um；150A)实现对Nisin的高效液相色谱在线分离，流动相为乙腈/水(0.1％三氟乙酸)＝45/55，检测波长220nm，进样量10μL。在此液相色谱条件下，Nisin的出峰时间在8min左右，如表4所示。

表4在巯基乙醇和巯基叔糖醇作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)

从表4数据中可见，在巯基乙醇和巯基叔糖醇的作用下，Nisin的含量发生明显降低，可见，巯基乙醇和巯基叔糖醇不适宜做Nisin溶液的稳定剂。

实施例5：

准确称取0.5g Nisin纯品(含量98％)，分别加入1％卵蛋白和明胶，溶解于50mL0.02M盐酸，分别取10mL至具塞试管中，最后使用200mM，pH＝7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5，搅拌均匀后，将所有样品置于55℃培养箱中，同时进行对照实验。分别于7天和14天取样，Nisin的含量测定均使用生物效价法测定，测定方法依据国标NY/T392-2000操作，结果如表5所示。

表5在3种蛋白作用下浓缩液中Nisin的剩余量(mg/mL)

从表5数据中可见，在该试验条件下，1％的牛血清蛋白、卵蛋白和明胶对Nisin溶液没有明显的保护作用，且在某些极端条件下，反而有可能会产生一定程度的破坏。

实施例6

在3个含有5000L Nisin发酵液的酸化罐中，分别加入5kg的甲硫氨酸、低酯果胶、壳聚糖，再加入100～130L浓盐酸调节pH为1.9，搅拌均匀，加热至80℃，保持1h后随后降温到50℃，随后陶瓷膜过滤，去除菌体，测定其中的Nisin浓度。同时进行对照组，不加保护剂，酸化结束后，测定Nisin浓度，结果如表6所示。

表6甲硫氨酸、低酯果胶和壳聚糖作用下浓缩液中Nisin的含量(mg/L)

表6数据表明，甲硫氨酸、低酯果胶、壳聚糖等3种物质作为Nisin溶液的稳定保护剂，应用于工业生产中，对Nisin的稳定性有较好的保护作用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施案例，本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，可以对这些实施案例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其同物限定。

Claims (1)

1.一种包含稳定剂的长效Nisin溶液的制备方法，其特征在于，

称取0.5g Nisin纯品，加入1%、2%或者5%的甲硫氨酸，溶解于50mL 0.02M盐酸，然后取10mL至具塞试管中，并室温搅拌15 min，最后使用200mM，pH=7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5；所述Nisin纯品含量为98%；

或者称取0.5 g正常Nisin产品，加入1%、2%或者5%的低酯果胶，溶解于50mL 0.02M盐酸，然后取10mL 至具塞试管中，并室温搅拌15 min，最后使用200mM，pH=7.4磷酸盐缓冲液调节pH至3.5；所述正常Nisin产品含量为98%。