CN109596830A - 用于检测肿瘤组织中ER-α36表达水平的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测肿瘤组织中ER‑α36表达水平的试剂盒，该试剂盒包括：ER‑α36检测抗体试剂和乳腺癌组织质控片。通过使用本发明的试剂盒检测患者乳腺癌组织中的ER‑α36的表达水平，从而辅助判断乳腺癌患者接受他莫昔芬治疗的预后，为临床治疗提供了指导意义。

Description

用于检测肿瘤组织中ER-α36表达水平的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测肿瘤组织中ER-α36表达水平的试剂盒，该试剂盒用于乳腺癌肿瘤组织中ER-α36表达水平的检测，属于医疗器械领域。

背景技术

雌激素受体ER-α36是2005年在人乳腺上皮Caveolin-1单倍不足细胞株研究中发现和克隆的一个全新的ER-α的同源异构体，其分子量为36kDa。ER-α36不同于ER-α66(通常的雌激素受体)主要存在于细胞核中，该受体主要分布在细胞质和/或细胞膜中。ER-α36与ER-α66结构的主要区别是缺乏两个转录激活位点AF-1区和AF-2区，但保留了DNA结合区和部分二聚体形成及配体结合区。ER-α36功能类似于生长因子受体，可与多种雌激素作用，参与雌激素和抗雌激素引起的细胞增殖。雌激素的快速应答通常激活例如MARK/ERK，磷脂酰肌醇-3-激酶以及蛋白激酶C。

在WO2005087811专利文件中，对于ER-α36的结构、获得方法及其用途做了详细的描述。

近来发现ER-α36在多种肿瘤细胞中高表达，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，特别是在乳腺癌中。实验表明ER-α36在乳腺癌细胞中高表达，并且促进乳腺癌细胞的增殖与转移。

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，每年会有150万新发病例，而且每年约有40万人死于乳腺癌。当乳腺癌患者中的雌激素受体ER-α66表达为阳性时，他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)一直作为这类乳腺肿瘤患者内分泌治疗的标准药物。然而大多数中晚期乳腺癌患者在接受他莫昔芬治疗后最终会出现预后不良。在《临床肿瘤杂志(Journal Of ClinicalOncology)》中发表了题为“Expression of ER-α36，a Novel Variant of EstrogenReceptor，and Resistance to Tamoxifen Treatment in Breast Cancer”。在该文章中提出对于雌激素受体ER-α36和ER-α66同时为阳性的乳腺癌患者，他莫昔芬的治疗导致其生存期的明显下降。研究表明，发现在ER-α66阳性服用他莫昔芬的患者中，ER-α36过表达的患者预后不良；而在ER-α66阳性未服用他莫昔芬的患者或ER-α66阴性接受化疗的患者中，ER-α36表达与预后无明显相关性。此研究是首次发现ER-α36的过表达是发生原发性他莫昔芬耐药的重要原因之一。因此ER-α36表达亦可作为ER-α66阳性患者是否接受他莫昔芬治疗的重要预测指标，其潜在的临床意义在于如果ER-α66阳性的乳腺癌患者同时表达ER-α36，则患者不适合接受他莫昔芬治疗，从而避免盲目和无效治疗。

因此，标准化的检测受试者组织样本中ER-α36表达量的检测试剂和检测方法，成为了亟待解决的问题。

但目前国际上和国内尚无检测ER-α36的检测试剂或试剂盒，也无相应的标准化检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供检测乳腺癌肿瘤组织样本中ER-α36表达水平的试剂盒，该试剂盒可以用于乳腺癌预后的分析，同时对于乳腺癌的用药起到指导作用。

本发明一个方面提供了一种用于检测肿瘤组织中ER-α36表达水平的试剂盒，该试剂盒包括：ER-α36检测抗体试剂和乳腺癌组织质控片，所述的肿瘤组织为乳腺癌肿瘤组织。

优选地，所述的乳腺癌组织质控片包括临床阴性和临床阳性的质控片。

优选地，所述的临床阴性质控片共有2张，所述的临床阳性质控片共有2张。

优选地，所述的临床阴性质控片包括1：肿瘤细胞染色强度为0的质控片；2：染色强度为1+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞任意比例的质控片，所述的肿瘤细胞为乳腺癌肿瘤细胞。

优选地，所述的临床阳性质控片包括1：染色强度为2+且该染色的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥50％的质控片；2：染色强度为3+且该染色的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞的百分比≥25％的质控片，所述的肿瘤细胞为乳腺癌肿瘤细胞。

优选地，所述的试剂盒还包括未经染色的乳腺癌细胞系质控片。

优选地，所述的乳腺癌细胞系质控片包括乳腺癌细胞系MDA-MB-231阳性质控片、乳腺癌细胞系MCF-7-ER-α36阳性质控片和乳腺癌细胞系MCF-7阴性质控片。

优选地，所述的乳腺癌细胞系MDA-MB-231阳性质控片由高表达ER-α36的MDA-MB-231乳腺癌细胞制成；所述的乳腺癌细胞系MCF-7-ER-α36阳性质控片由外源过表达ER-α36的MCF-7乳腺癌细胞制成；所述的乳腺癌细胞系MCF-7阴性质控片由低表达ER-α36的MCF-7乳腺癌细胞制成。

优选地，所述的ER-α36检测抗体试剂中含有SNGmB1的序列。

更优选地，所述的ER-α36检测抗体试剂的浓度为7μg/ml-25μg/ml。

优选地，所述的肿瘤组织是经过手术或穿刺得到的乳腺癌肿瘤组织，经过二甲苯固定石蜡包埋的乳腺癌肿瘤组织标本。

优选地，所述的检测肿瘤组织中ER-α36表达水平包括以下步骤：1.制备肿瘤组织蜡块、切片；2.通过免疫组织化学方法对切片进行染色；3.参考乳腺癌组织质控片，对染色切片表达ER-α36的临床结果进行解读；评价受检者肿瘤组织中的ER-α36表达水平。

优选地，所述的临床阴性质控片和临床阳性质控片是如图2所示的四种质控片。

本发明再一方面提供了本发明的试剂盒在检测乳腺癌肿瘤组织中ER-α36表达水平中的用途。

本发明用于检测肿瘤组织中ER-α36表达水平的试剂盒，利用免疫组化抗原抗体特异性结合的原理检测乳腺癌组织中ER-α36的表达水平。通过将检测到的ER-α36染色强度、不同染色强度的乳腺癌肿瘤细胞占总体肿瘤细胞的百分比与乳腺癌组织质控片之间进行对照，从而判读出受检者肿瘤组织中的ER-α36表达水平。当受检者的ER-α66为阳性，同时ER-α36水平的表达水平为临床阴性时，判断受检者接受他莫昔芬内分泌治疗预后良好；当受检者的ER-α66为阳性，同时ER-α36水平的表达水平为临床阳性时，判断受检者接受他莫昔芬内分泌治疗预后不好，不建议用他莫昔芬进行治疗。预后不良表示乳腺癌患者存在复发或转移的风险。

对于ER-α66和ER-α36表达均为临床阳性的乳腺癌患者，更适宜芳香酶抑制剂进行治疗；对于ER-α66表达为阳性，ER-α36表达为临床阴性的乳腺癌患者，更适合接受他莫昔芬治疗。

在试剂盒中做体系质量控制时有时需采用乳腺癌细胞系质控片。细胞系质控片与乳腺癌组织质控片不同。通过细胞系阳性质控片是否达到预期染色强度，可以确认免疫组化染色的所有步骤是否正确以及相关辅助试剂是否降解。对照细胞系阴性质控片可以用来检验用户购买试剂的特异性。上述ER-α36细胞系质控片的溯源程序见实施例5，如附图3。

本发明用于检测肿瘤组织标本中的标志物ER-α36，经过1000例以上的临床病例证明本发明的检测试剂准确性和特异性高。

本发明试剂通过批次内和批次之间重复性试验和加速稳定性试验，验证了本发明试剂具有良好的重复性和稳定性。

本发明用于检测患者乳腺癌组织中的ER-α36的表达水平，从而辅助判断乳腺癌患者接受他莫昔芬治疗的预后，为临床治疗提供了指导意义。

附图说明

图1表示不同浓度的抗体对乳腺癌组织切片的免疫组化染色结果。

图2表示乳腺癌组织中的ER-α36的染色强度和染色面积评价图例；左上图：肿瘤细胞染色强度为0的质控片；右上图：染色强度为1+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞任意比例的质控片；左下图：染色强度为2+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥50％的质控片；右下图：染色强度为3+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥25％的质控片。

图3表示试剂盒中质控片的溯源程序。

图4A-D表示乳腺癌患者ER-α66和ER-α36表达水平不同的乳腺癌患者的手术后总体生存及无病生存情况。图4A表示，ER-α66和ER-α36表达均为临床阳性患者的总体生存明显差于ER-α66临床阳性ER-α36临床阴性的患者；图4B表示，ER-α66和ER-α36表达均为临床阳性的患者中，患者的无病生存明显差于ER-α66临床阳性ER-α36临床阴性的患者；图4C表示，ER-α66临床阴性，ER-α36表达为临床阳性患者的总体生存明显差于ER-α66临床阴性ER-α36临床阴性的患者；图4D表示，ER-α66临床阴性，ER-α36表达为临床阳性患者的无病生存明显差于ER-α66临床阴性ER-α36临床阴性的患者。

具体实施方式

以下实施例仅用于对本发明进行示例性说明，不用于限制本发明，在本发明保护范围内所做的修改、改变、变型等都在本发明的保护范围内。

除非另外说明，本文中的术语“肿瘤”指的是机体在各种因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变，学术界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。

术语“受检者”表示通过本发明的试剂盒检测乳腺组织中ER-α36表达情况的乳腺癌患者。

术语“乳腺癌的复发”表示在乳腺癌初愈或缓解阶段，在乳腺癌最初患病的区域再次出现与原有癌细胞相同的癌症细胞。

术语“转移”表示在乳腺癌初愈或缓解阶段，在乳腺癌最初患病的区域以外的其他区域再次发现与原有癌症细胞相同的癌细胞。

术语“肿瘤组织标本”指的是通过手术或穿刺获得的乳腺肿瘤组织，该组织接着进行固定、脱水、透明与浸蜡、石蜡包埋和再经石蜡切片获得用于免疫组化检测的肿瘤组织标本。

术语“免疫组化”指的是应用免疫学基本原理，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性研究。

术语“穿刺”指的是借助空心针这一器械，对乳腺的可疑病灶(如：肿块、增厚区域、钙化灶等)穿刺去除部分腺体组织进行检查。

术语“高表达ER-α36的MDA-MB-231乳腺癌细胞”

购自ATCC，商品号为HTB-26，将该细胞系本底定义为呈ER-α36高表达状态。

术语“低表达ER-α36的MCF-7乳腺癌细胞”购自ATCC，商品号为HTB-22，该细胞系本底呈ER-α36低表达状态。

术语“过表达ER-α36的MCF-7的乳腺癌细胞”指的通过以下方法将前述低表达ER-α36的MCF-7乳腺癌细胞，转染ER-α36得到的MCF-7乳腺癌细胞系。

MCF-7人乳腺癌细胞购自ATCC，该细胞在适合的培养基中在37℃，5％CO₂中培养。为了建立表达重组ER-α36的MCF-7细胞系，细胞系在每60mm培养皿以1x 10⁵细胞的密度进行培养，并且通过哺乳动物表达载体pCB6+中的巨细胞病毒(CMV)启动子开启的载体使用转染剂(Lipofectamine 2000购自(英杰公司invitrogen))转染24小时。表达载体含有全长的ER-α36cDNA(ER-α36cDNA见CN102504025的SEQ ID NO：21，也见于GenBank登记号BX640939中的核苷酸序列234-1166)，空白的表达载体也转染进入细胞作为对照，在转染48小时后，再次培养细胞，并且用500μg/ml的遗传毒素(G418)进行选择2周，培养基每3天换液一次，直到出现克隆。

“乳腺癌细胞系质控片”表示通过以下方法制备而成的质控片。经过免疫印迹(Western Blot)实验，验证以上三种细胞系中ER-α36表达情况。将3种细胞系分别扩大培养，细胞经过消化、离心、磷酸盐缓冲液冲洗干净后，室温悬浮在10％福尔马林过夜(约20小时)后，离心，弃去福尔马林。将细胞移入1.5ml离心管，静置30分钟后，尽量将多余的福尔马林吸干净。小心将细胞和预热融化的琼脂混合，混合5分钟后，将细胞-琼脂混合物放入冰箱2-3分钟，挤出细胞-琼脂-混合物。经过全自动脱水机脱水和石蜡包埋，制备成细胞系质控片。组织蜡块经石蜡切片机切片前需要在-20℃冰箱里冻最少30分钟，防止切片时细胞变形和重叠。每张切片的厚度为3μm，切片储存在-20℃条件下。乳腺癌细胞系质控片在检测肿瘤组织时，与肿瘤组织检测片一起染色。

实施例1

参见PCT/CN2014/073673，该专利申请引入本文作为参考。

以下提供的ER-α36抗体包括SNGmB1抗体。

本文提供的“SNGmB1抗体”是一种鼠源的ER-α36的单克隆抗体。包括氨基酸序列为SEQ ID：1的轻链和氨基酸序列SEQ ID NO：2的重链序列。编码SNGmB1抗体轻链和重链的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19。轻链和重链的氨基酸序列如下所示，其中CDR区为斜体并有下划线，并且恒定区为阴影部分的斜体。

SNGmB1轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：

SNGmB1重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

编码轻链的鼠抗体SNGmB1的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)：

5‘-gaaacaactgtgacccagtctccagcatccctgtccatggctataggagaaaaagtcaccatcagatgcataaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccggaagaagccagggcaacctcctaagctccttatttcagaaggcaatactcttcgtcctggagtcccatcccgattctccagcagtggctatggtacagattttgtttttacaattgaaaacatgctctcagaagatgttgcagattactactgtttgcaaagtgataacttgcctcttacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaat gagtgttaa-3’

编码重链的鼠抗体SNGmB1的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)：

5’-caggcttatctacagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacatttaccagtcacaatatgcactggataaagcagacacctagacagggcctggaatggattggagctattcatccagtaaatggtgatactgcctacaatcagaagttcaagggcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacctgcaactcagcagcctgacatctgaagagtctgcggtctatttctgtgcaagagaggggtacggtagtgttgactactggggccaaggcaccactctcaccgtctcctcagctaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctgggtgtggagatacaactggttcctccgtgactctgggatgcctggtcaagggctacttccctgagtcagtgactgtgacttggaactctggatccctgtccagcagtgtgcacaccttcccagctctcctgcagtctggactctacactatgagcagctcagtgactgtcccctccagcacttggccaagtcagaccgtcacctgcagcgttgctcacccagccagcagcaccacggtggacaaaaaacttgagcccagcgggcccatttcaacaatcaacccctgtcctccatgcaaggagtgtcacaaatgcccagctcctaacctcgagggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaatatcaaggatgtactcatgatctccctgacacccaaggtcacgtgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagacgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactatccgggtggtcagcaccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccatcacccatcgagagaaccatctcaaaaattaaagggctagtcagagctccacaagtatacatcttgccgccaccagcagagcagttgtccaggaaagatgtcagtctcacttgcctggtcgtgggcttcaaccctggagacatcagtgtggagtggaccagcaatgggcatacagaggagaactacaaggacaccgcaccagtcctagactctgacggttcttacttcatatatagcaagctcaatatgaaaacaagcaagtgggagaaaacagattccttctcatgcaacgtgagacacgagggtctgaaaaattactacctgaagaagaccatctcccggtctccgggtaaataa-3’

表1为SNGmB1抗体的CDR序列

表1

CDR	序列	SEQ ID NO.
			LCDR1	ITSTDIDDDMN	SEQ ID NO：3
LCDR2	EGNTLRP	SEQ ID NO：4
			LCDR3	LQ SDNLPLT	SEQ ID NO：5
HCDR1	SHNMH	SEQ ID NO：6
			HCDR2	AIHPVNGDTAYNQKFKG	SEQ ID NO：7
HCDR3	EGYGSVDY	SEQ ID NO：8

在某些实施例中，ER-α36的抗体和包括至少一个选自SEQ ID：3-8的CDR区，CDR区用于与抗原的结合，然而并不是所有的6个CDR均不可缺少地与抗原结合，可以替换SNGmB1抗体的一个或者更多CDRs仍然保持与ER-α36抗原结合的选择性和亲合性。

实施例2

本发明试剂终浓度的选择

将抗体浓度梯度稀释为7ug/ml、12.5ug/ml、15ug/ml、17.5ug/ml和25ug/ml，用实施例3实验方法同时对同一乳腺癌组织的切片进行免疫组化染色。染色结果如图1所示。

结果显示：在7.0ug/ml-25ug/ml浓度范围内组织切片染色强度随抗体浓度升高而增强。因此，选择在抗体浓度为7.0ug/ml-25ug/ml，在以上浓度范围的抗体染色强度适合且背景干净。

实施例3

通过免疫组化的方法获得可供读取的病理切片

固定：首先将手术或者穿刺获得的肿瘤组织浸泡在福尔马林固定剂中，固定24小时。

洗涤与脱水：固定后的组织接着用浓度梯度50％、70％、85％和95％的乙醇及无水乙醇使组织逐步脱水。

透明：脱水后的组织先经无水乙醇∶二甲苯＝1∶1的混合液中浸泡20分钟，再转入纯二甲苯中浸泡10分钟，再重复浸入另一瓶二甲苯中浸10分钟进行适当的透明处理。

浸蜡与包埋：透明处理后，把组织材料放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍半小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中分别浸渍一个半小时，浸蜡在60℃左右温箱中进行。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中，同时摆好在蜡中的位置，待蜡液表层凝固迅速后速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。

切片：透蜡后用石蜡包埋，待蜡块凝固后，切成3μm厚的病理切片。

脱蜡水化：切片在65℃的烘箱中烤片2小时后，在二甲苯中浸泡10分钟2次，从而去除石蜡，然后依次在100％乙醇内浸泡3分钟2次，95％的乙醇内浸泡3分钟，85％的乙醇内浸泡3分钟和在75％的乙醇内浸泡3分钟，最后用含0.01％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗5次，每次2分钟。

抗原修复：采用高压修复法对抗原进行修复，将切片完全浸没于1mmolEDTApH8.0抗原修复液中，高压加热至沸腾，待高压锅冒气加阀开始计时，2分30秒后将高压锅离火自然冷却至室温后取出切片。

内源性过氧化酶的消除：用含0.01％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗5次，每次2分钟。将切片放入装有新鲜配置的3％过氧化氢(H₂O₂)反应皿中，37℃烘箱孵育30分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

血清封闭：用含0.01％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗5次，每次2分钟。在免疫组化笔圈定的组织区域内加入10％山羊血清37℃烘箱孵育20分钟，以封闭非特异性抗原。

使用抗体：小心甩掉并拭去组织上及周围多余的液体，滴加一抗试剂，实施例2中浓度为15μg/ml的抗体试剂(使用SNGmB1抗体)，4℃过夜(最好16小时至18小时)，室温复温30分钟。用含0.01％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5次，每次2分钟。滴加适量辣根过氧化物酶标记二抗工作液，37℃孵育30分钟。

冲洗显色：用含0.01％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5次，每次2分钟。经显色剂显色2-3分钟，镜下观察适时终止显色，苏木素染核2分钟，自来水冲洗多余的苏木素后，为了使核染色持久，再置于盐酸酒精中1秒，磷酸盐缓冲液(PBS)或自来水冲洗返蓝，再经脱水，透明，封片。制成可供阅片的病理片子。

实施例4

检测乳腺癌组织中ER-α66表达为临床阳性的肿瘤组织中的ER-α36的表达，以及乳 腺癌组织质控片的制备

通过免疫组化的方法，检测了500例ER-α66阳性的乳腺癌病例的ER-α36的表达情况。按照实施例3方法，将已经制备好的含有组织块的蜡块进行切片、脱蜡水化、抗原修复、内源性过氧化酶的消除、血清封闭、使用SNGmB1抗体以及辣根过氧化物酶标记的二抗工作液孵育、二氨基联苯胺(DAB)显色、脱水透明封片，制成可供阅片的病理片子，以下称为检测片。

在显微镜下阅读检测片，将500例乳腺癌病人的ER-α36的染色强度进行分级，分别定义为0、1+、2+和3+四种染色强度，背景干净，阳性信号定位于细胞膜和/或细胞质。这四种染色强度对应的附图如图2所示。因此将ER-α36的染色强度评分设定为0、1+、2+和3+四个等级。

临床阳性的判读标准：当检测片上的乳腺癌细胞染色强度为2+，且该强度染色的乳腺癌细胞占总体乳腺癌细胞百分比≥50％；或者检测片上的乳腺癌细胞染色强度为3+，且该强度染色的乳腺癌细胞占总体乳腺癌细胞百分比≥25％；这种肿瘤组织染色片为临床阳性染色片。

临床阴性的判读标准：当染色强度为0或者染色强度为1+，这两种染色强度的乳腺癌细胞占乳腺癌细胞的任意比例；或者染色强度为2+，并且这种强度的乳腺癌细胞占总体乳腺癌细胞百分比＜50％；或者染色强度为3+，并且这种强度染色的乳腺癌细胞占总体乳腺癌细胞的百分比＜25％。以上的肿瘤组织染色片为临床阴性染色片。

当染色细胞上出现多种染色强度，判读标准如下。

当染色细胞上仅有染色强度为0或者1+的染色细胞，无论两种强度染色细胞的比例如何，总体判定肿瘤组织的ER-α36表达阴性。

当染色细胞上仅有染色强度为2+或者3+的染色细胞，无论两种强度染色细胞的比例如何，总体判定肿瘤组织的ER-α36表达阳性。

当染色细胞上出现多种染色强度，例如：既有染色强度为2+和3+这种可能出现临床阳性的染色，也有0和1+这种只能出现临床阴性的染色，以染色强度为2+和3+中的一种或者两种的细胞比例来确定肿瘤组织是否为ER-α36表达阳性。即：如果染色强度为2+或3+的乳腺癌细胞比例达到临床阳性，那么判断该乳腺癌肿瘤组织染色片为临床阳性；如果染色强度为2+或3+的乳腺癌细胞比例均到临床阳性，那么判断该肿瘤组织染色片为临床阳性；如果染色强度为2+或3+的乳腺癌细胞比例均未达到临床阳性，那么判断该肿瘤组织染色片为临床阴性。

因此，将福尔马林固定石蜡包埋的人乳腺癌组织进行ER-α36免疫组化染色，筛选出组织形态良好，阳性细胞定位准确的组织样本，根据ER-α36的染色强度(3+，2+，1+，0)和每种染色强度细胞比例，制备成ER-α36的组织质控片。临床阳性质控片共2张，第一张：染色强度为2+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥50％的质控片，如图2左下；第二张：染色强度为3+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥25％的质控片，如图2右下。阴性质控片共2张，第一张：肿瘤细胞染色强度为0的质控片；如图2左上，第二张：染色强度为1+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞任意比例的质控片，如图2右上。

以上四种质控片可以在试剂盒中各自以一张片子的形式呈现，也可以集成在一张片子上，分为4个部分呈现。每次病理医生在评判乳腺癌患者ER-α36表达水平时，参照以上四种质控片进行阅片。质控片与检测片一起染色，进行判读。

在本发明试剂盒中可以放置已经染色完成的四种染色强度的乳腺癌组织质控片；也可以使用未经染色的四种乳腺癌组织质控片。在使用未经染色的质控片时，将质控片和检测片平行进行染色实验，再进行阅片。

实施例5

通过乳腺癌细胞系质控片进行的溯源程序(溯源程序对应的附图3)

通过免疫印迹(Western Blot)和酶联免疫吸附(ELISA)方法对ER-α36单克隆抗体的特异性和与抗原结合能力进行了检测和验证，并进行了抗原表位鉴定和抗体亲和力测定。之后通过细胞系质控片的免疫组化染色，确定了验证了阳性细胞的染色定位和强度。

用ER-α36高表达、过表达和低表达的细胞制备了细胞系质控片。高表达ER-α36的细胞是MDA-MB-231乳腺癌细胞；过表达ER-α36的细胞指的是转染ER-α36病毒的MCF-7乳腺癌细胞，即MCF-7-ER-α36乳腺癌细胞；低表达ER-α36的细胞是MCF-7乳腺癌细胞。

通过免疫组化的方法对细胞系质控片进行染色，制成可供阅读的病理片，在显微镜下阅片。乳腺癌细胞系高表达ER-α36的MDA-MB-231和过表达ER-α36的MCF-7-ER-α36为阳性细胞系质控片：预期细胞的细胞质和/或细胞膜上可见有棕黄色着色，无背景染色，对应乳腺癌组织的质控片的染色强度分别为2+和3+。乳腺癌细胞系低表达ER-α36的MCF-7为阴性细胞系质控片：预期细胞未见棕黄色着色，对应乳腺癌组织质控片的染色强度为0。

通过以上方法根据ER-α36的细胞系质控片验证免疫组织化学染色步骤的正确性，以及确认试剂是否有所降解。如果试剂出现降解时，阳性细胞系质控片预期细胞表达强度会减弱，不宜使用。

通过以上确定的免疫组织化学法检测乳腺癌组织切片，筛选出细胞形态完整、阳性信号定位准确，背景干净的不同表达强度的组织样本作为乳腺癌组织质控片。接下来，通过乳腺癌组织质控片和检测片同时进行免疫组化染色，从而达到确定染色程序是否正确，抗体是否失效，以及作为阅片时判读标准的参考。

实施例6

本发明抗体试剂的批内和批间重复性研究

批内重复性：取乳腺癌组织ER-α36临床阴性质控片N1(染色强度0)连续切片3张，乳腺癌组织ER-α36临床阴性质控片P1(染色强度1+)连续切片3张，乳腺癌组织ER-α36临床阳性质控片P2(染色强度2+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥50％)连续切片3张，乳腺癌组织ER-α36临床阳性质控片P3(染色强度3+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥25％)连续切片3张，按照实施例3的方法进行免疫组化检测，每种组织重复检测3张，用同一批次试剂检测乳腺癌组织样本中ER-α36的表达水平。结果显示：同一批次抗体试剂对同一组织来源的乳腺癌组织切片的染色强度和定位无明显差异。

批间重复性：取乳腺癌组织ER-α36临床阴性质控片N1(染色强度0)连续切片3张，乳腺癌组织ER-α36临床阴性质控片P1(染色强度1+)连续切片3张，乳腺癌组织ER-α36临床阳性质控片P2(染色强度2+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥50％)连续切片3张，乳腺癌组织ER-α36临床阳性质控片P3(染色强度3+且该临床阳性染色的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥25％)连续切片3张，用3个批号试剂进行ER-α36免疫组织化学检测，每种组织重复检测3张。结果显示：不同批号抗体试剂对同一组织来源的乳腺癌组织切片的染色强度和定位无明显差异。(同一批次抗体试剂对于不同表达量的乳腺癌组织切片，表现出了它应有的差别)

实施例7

本发明抗体试剂的检测准确性研究

取5例不同病理类型乳腺癌ER-α36临床阳性组织切片，按照实施例3的方法进行免疫组化检测，用3个批次试剂检测乳腺癌组织样本中ER-α36的表达水平。结果显示：在光学显微镜下，可见预期细胞的细胞质和/或细胞膜上有棕黄色着色，且无背景染色，且3个批次抗体试剂之间无显着差异。

实施例8

本发明抗体试剂的检测特异性研究

取3例乳腺癌ER-α36染色强度为0的组织切片，按照实施例3的方法进行免疫组化检测，用3个批次试剂检测乳腺癌组织样本中ER-α36的表达水平。结果显示：在光学显微镜下，可见预期细胞的细胞质和/或细胞膜上未见有棕黄色着色，且无背景染色，且3个批次抗体试剂之间无显著差异。

取其它肿瘤组织肾透明细胞癌、肺癌、膀胱癌和前列腺癌及人体正常组织脾、胰腺、肺、骨骼肌和卵巢组织切片，按照实施例3的方法进行免疫组化检测，用3个批次试剂检测乳腺癌组织样本中ER-α36的表达水平。结果显示：在光学显微镜下，可见预期细胞的细胞质和/或细胞膜上未见有棕黄色着色，且无背景染色，且3个批次试剂之间无显着差异。

实施例9

本发明抗体试剂的稳定性研究

抗体试剂在37℃至少放置7天(对应2-8℃下保存，有效期为1年)，按照实施例6、7、8的方法对抗体试剂的稳定性进行检测。

可见，本发明的试剂具有良好的保存稳定性，在2-8℃下保存，保存期为1年。

实施例10

检测有淋巴结转移的乳腺癌患者肿瘤组织中ER-α36的表达情况

实验方法：选取经过手术或者穿刺获得的乳腺癌患者的肿瘤组织，通过实施例3、实施例4免疫组化的方法确定这些患者的乳腺癌组织中ER-α36的表达。并且检测这些患者是否带有淋巴结转移。注：ER-α36表达为临床阴性表示按照实施例4中检测，ER-α36的染色强度为0或染色强度1+，且这两种强度染色肿瘤细胞占总体肿瘤细胞任意比例的情况；ER-α36表达为临床阳性表示按照实施例4中检测，ER-α36染色强度为2+且该染色的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞的百分比≥50％和染色强度为3+且该染色的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞的百分比≥25％的情况。

实验结果：

从以上分析可以看出，在以上的1068位乳腺癌患者中，在肿瘤大小超过2cm的患者中，ER-α36临床阳性的患者比例高于ER-α36临床阴性的患者；在组织学为II级以上的患者中，ER-α36临床阳性的患者比例高于ER-α36临床阴性的患者；在淋巴结转移的病人中，ER-α36临床阳性的患者比例大于ER-α36临床阴性的患者比例，并且随着淋巴结转移数量的增加，ER-α36临床阳性和ER-α36临床阴性的患者的比例差值增加。因此，可见在乳腺癌患者的疾病进展情况与ER-α36的表达直接相关。

乳腺癌肿瘤的分级主要通过以3个方面进行评估，1.腺管形成的程度；2.细胞核的多形性；3.核分裂计数。按照国际卫生组织的分级标准：

1.腺管形成①75％为1分，②10％-75％为2分，③＜10％为3分。

2.核的多形性①核小、规则、形态一致为1分，②核的性状、大小有中等度的变化为2分，③核的性状、大小有明显分化为3分。

3.核分裂数(X400)①(0-5)/10HPF为1分，②(6-10)/10HPR为2分，③＞11/10HPF为3分。

HPF表示是医学病理学专用术语，中文称之为高倍视野，一般是指显微镜在目镜十倍，物镜四十倍的情况下在目镜下所观察到的病理切片上组织或涂片的范围。

在以上3项指标确定的分数相加，3-5分为组织学I级，分化好；6-7分为组织学II级，中等分化；8-9分为组织学III级，分化差。

实施例11

乳腺癌患者手术后生存状况和ER-α36表达的关系

ER-α36表达为临床阳性和临床阴性的乳腺癌患者术后生存情况如图4A-D所示。图中纵坐标“总体生存率”指的是从随机化开始至因任何原因引起死亡的一段时间内存活病人的比例。图中“无病生存率”表示为无远处转移和无局部区域复发中较短者的病人比例。

图4A表示，ER-α66和ER-α36表达均为临床阳性患者的总体生存明显差于ER-α66临床阳性ER-α36临床阴性的患者。

图4B表示，ER-α66和ER-α36表达均为临床阳性的患者中，患者的无病生存明显差于ER-α66临床阳性ER-α36临床阴性的患者的。

图4C表示，ER-α66临床阴性，ER-α36表达为临床阳性患者的总体生存明显差于ER-α66临床阴性ER-α36临床阴性的患者。

图4D表示，ER-α66临床阴性，ER-α36表达为临床阳性患者的无病生存明显差于ER-α66临床阴性ER-α36临床阴性的患者。

因此，可见无论ER-α66的表达为阳性或者阴性，只要患者的ER-α36表达为临床阳性，患者的总体生存和无病生存均差于ER-α36表达为阴性的患者。

实施例12

芳香酶抑制剂对于ER-α36和ER-α66均为临床阳性的乳腺癌患者的生存率的影响

147例绝经后患者，通过免疫组化方法检测，这些患者的ER-α36和ER-α66的表达均为临床阳性。在这些病人中，部分采用他莫西芬进行治疗，其余采用芳香酶抑制剂进行治疗，治疗结果如下表所示。

以下为这些患者的无病生存率和无转移生存率的多变量分析。

ER-α36和ER-α66双临床阳性的绝经后乳腺癌患者的无病生存率和无转移生存率的多变量分析

多因素模型回归分析揭示了他莫昔芬治疗对于绝经后病人的无病生存率(风险率＝7.705，P＝0.008)而言是不利的；然而芳香酶抑制剂有利于病人的无病生存率(风险率＝0.779，P＝0.629)。因此，对于ER-α36和ER-α66双临床阳性的绝经后乳腺癌病人而言，更适于芳香酶抑制剂进行治疗。

序列表

<110> 北京珅奥基医药科技有限公司

<120> 用于检测肿瘤组织中ER-α36表达水平的试剂盒

<141>

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> SNGmB1轻链的氨基酸序列

<400> 1

Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp

20 25 30

Met Asn Trp Tyr Arg Lys Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> SNGmB1重链的氨基酸序列

<400> 2

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His

20 25 30

Asn Met His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Val Asn Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Ser Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp

180 185 190

Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

195 200 205

Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu

225 230 235 240

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val

245 250 255

Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val

275 280 285

Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met

305 310 315 320

Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser

325 330 335

Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser

370 375 380

Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr

385 390 395 400

Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn

420 425 430

Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser

435 440 445

Arg Ser Pro Gly Lys

450

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> SNGmB1轻链LCDR1序列

<400> 3

Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> SNGmB1轻链LCDR2序列

<400> 4

Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> SNGmB1轻链LCDR3序列

<400> 5

Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> SNGmB1重链HCDR1序列

<400> 6

Ser His Asn Met His

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> SNGmB1重链HCDR2序列

<400> 7

Ala Ile His Pro Val Asn Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> SNGmB1重链HCDR3序列

<400> 8

Glu Gly Tyr Gly Ser Val Asp Tyr

1 5

<210> 9

<211> 645

<212> DNA

<213> 编码鼠抗体SNGmB1轻链的核苷酸序列

<400> 9

gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga aaaagtcacc 60

atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga actggtaccg gaagaagcca 120

gggcaacctc ctaagctcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 180

cgattctcca gcagtggcta tggtacagat tttgttttta caattgaaaa catgctctca 240

gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgcctcttac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttaa 645

<210> 10

<211> 1362

<212> DNA

<213> 编码鼠抗体SNGmB1重链的核苷酸序列

<400> 10

caggcttatc tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agtcacaata tgcactggat aaagcagaca 120

cctagacagg gcctggaatg gattggagct attcatccag taaatggtga tactgcctac 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

ctgcaactca gcagcctgac atctgaagag tctgcggtct atttctgtgc aagagagggg 300

tacggtagtg ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agctaaaaca 360

acacccccat cagtctatcc actggcccct gggtgtggag atacaactgg ttcctccgtg 420

actctgggat gcctggtcaa gggctacttc cctgagtcag tgactgtgac ttggaactct 480

ggatccctgt ccagcagtgt gcacaccttc ccagctctcc tgcagtctgg actctacact 540

atgagcagct cagtgactgt cccctccagc acttggccaa gtcagaccgt cacctgcagc 600

gttgctcacc cagccagcag caccacggtg gacaaaaaac ttgagcccag cgggcccatt 660

tcaacaatca acccctgtcc tccatgcaag gagtgtcaca aatgcccagc tcctaacctc 720

gagggtggac catccgtctt catcttccct ccaaatatca aggatgtact catgatctcc 780

ctgacaccca aggtcacgtg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agacgtccag 840

atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 900

gattacaaca gtactatccg ggtggtcagc accctcccca tccagcacca ggactggatg 960

agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccatcacc catcgagaga 1020

accatctcaa aaattaaagg gctagtcaga gctccacaag tatacatctt gccgccacca 1080

gcagagcagt tgtccaggaa agatgtcagt ctcacttgcc tggtcgtggg cttcaaccct 1140

ggagacatca gtgtggagtg gaccagcaat gggcatacag aggagaacta caaggacacc 1200

gcaccagtcc tagactctga cggttcttac ttcatatata gcaagctcaa tatgaaaaca 1260

agcaagtggg agaaaacaga ttccttctca tgcaacgtga gacacgaggg tctgaaaaat 1320

tactacctga agaagaccat ctcccggtct ccgggtaaat aa 1362

Claims (12)

1.一种用于检测肿瘤组织中ER-α36表达水平的试剂盒，该试剂盒包括：ER-α36检测抗体试剂和乳腺癌组织质控片，所述的肿瘤组织为乳腺癌肿瘤组织。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的乳腺癌组织质控片包括临床阴性和临床阳性的质控片；优选地，所述的临床阴性质控片共有2张，所述的临床阳性质控片共有2张。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的临床阴性质控片包括1：肿瘤细胞染色强度为0的质控片；2：染色强度为1+且该染色强度的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞任意比例的质控片，所述的肿瘤细胞为乳腺癌肿瘤细胞。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的临床阳性质控片包括1：染色强度为2+且该染色的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥50％的质控片；2：染色强度为3+且该染色的肿瘤细胞占总体肿瘤细胞百分比≥25％的质控片，所述的肿瘤细胞为乳腺癌肿瘤细胞。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括未经染色的乳腺癌细胞系质控片。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的乳腺癌细胞系质控片包括乳腺癌细胞系MDA-MB-231阳性质控片、乳腺癌细胞系MCF-7-ER-α36阳性质控片和乳腺癌细胞系MCF-7阴性质控片。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的乳腺癌细胞系MDA-MB-231阳性质控片由高表达ER-α36的MDA-MB-231乳腺癌细胞制成；所述的乳腺癌细胞系MCF-7-ER-α36阳性质控片由外源过表达ER-α36的MCF-7乳腺癌细胞制成；所述的乳腺癌细胞系MCF-7阴性质控片由低表达ER-α36的MCF-7乳腺癌细胞制成。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的ER-α36检测抗体试剂中含有SNGmB1的序列，优选地，所述的ER-α36检测抗体试剂的浓度为7μg/ml-25μg/ml。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤组织是经过手术或穿刺得到的乳腺癌肿瘤组织，经过二甲苯固定石蜡包埋的乳腺癌肿瘤组织标本。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测肿瘤组织中ER-α36表达水平包括以下步骤：1.制备肿瘤组织蜡块、切片；2.通过免疫组织化学方法对切片进行染色；3.参考乳腺癌组织质控片，对染色切片表达ER-α36的临床结果进行解读；评价受检者肿瘤组织中的ER-α36表达水平。

11.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述的临床阴性质控片和临床阳性质控片是如图2所示的四种质控片。

12.权利要求1-11中任一项所述的试剂盒在检测乳腺癌肿瘤组织中ER-α36表达水平中的用途。