CN109563128B

CN109563128B - 恶性肿瘤靶向肽

Info

Publication number: CN109563128B
Application number: CN201780050376.5A
Authority: CN
Inventors: 福田道子; 野中元裕
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2037-08-16
Also published as: EP3502122A1; JP6666613B2; MX2019001905A; IL264845B1; PL3502122T3; PT3502122T; IL264845B2; JP2020079288A; PH12019500306A1; JPWO2018034356A1; IL264845A; AU2017311927B2; AU2017311927A1; ZA201901318B; KR102422174B1; RU2019107377A3; RU2019107377A; CN109563128A; EP3502122B1; CA3032775A1

Abstract

本发明提供了一种肽，其包含下式(I)～(III)中任一项的氨基酸序列：(I)氨基酸序列(X1)[D]P[D](X2)[D]，其中，X1是W或F，X2是S或T，并且其后紧接有符号[D]的各个氨基酸符号是该氨基酸的D型，(II)氨基酸序列P[D]T[D](X)_nF[D]，其中，(X)_n是彼此独立选择的n个任意氨基酸，n是0～4的整数，符号[D]如上所定义，(III)氨基酸序列，其是上述(I)和上述(II)中任一项氨基酸序列的逆向‑翻转(Retro‑inverso)序列；并且，本发明提供了含有所述肽和一个功能部分的缀合物。

Description

恶性肿瘤靶向肽

技术领域

本发明主要涉及癌症生物学领域，更具体地，涉及与膜联蛋白A1结合的肽及其应用。

背景技术

在脑肿瘤中，许多原生于脑膜、脑或脊神经的肿瘤(如脑膜瘤和神经鞘瘤)是良性脑肿瘤，并且如果可以通过手术切除，则是可以完全治愈的。相反，神经上皮肿瘤(包括神经胶质瘤)基本上都是恶性脑肿瘤。特别是，即使在通过开颅手术切除后进行放疗和化疗，4级胶质母细胞瘤的预后极差(5年生存率约为10％)。缺乏有效的脑肿瘤化疗的主要原因是存在血脑屏障。另一方面，替莫唑胺(temozolomide)是一种对胶质母细胞瘤有效的新药，于2006年在日本获得批准。该药物具有非常小的分子量(194Da)，并且已证实能够通过扩散穿过血脑屏障。然而，该药物只能将预期寿命从12个月延长至16个月。因此，为了在未来显著改善恶性脑肿瘤的治疗效果，必须开发一种治疗药物，其以极高的浓度积聚在脑肿瘤中，并且就血脑屏障方面，可以积极地穿过血管内皮壁而不是依赖于小分子扩散的被动方法。

最近，由于研究和开发费用的增加以及抗体药物的广泛使用，患者的经济负担变得越来越重。在未来，认为这种趋势会通过医疗保健(如通过遗传信息等的诊断系统)的复杂性而进一步加速。此外，这些飙升的药品价格对国家医疗保健费用的影响也是无法估量的。此外，不发达国家无法获得昂贵的抗体药物，导致全球范围内的医疗不平等。如果从长远角度对上述问题采取措施，除了追求优质的潜力新药(drug seed)之外，在未来有必要探索廉价生物药品(如短链肽)的可能性。

福田(本发明人之一)在美国的Sanford Burnham Prebys Medical DiscoveryInstitute主持实验室30多年，直到2014年，她赴任国立研究开发法人产业技术总合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)。在此期间，福田世界首次通过使用模拟糖链结构的肽，成功抑制了糖链依赖性癌症转移(非专利文献1)。此外，在研究与这些糖链模拟肽相互作用的血管内皮受体的过程中，她发现名为IF7的肽与膜联蛋白A1(Anxa1)结合(非专利文献2)。Jan Schnitzer等人的课题组阐明：Anxa1为目前已知的肿瘤血管特异性标记分子中最具特异性的并且在正常细胞中胞内表达，但在肿瘤新生血管内皮细胞中，Anxa1在与血流接触的腔面上强烈表达(非专利文献3)。福田等人阐明，通过将抗癌剂(SN38)与IF7结合而获得的药物(IF7-SN38)能以低剂量清除患癌小鼠的肿瘤(非专利文献2)。IF7结合于小鼠Anxa1的N-末端区域，该区域中的氨基酸序列在小鼠和人之间高度保守。因此，IF7-SN38也可用于人体。这一发现刊载在PNAS期刊的“本期PNAS(In this issue in PNAS)”中，并且NIH以专门文章进行了介绍。这一发现进一步引起了大量关注，包括世界各地媒体的报道。

[文献列表]

[非专利文献]

非专利文献1：Fukuda et al.,Cancer Research,60:450-6,2000

非专利文献2：Hatakeyama et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,108:19587-92,2011

非专利文献3：Oh et al.,Nature 429:629-35,2004

发明内容

[发明所要解决的问题]

当向荷瘤小鼠静脉注射IF7时，它会到达肿瘤周围的血管，之后IF7从血管内皮细胞的腔侧被吸到囊泡中并向基底侧移动，IF7在基底侧被释放到有癌细胞的基质中。同样，在小鼠血管内皮F2细胞中，与Anxa1结合的IF7通过胞吞转运作用主动穿过肿瘤血管内皮细胞。因此，认为IF7具有穿过脑瘤中的血管-脑肿瘤屏障的活性。令人惊讶的是，将荧光标记的IF7静脉注射到移植有神经胶质瘤细胞的脑肿瘤模型小鼠中，得到脑肿瘤部位的高浓度荧光积聚。荧光还穿过血管并到达脑基质中的癌细胞。此外，在同一小鼠中产生皮下肿瘤和脑肿瘤(双肿瘤模型)，并测试IF7-SN38的治疗效果。结果是，脑肿瘤和皮下肿瘤都被抑制，并且其在脑肿瘤中的作用高于在皮下肿瘤中的作用。在B16黑色素瘤转移性脑肿瘤模型中获得了类似的结果，并且即使将宿主小鼠改变为C57BL/6或SCID品系，结果仍保持相同。这些事实表明，靶向Anxa1的DDS不仅有效地穿过血脑肿瘤屏障，而且还在脑肿瘤中提供优异的治疗效果。

如上所述，尽管IF7具有优异的恶性肿瘤靶向活性，但它在临床开发中存在两个问题：低溶解度和低稳定性。首先，IF7肽对蛋白酶敏感并且容易降解。事实上，在包括向健康小鼠静脉施用A488-IF7的实验中，外周血的荧光信号在约1小时内差不多消失。然而，通过对荷瘤小鼠进行尾静脉给药，从外周血中回收的A488-IF7的荧光显著低于健康小鼠。该结果表明，大部分A488-IF7在肿瘤中迅速积累同时发生降解。此外，IF7是高疏水性的并且导致形成剂型困难，例如，当静脉施用IF7与抗癌剂结合的化合物时，需要在DMSO中溶解后添加表面活性剂以避免沉淀。

因此，本发明的一个目的是提供一种结合膜联蛋白A1的新型肽及其应用，其能够至少部分地克服上述与IF7相关的问题。

[解决问题的手段]

为了解决上述问题，本发明人进行了深入研究，并且设想了探索能够结合膜联蛋白A1的D型肽。为此，本发明人合成了与16-残基L-型肽(L-MC16)镜像关系的D-型肽(D-MC16)，L-MC16具有添加到已知与IF7结合的Anxa1的N末端15个残基的Cys修饰残基。并且本发明人使用T7噬菌体文库筛选以识别与D-MC16结合的多个7-氨基酸的L-型肽。他们对在已识别出的L-型肽中特别有希望的名为TIT7肽的肽进行了进一步研究。如发明人所预测的，他们证实了与TIT7肽呈镜像关系的D-型肽(dTIT7肽)与Anxa1结合。此外，本发明人通过体内实验证明：当通过尾静脉给药脑肿瘤模型小鼠时，dTIT7肽在肿瘤部位积聚；当对荷瘤小鼠进行静脉给药，与抗癌剂(格尔德霉素)结合的dTIT7肽(GA-dTIT7)显著抑制了肿瘤，从而导致肿瘤部位大量坏死；并且在大脑移植了C6细胞的脑肿瘤模型小鼠中和大脑移植B16细胞的脑转移模型小鼠中，口服GA-dTIT7都抑制了肿瘤生长，即使停止给药后肿瘤仍继续减少，在一些动物中最终实现完全治愈。

本发明人基于上述结果进行了进一步的研究，并完成了本发明。本发明如下。

[1]一种肽，其包含下式(I)～(III)中任一项的氨基酸序列：

(I)氨基酸序列(X1)[D]P[D](X2)[D]，其中，X1是W或F，X2是S或T，并且其后紧接有符号[D]的各个氨基酸符号是该氨基酸的D型，

(II)氨基酸序列P[D]T[D](X)_nF[D]，其中，(X)_n是彼此独立选择的n个任意氨基酸，n是0～4的整数，符号[D]如上所定义，

(III)氨基酸序列，其是上述(I)和上述(II)中任一项氨基酸序列的逆向-翻转(Retro-inverso)序列。

[2]一种肽，其包含以下(i)～(vii)中任一项的氨基酸序列(在以下序列中，符号[D]如上所定义)：

(i)氨基酸序列T[D]I[D]T[D]W[D]P[D]T[D]M[D]，

(ii)氨基酸序列L[D]R[D]F[D]P[D]T[D]V[D]L[D]，

(iii)氨基酸序列L[D]L[D]S[D]W[D]P[D]S[D]A[D]，

(iv)氨基酸序列S[D]P[D]T[D]S[D]L[D]L[D]F[D]，

(v)氨基酸序列M[D]P[D]T[D]L[D]T[D]F[D]R[D]，

(vi)上述(i)～(v)中任一项的氨基酸序列中插入、取代或缺失(或其组合)一个或数个氨基酸的氨基酸序列，

(vii)氨基酸序列，其是上述(i)～(vi)中任一项的氨基酸序列的逆向-翻转序列。

[3]如[2]所述的肽，其包含上述(i)的氨基酸序列。

[4]如[2]所述的肽，其由上述(i)的氨基酸序列组成。

[5]一种缀合物，其包含[1]～[4]中任一项的肽和一种以上组分。

[6]如[5]所述的缀合物，其中，所述一种以上组分包含抗癌剂。

[7]如[6]所述的缀合物，其中，上述抗癌剂选自包含代谢拮抗剂、烷化剂、抗癌抗生素、微管抑制剂、铂制剂、拓扑异构酶抑制剂、分子靶向性剂和抗血管生成剂。

[8]如[6]或[7]所述的缀合物，选自：依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟(carmofour)、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、八磷酸阿糖胞苷(cytarabine ocphosphate)、替加氟、替加氟/尿嘧啶、替加氟/吉美嘧啶/奥替拉西钾、去氧氟尿苷、奈拉滨、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、甲氨蝶呤；

环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、白消安、噻替派、尼莫司汀、雷莫司汀、达卡巴嗪、甲苄肼、替莫唑胺、卡莫司汀、链脲霉素、苯达莫司汀；

放线菌素D、阿克拉霉素、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁斯酯、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、脂质体多柔比星；

长春碱、长春新碱、长春地辛、紫杉醇、多西紫杉醇、奥沙利铂、卡铂、顺铂、奈达铂；

喜树碱、伊立替康、拓扑替康(nogitecan)、SN-38、多柔比星、依托泊苷、左氧氟沙星、环丙沙星；

瑞格菲尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、雷莫芦单抗、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、克里唑蒂尼、阿来替尼、色瑞替尼、乐伐替尼、曲妥珠单抗、拉帕替尼、帕妥珠单抗、舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼、帕唑帕尼、纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、维罗非尼、依维莫司、替西罗莫司、利妥昔单抗、贝伐单抗、格尔德霉素；

血管抑制素、内皮抑素、转移抑素(metastatin)、抗VEGF抗体和VEGFR-2抑制剂。

[9]如[5]所述的缀合物，其中，所述一种以上组分包含可检测物质。

[10]如[9]所述的缀合物，其中，所述可检测物质使得能够通过选自以下的方法在体内检测所述缀合物：X射线摄影、计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、超声波检查、闪烁扫描、正电子发射断层扫描(PET)、内窥镜检查和腹腔镜检查。

[11]如[9]或[10]所述的缀合物，其中，所述可检测物质是放射性同位素、MRI增强剂、不透射线物质、造影剂或荧光物质。

[12]如[9]～[11]中任一项所述的缀合物，其中，所述可检测物质选自：

放射性核素，选自：¹⁸F、⁵¹Mn、^52mMn、⁵²Fe、⁵⁵Co、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、^94mTc、¹¹⁰In、¹²⁰I、¹²⁴I等。用于检测γ射线的放射性核素的例子包括：⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁷⁵Se、⁹⁷Ru、^99mTc、¹¹¹In、^114mIn、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁶⁹Yb、¹⁹⁷Hg和²⁰¹Tl；

顺磁离子，选自：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，

镧(III)、金(III)、铅(II)、铋(III)；

碘化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物；

若丹明、荧光素、Cy染料、Alexa(注册商标)Fluor、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、它们的衍生物和近红外荧光试剂。

[13]一种组合物，其包含[1]～[4]中任一项的肽或[5]～[12]中任一项的缀合物，以及药学上可接受的载体。

[14]一种用于治疗癌症的组合物，其包含[6]～[8]中任一项的缀合物和药学上可接受的载体。

[15]一种用于检查癌症的组合物，其包含[9]～[12]中任一项的缀合物和药学上可接受的载体。

[16]如[14]或[15]所述的组合物，其中，所述癌症是实体癌或液体癌。

[17]如[16]所述的组合物，其中，所述实体癌是血管生成性实体癌。

[18]如[16]或[17]所述的组合物，其中，所述实体癌是脑或神经系统的癌症、头颈癌、消化道癌、泌尿或生殖器官癌、呼吸系统癌、乳腺癌、皮肤癌、骨癌或肌肉癌。

[19]如[16]～[18]中任一项所述的组合物，其中，所述实体癌是脑肿瘤、脊髓肿瘤、喉癌、口腔癌、唾液腺癌、鼻窦癌、甲状腺癌、胃癌、食道癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、肝癌、胆道癌、胰腺癌、肾癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、肾盂和输尿管癌、胆囊癌、胆管癌、睾丸癌、阴茎癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、输卵管癌、肺癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、骨肉瘤或横纹肌肉瘤。

[20]如[19]所述的组合物，其中，所述实体癌是良性或恶性脑肿瘤。

[21]如[20]所述的组合物，其中，所述脑肿瘤是原发性脑肿瘤或转移性脑肿瘤。

[22]如[20]或[21]所述的组合物，其中，所述脑肿瘤是脑膜瘤、垂体腺瘤、神经鞘瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、间变性星形细胞瘤、间变性少突神经胶质瘤、间变性少突星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。

[23]如[16]所述的组合物，其中，所述液体癌症是B细胞淋巴瘤。

[发明效果]

根据本发明，提供了与膜联蛋白A1结合的一种新型肽。

如红细胞生成素和最近的抗PD-1抗体的例子中所证明的，临床上成功的药物对药物靶向的生物分子的表达具有非常高的特异性。由于本发明的肽所靶向的膜联蛋白A1是目前已知的恶性肿瘤的新生血管靶标记物中最具特异性的分子，因此与现有的抗癌剂相比，组合了本发明的肽的抗癌剂可以表现出优异的治疗效果

特别地，肽-抗癌剂缀合物不仅能够高效地在恶性肿瘤中积累抗癌剂，而且还具有蛋白酶抗性，因此可以减少有效剂量的次数甚至剂量更低。此外，由于可以认为维持了免疫系统，因此通过组合使用抗癌剂和免疫疗法可以预期恶性肿瘤的完全治愈。

膜联蛋白A1的特征在于，它在肿瘤中形成的新生血管内皮细胞的血液侧表达，并且，当在血液侧与配体(如本发明的肽)结合时，配体通过转胞吞作用被转运到基底侧并且主动释放到有癌细胞的基质中。该特性也可以作为主动穿过血管脑屏障的机制。与传统的血管生成抑制剂(阿瓦斯汀)和替莫唑胺(如上所述)不同，靶向膜联蛋白A1的本发明的肽使得可以通过新机制来治疗恶性脑肿瘤。换言之，目前已经开发出穿过血脑屏障的化学治疗剂、在肿瘤组织中积聚的化学治疗剂，以及可以在体内稳定并且口服给药的化学治疗剂，但除了本发明的肽(图10)之外，不存在组合所有这些的化学治疗剂。

由于本发明的肽可以与各种抗癌剂组合，因此它可以提供广泛的生理活性。

本发明为脑肿瘤的治疗打开了一个突破口。此外，已知ANXA1在各种恶性肿瘤的血管表面上表达，并且可预期，结合dTIT7的抗癌剂在临床上不仅可用作脑肿瘤还有更多癌症的治疗剂。

另外，由于本发明的肽可以容易地化学合成和修饰，因此作为替代抗体药物的中分子生物药物非常有前途。特别是，由于本发明的肽可以是短链肽(例如7个氨基酸残基)，因此可以通过化学合成法经济地制备。

此外，本发明的肽以及含有肽和其他功能部分的缀合物具有优异的稳定性，并且还可以用作口服给药的药物。因此也容易进行临床试验。在作为医疗药物实际获批之后，即使在医疗设施稀缺的欠发达国家，它也可以作为药品普及。

另外，含有本发明的肽和可检测物质的缀合物可用于例如癌症诊断用途。本发明人过去曾尝试用IF7对小鼠进行PET检测，但未获得肿瘤特异性图像。认为失败的原因是：由于IF7的高疏水性，与放射性试剂结合的IF7被埋在化合物内侧。本发明的肽可以是水溶性的，因此可以克服这个问题。本发明的肽可以相对容易地对其例如N-末端进行修饰，可以被用于例如PET的3D成像的试剂标记，并且可以开发诊断试剂。

附图说明

图1显示了IF7的脑肿瘤靶向作用。静脉施用IF7-A488至脑肿瘤模型小鼠后的脑组织切片。A488(左)和Hoechst(右，肿瘤部位)。RQ7是IF7的反序列阴性对照。标尺：5mm。

图2显示了用荧光标记的IF7处理的小鼠的脑肿瘤组织切片的荧光显微图像。其为图1显示的脑肿瘤组织切片的放大图。血管内皮细胞用CD31特异性抗体染色(红色)。IF7-A488(绿色)通过血管到达基质中的癌细胞。RQ7是IF7的反序列对照。标尺：40μm。

图3说明了双肿瘤模型小鼠。为了研究对血管-脑肿瘤屏障(BBTB)的影响，将表达荧光素酶(Luc)的癌细胞移植到一只小鼠的脑和皮下以产生肿瘤。当BBTB抑制通过尾静脉施用的抗癌药物渗透到脑肿瘤中时(BBTB+)，抗癌药物的作用仅出现在皮下肿瘤中。另一方面，当抗癌药物穿透脑肿瘤时(BBTB-)，它在脑和皮下肿瘤中均有效。

图4显示了IF7-SN38对脑肿瘤的治疗效果。将C6-Luc细胞(在大鼠神经胶质瘤中强制表达荧光素酶的细胞)移植到免疫缺陷SCID小鼠的脑和皮下以产生肿瘤，得到双肿瘤模型。通过尾静脉每天施用IF7-SN38，测量由于肿瘤中荧光素酶活性引起的荧光，并测定C6-Luc细胞的生存率。IF7-SN38不仅抑制脑肿瘤的生长，而且相比皮下肿瘤更强烈地抑制脑肿瘤。

图5显示对荷瘤小鼠和健康小鼠静脉内给药A488-IF7，血液中剩余的荧光的定量分析。通过尾静脉向患有黑素瘤B16皮下癌的小鼠给药A488-IF7，随时间从眼静脉收集外周血并测量荧光。回收的荧光与肿瘤尺寸负相关。

图6说明了筛选与Anxa1结合的D-型肽。(A)通过镜像筛选的D型肽序列识别方法。IF7与由16个氨基酸残基组成的Anxa1 N末端肽((1)L-型MC16)结合。(2)合成D-型MC16，并选择与其结合的序列。(3)用D-氨基酸合成得到的L-型肽，形成与Anxa1结合的D-型肽。(B)靶向D-MC16的T7噬菌体文库的筛选结果。每轮都观察到噬菌体富集。(C)下一代测序仪对D-MC16特异性T7噬菌体的序列分析。(D)富集的肽及其比例。(E)确认TIT7噬菌体与D-MC16结合(噬斑形成实验)。

图7显示了IRDye-dTIT7给药实验的结果。将强制表达荧光素酶的大鼠神经胶质瘤细胞(C6-Luc)移植到裸鼠的脑中，以制备脑肿瘤模型小鼠。将用近红外荧光试剂(IRDye800CW)标记的dTIT7(IRDye-dTIT7，未纯化的产物)注射到尾静脉中，并通过IVIS Imager随时间观察荧光。24小时后，在脑肿瘤部位和肾中观察到荧光信号的积累。(A)随时间变化的总图像(B)放大照片(C)通过IVIS成像仪的软件进行信号量化。

图8显示了GA-dTIT7缩合物的结构。将氨基引入格尔德霉素以连接马来酰亚胺接头。预先将半胱氨酸添加至dTIT7的N末端进行合成。它通过半胱氨酸残基的巯基与马来酰亚胺反应得到GA-dTIT7缩合物。

图9显示了实验结果，包括每隔一天口服施用与抗癌剂格氏霉素(GA)结合的dTIT7药物(GA-dTIT7)给脑肿瘤模型小鼠。通过荧光素酶的荧光定量脑肿瘤的残存。将含有与格尔德霉素结合的WIPTTMT(肽，其中构成dTIT7的D-氨基酸序列的顺序改变)的GA-dWIP7作为对照施用于小鼠。图(右上)显示了定量恶性肿瘤的活细胞信号(左)和存活曲线(右下)。

图10概念性地说明了用IF7、结合dTIT7的抗癌剂靶向治疗恶性脑肿瘤。为方便起见，认为血脑屏障存在于颈部上方。一般抗癌药物不具有肿瘤靶向能力。替莫唑胺在一定程度上渗透到脑肿瘤中但不集中。阿瓦斯汀作用于新血管，但不直接作用于肿瘤细胞。相对地，结合Anxa1的肽穿过血脑肿瘤屏障并且仅在肿瘤中以高浓度积累。

图11显示了Anxa1与dLRF7、dSPT7、dMPT7和dLLS7肽的分子间相互作用的结果。测试的所有肽显示与Anxa1的阳性结合。

图12显示了向脑肿瘤模型裸鼠施用IRDye-dLRF7、IRDye-dSPT7、IRDye-dMPT7和IRDye-dLLS7的实验结果。除注射dLLS7的小鼠外，所有小鼠在脑肿瘤部位均显示强信号，并且dLRF7、dMPT7和dSPT7三种肽(dLLS7除外)显示出通过脉管系统途径靶向脑肿瘤的能力。

具体实施方式

1.肽

本发明提供一种肽，其包含下式(I)～(III)中任一项的氨基酸序列：

(I)氨基酸序列(X1)[D]P[D](X2)[D]，其中，X1是W或F，X2是S或T，

(II)氨基酸序列P[D]T[D](X)_nF[D]，其中，(X)_n是彼此独立选择的n个任意氨基酸，n是0～4的整数，

本发明还提供一种肽，其包含以下(i)～(vii)中任一项的氨基酸序列：

(i)氨基酸序列T[D]I[D]T[D]W[D]P[D]T[D]M[D]，

(ii)氨基酸序列L[D]R[D]F[D]P[D]T[D]V[D]L[D]，

(iii)氨基酸序列L[D]L[D]S[D]W[D]P[D]S[D]A[D]，

(iv)氨基酸序列S[D]P[D]T[D]S[D]L[D]L[D]F[D]，

(v)氨基酸序列M[D]P[D]T[D]L[D]T[D]F[D]R[D]，

在本说明书中，根据描述肽的常规方式描述链肽的氨基酸序列，其中N末端侧在左侧并且C末端侧在右侧。另外，除非与上下文意思相反，其后紧接有符号[D]的各个氨基酸符号是该氨基酸的D型，其后没有紧接符号[D]的各个氨基酸符号是该氨基酸的L型。在本说明书中，含有上述(I)～(II)中任一项的氨基酸序列的肽以及含有上述(i)～(vii)中任一项的氨基酸序列的肽统称为本发明的肽。

上述(I)的氨基酸序列可以是W[D]P[D]S[D]、W[D]P[D]T[D]、F[D]P[D]S[D]和F[D]P[D]T[D]中的任何一个。

在上述(II)的氨基酸序列中，整数n为0～4，优选为2～3。X可以是彼此独立选择的任何氨基酸。

本发明的肽可以由上述(I)～(III)和(i)～(vii)中任一项的氨基酸序列组成，或者可以在这些序列的N末端侧和/或C末端侧添加一个以上氨基酸。

在本说明书中，肽是指具有两个以上肽键合的氨基酸的物质。本发明的肽的长度没有特别限制。本发明的肽可含有至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个氨基酸。本发明的肽可以由最多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7个氨基酸组成。本发明的肽的长度可以为3～10、3～15、3～20、3～25、3～30、3～40、3～50、4～10、4～15、4～20、4～25、4～30、4～40、4～50、5～10、5～15、5～20、5～25、5～30、5～40、5～50、6～10、6～15、6～20、6～25、6～30、6～40、6～50、7～10、7～15、7～20、7～25、7～30、7～40、7～50、8～10、8～15、8～20、8～25、8～30、8～40或8～50个氨基酸。例如，本发明的肽可具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸的长度。

本发明的肽可以由D型氨基酸和L型氨基酸的组合组成。更详细地，构成含有上述(I)～(II)和(i)～(vi)中任一项的氨基酸序列的肽的所有氨基酸可以是D型氨基酸，也可以在D型氨基酸之外还含有L型氨基酸；构成含有上述(III)或(vii)的氨基酸序列的肽的所有氨基酸可以是L型氨基酸，或者可以在L型氨基酸之外还含有D型氨基酸。L-型氨基酸可以是天然存在的L-型氨基酸，例子包括：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、色氨酸、缬氨酸，所有这些均为L型。D-型氨基酸包括，例如，如上所述的L-型氨基酸的光学异构体。在本说明书中，除非与上下文意思相反，否则甘氨酸是不具有光学活性的氨基酸，可以读作L-型和D-型氨基酸。

本发明的肽可含有修饰的或不常见的氨基酸，如37C.F.R.1.821-1.822等涉及的那些。在一个实施方案中，本发明的肽不含修饰的或不常见的氨基酸。修饰的或不常见氨基酸的例子包括：3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟基赖氨酸(allo-hydroxylysine)、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸，正亮氨酸、鸟氨酸等。

本发明的肽的氨基末端和/或羧基末端可以修饰。氨基末端的修饰可以是甲基化(例如，-NHCH₃或-N(CH₃)₂)、乙酰化(例如，通过乙酸或其卤代衍生物)，或任何保护基团，例如可以引入苄氧基羰基、羧酸酯官能团(RCOO-)或磺酰基官能团(R-SO₂-)(其中R选自烷基、芳基、杂芳基和烷基芳基等)。羧基末端的修饰包括酰胺化(-CONH₂)、酯化(-COOR)等。此处，作为酯中的R，可以采用例如，C_1-6烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基；C_3-8环烷基，如环戊基、环己基；C_6-12芳基，如苯基、α-萘基；苯基-C_1-2烷基，如苄基、苯乙基；C_7-14芳烷基，如α-萘基-C_1-2烷基；新戊酰氧基甲基等。

除了N-末端或C-末端之外，本发明的肽还可以进行各种修饰。化学修饰可以是，例如，甲基化、乙酰化、磷酸化等。当本发明的肽在除C-末端之外的位点具有羧基(或羧酸酯)时，该羧基可被酰胺化或酯化。作为这种情况下的酯，例如，使用上述的C-末端酯等。或者，可以用适当的保护基团(例如，C_1-6酰基如C_1-6烷酰基，如甲酰基、乙酰基等)保护分子中氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)。

含有上述(vi)的氨基酸序列的本发明的肽可以含有上述(i)～(v)的氨基酸序列中的由四个连续氨基酸组成的部分序列、由五个连续氨基酸组成的部分序列、或由六个连续氨基酸组成的部分序列。具体地，例如，当原始氨基酸序列是上述(i)的氨基酸序列时，肽可以含有氨基酸序列T[D]I[D]T[D]W[D]、氨基酸序列I[D]T[D]W[D]P[D]、氨基酸序列T[D]W[D]P[D]T[D]、氨基酸序列W[D]P[D]T[D]M[D]、氨基酸序列T[D]I[D]T[D]W[D]P[D]、氨基酸序列I[D]T[D]W[D]P[D]T[D]、氨基酸序列T[D]W[D]P[D]T[D]M[D]、氨基酸序列T[D]I[D]T[D]W[D]P[D]T[D]或、氨基酸序列I[D]T[D]W[D]P[D]T[D]M[D]。

在上述(vi)的氨基酸序列中，突变(即插入、取代、缺失及其组合)的位点没有特别限制。突变可以包括(a)仅插入、(b)仅取代、(c)仅缺失、(d)仅插入和取代、(e)仅插入和缺失、(f)仅取代和缺失、或(g)插入、取代和删除的组合。上述(a)～(g)中的突变数量为例如1～5，优选为1～4，更优选为1～3，进一步优选为1或2，进一步优选为1。

插入上述(vi)的氨基酸序列中的氨基酸可以是上述任何氨基酸。氨基酸可以是L-型或D-型氨基酸，例如，上述天然存在的L-型氨基酸，或者是其光学异构体的D-型氨基酸。氨基酸也可以进行上述各种化学修饰。

优选地，上述(vi)的氨基酸序列中的取代是保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是本领域中众所周知的。例如，保守氨基酸取代可定义为侧链性质相似的氨基酸之间的取代。因此，保守氨基酸取代可以是，例如(1)芳香族氨基酸之间的取代(Phe、Trp、Tyr)、(2)非极性脂肪族氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Met、Ile、Pro)之间的取代、(3)不带电极性氨基酸(Ser、Thr、Cys、Asn、Gln)之间的取代、(4)碱性氨基酸(Lys、Arg、His)之间的取代，或(5)酸性氨基酸(Asp、Glu)之间的取代。在本说明书中，保守氨基酸取代还可以包括将D型氨基酸用L型氨基酸(该D型氨基酸的光学异构体)取代。因此，保守氨基酸取代也可以是上述(1)～(5)内的两个L-型氨基酸之间的取代、两个D-型氨基酸之间的取代，或一个L-型氨基酸和一个D-型氨基酸之间的取代。

在一个实施方案中，上述(vi)的序列可以包括在上述(I)或(II)的序列中。在这种情况下，上述(vii)的序列包括在上述(III)的序列中。在这样的实施方案中，在上述(i)的序列中，第四个氨基酸可以是W[D]或F[D]，第五个氨基酸可以是P[D]，第六个氨基酸可以是T[D]或S[D]；在上述(ii)的序列中，第三个氨基酸可以是W[D]或F[D]，第四个氨基酸可以是P[D]，第五个氨基酸可以是T[D]或S[D]；在上述(iii)的序列中，第四个氨基酸可以是W[D]或F[D]，第五个氨基酸可以是P[D]，第六个氨基酸可以是T[D]或S[D]；在上述(iv)的序列中，第二个氨基酸可以是P[D]，第三个氨基酸可以是T[D]，第六个氨基酸可以是F[D]；以及在上述(v)的序列中，第二个氨基酸可以是P[D]，第三个氨基酸可以是T[D]，第五个氨基酸可以是F[D]。

肽的逆向-翻转异构体是指其中每个氨基酸残基的手性反转(“inverso”)并且氨基酸序列的方向相对于原始肽逆转(“Retro”)的肽。已知逆向-翻转异构体具有与原始肽类似的结构和功能(例如，Acc.Chem.Res.，1993，26(5)，266-273页和PLoS One.2013Dec 2；8(12)：e80390)。具体地，上述(vii)的氨基酸序列包括，例如，上述(i)的序列的逆向-翻转序列MTPWTIT(SEQ ID NO：1)、上述(ii)的序列的逆向-翻转序列LVTPFRL(SEQ ID NO：2)、上述(iii)的序列的逆向-翻转序列ASPWSLL(SEQ ID NO：3)、上述(iv)的序列的逆向-翻转序列FLLSTPS(SEQ ID NO：4)，以及上述(iv)的序列的逆向-翻转序列RFTLTPM(SEQ ID NO：5)。

本发明的肽可含有两种以上选自上述(I)～(III)和(i)～(vii)的序列。在一个实施方案中，本发明的肽含有上述(I)～(III)和(i)～(vii)中任一序列的串联重复(即，相同序列部分彼此直接连接的结构)。在另一个实施方案中，本发明的肽含有上述(I)～(III)和(i)～(vii)中两个以上不同序列直接连接的结构。具体的重复结构包括，例如，T[D]I[D]T[D]W[D]P[D]T[D]M[D]-T[D]I[D]T[D]E[D]P[D]T[D]M[D]和T[D]I[D]T[D]-T[D]I[D]T[D]。或者，本发明的肽可以与树枝状聚合物一起构成多价肽。

本发明的肽可以是游离形式或盐形式。本发明的肽的盐的例子包括药学上可接受的酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐的例子包括与无机酸如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐；以及有机酸如乙酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸等的盐。碱加成盐的例子包括与碱金属如钠、钾等的盐；碱土金属如钙、镁等的盐；以及胺类如铵、三乙胺等的盐。

本发明的肽可以与膜联蛋白A1结合。膜联蛋白A1(Anxa1)是属于膜联蛋白家族的已知蛋白质，也称为脂皮质素1。各种物种Anxa1的基因序列和氨基酸序列是已知的。例如，人Anxa1的mRNA的RefSeq No.NM-000700.2(SEQ ID NO：6)、蛋白质的RefSeq No.NP-000691.1(SEQ ID NO：7)；小鼠Anxa1的mRNA的RefSeq No.NM-010730.2(SEQ ID NO：8)、蛋白质的RefSeq No.NP-034860.2(SEQ ID NO：9)。本发明的肽可以与Anxa1的N末端区域结合。更具体地，本发明的肽可结合人Anxa1中由SEQ ID NO：7的第1个至第15个氨基酸组成的区域，或鼠Anxa1中由SEQ ID NO：9的第1个至第15个氨基酸组成的区域。当例如使用QCM(石英晶体微天平)方法测量与小鼠或人Anxa1的分子间相互作用时，本发明的肽的解离常数(Kd值)优选小于10^-6M，更优选小于10^-7M，进一步更优选小于5×10^-8M。对于上述测量，可以使用由346个氨基酸残基组成的人重组Anxa1蛋白，其可从ATGen公司(城南市，韩国)商购获得。

可以根据已知的肽合成方法制备本发明的肽。肽合成方法可以是例如固相合成方法和液相合成方法中的任何一种。可以通过缩合能够构成本发明的肽的部分肽或氨基酸和剩余部分，来制备目标肽，以及当产物具有保护基团时，通过消去保护基团来制备。

此处，可以根据已知的方法进行保护基团的缩合和消去，例如，以下(1)～(8)中描述的方法。

(1)M.Bodanszky&M.A.Ondetti，肽合成(Peptide Synthesis)，Interscience出版社，纽约(1966)

(2)Schroeder&Luebke，肽(The Peptide)，美国学术出版社，纽约(1965)

(3)Nobuo Izumiya等人：Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken(肽合成的基础和实验)，Maruzen公司出版(1975)

(4)Haruaki Yajima和Shunpei Sakakibara：Seikagaku Jikken Koza(生化实验)1，Tanpakushitsu no Kagaku(蛋白质化学)IV，205(1977)

(5)Haruaki Yajima编辑：Zoku Iyakuhin no Kaihatsu(药品开发续)，14卷，肽合成，由Hirokawa Shoten出版。

(6)Stewart,J.M.&Young,J.D.，“固相肽合成(Solid phase peptide synthesis)(第2版)”，皮尔斯化学公司，罗克福德(1984)

(7)Atherton,E.&Sheppard,R.C.，“固相肽合成：实用方法”，IRL出版社，牛津(1989)

(8)“Fmoc固相肽合成：实用方法(实用方法系列)”，牛津大学出版社(2000)

由此获得的肽可以通过已知的纯化方法纯化和分离。纯化方法的例子包括溶剂萃取、蒸馏、柱色谱、液相色谱、重结晶、它们的组合等。

当通过上述方法获得的肽是游离形式时，可以通过已知方法或与其类似的方法将其转化为合适的盐；相对地，当以盐的形式获得肽时，可以通过已知方法或与其类似的方法将盐转化为游离形式或其他盐。

如上所述，已知膜联蛋白A1为目前已知的肿瘤血管特异性标记分子中最具特异性的，并且在正常细胞中胞内表达，但在肿瘤新生血管内皮细胞中，膜联蛋白A1在与血流接触的腔面上强烈表达(Oh等，Nature 429：629-35，2004)。因此，本发明的肽可以在体内选择性地结合血管生成性肿瘤。此外，Anxa1在肿瘤中形成的新生血管内皮细胞的血液侧表达，并且，当在血液侧与配体(如本发明的肽)结合时，配体通过转胞吞作用被转运到基底侧并且主动释放到有癌细胞的基质中。因此，本发明的肽可以在体内靶向恶性肿瘤。因此，本发明的肽可用于例如靶向恶性肿瘤。

2.缀合物

本发明还提供一种以上组分与上述本发明的肽结合的缀合物(下文中也称为本发明的缀合物)。

对该组分没有特别限制，只要其可以与本发明的肽连接，并且可以适合于对动物(例如人)施用，并且可以在动物体内发挥一些功能。该组分可以是天然的或非天然的。组分的例子包括但不限于：生物材料(例如，细胞、噬菌体、病毒等)、寡核苷酸和核酸(例如，DNA、RNA、DNA/RNA嵌合体等)、肽、多肽、蛋白质、抗体、脂质、多糖、小分子化合物(例如，不大于1000Da的有机化合物或无机化合物)、颗粒(例如，金颗粒、各种纳米颗粒等)、它们的组合等。

该组分可以在动物(例如人)体内的靶向部位执行给定的功能。功能的类型不受特别限制。由于本发明的缀合物可以通过对应于本发明的肽的部分的作用靶向恶性肿瘤，因此该功能的优选例子包括抗癌活性和提供可检测性。因此，该组分可以是例如抗癌剂或可检测物质。

(抗癌剂)

在本说明书中，抗癌剂是指旨在抑制恶性肿瘤(癌症)生长的药物。抗癌剂的作用机理没有特别限制。抗癌剂可以是代谢拮抗剂、烷化剂、抗癌抗生素、微管抑制剂、铂制剂、拓扑异构酶抑制剂、分子靶向剂等。本发明的缀合物可含有两种以上相同或不同的抗癌剂。

代谢拮抗剂可以是，例如，叶酸代谢拮抗剂、二氢蝶酸合成酶抑制剂、二氢叶酸还原酶抑制剂(DHFR抑制剂)、嘧啶代谢抑制剂、胸苷酸合成酶抑制剂、嘌呤代谢抑制剂、IMPDH抑制剂、核糖核苷酸还原酶抑制剂、核糖核苷酸还原酶抑制剂、核苷酸类似物、L-天冬酰胺酶等。代谢拮抗剂的具体例子包括依诺他滨(SUNRABIN)、卡培他滨(希罗达)、卡莫氟(Mifurol)、克拉屈滨(Leustatin)、吉西他滨(Gemzar)、阿糖胞苷(kiloside)、八磷酸阿糖胞苷(Starasid)、替加氟(Achillon、AFTHOUR、Tefseal、Futrafur、Lunasin等)、替加氟/尿嘧啶(UFT)、替加氟/吉美嘧啶/奥替拉西钾(TS-1：T-S-One)、去氧氟尿苷(FURTURON)、奈拉滨(Arranon G)、羟基脲(HYDREA)、氟尿嘧啶(5-FU、carzonal、Benton、Lunachol、Lunapon)、氟达拉滨(fludara)、培美曲塞(alimta)、喷司他丁(cofolin)、巯嘌呤(leukerin)、甲氨蝶呤(methotrexate)等。

烷基化剂的具体例子包括基于氮芥的烷基化剂，如环磷酰胺(endoxane)、异环磷酰胺(ifomide)、美法仑(alkeran)、白消安、噻替派(tespamine)等；基于亚硝基脲的烷基化剂，如尼莫司汀(nidran)、雷莫司汀(cymerin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲苄肼(盐酸丙卡巴肼)、替莫唑胺(Temodal)、卡莫司汀(Gliadel)、链脲霉素(zanosar)、苯达莫司汀(treakisym)等。

抗癌抗生素的具体例子包括：放线菌素D(cosmegen)、阿克拉霉素(aclacinone)、氨柔比星(Calsed)、伊达比星(idamycin)、表柔比星(盐酸表柔比星、Farmorubicin)、净司他丁斯酯(Smancs)、柔红霉素(daunomycin)、多柔比星(adriacin)、吡柔比星(Pinorubin、THERARUBICIN)、博来霉素(Bleo)、培洛霉素(Peleo)、丝裂霉素C(Mitomycin)、米托蒽醌(Novantrum)、脂质体多柔比星(Doxil)等。

微管抑制剂的例子包括：长春碱生物碱微管聚合抑制剂，如长春碱(exal)、长春新碱(oncovin)、长春地辛(Fildesin)等；紫杉烷类微管解聚抑制剂，如紫杉醇(taxol)、多西紫杉醇(taxotere)等。

铂制剂的例子包括：奥沙利铂(El Prat)、卡铂(Carboplatin、Carbomerck、Paraplatin)、顺铂(IA-call、Konaburi、Cisplatin等)、奈达铂(Aqupla)等。

拓扑异构酶抑制剂的例子包括：I型拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱及其衍生物(例如伊立替康(Campto)、拓扑替康(HYCAMTIN)、SN-38等)等；II型拓扑异构酶抑制剂，如蒽环霉素药物(如多柔比星(adriacin)等)、表鬼臼毒素药物(如依托泊苷(Lastet、VePesid)等)和喹诺酮药物(如左氧氟沙星(cravit)、环丙沙星(ciproxan)等)。

分子靶向药物的例子包括：瑞格菲尼(Stivarga)、西妥昔单抗(Erbitux)、帕尼单抗(Vectibix)、雷莫芦单抗(Cyramza)、吉非替尼(Iressa)、厄洛替尼(Tarceva)、阿法替尼(GIOTRIF)、克里唑蒂尼(XALKORI)、阿来替尼(ALECENSA)、色瑞替尼、乐伐替尼(Lenvima)、曲妥珠单抗(Herceptin)、拉帕替尼(Tykerb)、帕妥珠单抗(PERJETA)、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nexavar)、阿西替尼(Inlyta)、帕唑帕尼(Votriento)、纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗、伊匹单抗(YERVOY)、维罗非尼(ZELBORAF)、依维莫司(AFINITOR)、替西罗莫司(TORISEL)、利妥昔单抗(Rituxan)、贝伐单抗(Avastin)、格尔德霉素等。

抗癌剂也可以是抗血管生成剂。抗血管生成剂可以是抑制血管内皮生长因子(VEGF)或其他血管生成因子或其受体的抗血管生成剂。抗血管生成剂的具体例子包括：血管抑制素、内皮抑素、转移抑素、抗VEGF抗体(例如Avastin)、VEGFR-2抑制剂(例如SU5416、SU6668)等。

(可检测物质)

在本说明书中，可检测物质是指，使得含有该可检测物质的本发明的缀合物可检测的任何物质。优选地，可检测物质能够使用适当的可视化或成像手段、直接或间接地在体内检测本发明的缀合物。可视化或成像装置的例子包括但不限于：X射线摄影、计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、超声波检查、闪烁扫描、正电子发射断层扫描(PET)、内窥镜检查和腹腔镜检查等。可检测物质可以是，例如，放射性同位素、用于MRI的增强剂(例如，顺磁性离子)、不透射线物质、造影剂、荧光物质等。

用于PET的放射性核素的例子包括：¹⁸F、⁵¹Mn、^52mMn、⁵²Fe、⁵⁵Co、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、^94mTc、¹¹⁰In、¹²⁰I、¹²⁴I等。用于检测γ射线的放射性核素的例子包括：⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁷⁵Se、⁹⁷Ru、^99mTc、¹¹¹In、^114mIn、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁶⁹Yb、¹⁹⁷Hg和²⁰¹Tl等。

优选地，顺磁离子的例子包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)等，特别优选钆。另外，金属如镧(III)、金(III)、铅(II)、铋(III)等也可用于X射线成像等。

不透射线物质和造影剂的例子包括：碘化合物(例如有机碘酸，如碘代羧酸、碘仿、三碘苯酚、四碘乙烯等)、钡化合物(例如硫酸钡等)、镓化合物(例如柠檬酸镓)、铊化合物(如氯化铊)等。

荧光物质的例子包括若丹明、荧光素、Cy染料、Alexa(注册商标)Fluor、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、它们的衍生物等。近红外荧光试剂，如靛蓝(indocyanine)也作为优选的荧光物质的例子。

(本发明的肽与组分的结合)

在本发明的缀合物中，本发明的肽与一种以上组分的结合方式没有特别限制。可以直接或通过接头等间接地结合。结合可以通过共价结合、非共价结合或其组合进行。一种以上组分可以直接或间接地结合在本发明肽的N-末端、C-末端或其他位置。肽与其他组分(或第二肽)的结合是本领域熟知的，并且本发明的缀合物中的结合可以通过任何已知方式进行。

例如，当通过接头结合时，可以使用已知的交联剂，例如NHS酯、酰亚胺酯、马来酰亚胺、碳二亚胺、烯丙基叠氮化物、双吖丙啶、异氰、补骨脂素等。取决于所使用的交联剂，可以适当地修饰本发明的肽。例如，半胱氨酸可以预先添加到本发明肽的C-末端，用于与马来酰亚胺接头结合。

为了将上述放射性金属或顺磁性离子与本发明的肽连接，可以使用合适的螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、4,7,10-四氮杂环十二烷-N-N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)等)和/或金属硫蛋白等。参见，例如，Culali Aktolun等人，“核医学治疗：原理和临床应用(Nuclear Medicine Therapy：Principles and ClinicalApplications)”，Springer，2013等。

3.组合物

本发明还提供含有本发明的肽或缀合物和药学上可接受的载体的组合物(下文中也称为本发明的组合物)。该组合物可以以适于口服或肠胃外给药的剂型提供。

用于肠胃外给药的组合物的例子包括注射剂、栓剂等。注射剂可包括：剂型如静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉滴注等。可以根据已知方法制备这种注射剂。作为制备注射剂的方法，例如，可以通过将本发明的肽或缀合物在通常用于注射的无菌水溶液或油性溶液中溶解、悬浮或乳化，来制备本发明的肽或缀合物。作为注射用水溶液，例如，可以使用生理盐水，含有葡萄糖和其他佐剂的等渗溶液，并且可以与合适的增溶剂如单醇类(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物))等一起使用。作为油性溶液，例如，使用芝麻油、大豆油等，并且可以组合使用苯甲酸苄酯、苯甲醇等作为增溶剂。制备的注射溶液优选填充在合适的安瓿中。可以通过将本发明的肽或缀合物与用于栓剂的常规基质混合，来制备用于直肠给药的栓剂。

用于口服给药的组合物包括例如固体或液体剂型，特别是片剂(包括糖衣片剂、薄膜包衣片剂)、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。这些组合物通过已知方法制备，并可含有通常用于制剂领域的载体、稀释剂或赋形剂。作为片剂的载体和赋形剂，例如，使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。

每种上述组合物可含有其它活性成分，只要与上述肽或缀合物混合不会引起不希望的相互作用即可。

上述肠胃外或口服药物组合物可方便地配制成与活性成分剂量相配的剂量单位形式。用于这种剂量单位的剂型的例子包括片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿剂)和栓剂。肽或缀合物的含量通常优选为每剂量单位形式1～500mg，特别优选1～100mg用于注射，以及10～250mg用于其他剂型。

本发明的组合物可以靶向肿瘤，特别是血管生成性恶性肿瘤，并且优选地可以在肿瘤中积聚肽或缀合物。因此，在缀合物中含有抗癌剂的本发明组合物可用于治疗或预防靶向的恶性肿瘤。在缀合物中含有可检测物质的本发明组合物也可用于检查或诊断恶性肿瘤。

恶性肿瘤(癌症)可以是任何类型的癌症，也可以是实体癌症或液体癌症。作为实体癌，优选列举在细胞表面表达Anxa1的那些，因此列举有生成血管的实体瘤。实体癌的例子包括脑/神经系统的癌症(例如，脑肿瘤、脊髓肿瘤等)、头颈癌(例如，喉癌、口腔癌、唾液腺癌、鼻窦癌、甲状腺癌等)、消化道癌(如胃癌、食道癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、肝癌、胆道癌、胰腺癌等)、泌尿生殖器官癌(例如，肾癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、肾盂和输尿管癌、胆囊癌、胆管癌、睾丸癌、阴茎癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、输卵管癌等)，呼吸系统癌(如肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、转移性肺癌)、支气管癌等)、乳腺癌、皮肤癌(例如，恶性黑素瘤等)、骨癌(例如，骨肉瘤等)、肌肉癌(例如，横纹肌肉瘤等)等。

作为液体癌症，可以提及白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等。作为白血病，可以列举急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病等。恶性淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤的例子包括：B细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等。

由于本发明的肽或缀合物可以有效地穿过血脑肿瘤屏障，因此可以列举脑肿瘤作为特别优选的靶标。脑肿瘤可以是原发性脑肿瘤或转移性脑肿瘤。脑肿瘤也可以是良性脑肿瘤(例如，脑膜瘤、垂体腺瘤、神经鞘瘤等)或恶性脑肿瘤，优选恶性脑肿瘤。恶性脑肿瘤的例子包括：2级脑肿瘤，如星形细胞瘤、少突神经胶质瘤；3级脑肿瘤，如间变性星形细胞瘤、间变性少突神经胶质瘤、间变性少突星形细胞瘤；以及4级脑肿瘤，如胶质母细胞瘤。

本发明的组合物可以施用于表达膜联蛋白A1的动物，特别是哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于：实验动物，如啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和兔等；家畜，如猪、牛、山羊、马、绵羊、貂等；宠物，如狗、猫等；灵长类动物，如人类、猴子、猕猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等。

本发明组合物的剂量也根据给药目的、给药对象、靶标疾病、病症、给药途径等而变化。例如，当用于治疗或预防上述癌症时，方便的是每周一次静脉内或口服施用含有抗癌剂的本发明的缀合物，通常以每公斤体重0.1～10mg作为单剂量。或者，当用于测试或诊断上述癌症时，方便的是在测试之前静脉内或口服施用含有可检测物质的本发明的缀合物，通常以约0.1～10mg/kg体重。

[实施例]

通过参考实施例等，在以下更详细地描述本发明，但本发明不受以下实施例等的限制。

(实验动物的准备)

在添加有10％胎牛血清、高浓度葡萄糖和抗生素的DMEM培养基(Dulbecco’sModified Eagles Medium)中培养大鼠神经胶质瘤C6细胞。在Sanford-Burnham-Prebys医学发现研究所的Virus Core Facility制备慢病毒载体PGK-Luc。用PGK-Luc慢病毒感染C6细胞和B16细胞，并产生荧光素酶阳性细胞。使用立体定向框架，将C6-Luc细胞(悬浮在4μlPBS中的4.8×10⁴个细胞)注射到C57BL/6小鼠的脑纹状体中。两天后，对小鼠进行针对表达荧光素酶的肿瘤的成像。为此，将100μl荧光素(30mg/ml PBS)注入腹膜腔，小鼠用异氟烷气体(20ml/min)与氧气(1ml/min)麻醉并置于配有Xenogen IVIS 200成像仪的照相机下。测量光子数1～10秒。对于双肿瘤模型，将C6-Luc细胞类似地注射到NOD-SCID小鼠的脑中，并通过Xenogen成像仪监测肿瘤生长。

当脑肿瘤变得可检测时，将C6-Luc细胞(悬浮于100μl PBS中的2×10⁵个细胞)皮下注射到同一小鼠的背侧。使用Xenogen成像仪测量脑肿瘤和皮下肿瘤中的光子数。还使用B16-Luc细胞制备相同品系C57BL/6小鼠的双肿瘤模型。如上所述，对于C6-Luc细胞，将B16-Luc细胞(5×10⁴个细胞)注射到8至10周龄的C57BL/6雌性小鼠的脑中。当脑中的B16-Luc肿瘤变得可检测时，皮下注射B16-Luc细胞(2×10⁵个细胞)。

检测实施例1：IF7对荷瘤小鼠的给药实验

将IF7(即具有IFLLWQR(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的L型肽)静脉施用于荷瘤小鼠。到达肿瘤周围的血管后，IF7从血管内皮细胞的腔侧进入囊泡，移至基底侧并释放到有癌细胞的基质中。

即使在小鼠血管内皮F2细胞中，IF7与Anxa1结合，通过转胞吞作用主动穿过肿瘤血管内皮细胞。因此，认为IF7具有穿过脑肿瘤中血管-脑肿瘤屏障的活性。

令人惊讶的是，当将荧光标记的IF7静脉内注射到移植有神经胶质瘤细胞的脑肿瘤模型小鼠中时，在脑肿瘤部位观察到高浓度的荧光积累(图1和2)。此外，荧光穿过血管并到达脑基质中的癌细胞。

检测实施例2：IF7-SN38对双肿瘤模型的给药实验

使用有皮下肿瘤和脑肿瘤的小鼠(双肿瘤模型)验证了IF7-SN38的治疗效果。实验如下进行。

当脑肿瘤的光子数>1.0×10⁶时(通常发生在2周后)，IF7C(RR)-SN38通过尾静脉注射到荷瘤小鼠中。将IF7C(RR)-SN38(14.2mg或6.63mmol)溶于100μl的二甲基亚砜(DMSO)中，用聚氧乙烯蓖麻油EL(聚氧乙烯蓖麻油EL)的50％乙醇溶液(10μl)稀释1μL的该溶液(142mg或66.3nmol)，进一步加入90μl的PBS。每次注射的IF7C(RR)-SN38量为142mg/小鼠或7.1mg/kg。类似地制备的IF7或RQ7C(RR)-SN38的反向序列用作对照。以伊立替康溶解在PBS中和纯PBS用作阴性对照。

结果是，脑肿瘤和皮下肿瘤都被抑制，并且其在脑肿瘤中的作用高于在皮下肿瘤中的作用(图3和4)。在B16黑素瘤转移性脑肿瘤模型中获得了类似的结果，并且，即使将宿主小鼠改变为C57BL/6或SCID品系，结果也没有改变。这些事实表明，与肿瘤细胞类型和小鼠品系无关，靶向Anxa1的DDS不仅有效地穿过血脑肿瘤屏障，而且在脑肿瘤中提供了优异的治疗效果。

检测实施例3：IF7的药代动力学研究

如在检测实施例1和2中所证明的，IF7具有优异的恶性肿瘤靶向活性。然而，就临床开发而言，存在两点问题：溶解性差和稳定性低。换言之，IF7肽对蛋白酶敏感并且易于降解。事实上，在包括向健康小鼠静脉施用A488-IF7的实验中，外周血的荧光信号在约1小时内差不多消失(图5)。然而，通过对荷瘤小鼠进行尾静脉给药，从外周血中回收的A488-IF7的荧光显著低于健康小鼠。该结果表明，大部分A488-IF7在肿瘤中迅速积累同时发生降解。此外，IF7具有高疏水性并且导致形成剂型困难，例如，需要在DMSO中溶解后添加表面活性剂，以在静脉内施用与抗癌药物结合的化合物时避免沉淀。

实施例1：dTIT7肽的识别

本发明人认为，一旦克服了与IF7相关的上述弱点就可以创造更优异的治疗剂，并开始开发由新序列组成的下一代肽。

作为该研究基础的技术是筛选噬菌体文库的方法，该噬菌体文库表面展示约10亿(20⁷种)由7个氨基酸残基组成的随机肽。构成活生物体的所有氨基酸都是L-型氨基酸，除了一些例外。因此，不可能通过常规噬菌体文库筛选获得与靶标结合的D-型肽的序列。因此，使用T7噬菌体文库重新进行了镜像筛选(Funke等，Mol.Biosystem.2009，783-6)(图6)。

基于以下发现和假设进行筛选，以获得对Anxa1具有高结合亲和力的噬菌体。已经阐明，IF7与Anxa1的N末端的15个残基(MAMVSEFLKQAWFIE；SEQ ID NO:11)相互作用，以及IF7与添加了用于修饰Axna1的N-末端15个残基的Cys残基的具有16个残基的L-肽(L-MC16)结合(Sasai等，未发表)。首先，合成与L-MC16呈镜像关系的D-MC16(全部16个碱基为D-型)，通过使用T7噬菌体文库筛选，识别与D-MC16结合的7个氨基酸(L-型TIT7肽)。基于获得的序列，合成由D-型氨基酸组成的TIT7肽(dTIT7)。预期该dTIT7肽可与Anxa1结合。

当分析噬菌体展示的肽序列时，通常通过将各种突变引入肽序列来优化序列。目前，通过将获得的噬菌体组应用于下一代DNA测序仪，可以从不少于10,000个候选肽的序列中一次评估和鉴定最佳肽序列。

分析结果显示，作为与Anxa1的N末端部分结合的序列，以TIT(苏氨酸-异亮氨酸-苏氨酸)开头的7个氨基酸的出现频率高，并且其中TIT7序列“TITWPTM”(SEQ ID NO：12)很突出。虽然TIT7的部分序列的频率也出现在高排名位置，但没有发现TIT7的序列替代。另外，TIT7的肽由完全不同于IF7序列(IFLLWQR；SEQ ID NO：10)的新序列组成。

上述结果表明，成功获得了七个氨基酸(全部由D-型氨基酸组成)的直链肽TIT7。

此外，当通过QCM方法测量dTIT7和Anxa1之间的分子间相互作用时，解离常数(Kd值)为4.57×10^-8M。

如图6D所示，除了TIT7序列(SEQ ID NO：12)之外，还经常出现序列为LRFPTVL(SEQID NO：13)、SPTSLLF(SEQ ID NO：14)、MPTLTFR(SEQ ID NO：15)、LKGMLRI(SEQ ID NO：16)和LLSWPSA(SEQ ID NO：17)的肽，并且，在10⁹种的大量随机肽中，这六种肽占整体的约50％。

实施例2：dTIT7肽的脑肿瘤靶向能力

制备用近红外荧光试剂IRDye 800CW标记的dTIT7(IRDye-dTIT7)。准备脑肿瘤裸鼠模型，在该模型中，大鼠神经胶质瘤被移植到小鼠的脑中，并通过小鼠的尾静脉注射IRDye-dTIT7。结果是，通过体内成像观察到IRDye-dTIT7在脑肿瘤模型小鼠的肿瘤部位积聚(图7)。

实施例3：结合dTIT7的抗癌剂对脑肿瘤模型的抗肿瘤作用

接下来，讨论dTIT7-抗癌剂缀合物对脑肿瘤模型小鼠的作用。

抗癌药物格尔德霉素与dTIT7肽结合的GA-dTIT7(图8)对蛋白酶和酯酶都具有抗性，并且认为GA-dTIT7在体内更稳定。每1天或每2天将GA-dTIT7以推荐剂量的1/10倍(以摩尔数计)静脉内施用于荷瘤小鼠(黑色素瘤B16细胞，皮下施用)。结果是，肿瘤生长被显著抑制，并且，通过组织病理学观察，观察到施用了GA-dTIT7的小鼠的肿瘤部位大量坏死。该效果有力表明，dTIT7优于需要连续给药的IF7(Hatakeyama等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，108：19587-92，2011)。

更令人惊讶的是，当将GA-dTIT7口服施用于移植B16细胞到脑中的脑肿瘤模型时，观察到肿瘤消退，即使停止给药后肿瘤仍继续减少，最后，在4只小鼠中的2只中观察到完全治愈(图9)。在使用C6细胞的脑肿瘤模型中也观察到类似的治疗效果。这表明，作为可以口服给药的抗癌剂，GA-dTIT7可以导致脑肿瘤的完全治愈。

实施例4：dLRF7、dSPT7、dMPT7和dLLS7肽与Anxa1之间的分子间相互作用

除实施例1中描述的TIT7序列(SEQ ID NO：12)外，对于出现频率高的LRFPTVL(SEQID NO：13)、SPTSLLF(SEQ ID NO：14)、MPTLTFR(SEQ ID NO：15)和LLSWPSA(SEQ ID NO：17)的序列的肽，与dTIT7肽类似，合成由D-型氨基酸组成的肽(dLRF7、dSPT7、dMPT7和dLLS7肽)，并通过以下方法测量每种肽与Anxa1的分子间相互作用。

将传感器芯片用水虎鱼溶液洗涤两次5分钟，然后在0.9mM的羟基-EG3-十一硫醇(Dojindo)和0.1mM的氨基-EG6-十一烷硫醇(Dojindo)的溶液中浸泡过夜。用水洗涤后，用1mM的GMBS(Dojindo)处理芯片，并在室温下温育1小时。洗去剩余的GMBS后，将1mM肽溶液加到芯片上，并将芯片温育30分钟。将结合肽的传感器芯片置于QCM装置(Single-Q，ASONE)中，并向孔中加入0.5ml PBS。将各种剂量的Anxa1注射到反应室中，测定每种肽的结合亲和力(kd值)。

结果是，所有测试的肽都显示出与Anxa1的阳性结合(表1和图11)。

[表1]

合成肽的名称	kd值(M)
		dLRF7	3.119x10<sup>-8</sup>
dSPT7	9.029x10<sup>-8</sup>
		dMPT7	2.982x10<sup>-7</sup>
dLLS7	5.418x10<sup>-8</sup>

实施例5：dLRF7、dSPT7、dMPT7和dLLS7肽的脑肿瘤靶向能力

化学合成末端添加半胱氨酸延伸的DLRF7、dSPT7、dMPT7和dLLS7肽。然后，通过半胱氨酸残基将每种肽与近红外荧光染料IRDye 800CW马来酰亚胺(Li-Cor)连接。通过HPLC纯化得到的肽缀合物，然后冻干。将每种肽-IRDye缀合物溶解在DMSO和6％的葡萄糖中，并以100μl/小鼠静脉内注射到脑肿瘤模型裸鼠中。24小时后，通过IVIS光谱(Perkin Elmer)测量荧光图像。

结果是，除了注射dLLS7的那些小鼠之外，所有小鼠都在脑肿瘤部位呈现强烈的IRDye信号，并且除了dLLS7之外的三种肽dLRF7、dMPT7和dSPT7通过脉管系统途径显示出脑肿瘤靶向能力(图12)。

本申请以在日本提交的专利申请No.2016-159743(申请日：2016年8月16日)为基础，其全部内容并入本文。

序列表

<110> 国立研究开发法人产业技术总合研究所(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)

<120> 恶性肿瘤靶向肽

<130> 092619

<140> PCT/JP2017/030003

<141> 2017-08-16

<150> JP 2016-159743

<151> 2016-08-16

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 肿瘤靶向肽

<400> 1

Met Thr Pro Trp Thr Ile Thr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 肿瘤靶向肽

<400> 2

Leu Val Thr Pro Phe Arg Leu

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 肿瘤靶向肽

<400> 3

Ala Ser Pro Trp Ser Leu Leu

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 肿瘤靶向肽

<400> 4

Phe Leu Leu Ser Thr Pro Ser

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 肿瘤靶向肽

<400> 5

Arg Phe Thr Leu Thr Pro Met

1 5

<210> 6

<211> 1556

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

acttgtttca ctttgttttt ggacatagct gagccatgta cttcaaacag aaggcagcca 60

attactaact tctggttgct aggtgtggct tcctttaaaa tcctataaaa tcagaagccc 120

aagtctccac tgccagtgtg aaatcttcag agaagaattt ctctttagtt ctttgcaaga 180

aggtagagat aaagacactt tttcaaaaat ggcaatggta tcagaattcc tcaagcaggc 240

ctggtttatt gaaaatgaag agcaggaata tgttcaaact gtgaagtcat ccaaaggtgg 300

tcccggatca gcggtgagcc cctatcctac cttcaatcca tcctcggatg tcgctgcctt 360

gcataaggcc ataatggtta aaggtgtgga tgaagcaacc atcattgaca ttctaactaa 420

gcgaaacaat gcacagcgtc aacagatcaa agcagcatat ctccaggaaa caggaaagcc 480

cctggatgaa acactgaaga aagcccttac aggtcacctt gaggaggttg ttttagctct 540

gctaaaaact ccagcgcaat ttgatgctga tgaacttcgt gctgccatga agggccttgg 600

aactgatgaa gatactctaa ttgagatttt ggcatcaaga actaacaaag aaatcagaga 660

cattaacagg gtctacagag aggaactgaa gagagatctg gccaaagaca taacctcaga 720

cacatctgga gattttcgga acgctttgct ttctcttgct aagggtgacc gatctgagga 780

ctttggtgtg aatgaagact tggctgattc agatgccagg gccttgtatg aagcaggaga 840

aaggagaaag gggacagacg taaacgtgtt caataccatc cttaccacca gaagctatcc 900

acaacttcgc agagtgtttc agaaatacac caagtacagt aagcatgaca tgaacaaagt 960

tctggacctg gagttgaaag gtgacattga gaaatgcctc acagctatcg tgaagtgcgc 1020

cacaagcaaa ccagctttct ttgcagagaa gcttcatcaa gccatgaaag gtgttggaac 1080

tcgccataag gcattgatca ggattatggt ttcccgttct gaaattgaca tgaatgatat 1140

caaagcattc tatcagaaga tgtatggtat ctccctttgc caagccatcc tggatgaaac 1200

caaaggagat tatgagaaaa tcctggtggc tctttgtgga ggaaactaaa cattcccttg 1260

atggtctcaa gctatgatca gaagacttta attatatatt ttcatcctat aagcttaaat 1320

aggaaagttt cttcaacagg attacagtgt agctacctac atgctgaaaa atatagcctt 1380

taaatcattt ttatattata actctgtata atagagataa gtccattttt taaaaatgtt 1440

ttccccaaac cataaaaccc tatacaagtt gttctagtaa caatacatga gaaagatgtc 1500

tatgtagctg aaaataaaat gacgtcacaa gacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1556

<210> 7

<211> 346

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly Gly Pro

20 25 30

Gly Ser Ala Val Ser Pro Tyr Pro Thr Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val

35 40 45

Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr

50 55 60

Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile

65 70 75 80

Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu

85 90 95

Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu

100 105 110

Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys

115 120 125

Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Thr Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg

130 135 140

Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp Ile Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu

145 150 155 160

Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe

165 170 175

Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu Ala Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe

180 185 190

Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp Ser Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu

195 200 205

Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly Thr Asp Val Asn Val Phe Asn Thr Ile

210 215 220

Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro Gln Leu Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr

225 230 235 240

Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp Met Asn Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu

245 250 255

Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys Leu Thr Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr

260 265 270

Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala Glu Lys Leu His Gln Ala Met Lys Gly

275 280 285

Val Gly Thr Arg His Lys Ala Leu Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser

290 295 300

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305 310 315 320

Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile Leu Asp Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu

325 330 335

Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys Gly Gly Asn

340 345

<210> 8

<211> 1395

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

gtctgaaacc atctgagcag agtctctctt cagtccccgg gaagacaagc aaatacaaag 60

atacttctct aaaaatggca atggtatcag aattcctcaa gcaggcccgt tttcttgaaa 120

atcaagaaca ggaatatgtt caagctgtaa aatcatacaa aggtggtcct gggtcagcag 180

tgagccccta cccttccttc aatgtatcct cggatgttgc tgccttgcac aaagctatca 240

tggttaaagg tgtggatgaa gcaaccatca ttgacattct taccaagagg accaatgctc 300

agcgccagca gatcaaggcc gcgtacttac aggagaatgg aaagcccttg gatgaagtct 360

tgagaaaagc ccttacaggc cacctggagg aggttgtttt ggctatgcta aaaactccag 420

ctcagtttga tgcagatgaa ctccgtggtg ccatgaaggg acttggaaca gatgaagaca 480

ctctcattga gattttgaca acaagatcta acgaacaaat cagagagatt aatagagtct 540

acagagaaga gctgaaaaga gatctggcca aagacatcac ttcagataca tctggagact 600

ttcggaaagc cttgcttgct cttgccaagg gtgaccgttg tcaggacttg agtgtgaatc 660

aagatttggc tgatacagat gccagggctt tgtatgaagc tggagaaagg agaaagggga 720

cagacgtgaa cgtcttcacc acaattctga ccagcaggag ctttcctcat cttcgcagag 780

tgtttcagaa ttacggaaag tacagtcaac atgacatgaa caaagctctg gatctggaac 840

tgaagggtga cattgagaag tgcctcacaa ccatcgtgaa gtgtgccacc agcactccag 900

ctttctttgc cgagaagctg tacgaagcca tgaagggtgc cggaactcgc cataaggcat 960

tgatcaggat tatggtctcc cgttcggaaa ttgacatgaa tgaaatcaaa gtattttacc 1020

agaagaagta tggaatctct ctttgccaag ccatcctgga tgaaaccaaa ggagactatg 1080

aaaaaatcct ggtggctctg tgtggtggaa actagacatc ccaactattc tgcaaggttc 1140

tgaggagaat gtctcttagc tgttttcctt cgatggcatg ggcttaagta ggaaagttgc 1200

tttggcagat aagtctaatt acctgctttg aataatatag cctataaata gattttacat 1260

cattactctg tacaatagag aaatacttgt tttgttaatt atgtttatcc caaattataa 1320

agccccataa gcaagtcact ttggtaccat tcctgagaaa gaagtttaca tataataaaa 1380

taaaacaatt ttata 1395

<210> 9

<211> 346

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Arg Phe Leu Glu Asn

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Gln Glu Gln Glu Tyr Val Gln Ala Val Lys Ser Tyr Lys Gly Gly Pro

20 25 30

Gly Ser Ala Val Ser Pro Tyr Pro Ser Phe Asn Val Ser Ser Asp Val

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Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr

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Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe

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Ala Gly Thr Arg His Lys Ala Leu Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser

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<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 肿瘤靶向肽

<400> 10

Ile Phe Leu Leu Trp Gln Arg

1 5

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> TIT7序列

<400> 12

Thr Ile Thr Trp Pro Thr Met

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 随机肽

<400> 13

Leu Arg Phe Pro Thr Val Leu

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 随机肽

<400> 14

Ser Pro Thr Ser Leu Leu Phe

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 随机肽

<400> 15

Met Pro Thr Leu Thr Phe Arg

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 随机肽

<400> 16

Leu Lys Gly Met Leu Arg Ile

1 5

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 随机肽

<400> 17

Leu Leu Ser Trp Pro Ser Ala

1 5

Claims

1.一种肽，其由以下(i)所示的氨基酸序列组成，在以下序列中，紧接有符号[D]的各个氨基酸符号是所述氨基酸的D型：

(i)氨基酸序列C[D]T[D]I[D]T[D]W[D]P[D]T[D]M[D]。

2.一种缀合物，其包含权利要求1所述的肽，和一种以上的其他组分，所述其他组分包含抗癌剂和/或可检测物质，所述可检测物质是放射性同位素、MRI增强剂、不透射线物质、造影剂或荧光物质，所述荧光物质是若丹明、荧光素、Cy染料、AlexaFluor、藻红蛋白、别藻蓝蛋白或近红外荧光试剂。

3.如权利要求2所述的缀合物，其中，所述抗癌剂选自：代谢拮抗剂、烷化剂、抗癌抗生素、微管抑制剂、铂制剂、拓扑异构酶抑制剂、分子靶向性剂和抗血管生成剂。

4.如权利要求2或3所述的缀合物，其中，所述抗癌剂选自：依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、八磷酸阿糖胞苷、替加氟、UFT、TS-1：T-S-One、去氧氟尿苷、奈拉滨、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、甲氨蝶呤；

放线菌素D、阿克拉霉素、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁斯酯、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌；

喜树碱、伊立替康、拓扑替康、SN-38、依托泊苷、左氧氟沙星、环丙沙星；

血管抑制素、内皮抑素、转移抑素、抗VEGF抗体和VEGFR-2抑制剂。

5.如权利要求2所述的缀合物，其中，所述可检测物质选自：

放射性核素，选自：¹⁸F、⁵¹Mn、^52mMn、⁵²Fe、⁵⁵Co、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、^82mRb、⁸³Sr、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、^94mTc、¹¹⁰In、¹²⁰I、¹²⁴I、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁷⁵Se、⁹⁷Ru、^99mTc、¹¹¹In、^114mIn、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁶⁹Yb、¹⁹⁷Hg和²⁰¹Tl；

顺磁离子，选自：铬、锰、铁、钴、镍、铜、钕、钐、镱、钆、钒、铽、镝、钬和铒，

镧、金、铅、铋；

碘化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物。

6.一种组合物，其包含权利要求1所述的肽或权利要求2所述的缀合物，以及药学上可接受的载体。

7.一种用于治疗癌症的组合物，其包含权利要求3或4所述的缀合物，和药学上可接受的载体。

8.一种用于诊断癌症的组合物，其包含权利要求3或4所述的缀合物，和药学上可接受的载体。