CN109562166B - 一种眼用药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

一种眼用药物组合物，其包含能够拮抗抑制血管内皮生长因子与其受体结合的抗体或其衍生体，以及用于眼科治疗剂的一种或多种药学上可接受的辅料，所述抗体或其衍生体的轻链抗原互补决定区具有选自如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；其重链抗原互补决定区具有选自如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，以及该眼用药物组合物在制备用于治疗与血管生成相关的眼部疾病或病症的药物中的用途。

Description

一种眼用药物组合物及其用途

技术领域

本发明属于生物技术-单克隆抗体领域，具体地，本发明涉及一种眼用药物组合物及其用途。

背景技术

血管新生或增生(angiogenesis)在生物学上是指体内已存在的血管(如毛细血管和微小动、静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。

血管新生在维持机体许多正常生理过程如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的；但过度的血管新生或增生也会导致机体发生病变。如体内如肿瘤的增生扩散转移与复发、老年黄斑变性(又称年龄相关性黄斑变性，age-related maculardegeneration，AMD)眼底病、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)、炎症反应及自身免疫疾病等都与血管新生或增生密切相关。

体内血管能够增生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有不断分裂增生及定向迁移植入已有的血管管壁的能力。目前已知的最重要及最强烈的促血管内皮细胞分裂新生或血管增生的物质是血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)。VEGF又称为血管渗透因子(vascular permeability factor，VRF)，编码VEGF/VRF蛋白的cDNA已由两研究组于1989年同时在美国Science杂志上公开报道。

VEGF通过特异性地与血管内皮细胞上的VEGF受体(VEGF-R1，VEGF-R2)结合而发挥促血管内皮细胞生长迁移、血管新生及增加血管通透性的作用。VEGF及其受体介导的血管增生之重要性已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被充分证实：因为只要当VEGF基因中的一份被敲除后，小鼠胚胎在仅发育至11至12天时就会因血管增生受阻及异常而死亡。

VEGF及其受体介导的促血管新生及促血管渗透在老年黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿等致盲性眼底疾病的发生与病理进展中也起着关键的作用。老年黄斑变性大多发生于50多岁以上，患病率随年龄增长而增高，该病的临床症状表现为中心视力减退、病程进展迅速，是导致老年人失明的重要疾病。而糖尿病性黄斑水肿则是当今危害数以千万计的中年工薪阶层(working-class)视力的重大疾病。

老年黄斑变性及糖尿病性黄斑水肿的主要病理表现为黄斑及周边组织萎缩变性、视细胞破坏、玻璃膜疣形成，严重者发生渗出性黄斑变性，伴随视网膜下新生血管形成、出血以及渗出。以往对老年黄斑变性及糖尿病性黄斑水肿等致盲性眼底疾病常采用激光治疗和光动力治疗手段，虽可暂时缓解症状，但复发率高，且并不能阻止病程进展。

2005年以来，临床上采用各种VEGF抑制剂来治疗渗出性黄斑变性及糖尿病性黄斑水肿，均取得比较理想的疗效，现已被美国国家眼科研究所(National Eye Institute，NEI)推荐为常规疗法。

到目前为止，经美国FDA批准用于治疗血管新生相关眼底疾病的VEGF抑制剂上市药物主要包括以下三大类：

(一)哌加他尼钠注射液(Pegaptanib，商品名为Macugen)，由美国Eyetech制药公司(Eyetech Pharmaceuticals,Inc.)和辉瑞公司(Pfizer Inc.)合作开发，于2004年12月获美国FDA批准上市。哌加他尼钠为PEG修饰的单链RNA类似物，其独特的三维结构使其能特异结合VEGF并抑制VEGF的活性。

(二)拮抗VEGF的抗体或抗体衍生物。目前该类药物中获美国FDA批准上市的仅有Genentech公司开发的雷珠单抗(Ranibizumab，中文商品名：诺适得，英文商品名：Lucentis)，用于治疗包括老年黄斑变性及糖尿病性黄斑水肿等致盲性眼底疾病。雷珠单抗与Genentech公司早先开发上市的适应症为治疗多种肿瘤的另一个抗体药物贝伐珠单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)药物同源：两者都是由鼠源单抗A4.6.1衍生而来，其可变区同源性在99％以上。贝伐单抗是全长抗体，分子量约149kd，而雷珠单抗是Fab片段，分子量约48kd。与Avastin一样，雷珠单抗可与VEGF高亲和力结合，竞争性阻断VEGF信号通路，抑制新生血管形成及促进黄斑区渗液吸收。Genentech公司发起的临床研究表明患者接受雷珠单抗治疗2年后，95％的“湿性”AMD患眼的视力稳定或提高。凭此优异疗效，雷珠单抗于2006年6月获美国FDA批准上市。雷珠单抗其后在美国进一步获批用于治疗糖尿病性黄斑水肿、视网膜静脉阻塞继发黄斑水肿、病理性近视继发脉络膜新生血管等多个适应症，雷珠单抗目前已成为治疗AMD等与血管新生相关眼底疾病的主流药物。

在中国，雷珠单抗于2011年获中国药监局批准上市用于治疗AMD。

(三)VEGF受体-Fc融合蛋白。该类药物由VEGF受体胞膜外区与人免疫球蛋-Fc段融合而成，其代表性药物为美国再生元(Regeneron)公司开发的阿柏西普(Aflibercept，商品名：Eylea)。阿柏西普由VEGF-R1受体胞膜外区第2结构域、VEGF-R2胞膜外区第3结构域、人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合而成。VEGF-Trap与VEGF的亲和力高于其受体与配体的自然亲和力，可竞争性阻抑人体内的VEGF-R与VEGF的结合。阿柏西普自2011年以来已先后获美国FDA批准用于治疗包括老年黄斑变性及糖尿病性黄斑水肿等致盲性眼底疾病，且目前在临床适应症的获批范围及全球多个市场销售领域都在赶超雷珠单抗。

中国成都康宏药业集团股份有限公司开发的康柏西普(Conbercept)也是VEGF受体-Fc融合蛋白。康柏西普在药物结构上与阿柏西普非常相似，由VEGF-R1胞膜外第2结构域、VEGF-R2胞膜外第3和4结构域、人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合而成。康柏西普于2013年获中国CFDA批准用于治疗老年眼底黄斑变性等疾病，目前也正在美国开展临床III期研究。

综上所述，目前世界范围内正式获批用于治疗AMD/DME等眼底疾病的VEGF抑制剂类药物均属VEGF单抗的Fab片段或VEGF受体-抗体Fc融合蛋白。单抗-Fab片段如雷珠单抗因其分子量较小，眼底注射后具有易快速穿透到病灶而发挥药效的优点；但单抗-Fab片段在眼内半衰期仅为2-3天，短于完整的抗体,从而增加了给药次数和患者的经济负担。VEGF受体-Fc融合蛋白药物如阿柏西普及康柏西普因其与配体结合亲和力高于其天然受体(VEGFR-1，VEGFR-2)；且眼底注射后，其在眼内半衰期为3-5天，稍长于雷珠单抗，故具有药效高、用药频率低等优点。但阿柏西普及康柏西普因其同时还可与VEGF-B、VEGF-C、PLGF(Placental growth factor)等其他生长因子结合，从而增加了与治疗目的(特异性阻断VEGF介导)不一致的药物不良反应发生的潜在风险。

与Fab片段或Fc融合蛋白相比，完整的、全长的抗体如Avastin兼具Fab段和Fc段双重优势，具有体内半衰期长、用药频率低等优势，临床上可望以更少的剂量或更低的注射频率用于治疗AMD/DME等血管新生性眼病。近年来临床前及临床研究结果数据均显示，全长抗体Avastin用于治疗AMD/DME的效果其实并不亚于雷珠单抗或阿柏西普。但Avastin并未获FDA或其他国家的药监部门批准用于治疗恶性肿瘤之外的其他适应症如眼科适应症；Avastin在治疗AMD/DME的眼科使用属于“非标签使用”或“标签外使用”。用于治疗肿瘤适应症的药物和用于治疗AMD/DME等眼科适应症药物在药物配方、剂量、制造与检测放行标准及产品包装等都有很多不同之处。用于治疗AMD/DME等眼科适应症药物需眼底注射，药物除需严格保持无菌之外，其pH及渗透压应接近于泪液，且不溶性微粒物质要求控制在非常低的数量下；而用于治疗肿瘤的Avastin在其制造及包装上并没有考虑眼科用药的这些特点与要求。此外，临床上患者或医生为了降低眼底注射用药的成本费用，更是常将大包装规格的Avastin(每瓶规格为4ml,或20ml)分装成小份供患者分享使用，患者接受眼底注射分装的药物后常发生感染或炎症的安全风险。

抗血管增生药物治疗AMD/DME的市场惠及千万个患者，且患者需常年或反复多次给药，现仅有的抗血管增生眼科药物雷珠单抗、阿柏西普及康柏西普还未满足市场需求；而另一方面，目前上市的这三个药物也不是对所有的AMD/DME患者都有疗效。因此，临床上及市场上也都仍然需要再研发出新的或更安全有效的抗血管增生眼科药物。

发明内容

本发明提供了一种眼用药物组合物，其包含能够拮抗抑制血管内皮生长因子与其受体结合的抗体或其衍生体，以及用于眼科治疗剂的一种或多种药学上可接受的辅料，所述抗体或其衍生体的轻链抗原互补决定区具有选自如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列；其重链抗原互补决定区具有选自如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。在所述眼用药物组合物的一个优选实施方案中，其中所述抗体或其衍生体的轻链可变区具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，其重链可变区具有SEQID NO：8所示的氨基酸序列。其中，SEQ ID NO：1-8如下表所示：

表1：氨基酸序列

在所述眼用药物组合物的一个优选实施方案中，基于所述眼用药物组合物的总体积，其中所述一种或多种药学上可接受的辅料含有0.01-0.15％(m/v,g/ml)的选自聚山梨醇酯(吐温)、聚乙二醇、丙二醇及它们的组合中的至少一种的有机共溶剂；和1-10％(m/v,g/ml)的选自蔗糖、山梨醇、甘油、海藻糖和甘露醇中的至少一种的稳定剂。

优选地，基于所述眼用药物组合物的总体积，所述一种或多种药学上可接受的辅料含有0.01-0.02％(m/v,g/ml)的聚山梨醇酯和7-9％(m/v,g/ml)的蔗糖。

优选地，基于所述眼用药物组合物的总体积，所述一种或多种药学上可接受的辅料含有0.03-0.04％(m/v,g/ml)的聚山梨醇酯和0-5％(m/v,g/ml)的蔗糖

在所述眼用药物组合物的一个优选实施方案中，其中所述抗体或其衍生体在所述制剂中的蛋白浓度为0.1-50mg/ml。

优选地，其中所述抗体或其衍生体在所述药物组合物中的蛋白浓度为1-10mg/ml。

优选地，所述眼用药物组合物的渗透压为285-310mOsmol/kg，优选300mOsmol/kg。

优选地，所述眼用药物组合物的pH值为5.5-6.5，更优选pH值为6.0。

本发明还提供了上述眼用药物组合物在制备用于治疗与血管生成相关的眼部疾病或病症的药物中的用途。

在所述用途中，其中所述与血管生成相关的眼部疾病或病症选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、病理性近视继发脉络膜新生血管、新生血管性青光眼、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜血管阻塞、特发性脉络膜视网膜炎、眼组织胞浆菌病、眼部肿瘤、眼外伤、脉络膜新生血管形成、囊性黄斑水肿、角膜新生血管形成、角膜移植、和慢性结膜炎中的一种或多种。

在所述用途中，其中所述与血管生成相关的眼部疾病或病症的结果包括选自平均脉络膜血管新生渗漏减少、平均视力改善、平均中央凹视网膜厚度减少、平均黄斑大小减少和平均损伤大小减少中的一种或多种的症状改善。

在所述用途中，其中所述眼用药物组合物的使用剂量为0.005mg/50μL/眼至2mg/50μL/眼，更优选的使用剂量为0.05mg/50ul/眼至0.5mg/50ul/眼。

优选地，其中所述眼用药物组合物的施用方式为通过玻璃体内注射。

优选地，其中所述眼用药物组合物的施用时间为每间隔1至3个月施用一次。

本发明还提供了一种治疗受试者的与血管生成相关的眼部疾病或病症的方法，其包括向受试者眼内局部施用上述眼用药物组合物。

在所述方法中，其中，所述与血管生成相关的眼部疾病或病症选自年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性视网膜病变，脉络膜新生血管形成(CNV)，囊性黄斑水肿，糖尿病性黄斑水肿，视网膜血管闭塞，角膜新生血管形成，角膜移植，新生血管性青光眼和慢性结膜炎，优选为年龄相关性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变。

优选地，所述治疗的结果包括选自平均脉络膜血管新生渗漏减少、平均视力改善、平均中央凹视网膜厚度减少、平均黄斑大小减少和平均损伤大小减少中的一种或多种的症状改善。

优选地，所述眼用药物组合物的施用剂量为0.05mg/50μL/眼至0.5mg/50μL/眼。

优选地，所述施用为单次或多次施用。

优选地，所述眼用药物组合物的施用方式为通过玻璃体内注射。

优选地，所述眼用药物组合物的施用时间为每间隔1至3个月施用一次。

本文所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所采用的术语“人源化单克隆抗体”系将鼠源单克隆抗体的氨基酸序列除保留互补决定区(complementarity-determining regions，CDR)外，其它序列(包括可变区中的框架区序列)全部或大部分替换成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以达到通过基因工程手段最大限度地降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性。

本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(Framework regions，FR)。抗体重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。抗体恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性(antibody-dependent cellularcytotoxicity，ADCC)或补体介导毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)。

本发明提供的眼用药物组合物含有药学上有效量的如本发明中描述的人源化抗体或其衍生体以及药学上可接受的合适载体及其他组分，使该生物制剂符合眼科用制剂的特殊剂量规格及技术要求。其中技术要求的一大指标是该眼科用制剂渗透压应与泪液等渗，且不含或含极少量的不溶性颗粒物质，以用于眼睛玻璃体内注射或滴眼给药。

在本发明的具体实施例中，描述了对该眼用药物组合物的不溶性微粒、渗透压、pH值和注射体积的规定。通常，用于临床使用的制剂中的融合蛋白的浓度为0.01mg/mL至100mg/mL，具体剂量取决于制剂的形式，临床需要等。通常，玻璃体内注射包括给予约0.01mg至10mg；本发明的该眼用注射液中的微粒数量最高限度为：每支制剂中直径>10μm的微粒个数小于6000，直径>25μm的微粒个数小于600；或直径>10μm的微粒个数小于25粒/ml，直径>25μm的微粒个数小于3粒/ml。本发明的该眼用药物组合物摩尔浓度渗透压应与泪液等渗，一般为285-310mOsmol/kg；该眼用药物组合物pH应在5.5-6.5左右，以尽可能与泪液接近；本发明的该眼用药物组合物采用玻璃体内注射方式给药，要求给药体积很小，药物浓度达到一定要求。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当该抗体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生过敏或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的抗体蛋白相容，即能与其共混而不会大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子包括糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；稳定剂；抗氧化剂；无热原无菌注射用水；生理盐水溶液；磷酸盐缓冲剂等。

本发明提供了眼用药物组合物中抗体使用浓度、药物使用剂量及使用频率。根据现有研究资料，确定抗体的浓度为0.5mg/ml-20mg/ml，使用剂量与规格一般为0.005mg/50μL/眼至2mg/50μL/眼之间，每隔一定时间(如每隔1到3个月)玻璃体腔注射一次。具体实施中应由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的给药剂量，给药时间及给药频率。

在下文的实施例及附图说明中，为表述方便，将本发明药物组合物中的所述抗体或其衍生体以代号hPV19K表示。hPV19K单抗是由两条相同的重链和两条相同的轻链组成的四聚体，其中hPV19K单抗轻链具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，hPV19K单抗重链具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：9-10如下表2所示：

表2：hPV19K单抗轻链及重链氨基酸序列

附图说明

图1为本发明实施例1中体外检测分析hPV19K单抗及Avastin抑制VEGF介导的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)增殖活性的结果。其中，溶媒对照组作为阴性对照组。

图2为本发明实施例2中含不同配方的hPV19K单抗眼用注射液中不溶性微粒的检测结果。其中，浅灰柱状物为含不同配方的hPV19K单抗注射液放置一小时后的不溶性微粒检测数值，深灰柱状物为各配方注射液放置14小时后的不溶性微粒检测数值；粗线为药典规定的注射剂大输液不溶性微粒的标准线，细线为药典规定的注射剂小针剂不溶性微粒的标准线。

图3为本发明实施例2中直接ELISA法检测含不同配方的hPV19K单抗的眼用注射液的结合VEGF的相对活性。

图4为本发明实施例3中直接ELISA法检测含不同配方的hPV19K单抗的眼用注射液与市售的Avastin及康柏西普与VEGF结合的相对活性比较。

图5为本发明实施例3中竞争性ELISA法检测各VEGF抑制剂体外阻断VEGF与其受体(VEGFR-1)的结合的示意图。

图6为本发明实施例4中hPV19K单抗眼用注射液单次玻璃体腔注射给予食蟹猴后血清hPV19K单抗浓度-时间曲线(n＝6)。

图7为本发明实施例4中hPV19K单抗眼用注射液单次玻璃体腔注射给予食蟹猴后房水hPV19K单抗浓度-时间曲线(n＝12)。

图8为本发明实施例4中hPV19K单抗眼用注射液单次玻璃体腔注射给予食蟹猴后玻璃体液中hPV19K单抗浓度-时间曲线(n＝12)。

图9为本发明实施例5中hPV19K单抗眼用注射液玻璃体腔单次注射前后食蟹猴眼底照相和荧光造影中晚期图片。

图10为本发明实施例5中hPV19K单抗眼用注射液玻璃体腔单次注射对食蟹猴脉络膜新生血管4级光斑改善率的检测结果图，与同期溶媒对照组比较，a表示p<0.05。

图11A、11B及11C为本发明实施例5中hPV19K单抗眼用注射液玻璃体腔单次注射对食蟹猴脉络膜新生血管4级光斑渗漏面积及改善率结果图。

其中，图11A为给药前后各组动物每眼荧光渗漏平均面积变化结果，与同期溶媒对照组比较，a表示p<0.05；

图11B为D24、D31各组动物每眼荧光渗漏平均面积减少量，与同期溶媒对照组比较，a表示p<0.05；与同期供试品高剂量组比较，d表示p<0.05；与同期雷珠单抗注射液组比较，e表示<0.05；

图11C为D24、D31各组动物每眼荧光渗漏面积改善率，与同期溶媒对照组比较，a表示p<0.05；与同期供试品低剂量组比较，b表示p≤0.05；与同期供试品中剂量组比较，c表示p<0.05；与同期雷珠单抗注射液组比较，e表示p<0.05。

图12A、12B及12C为本发明实施例5中hPV19K单抗眼用注射液玻璃体腔单次注射对食蟹猴视网膜下的异常高反射信号物质的光学相干断层扫描结果。

其中，图12A为给药前后各组动物每眼SHRM平均高度变化，与同期溶媒对照组比较，a表示p<0.05；

图12B为D24、D31各组动物每眼SHRM平均高度减少量，与同期溶媒对照组比较，a表示p<0.05；

图12C为D24、D31各组动物每眼SHRM平均高度改善率，与同期溶媒对照组比较，a表示p<0.05；与同期供试品中剂量组比较，c表示p<0.05。

具体实施方式

下面将结合实施实例来进一步描述本发明，这些实施例只是为了起说明作用，而不是用来限制本发明。

实施例1.体外检测含hPV19K单抗的样品抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性

在本研究实施例中，分别用稀释液(含10％FBS的DMEM-Medium培养液)将hPV19K抗体参比品、hPV19K抗体供试样品和Avastin对照抗体样品，配制成2000ng/ml的溶液，随后用含6ng/ml rhVEGF165的稀释液连续3倍梯度稀释，共10个浓度梯度。以稀释液作为阴性对照，含6ng/ml rhVEGF165的稀释液作为阳性对照，将阴性对照、阳性对照、系列稀释样品按50μl/孔加入96孔白色细胞培养板中，37℃5％二氧化碳培养箱孵育30分钟。

来源于人脐静脉的血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)用稀释液重悬至1.0×104/ml，按50μl/孔加入上述96孔细胞培养板中，外圈用无菌水封闭，37℃5％二氧化碳培养箱孵育72小时。按顺序加入新鲜配制的CellTier-Glo增殖试剂(美国Promega公司产品)100μl/孔，室温避光显色15min，以荧光酶标仪读取RLU读数，以参比品或待测样品的浓度作为横坐标、RLU读数的平均数作为纵坐标作图，结果如图1。经计算，hPV19K抗体参比品、hPV19K供试样品和Avastin对照品的IC50分别为16.9ng/ml、16.8ng/ml和89.6ng/ml，对于体外抑制VEGF介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖活性，hPV19K抗体显著强于Avastin(平均强6.7倍)。

实施例2.眼用hPV19K单抗药物制剂的开发

为降低眼科用hPV19K单抗注射剂中不溶性微粒数量，防止眼部非特异性炎症的发生，在hPV19K单抗药物制剂开发中特意加入糖类(如蔗糖)、乳化剂(如聚山梨醇酯,吐温80或吐温20)等载体以减少抗体大分子的相互聚集。在该药物制剂开发中初步设计了8个不同的配方，将hPV19K单抗分别溶于含有不同浓度的吐温和蔗糖的不同配方的液体中，各放置1小时和14小时后检测各溶液中的不溶性微粒。图2为含不同配方的hPV19K单抗药物制剂中的不溶性微粒检测结果。

之后，对含配方8的hPV19K单抗药物制剂样品中的氯化钠含量和缓冲液的比例分别进行调整获得注射液制剂初步样品。经检测，该注射液制剂样品的渗透压为300mOsmol/kg；pH为5.5-6.5；不溶性微粒为：直径>10μm的微粒个数为5.8粒/ml，直径>25μm的微粒个数为0.3粒/ml。其后将注射液制剂样品于25℃下放置6个月后，不溶性微粒再检测结果为直径>10μm的微粒个数为312粒/ml，直径>25μm的微粒个数为11粒/ml。

在上述研究结果基础上，再进一步设计出含8种不同优化配方(代号：YF20161201-YF20161208)的拟用于眼底给药的hPV19K单抗注射液。

表3拟用于眼底给药的hPV19K单抗制剂中不同优化配方组分及其含量

经紫外吸收法测得各优化配方制剂中的hPV19K抗体蛋白浓度在9.81mg/ml-10.01mg/ml范围内，SEC-HPLC测定hPV19K单抗纯度为96.60％-96.70％，由此可知上述含不同优化配方的hPV19K单抗眼用注射液的蛋白浓度和纯度基本相同。

之后利用直接ELISA法检测hPV19K单抗眼用注射液中的抗体相对结合活性。其检测步骤如下：以重组人VEGF165蛋白(0.1μg/ml，PBS，100μl/孔)包被酶标板，37℃包被2小时或4℃过夜；5％脱脂牛奶37℃放置1小时或4℃封闭过夜。经PBS-0.1％Tween20液(PBST)洗涤后分别加入hPV19K单抗参考品、含不同优化配方的hPV19K单抗眼用注射液样品，参考品及各样品的起始浓度为5μg/ml，进行连续3倍梯度稀释，共12个浓度梯度，37℃孵育1小时；经PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)-标记的羊抗人IgG(购自上海西唐生物公司)，37℃孵育1小时；再经PBST充分洗涤后，加入邻苯二胺(OPD)-0.1％H₂O₂底物液显色10-15min，以0.1M HCl终止反应。在MK3-Multiskan酶标仪(美国Thermo Scientific公司产品)中读取492nm处OD值，结果如图3，经计算含不同配方的hPV19K单抗眼用注射液的相对结合活性保持在84.19％-100.83％之间。

其后，选择单抗相对结合活性大于90％的5个优化配方的hPV19K单抗眼用注射液(YF20161202、YF20161205、YF20161206、YF20161207、YF20161208)给予新西兰兔眼底注射，进行动物眼部毒性观察和比较实验。

该实验具体过程如下：

选择检疫合格、体重相近的15只雄性新西兰兔，按体重随机分成5组，每组3只动物，分组当天记为D-1。第二天(记为D1)各组动物分别双眼玻璃体腔单次注射含不同配方的hPV19K单抗眼用注射液(10mg/ml，50μl/眼)。在筛选时(D-1)、给药前(D1)、D3、D8、D15进行一般眼科检查。下表4为各组实验动物的观察结果。

表4不同优化配方hPV19K单抗眼用注射液给予新西兰兔一般眼科检查结果

注：各组眼睛总数为6；“+、++、+++、++++”分别表示轻微、轻度、中度、重度

经比较，发现配方1、配方3及配方4的兔眼部安全毒理表现相对较好。其中，配方4(10mM磷酸盐，8.8mM冰醋酸，44mM NaCl，0.03％吐温20，5％蔗糖，1-20mg/ml hPV19K单抗)作为本发明的最优选眼用制剂，用于开展下述实施例3-5的研究。

实施例3.体外检测优选的hPV19K单抗眼用药物制剂的生物活性

1)直接ELISA法检测与比较本发明优选的hPV19K单抗眼用药物制剂、市售的Avastin及康柏西普结合VEGF的生物活性

以重组人VEGF165蛋白(0.1μg/ml，pH 9.6，0.1M NaHCO₃液)包被酶标板，37℃包被2小时或4℃过夜；2％BSA4℃封闭过夜。经PBST洗涤后分别加入hPV19K单抗眼用注射液、市售的Avastin、市售的康柏西普，各样品的起始浓度为1000ng/ml，并进行连续两倍梯度稀释，37℃孵育2小时；经PBST洗涤后，加入HRP-标记的羊抗人IgG(购自上海西唐生物公司西唐生物)，37℃孵育1小时；再经PBST充分洗涤后，加入OPD-0.1％H₂O₂底物液显色10-15min,以0.1M HCl终止反应。在酶标仪中读取492nm处OD值。

ELISA检测结果如图4，hPV19K单抗眼用注射液保持与人VEGF165蛋白高度结合的活性，且其结合活力比Avastin和康柏西普高4-8倍。

2)竞争性ELISA法检测与比较本发明优选的hPV19K单抗眼用药物制剂、市售的Avastin、Lucentis及康柏西普体外阻断VEGF与其重组受体(VEGF-R)的结合

用重组可溶性人VEGFR1蛋白(美国R&D公司产品)包被96-孔板(2μg/ml，50μl/孔)，4℃过夜；经PBST漂洗及2％BSA室温封闭后，分别加入0.1μg/ml的生物素标记的VEGF165与不同浓度的本发明优选的hPV19K单抗眼用注射液样品、市售的Avastin、市售的Lucentis及市售的康柏西普，37℃孵育2h；经PBST洗脱后，加入HRP标记的Avidin(1：5000)，37℃孵育1h；经PBST洗脱后，加入OPD-3％双氧水，室温10min至显色；加入0.1M HCl终止反应，以酶标仪测定492nm波长处各孔的吸光值。

图5为该竞争性ELISA检测结果，如图所示：本发明优选的hPV19K单抗眼用注射液样品及市售的几个VEGF阻断剂体外均可特异阻断VEGF与其受体(VEGF-R)的结合，根据检测曲线可测算hPV19K单抗眼用注射液样品的IC50值<1nM，其体外活性优于市售的Avastin、雷珠单抗(Lucentis)及康柏西普。

实施例4.优选的hPV19K单抗药物眼用制剂单次玻璃体腔注射给予食蟹猴药代动力学研究

试验选用食蟹猴18只，雌雄各半，分性别随机分成3组(玻璃体注射低、高剂量组及静脉注射组)。玻璃体注射低、高剂量组分别单次双眼玻璃体注射给予hPV19K单抗眼用注射液供试品(供试品0.5mg/50μL/眼、1mg/50μL/眼，静脉组单次静脉推注给予供试品2mg/只)。玻璃体注射给药组动物给药前，药后2、6、12、24、48、72h，5、7、9、11、14、17、21、24、28天采集全血，静脉组动物给药前，药后2min、30min、2、6、12、24、48、72h，5、7、11、14、17、21、24、28天采集全血，分离血清，ELISA测定血清中药物浓度，采用Winnonlin 6.4非房室模型(NCA)计算药代动力学参数。玻璃体给药组动物于给药后1h，3、7、14、28天各采集约0.1mL房水和玻璃体液，ELISA测定hPV19K单抗浓度，采用Winnonlin 6.4非房室模型(NCA)计算药代动力学参数。

试验期间各动物均未见异常临床表现，各组动物血清、房水中及玻璃体药物代谢动力学参数统计结果分别见表5、表6及表7。

表5 hPV19K单抗单次玻璃体腔注射给予食蟹猴血清药物代谢动力学参数

表6 hPV19K单抗单次玻璃体腔注射给予食蟹猴房水中药物代谢动力学参数

表7 hPV19K单抗单次玻璃体腔注射给予食蟹猴房玻璃体液中药物代谢动力学参数

图6、图7及8分别为hPV19K单抗眼用注射剂给药后，食蟹猴血清、房水及玻璃体液中hPV19K单抗浓度与时间图。

结果如上述图表所示，食蟹猴血清、房水及玻璃体中药物峰浓度及血清药物暴露量均与给药剂量正相关。血清平均C_max之比及平均AUC_last之比分别为1:1.94、1:1.99，房水平均C_max之比及平均AUC_last之比分别为1:2.28、1:3.16，玻璃体平均C_max之比及平均AUC_last之比分别为1:1.59、1:2.02。

单次双眼玻璃体注射给药(1mg/眼，2mg/只)的绝对生物利用度(玻璃体注射高剂量组AUC(0-408h)/静脉组AUC(0-408h)为44.90％。

单次玻璃体腔注射给药后，供试品(hPV19K单抗眼用注射剂)低、高剂量组动物玻璃体液、房水与血清中平均药物峰浓度(C_max)比值分别为300.21:101.42:1、245.32:118.73:1；药物暴露量AUC_last比值分别为151.02:44.78:1、153.13:71.05:1，药物在玻璃体中的暴露量高于房水，远高于血清。

实施例5.hPV19K单抗眼用药物制剂单次玻璃体腔注射对食蟹猴脉络膜新生血管的抑制作用

步骤1：食蟹猴脉络膜新生血管模型(choroidal neovascularization CNV)建立

从54只食蟹猴中选取50只经筛选合格的动物进行双眼眼底激光光凝，以诱导脉络膜血管新生(CNV模型)，每只眼激光灼烧数量为6-8个，所有动物造模当天记为D1；造模后2周(D15)，通过眼底荧光造影(FFA)检查评估动物的眼底荧光渗漏情况，评估时将食蟹猴CNV的损伤程度分为4级。D17挑选36个有4级渗漏光斑的动物入组，根据4级光斑平均渗漏面积和4级光斑率进行平均分组，保证在分组时各组动物眼底平均渗漏面积和4级光斑率无显著差异。

步骤2：hPV19K单抗眼用药物制剂治疗食蟹猴脉络膜新生血管

将上述形成CNV的食蟹猴随机分成6组(每组6只，雌雄各3只)，入组当天(D17)各组动物分别单次经玻璃体腔注射(50μL/眼，双眼给药)供试品(hPV19K单抗眼用注射剂)或市售的对照品雷珠单抗(Lucentis)及康柏西普。

各组动物给药分组如下：

1)hPV19K单抗眼用注射液溶媒照品组；

2)hPV19K单抗眼用注射液供试品低剂量组(0.05mg/眼)；

3)hPV19K单抗眼用注射液供试品中剂量组(0.15mg/眼)；

4)hPV19K单抗眼用注射液供试品高剂量组(0.5mg/眼)；

5)市售的雷珠单抗注射液对照品组(0.5mg/眼)；

6)市售的康柏西普眼用注射液对照品组(0.5mg/眼)。

造模前、D15、D24和D31对各组动物进行眼底照相、眼底血管荧光造影(FFA)及光相干断层成像(OCT)检测。根据眼底荧光渗漏情况对食蟹猴CNV进行分级和测量。测定OCT图像中视网膜下高反射信号物质(Subretinal hyperreflective material，SHRM)的高度。第33天(D33)试验结束。

试验结果：

1)荧光造影检查(FFA)

所有动物在造模前进行了眼底照相和荧光造影检查，结果均无明显异常。造模后D15、D24和D31进行了眼底照相和荧光造影检查，图9为hPV19K单抗眼用注射液组、雷珠单抗注射液组和康柏西普眼用注射液组给药前后食蟹猴眼底照相和荧光造影中晚期图片。各组动物眼底照相除可见激光光凝斑及光凝造成的损伤，未见其他异常。

同时，对造模后D15、D24和D31的眼底荧光造影检查图片进行阅图评级及相关测量，计算4级光斑数、4级光斑率及4级光斑渗漏面积。

a.4级光斑数及4级光斑改善率

造模后2周(D15)，各组间4级光斑数均无显著差异(p>0.05)。给药后7天(D24)，溶媒对照品组，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中、高剂量组，雷珠单抗注射液组和康柏西普眼用注射液组4级光斑数(个)分别为4.8±2.8、1.8±2.1、2.4±2.4、1.3±2.7、1.9±2.3和0.8±1.4，4级光斑改善率(％)分别为16.7±38.9、69.9±33.4、66.2±38.4、82.4±36.69.1±35.3和87.4±25.5。给药后14天(D31)，溶媒对照品组，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中、高剂量组，雷珠单抗注射液组和康柏西普眼用注射液组4级光斑数(个)分别为4.7±2.9、1.8±2.1、1.3±1.7、1.0±2.2、1.4±1.9和0.8±1.3，4级光斑改善率(％)分别为20.8±39.6、69.9±33.4、78.8±31.4、85.9±28.8、77.1±28.1和87.4±24.0。各组动物每眼4级光斑改善率示意图见图10。

给药后7天和14天，溶媒对照品组4级光斑数未见明显变化，4级光斑改善率不明显，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中、高剂量组，雷珠单抗注射液组和康柏西普眼用注射液组4级光斑数均显著低于溶媒对照品组(p<0.05)；各组动物4级光斑改善率均显著高于溶媒对照品组(p<0.05)。

b.4级光斑平均渗漏面积、平均渗漏面积减少量及改善率

给药前(造模后2周，D15)、给药后7天(D24)和14天(D31)，各组动物每眼荧光渗漏平均面积、减少量及荧光渗漏改善率(均数标准差)如下表：

表8各组动物每眼荧光渗漏平均面积、平均渗漏面积减少量及改善率

造模后2周(D15)，溶媒对照品组，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中、高剂量组，雷珠单抗注射液组和康柏西普眼用注射液组每眼荧光渗漏平均面积(mm2)均值无显著差异(p>0.05)。

给药后7天和14天，溶媒对照品组荧光渗漏面积变化不明显，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中、高剂量组，雷珠单抗注射液组及康柏西普眼用注射液组荧光渗漏面积明显减少，各组动物每眼荧光渗漏平均面积减少量和荧光渗漏改善率(％)均显著高于溶媒对照品组(p<0.05)。各组动物每眼荧光渗漏面积及改善情况见图11。给药后7天供试品(hPV19K单抗眼用注射液)高剂量组每眼荧光渗漏平均面积减少量及改善率高于(p>0.05)雷珠单抗注射液组、供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中剂量组。给药后14天，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)高剂量组每眼荧光渗漏平均面积减少量及改善率高于(p>0.05)雷珠单抗注射液组、康柏西普眼用注射液组及供试品低、中剂量组。

2)光学相干断层扫描(OCT)

所有动物在造模前进行光学相干断层扫描(OCT)检查，结果显示所有动物均无明显异常。造模后D15、D24和D31进行了OCT检查，并根据D15荧光造影检查结果测定了4级光斑对应的OCT图像中视网膜色素上皮层以上感光视网膜下的异常高反射信号物质(Subretinal hyperreflective material，SHRM)的最高高度。

给药前(造模后2周，D15)、7天(D24)和14天(D31)，各组动物每眼SHRM平均高度、减少量及改善率(均数标准差)如表9。

表9各组动物每眼SHRM平均高度、平均高度减少量及改善率

造模后2周(D15)，溶媒对照品组，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中、高剂量组，雷珠单抗注射液组和康柏西普眼用注射液组每组动物每眼SHRM平均高度(μm)均值分别为212.7±39.4、250.5±70.6、246.3±78.9、249.5±53.5、246.1±69.5和241.9±89.2，各组间无显著差异(p>0.05)。

给药后7天和14天，溶媒对照品SHRM高度变化不明显，其他各组均明显减少。给药后7天(D24)，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中、高剂量组，雷珠单抗注射液组和康柏西普眼用注射液组动物每眼SHRM平均高度均显著低于溶媒对照品组(p<0.05)；各组每眼SHRM平均高度减少量及SHRM高度改善率(％)均显著高于溶媒对照品组(p<0.05)。

给药后14天(D31)，供试品(hPV19K单抗眼用注射液)低、中、高剂量组，雷珠单抗注射液组和康柏西普眼用注射液组每眼SHRM平均高度均显著低于溶媒对照品组(p<0.05)；各组每眼SHRM平均高度减少量及SHRM高度改善率(％)均显著高于溶媒对照品组(p<0.05)。供试品(hPV19K单抗眼用注射液)高剂量组每眼SHRM平均高度减少量及改善率略高于(p>0.05)雷珠单抗注射液组、康柏西普眼用注射液组、供试品低、中剂量组。

综合分析上述荧光造影检查及光学相干断层扫描结果表明，各剂量组的hPV19K单抗眼用注射液均可明显抑制食蟹猴脉络膜新生血管，减少4级光斑数、改善4级光斑渗漏面积及SHRM高度。此外，单次仅注射1/10剂量(0.05mg/眼)的hPV19K单抗眼用液，其抑制食蟹猴脉络膜血管新生及渗漏的疗效就与注射0.05mg/眼的市售对照品雷珠单抗或注射0.05mg/眼的疗效相近，显示优良的体内活性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州思坦维生物技术股份有限公司

<120> 一种眼用药物组合物及其用途

<130> DX182219PPC-CN

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser Gly Ile Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Phe Gly Asp Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp

1 5 10

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Asn Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Gly Asp Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val

115

<210> 9

<211> 219

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 10

<211> 450

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Asn Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Gly Asp Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

Claims (8)

1.一种用于治疗与血管生成相关眼部疾病或病症的眼用药物制剂，其包含能够拮抗抑制血管内皮生长因子与其受体结合的抗体，以及用于眼科治疗剂的一种或多种药学上可接受的辅料，所述抗体的轻链为SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；其重链为SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；所述抗体是由两条相同的所述重链和两条相同的所述轻链组成的四聚体；

所述辅料为聚山梨醇酯和蔗糖的组合，基于所述眼用药物制剂的总体积，辅料含有以克每毫升计0.03-0.04%的聚山梨醇酯和以克每毫升计0-5%的蔗糖；

所述眼用药物制剂还包含缓冲试剂；所述缓冲试剂为十二水合磷酸氢二钠和冰醋酸的组合；

所述抗体在所述药物制剂中的抗体浓度为1-20 mg/ml；

所述眼用药物制剂的渗透压为285-310mOsmol/kg；

所述眼用药物制剂的pH值为5.5-6.5。

2.权利要求1所述的眼用药物制剂在制备用于治疗与血管生成相关的眼部疾病或病症的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述与血管生成相关的眼部疾病或病症选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、病理性近视继发脉络膜新生血管、新生血管性青光眼、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜血管阻塞、特发性脉络膜视网膜炎、眼组织胞浆菌病、眼部肿瘤、脉络膜新生血管形成、囊性黄斑水肿、角膜新生血管形成、角膜移植、和慢性结膜炎中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述治疗与血管生成相关的眼部疾病或病症的结果包括选自平均脉络膜血管新生渗漏减少、平均视力改善、平均中央凹视网膜厚度减少、平均黄斑大小减少和平均损伤大小减少中的一种或多种的症状改善。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，其中所述眼用药物制剂的使用剂量为0.005mg/50μL/眼至2mg/50μL/眼。

6.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，其中所述眼用药物制剂的使用剂量为0.05mg/50μ L /眼至0.5mg/50μ L /眼。

7.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，所述眼用药物制剂的施用方式为通过玻璃体内注射。

8.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，所述眼用药物制剂的施用时间为每间隔1至3个月施用一次。

Images