CN109562129B - 含有从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分的用于预防或治疗肺纤维化的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及组合物，其用于治疗肺纤维化并且包含从脂肪来源的干细胞提取的外排体作为活性成分；所述外排体在制备用于治疗肺纤维化的药物中的用途；以及肺纤维化治疗方法。从根据本发明的脂肪来源的干细胞提取的外排体包含与肺纤维化治疗相关的生长因子，例如肝细胞生长因子和IL‑10，并且可显著减少肺纤维化诱导的试验动物模型中的纤维化区域。因此，可有效用于治疗肺纤维化。此外，在使用根据本发明的外排体的肺纤维化治疗中，几乎不用担心由在典型的肺纤维化治疗发生时使用的基于类固醇的药物和抗氧化剂引起的副作用，并且外排体可以通过基于注射或摄入的施用自然地输送至肺部而不用手术处理，并且因此，可以方便且经济地治疗肺纤维化。

Description

含有从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分的用于 预防或治疗肺纤维化的组合物

技术领域

本公开内容涉及用于预防或治疗肺纤维化的组合物，其含有从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分，所述外排体在制备用于预防或治疗肺纤维化的药物中的用途以及用于预防肺纤维化的方法，所述方法包括向对象施用含有所述外排体作为活性成分的药物组合物的步骤。

背景技术

肺纤维化是指由于当慢性炎性细胞浸润到肺泡壁中时诱导组织的纤维化，肺组织发生严重的结构损伤的疾病。随着纤维化的进行，肺组织变硬并且肺泡壁变厚。结果，血液中的氧供应减少，从而导致呼吸短促。目前，还没有用于完全恢复已经发生纤维化的肺组织的治疗方法。除了早期检测并治疗以及肺移植的一些病例外，大多数患者在症状出现后3至5年内死亡。

为了治疗早期检测到的肺纤维化，使用基于类固醇的药物例如类固醇、硫唑嘌呤或环磷酰胺，抗氧化剂例如乙酰半胱氨酸，生长因子例如细胞因子IFN-γ等。尽管自2000年以来一直在研究和报道使用基于类固醇的药物和抗氧化剂的治疗方法，但没有明确证实有效力的药物。报道称目前可用的药物当长期施用时会引起全身性副作用或引起耐受性副作用。最近引起很多关注的涉及施用生长因子的治疗方法是使用“干扰素”的相对基础的治疗方法，“干扰素”抑制已知作为肺纤维化中的重要因子的TGF-β的产生。因为该治疗方法是基于对疾病原因的分析，所以与使用基于类固醇的药物或抗氧化剂的治疗方法相比它具有更少的副作用，并且已经报道了多种治疗方法例如注射剂、气溶胶等。然而，由于肺纤维化的确切原因尚不清楚，因此单一成分(例如干扰素)的治疗效果可能是暂时的并且可能仅在某些患者中发生。因此，需要进行持续的研究和临床试验。

为了克服这些局限性，报道了使用能够产生和调节多种因子的干细胞和所述干细胞的培养物用于治疗肺纤维化的研究(韩国专利登记号10-0837167和韩国专利公开号10-2009-0122415)。然而，干细胞的最大问题是无法确认其准确效力，因为它们体内存活率在患者之间不一致，并且无法避免干细胞向癌细胞发展的风险。此外，含有从干细胞分泌的多种生长因子的培养物可引起意想不到的问题，因为它们除生长因子外还含有多种细胞废物。

在此背景下，本公开内容的发明人已经一直致力于开发用于肺纤维化的治疗剂，并且因此已经鉴定出从脂肪来源的干细胞分离的外排体含有与肺纤维化的治疗相关的生长因子，例如HGF(肝细胞生长因子，hepatocyte growth factor)和IL-10，并且在肺纤维化诱导的试验动物模型中表现出对肺纤维化的优异治疗效果。

发明内容

技术问题

本公开内容旨在提供用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，其含有从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分。

本公开内容还旨在提供所述外排体在制备用于预防或治疗肺纤维化的药物中的用途。

本公开内容还旨在提供用于预防肺纤维化的方法，其包括向对象施用含有所述外排体作为活性成分的药物组合物的步骤。

技术方案

为了解决上述问题，本公开内容提供了用于预防或治疗肺纤维化的组合物，其包含从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分，所述外排体在制备用于预防或治疗肺纤维化的药物中的用途以及用于预防肺纤维化的方法，所述方法包括向对象施用含有所述外排体作为活性成分的药物组合物的步骤。

在下文中，详细描述了本公开内容。

在一个方面，本公开内容提供了用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，其含有从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分。

在本公开内容中，术语“干细胞”是指这样的细胞，由于其在细胞环境下在存在适当信号的情况下的多能性，不仅可以自我更新而且还可以分化成多种细胞类型，包括脂肪、骨髓、脐带血、胎盘等，并且可用于治疗多种细胞损伤性疾病，例如心肌梗塞、脑梗塞、退行性关节炎、骨折等。

在本公开内容中，干细胞可以是自体或同种异体干细胞，并且可来源于任何动物物种，包括人和非人哺乳动物。

在本公开内容中，术语“脂肪来源的干细胞”是指来源于脂肪组织的干细胞。脂肪组织为收获干细胞提供了良好的条件，原因是可以容易地取得大量组织。此外，脂肪来源的干细胞在培养时表现出稳定的生长和增殖，并且可以分化成多种细胞类型。报道称，干细胞不但分化为脂肪组织，而且还分化为间充质组织，例如软骨、骨骼、神经组织、血管组织等，以及其他多种组织例如肝、肾、心血管组织等。

在本公开内容中，术语“外排体”是指从细胞分泌的40nm至120nm大小的纳米囊泡，并且包括免疫学上重要的蛋白质主要组织相容性复合物(MHC)和热休克蛋白、诱导强烈的抗肿瘤免疫应答的抗炎微小RNA和调节胶原蛋白的积累的微小RNA。此外，已知它与其他细胞或组织结合并发挥多种作用，例如膜组分、蛋白质和RNA等的转运。

本公开内容的外排体是来源于干细胞的外排体并且可来源于脂肪来源的干细胞、脐带来源的干细胞或骨髓来源的干细胞，但不限于此。

因为来源于干细胞的外排体含有与相应干细胞的增殖、分化和再生相关的基因、蛋白质、生长因子等，所以它可以在组织再生中发挥重要作用。

具体地，可从本公开内容的脂肪来源的干细胞分离含有起源细胞的遗传信息、蛋白质和生长因子的外排体。分离的外排体可具有干细胞的基本特征并且可包含组织再生所必需的生长因子、生物活性蛋白质、基因等。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，已经鉴定来源于脂肪来源的干细胞的外排体含有与肺纤维化的治疗相关的生长因子，例如HGF(肝细胞生长因子)、白细胞介素-10等(图3，B)。

可通过本领域已知的外排体分离方法获得外排体。它可通过包括以下步骤的分离方法获得，但不限于此：

1)在正常培养基中培养干细胞，然后在无血清、无抗生素的培养基中传代培养的步骤；

2)回收细胞培养物的上清液的步骤；

3)通过离心所回收的细胞培养物的上清液来去除细胞碎片的步骤；以及

4)通过多过滤系统过滤去除了细胞碎片的细胞培养上清液获得分离/纯化的外排体的步骤。

具体地，在步骤1)中，干细胞可以是脂肪来源的干细胞、脐带来源的干细胞或骨髓来源的干细胞，但不限于此。例如，它可以是脂肪来源的干细胞。

脂肪来源的干细胞可以是来源于人或动物的干细胞。

在步骤1)中，干细胞可以在常氧条件或低氧条件下培养，但不限于此。

常氧条件可以是正常氧浓度的培养条件，即，其中供应21％的氧(O₂)，但不限于此，或者其中不向细胞培养基添加低氧细胞敏化剂的培养条件。

低氧细胞敏化剂是诱导低氧条件的物质，并且可选自氯化钴、去铁草酰胺(desferrioxamine)和二甲基草酰甘氨酸(dimethyloxalylglycine，DMOG)，但不限于此。

低氧条件可以是低氧浓度的培养条件，即，其中供应10％或更少的氧(O₂)，但不限于此，或者其中向细胞培养基添加低氧细胞敏化剂的培养条件。

低氧浓度可以是0.5％至10％、0.5％至5％或0.5％至2％的氧浓度，但不限于此。

低氧细胞敏化剂与如上所述相同。在本公开内容的一个示例性实施方案中，通过向用于培养脂肪来源的干细胞的培养基添加100μM氯化钴(II)六水合物(CoCl₂·6H₂O)来诱导低氧培养条件(图5，A)。

在步骤1)中，正常培养基可以是本领域常用的任何培养基。可使用DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、MEM(最小必需培养基)或RPMI 1640(Roswell Park MemorialInstitute 1640)，但不限于此。

如果需要的话，可将向细胞培养基添加一种或更多种助剂。作为助剂，其选自牛胎儿、马、人等血清中的一种或更多种，防止细菌污染的抗生素例如青霉素G、硫酸链霉素、庆大霉素等，抗真菌剂例如两性霉素B、制霉菌素等，以及可使用它们的混合物。

具体地，培养基可以是含有10％FBS(胎牛血清)和1％青霉素/链霉素的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖)。此外，它可以是不含血清、抗生素或酚红的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖)，但不限于此。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，使用含有10％FBS(胎牛血清)和1％青霉素/链霉素的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖)培养人脂肪来源的干细胞(第7代或第8代)然后在无血清、无抗生素、无酚红的培养基中培养24小时，之后从干细胞中分离外排体(实施例1)。

在步骤2)中回收的细胞培养上清液含有细胞碎片和从干细胞分泌的外排体，在细胞培养上清液中含有的细胞碎片可在步骤3)中通过离心去除。

可通过离心并通过多过滤系统过滤来最终分离和纯化步骤2)中回收的细胞培养上清液中包含的外排体。

离心可以以250g至500g进行5至10分钟，或以300g进行10分钟，但不限于此。

多过滤系统是通过不同孔径的过滤器逐步过滤的系统。例如，它可以是通过4μm孔径的细胞过滤器，0.22μm孔径的过滤器和具MWCO(分子量截止值)为500kD的过滤器逐步进行过滤的系统，但不限于此。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，将从培养的人脂肪来源的干细胞中回收的细胞培养上清液以300g离心10分钟以去除细胞碎片。然后，使用4μm孔径的细胞过滤器来去除大于该孔径的细胞碎片，之后使用0.22μm孔径的过滤器来去除大于该孔径的细胞碎片。使去除细胞碎片后回收的溶液通过MWCO(分子量截止值)为500kD的过滤器以流量为4mL/分钟经受TFF(切向流过滤)以去除蛋白质。将在TFF过程后所回收的溶液进行超声。连续重复该TFF过程以获得最终分离和纯化的外排体(图2)。

通过上述外排体分离方法获得的本公开内容的外排体可以是从在常氧条件下或低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞分离的外排体。

外排体可含有与肺纤维化的治疗相关的生长因子，例如HGF(肝细胞生长因子)、白细胞介素-10等。因此，外排体可用作用于预防或治疗肺纤维化的组合物中的活性成分。

在本公开内容中，术语“肺纤维化”是指以在肺泡壁中弥漫性纤维增生，在工作期间具有干咳或呼吸短促的症状为特征的疾病。在狭义上它指的是间质性肺炎的结束，但在广义上，它意指狭义上的肺纤维化和间质性肺炎同时存在。任何间质性肺炎都可引起这种肺纤维化。间质性肺炎统称在肺的间质中(包括在狭义上的肺泡壁和广义上的胸膜等)引起炎症的疾病，并且包括具有特定原因(例如感染、弥漫性胶原蛋白病、辐射、药物、灰尘等)的间质性肺炎以及原因不明的特发性间质性肺炎。基于电视辅助胸腔镜手术(video-assisted thoracoscopic surgery，VATS)、高分辨率计算机断层扫描术(high-resolutioncomputed tomography，HRCT)等，特发性间质性肺炎分为特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)、非特异性间质性肺炎(nonspecific interstitialpneumonia，NSIP)、急性间质性肺炎(acute interstitial pneumonia，AIP)、隐源性机化性肺炎(cryptogenic organizing pneumonia，COP)、呼吸性细支气管炎相关的间质性肺病(respiratory bronchiolitis-associated interstitial lung disease，RB-ILD)、脱屑性间质性肺炎(desquamative interstitial pneumonia，DIP)、淋巴细胞性间质性肺炎(lymphoid interstitial pneumonia，LIP)等。

根据本公开内容的用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物与现有技术的区别在于从特定培养条件(例如常氧条件或低氧条件)下培养的脂肪来源的干细胞分离的外排体用作用于有效治疗肺纤维化的活性成分。

分离和纯化的外排体含有用于减轻或治疗肺纤维化的多种遗传信息、蛋白质和生长因子。此外，由于它是细胞来源的物质，因此表现出优异的生物相容性和优异的吸收率。

因此，可以使得使用目前研究的干细胞培养物在治疗期间可发生的干细胞向癌细胞的发展或用于治疗肺纤维化的目前可用的治疗剂可引起的问题或者由细胞废物引起的副作用等最小化。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，已经证实从脂肪来源的干细胞分离的外排体含有与肺纤维化的治疗相关的生长因子，例如HGF(肝细胞生长因子)、白细胞介素-10等(图3，B)，并且已经证实，在纤维化诱导的肺成纤维细胞中，从脂肪来源的干细胞分离的外排体抑制在纤维化期间累积的胶原蛋白的合成，从而破坏正常结构并引起功能障碍(图4，B)。

此外，当将常氧条件和低氧条件下分别从脂肪来源的干细胞分离的常氧-Exo(Normoxia-Exo)和低氧-Exo(Hypoxia-Exo)施用于博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠，然后对肺组织进行三色染色时，与阴性对照组(PBS施用组)和阳性对照组(脂肪来源的干细胞施用组)相比，染色的胶原蛋白区域显著减少，与正常肺组织相似。特别地，当施用低氧-Exo时，与阴性对照组、阳性对照组和常氧-Exo施用组相比，染色的胶原蛋白区域显著减少，与正常肺组织相似(图7至9)。

基于上述结果，可以看出从在常氧条件下培养的脂肪来源的干细胞获得的外排体(常氧-Exo)和从在低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞获得的外排体(低氧-Exo)在改善或治疗肺纤维化方面均有效。特别地，可以看出在低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞(低氧-Exo)对肺纤维化表现出显著优异的治疗效果。

因此，含有从根据本公开内容的脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分的组合物可有效地用作用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物。

根据本公开内容的用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物可单独或与一种或更多种可药用载体、赋形剂或稀释剂一起含有药学有效量的从脂肪来源的干细胞分离的外排体。此处，药学有效量意指足以预防、改善或治疗肺纤维化症状的量。

从根据本公开内容的脂肪来源的干细胞分离的外排体的药学有效量可以是5×10⁸至5×10¹⁰个颗粒/天/kg体重或5×10⁹个颗粒/天/kg体重。然而，药学有效量可根据肺纤维化的症状的严重程度，患者的年龄、体重、健康状况和性别，施用途径，治疗期等适当地改变。

并且，术语“可药用”意指该组合物是生理学上可接受的，并且当施用于人时，通常不会引起变态反应，例如胃肠病或头晕或类似反应。载体、赋形剂和稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，还可包含填充剂、抗絮凝剂、润滑剂、保湿剂、食用香料、乳化剂、防腐剂等。

此外，本公开内容的组合物可制备成适合于根据药学领域中常用的方法施用至患者体内的单位剂量制剂，并且所述制剂含有通过一次或数次施用对于发生肺泡有效的施用量。具体地，适合于该目的的制剂可以是肠胃外制剂，例如像注射安瓿的注射剂，例如输液袋的输注剂，例如气溶胶的喷雾剂等。注射安瓿可在使用之前立即与注射溶液混合并且生理盐水、葡萄糖、甘露醇、林格溶液等可用作注射剂。输液袋可由聚氯乙烯或聚乙烯制成。例如，可使用可从Baxter,Becton-Dickinson,Medcep,National Hospital Products或Terumo获得的输液袋。

除活性成分外，药物制剂还可含有一种或更多种可药用常见惰性载体，例如用于注射的防腐剂、止痛剂、增溶剂、稳定剂等或者用于表面制剂的基质、赋形剂、润滑剂或防腐剂等。

如上所述制备的本公开内容的组合物或药物制剂可通过包括肠胃外和经口途径的多种途径施用于哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、人等。可使用本领域常用的任何施用方式。例如，施用可以以经口、直肠、静脉内、肌内、皮下、子宫内、脑室内等进行，但不限于此。

具体地，从脂肪来源的干细胞分离的外排体可经静脉内施用(静脉内注射)，施用到对象的肺或气管中(表面施用)或通过吸入施用。此外，外排体可使用雾化器施用，或者可使用气管内导管施用。

在另一个方面，本公开内容提供了用于预防或治疗肺纤维化的注射剂，其含有从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分。

注射剂还可含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)。也就是说，可通过向磷酸盐缓冲盐水添加从脂肪来源的干细胞分离的外排体来制备注射剂。

注射剂可含有水凝胶来替代磷酸盐缓冲盐水。

水凝胶可以是选自透明质酸、明胶、藻酸盐、壳聚糖、纤维蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白和甲基纤维素中的一种或更多种，特别是透明质酸，但不限于此。

注射剂可含有浓度为5×10⁸至5×10¹⁰个颗粒/kg或5×10⁹个颗粒/kg的外排体，但不限于此。

注射剂可施用于哺乳动物(例如大鼠、小鼠、家畜、人等)的受损部分(例如肺)，或者可经静脉内施用。

在另一个方面，本公开内容提供了从脂肪来源的干细胞分离的外排体在制备用于预防或治疗肺纤维化的药物中的用途。

从脂肪来源的干细胞分离的外排体与如上所述相同，并且它可用作如上所述的用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物的活性成分。

在另一个方面，本公开内容提供了使用含有从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分的药物组合物用于治疗肺纤维化的方法。

该方法包括根据如上所述的多种方法向对象施用药物组合物的步骤。具体的施用剂量可根据对象的状况和体重、疾病的严重程度、药物类型、施用途径和施用期而变化。本领域技术人员可适当地选择施用剂量，并且所述对象是指已经发生或可能发生肺纤维化的任何动物，包括人。

具体地，可通过静脉内注射、吸入、表面施用等向对象施用药物组合物。因为外排体可通过吸入或表面施用直接递送至肺部，或者当静脉内注射时，在通过血管循环的同时天然地在肺中累积，可通过如上所述的简单方法有效地治疗肺纤维化，而无需复杂的治疗程序。

除非另外定义，否则本公开内容中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

有益效果

根据本公开内容的从脂肪来源的干细胞分离的外排体含有与肺纤维化的治疗相关的生长因子，例如HGF(肝细胞生长因子)和IL-10，并且可以在肺纤维化诱导的试验动物模型中显著减少纤维化区域。因此，它可以有效地用于预防或治疗肺纤维化。此外，在使用根据本公开内容的外排体治疗肺纤维化时，几乎不用担心由肺纤维化的典型治疗中使用的基于类固醇的药物和抗氧化剂引起的副作用，并且外排体可以通过注射、吸入等自然地递送至肺部。因此，可以方便且经济地治疗肺纤维化。

附图说明

图1示意性地举例说明了根据本公开内容的一个示例性实施方案从人脂肪来源的干细胞(HASC)分离的外排体及其应用。

图2示意性地举例说明了根据本公开内容的一个示例性实施方案用于从多种来源的干细胞分离外排体的方法。

图3示出了根据本公开内容的一个示例性实施方案对从人脂肪来源的干细胞(HASC)、人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSC)和人骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)分离的外排体的特征进行分析的结果：(A)通过纳米颗粒跟踪分析测定的从多种来源的干细胞分离的外排体的浓度；(B)通过ELISA分析测定的HGF(肝细胞生长因子)和IL-10(白细胞介素-10)外排体的表达水平。

图4示出了根据本公开内容的一个示例性实施方案使用纤维化诱导的肺成纤维细胞分析从人脂肪来源的干细胞(HASC)、人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSC)和人骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)分离的外排体的胶原蛋白合成抑制能力的结果：(A)用于诱导纤维化的肺成纤维细胞的低氧条件以及外排体处理条件的示意图；(B)通过用从HASC、UC-MSC和BM-MSC分离的外排体处理纤维化诱导的肺成纤维细胞并在24小时后将获得的培养基进行ELISA分析而获得的COLIA1(人I型前胶原α1)的表达水平。此处，GM代表使用生长培养基的阳性对照组，BM代表使用无血清基础培养基的阴性对照组。

图5示出了根据本公开内容的一个示例性实施方案分别对从在常氧条件和低氧条件下培养的人脂肪来源干细胞分离的常氧外排体和低氧外排体的特征进行分析的结果：(A)培养条件和用于从人脂肪来源的干细胞分离外排体的条件(含有10％FBS和1％抗生素的DMEM(高葡萄糖)正常培养基用于分离常氧外排体，而补充有100μM氯化钴(II)六水合物(CoCl₂·6H₂O)的正常培养基用于分离低氧外排体)的示意图。将人脂肪来源的干细胞培养24小时后，用无血清培养基替换培养基并分离外排体；(B)示出了常氧外排体和低氧外排体的结构和形态的透射电子显微镜图像；(C)通过纳米颗粒跟踪分析测定的常氧外排体和低氧外排体的浓度。

图6示出了根据本公开内容的一个示例性实施方案从脂肪来源的干细胞分离的外排体对肺纤维化的治疗效果：(A)博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠模型的建立和从人脂肪来源的干细胞分离的常氧外排体和低氧外排体的施用方案的示意图；(B)间隔2天通过静脉内注射向博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠施用从人脂肪来源的干细胞分离的常氧外排体和低氧外排体并在1天后对小鼠的肺进行成像而获得的小鼠肺的图像(PBS代表施用PBS(磷酸盐缓冲盐水)的阴性对照组(N＝3)，HASC代表施用浓度为1×10⁶个细胞/100μL的人脂肪来源的干细胞的阳性对照组(N＝3)。常氧-Exo和低氧-Exo分别代表施用浓度为1×10⁸个颗粒/100μL的常氧外排体和低氧外排体的测试组(N＝3)。间隔2天通过静脉内注射向博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠施用PBS、人脂肪来源的干细胞(HASC)、常氧外排体和低氧外排体3次。

图7示出了根据本公开内容的一个示例性实施方案，从脂肪来源的干细胞分离的外排体对肺纤维化的治疗效果。间隔2天通过静脉内注射向博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠施用从人脂肪来源的干细胞分离的常氧外排体和低氧外排体3次后，在1天后对小鼠的肺进行三色染色(放大倍数：×10)(PBS代表施用PBS(磷酸盐缓冲盐水)的阴性对照组(N＝3)，HASC表示施用浓度为1×10⁶个细胞/100μL的人脂肪来源的干细胞的阳性对照组(N＝3)。常氧-Exo和低氧-Exo分别代表施用浓度为1×10⁸个颗粒/100μL的常氧外排体和低氧外排体的测试组(N＝3))。

图8示出了根据本公开内容的一个示例性实施方案，从脂肪来源的干细胞分离的外排体对肺纤维化的治疗效果。间隔2天通过静脉内注射向博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠施用来自人脂肪来源的干细胞的常氧外排体和低氧外排体3次后，在1天后对小鼠的肺进行三色染色(放大倍数：×40；比例尺：100μm)。

图9示出了根据本公开内容的一个示例性实施方案，从脂肪来源的干细胞分离的外排体对肺纤维化的治疗效果。间隔2天通过静脉内注射向博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠施用从人脂肪来源的干细胞分离的常氧外排体和低氧外排体3次后，在1天后对小鼠的肺进行三色染色，并定量染色的胶原蛋白面积，即纤维化面积(％)(PBS代表施用PBS(磷酸盐缓冲盐水)的阴性对照组(N＝3)，HASC代表施用浓度为1×10⁶个细胞/100μL的人脂肪来源的干细胞的阳性对照组(N＝3)。常氧-Exo和低氧-Exo分别代表施用浓度为1×10⁸个颗粒/100μL的常氧外排体和低氧外排体的测试组(N＝3))。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开内容的构成和效果。这些实施例仅用于举例说明目的，并且本公开内容的范围不受实施例的限制。

实施例1：从多种来源的干细胞分离外排体

干细胞根据其来源的组织和培养条件而表现出不同的特征。因此，从表现出不同特征的干细胞分离的外排体在结构组分方面显示出差异(Extracellular vesicles:Exosomes,microvesicles,and friends；G Raposo等,J.Cell Biol.,2013,第200卷,第4期,第373-383页)。也就是说，作为外排体来源的细胞类型是决定外排体的特征的非常重要的因素。

因此，外排体来源于多种来源的干细胞以分离表现出对肺纤维化有效治疗效果的外排体。

具体而言，在培养人脂肪来源的干细胞(HASC)、人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSC)和人骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)的同时从各干细胞分离出外排体。

使用补充有10％FBS(胎牛血清)和1％青霉素/链霉素的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖；Gibco,Cat#:11995065)正常培养基培养各干细胞。

在从各干细胞分离外排体之前24小时，用无血清、无抗生素、无酚红的培养基(Gibco,Cat#:31053028)替换培养基。培养24小时后，回收细胞培养上清液。将回收的细胞培养上清液以300g离心10分钟以去除细胞碎片，然后使用孔径为0.4μm的细胞过滤器去除大于该孔径的碎片。然后，使用孔径为0.22μm的过滤器去除大于该孔径的细胞碎片。过滤后，使用MWCO(分子量截止值)为500kD的过滤器以4mL/分钟的流量对回收的溶液进行TFF(切向流过滤)以去除蛋白质。将回收的溶液进行超声。连续重复TFF过程以获得最终分离和纯化的外排体(图2)。

回收上清液后，在添加正常培养基后再次培养各干细胞。进行传代培养直至第7或8代。

实施例2：从多种来源的干细胞分离的外排体的特征

分析了从实施例1中多种来源的干细胞分离的外排体的特征。

首先，通过纳米颗粒跟踪分析研究从人脂肪来源的干细胞分离的外排体(HASC-Exo)、从人脐带来源的干细胞分离的外排体(UC-MSC-Exo)和从人骨髓来源的干细胞分离的外排体(BM-MSC-Exo)的浓度。

作为通过纳米颗粒追踪分析研究各外排体的浓度的结果，人脂肪来源的干细胞外排体(HASC-Exo)的浓度为2.25×10⁹个颗粒/mL、人脐带来源的干细胞外排体(UC-MSC-Exo)的浓度为1.38×10⁹个颗粒/mL，人骨髓来源的干细胞外排体(BM-MSC-Exo)的浓度为1.81×10⁹个颗粒/mL(图3，A)。

此外，进行ELISA(酶联免疫吸附测定)以对从人脂肪来源的干细胞、人脐带来源的干细胞和人骨髓来源的干细胞分离的外排体的特征进行比较。由此，测定已知有助于减轻肺纤维化的HGF(肝细胞生长因子)和IL-10(白细胞介素-10)的表达水平。

具体地，在将从多种来源的干细胞分离的各外排体以7×10⁷个颗粒/200μL的浓度与RIPA(放射免疫沉淀测定)缓冲液以1:1的比混合后，使用HGF ELISA试剂盒(Abcam,ab100534)和IL-10ELISA试剂盒(Abcam,ab100549)研究外排体中HGF和IL-10的表达水平。

作为通过ELISA研究HGF和IL-10的表达水平的结果，HGF在从人脂肪来源的干细胞分离的外排体(HASC-Exo)中以最高水平表达，示出与从人脐带来源的干细胞分离的外排体(UC-MSC-Exo)具有显著的差异。同时，该表达水平与从人骨髓来源的干细胞分离的外排体(BM-MSC-Exo)没有显著差异。至于IL-10，表达水平在从多种来源的干细胞分离的所有外排体中相似(图3，B)。

实施例3：使用纤维化诱导的肺成纤维细胞评价外排体的胶原蛋白合成抑制能力

大多数器官在组织损伤后经历炎症和愈合过程。如果损伤轻微，则保持组织的正常结构和功能。但是，在愈合过程期间持续的损伤导致组织的纤维化。纤维化过程涉及组织中胞外基质(ECM)例如胶原蛋白、纤连蛋白等的积累，导致正常结构的破坏和功能障碍(Tuberculosis and Respiratory Diseases,第54卷,第2期,第1-12页,2003年2月)。

为了研究从人脂肪来源的干细胞、人脐带来源的干细胞和人骨髓来源的干细胞分离的各外排体是否对肺纤维化表现出有效的治疗效果，使用肺成纤维细胞建立体外模型并评价从多种来源的干细胞分离的各外排体的胶原蛋白合成抑制能力。

具体地，使用补充有低血清成纤维细胞生长试剂盒(ATCC,PCS-201-041)的成纤维细胞基础培养基(ATCC,PCS-201-030)将原代人肺成纤维细胞(正常,ATCC,PCS-201-013)传代培养至第6代。

在传代培养后，通过以100μM的浓度向培养基添加在培养细胞中诱导低氧条件的已知作为肺敏化剂的氯化钴(II)六水合物(CoCl₂·6H₂O)来改变培养基的组成。以浓度为1×10⁸个颗粒/mL或5×10⁸个颗粒/mL用从人脂肪来源的干细胞分离的外排体(HASC-Exo)、从人脐带来源的干细胞分离的外排体(UC-MSC-Exo)或从人骨髓来源的干细胞分离的外排体(BM-MSC-Exo)处理培养基。24小时后，收获培养基，并使用ELISA试剂盒研究COLIA1的表达水平(I型胶原蛋白，α1)。生长培养基(GM)和无血清基础培养基(BM)分别作为阳性对照组和阴性对照组。

作为通过ELISA评价从多种来源的干细胞分离的外排体的胶原蛋白合成抑制能力的结果，与用从人脐带来源的干细胞分离的外排体(UC-MSC-Exo)和从人骨髓来源的干细胞分离的外排体(BM-MSC-Exo)处理的组相比，用从人脂肪来源的干细胞分离的外排体(HASC-Exo)处理的组显示出显著降低的COLIA1的表达。

根据该结果，可以确认与从人脐带来源的干细胞分离的外排体(UC-MSC-Exo)和从人骨髓来源的干细胞分离的外排体(BM-MSC-Exo)相比，从人脂肪来源的干细胞分离的外排体(HASC-Exo)表现出优异的胶原蛋白合成抑制能力(图4)。

因为与从来源于其他干细胞的外排体(UC-MSC-Exo和BM-MSC-Exo)相比，从人脂肪来源的干细胞分离的外排体(HASC-Exo)在纤维化诱导的肺成纤维细胞中表现出优异的胶原蛋白合成抑制能力，所以可以推断从脂肪来源的干细胞分离的外排体(HASC-Exo)可用于治疗肺纤维化。

实施例4：从在常氧和低氧条件下的人脂肪来源的干细胞分离外排体

通常而言，使用干细胞的实验在正常氧分压(氧21％)下进行。然而，已知体内干细胞实际暴露的体内环境具有非常低的氧分压(Exp Hematol.,2002；30:67-73)。

在实施例3中，证实了与来源于其他干细胞的外排体(UC-MSC-Exo和BM-MSC-Exo)相比，从人脂肪来源的干细胞分离的外排体(HASC-Exo)在纤维化诱导的肺成纤维细胞中表现出优异的胶原蛋白合成抑制能力并且从脂肪来源的干细胞分离的外排体可以有效地用于治疗肺纤维化。

基于该结果，为了分离有效用于治疗肺纤维化的外排体，通过传代培养直至第7代来使人脂肪来源的干细胞增殖，然后在常氧条件或低氧条件下培养以分离外排体(常氧外排体或低氧外排体)。

具体地，使用补充有10％FBS(胎牛血清)和1％青霉素/链霉素的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，高葡萄糖；Gibco,Cat#:11995065)正常培养基，将人脂肪来源的干细胞传代培养至第7代。使用已知作为在培养细胞中诱导低氧条件的物质的氯化钴(II)六水合物(CoCl₂·6H₂O)来诱导低氧培养条件。在通过以100μM的浓度向培养基添加氯化钴(II)六水合物改变培养基的组成后，将细胞培养1天(图5，A)。同时，对于常氧培养条件，不向培养基添加氯化钴(II)六水合物。

在分离外排体前24小时，用无血清、无抗生素、无酚红的培养基(Gibco,Cat#:31053028)替换培养基。培养24小时后，回收细胞培养上清液。使用如实施例1中所述的多过滤系统从回收的细胞培养上清液中分离和纯化外排体。

作为通过纳米颗粒追踪分析研究从在常氧条件下或低氧条件下培养的人脂肪来源的干细胞分离的外排体的浓度的结果，从在常氧条件下培养的人脂肪来源的干细胞分离的外排体(常氧外排体)的浓度为2.25×10⁹个颗粒/mL，从在低氧条件下培养的人脂肪来源的干细胞分离的外排体(低氧外排体)的浓度为2.45×10⁹个颗粒/mL(图5，C)。此外，发现分离的外排体呈圆形纳米颗粒的形式(图5，B)。

实施例5：评价从脂肪来源的干细胞分离的外排体对肺纤维化的治疗效果

为了研究实施例4中获得的外排体，即从在常氧条件下培养的脂肪来源的干细胞获得的外排体(常氧-Exo)和从在低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞获得的外排体(低氧-Exo)对肺纤维化的治疗效果，建立了肺纤维化动物模型，并通过向已建立的肺纤维化动物模型施用外排体来评价对肺纤维化的治疗效果。

具体地，经气管内滴注(intratracheal instillation，IT)通过将诱导肺纤维化的博来霉素溶液直接注射到C57BL/6J小鼠的肺中来建立博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠模型(9周龄，雄性，中央实验室，动物)。通过静脉内(IV)注射向已建立的博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠分别施用常氧-Exo和低氧-Exo。施用PBS(磷酸盐缓冲盐水)的组用作阴性对照组，施用人脂肪来源的干细胞(HASC)的组用作阳性对照组。

更具体地，以1×10⁶个细胞/100μL的浓度在PBS中制备人脂肪来源的干细胞(HASC)，并将常氧-Exo和低氧-Exo各自分散在PBS中至浓度为1×10⁸个颗粒/100μL(相当于5×10⁹个颗粒/kg)以用于注射。

间隔2天在第1、3和5天通过静脉内注射向博来霉素诱导的肺纤维化C57BL/6J小鼠施用制备的常氧-Exo和低氧-Exo 3次。作为阴性对照组的PBS和作为阳性对照组的以1×10⁶个细胞/100μL浓度制备的人脂肪来源的干细胞(HASC)也像常氧-Exo和低氧-Exo一样间隔2天通过静脉内注射施用3次(图6，A)。

在第6天，即在通过静脉内注射第三次施用PBS、HASC、常氧-Exo和低氧-Exo之后的第二天，提取肺组织以研究对肺纤维化的治疗效果(图6，B)。

对肺组织进行三色染色。通过定量蓝色染色的胶原蛋白面积来研究肺纤维化的程度(图7至9)。

结果，证实了与阴性对照组(PBS施用组)或阳性对照组(人脂肪来源的干细胞(HASC)施用组)相比，施用分别从在常氧条件和低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞中分离的常氧-Exo和低氧-Exo的试验组显示出显著降低的染色胶原蛋白面积，达到与正常肺组织相似的水平。

特别地，与阴性对照组、阳性对照组和施用常氧-Exo的测试组相比，施用从在低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞分离的外排体(低氧-Exo)的测试组显示出明显降低的染色胶原蛋白面积，达到与正常肺组织几乎相似的水平(图7至9)。

从这些结果可以确认，从在常氧条件下培养的脂肪来源的干细胞获得的外排体(常氧-Exo)和从在低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞获得的外排体(低氧-Exo)二者均具有改善或治疗肺纤维化的作用。特别地，可以看出从在低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞获得的外排体(低氧-Exo)显示出对肺纤维化的明显优异的治疗效果。

Claims (6)

1.从脂肪来源的干细胞分离的外排体在制备用于治疗肺纤维化的药物中的用途，

其中所述外排体是从在常氧条件或低氧条件下培养的脂肪来源的干细胞分离的。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述低氧条件是由0.5％至10％的氧或低氧细胞敏化剂诱导的。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述外排体包含肝细胞生长因子(HGF)和白细胞介素-10。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于气管内施用或吸入。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是注射剂。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述外排体以5×10⁹至5×10¹⁰个颗粒/kg的浓度施用。

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